Tinción Simple y Tinción Gram

Brayan Pinchao
Laboratorio de Microbiología I, Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos, Universidad Técnica de Ambato

Resumen
Los métodos de tinción ayudaron a identificar la morfología de las bacterias, pues al enfocarse con el lente
de 1000X se observa a bacterias con forma redonda y otras con forma ovalada alargada, siendo los
primeros cocos, y los segundos bacilos, cabe mencionar que esto fue posible por la acción de los
colorantes empleados ya que estos interactúan con las estructuras de las bacterias haciéndolas visibles.

Introducción

Las bacterias observadas al microscopio son casi incoloras, la principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea por ello el método de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes. (Hernández. 2008)

Tinción Simple

Es una tinción en la cual la bacteria es teñida con un solo reactivo, de preferencia tintes básicos que
contengan un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de
las baterías posee componentes con carga negativa que atraen el cromógeno. La tinción simple se utiliza
para observar la morfología y arreglo en el crecimiento de las bacterias.
(UMB. 2014)

Tinción diferencial de Gram.

Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico
danés Hans Christian Gram en 1884. Los principios de la tinción de Gram están basados en las
características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. (Lopez, Hernandez, Colin, Peña, Gonzales, Cendejas. 2014)

El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula
gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano, generalmente,
80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos,
y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Las gram-
positivas aparecen de color azul o violeta y las gram-negativas de color rosa o rojo.
(UTN. 2009)

El objetivo de la práctica es identificar la morfología de bacterias, que será posible gracias al conocimiento
de mecanismos de tinción simple y tinción diferencial de Gram, para ello también se debe conocer las
funciones de los colorantes empleados en la tinción.

Procedimiento

Se preparó un frotis colocando una pequeña gota de agua estéril sobre un portaobjetos luego con el asa
previamente flameada se tomó una pequeña cantidad de células bacterianas y se esparció con la gota de
agua hasta formar una suspensión, por último se pasó el cubreobjetos tres veces sobre la llama del
mechero para ayudar a secar la suspensión

Para la tinción simple se cubrió la suspensión preparada con azul de metileno, se dejó actuar por un
minuto y luego se lavó con agua el exceso de colorante, por último se dejó secar al aire y se observó con
el objetivo de inmersión.

Para la tinción Gram se cubrió la suspensión preparada con violeta de cristal por un minuto, se lavó con
agua el exceso de colorante y se dejó secar, luego se cubrió con lugol por un minuto, se lavó nuevamente
y se dejó secar, para decolorar la muestra se colocó etanol al 95% por 30 segundos, se lavó y se dejó secar,
por último se tiñó con safranina por un minuto, se lavó el exceso con agua y se dejó secar para luego
observar con el objetivo de inmersión.
Resultados

Tabla N°1: Tinción simple.

Tinción simple – Lente de inmersión 1000X

Organismo: Organismo:
Forma: Forma:
Agrupación: Agrupación:
Color: Color:

Tabla N°2: Tinción diferencial de Gram

Tinción diferencial de Gram – Lente de inmersión 1000X

Organismo: Organismo:
Forma: Forma:
Arreglo: Arreglo:
Color: Color:
Grupo: Grupo:
Discusión

En la tinción simple se usa tintes básicos ya que contienen un cromógeno (compuesto que da color al
tinte) con carga positiva, y como la pared celular de las baterías posee componentes con carga negativa,
entonces estos se atraen y es posible la tinción.

Los principios de tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias,
la pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y
una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas
y Gram positivas explica y determina las características tintoriales. El peptidoglicano es una
macromolécula que rodea completamente las células bacterianas proporcionándoles resistencia frente a
la presión osmótica y confiriéndoles la forma característica de los diferentes grupos bacterianos

Para entender los motivos por los cuales se diferencian las bacterias es conveniente explicarlo de
acuerdo como se llevó el procedimiento, es así que al colocar el colorante violeta de genciana este penetra
a través de la pared bacteriana tanto de las Gram-positivas como de las Gram-negativas, luego cuando se
añade el lugol éste impide la salida del violeta de genciana debido a la formación de un complejo violeta
de genciana-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana, luego al añadir el
alcohol se deshidrata la pared bacteriana y se cierran los poros de la misma, también destruye la
membrana externa de las bacterias Gram-negativas debido a que el complejo antes formado (violeta-
yodo) es soluble con el alcohol y la muestra se decolora, las bacterias Gram-positivas al contener una
gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram-
negativas no lo pueden retener debido a que tienen menor cantidad de peptidoglicano, por último al
colocar un colorante secundario como la safranina se logra teñir las bacterias que no pudieron retener el
complejo violeta-yodo.

Por eso es que las bacterias Gram-positivas se tiñen de azul-violeta proveniente del violeta de genciana y
las Gram-negativas de rojo proveniente de la safranina, y por eso es importante conocer los cambios
químicos que se realizan al momento de teñir una muestra bacteriológica.

Cuestionario

 ¿Por qué se utilizan colorantes básicos en la tinción simple? Nombre 3 ejemplos.

Porque los tintes básicos contienen un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga
positiva, ya que la pared celular de las baterías posee componentes con carga negativa que atraen
el cromógeno.
 Ejemplos: Carbón fuchsin: 15 a 30 segundos
Cristal Violeta: 20 a 60 segundos
Metíl Azul: 1 a 2 minutos (UMB. 2014)

 Señalar las diferencias entre la tinción simple y la tinción diferencial de Gram.

La tinción simple sucede cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo
colorante en cambio la tinción diferencial de Gram sucede cuando se visualiza más de un color
porque se utiliza más de un colorante.
La tinción simple permite observar la forma, tamaño y agrupamiento de las bacterias mientras
que la tinción diferencial de Gram permite distinguir diferentes tipos de microorganismos en
función de sus características estructurales. (Unavarra. 2009)

 ¿Cuál es la función del lugol y del alcohol en la tinción Gram?

El lugol sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo
cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana.
El alcohol deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la
membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de
solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona.
(Lopez, Hernandez, Colin, Peña, Gonzales, Cendejas. 2014)

 Escriba las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas y 2 ejemplos

de cada grupo.

Estructuralmente ambos grupos se diferencian porque las Gram-positivas carecen de membrana

externa, tienen una gruesa capa de peptidoglicano, mientras que las Gram-negativas tienen
membrana externa portadora de lipopolisacárido y una capa de peptidoglicano más fina.

Gram positivas Gram negativas

Bacillus anthrasis Neisseria meningitidis
Clostridium tetani Neisseria gonorrhoeae

(Unavarra. 2009)
Conclusiones

 Se identificó la forma de las baterías observadas pues en las placas se miraron círculos pequeños,
forma que corresponde a los cocos y también una forma ovalada muy alargada que corresponde
a los bacilos.
 Se conoció los mecanismos de tinción para la determinación morfológica de cada bacteria, es así
que la tinción simple ayuda a determinar la forma, el tamaño y agrupamiento de las bacterias, por
otro lado la tinción diferencial de Gram permite diferenciar microorganismos en base a sus
características estructura.
 Los colorantes empleados en la práctica permitieron hacer visibles a las bacterias que por
naturaleza son casi incoloras, al teñirlas de colorante se determinó la forma que tenían dichas
bacterias.

Bibliografía

 Universidad Tecnológica Nacional. 2009. Tinción y observación microorganismos. Disponible en:

http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf
Obtenido el 10 de mayo del 2015.

 Hernández B. 2008. Tinciones utilizadas en microbiología. Disponible en:

http://analisisaproductoscarnicos.blogspot.com/2012/06/tinciones-utilizadas-en-
microbiologia.html Obtenido el 10 de mayo del 2015.

 Lopez L, Hernandez M, Colin C, Peña S, Gonzales G, Cendejas R. 2014. Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Investigación en discapacidad 1 (3): 10-18.

 Universidad Metropolitana Bayamón. 2014. Tinción simple. Disponible en:

http://pdfsr.com/pdf/8-tincion-simple Obtenido el 10 de mayo del 2015.

 Unavarra. 2009. Microbiología Clínica. Disponible en:

http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema01.pdf Obtenido el 10 de mayo del 2015.