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1. Terrain d’application
Ce document fournit des instructions pour faire un comptage manuel des globules blancs à l’aide d’une
cellule de Neubauer (double improved). Les globules blancs sont dilués et comptés sous microscope
dans un volume défini (la cellule de numération), puis le nombre de globules blancs par µl de sang est
calculé.
2. Responsabilités
Fonction Activités
Technicien de laboratoire • suit cette procédure
• enregistre toutes les données dans le registre de laboratoire
• emploie les procédures d’entretien pour le microscope
• est responsable de produire le liquide de Türk et de le stocker
correctement
• rapporte des problèmes techniques au directeur du laboratoire
Responsable de la qualité du • vérifie que les techniciens de laboratoire suivent la procédure
laboratoire • vérifie que les consommables sont stockés correctement
ou • vérifie que l’entretien des appareils s’est fait au bon moment
Laborantin coordonnateur • prend des mesures lorsqu’une réparation est nécessaire
• rédige un contrat d’entretien avec le fournisseur du microscope
• vérifie que les données sont correctement enregistrées
3. Références
• Manuel des techniques de base pour le laboratoire médical, OMS, 1982
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/9242541451.pdf
• Hématologie tropicale pratique, notions de base. Institut de Médicine Tropicale Prince Léopold,
Philippe Gillet, Janvier 2006.
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/HEMATOLOGY/ITM_2006-PG-
%20Hématologie%20Tropicale%20Pratique.pdf
• Manuel d’entretien et de maintenance des appareils de laboratoire, 2e édition. OMS, 2008.
http://www.labquality.be/documents/LAB%20MANAGEMENT/EQUIPMENT/MAINTENANCE/9789242
596359_fre.pdf
4. Procédure
4.1 Principe du test
La méthode manuelle de comptage des globules blancs consiste à compter sous microscope le nombre de
globules présents dans un volume défini (cellule de numération). Le sang est dilué 1/20e pour obtenir un
nombre de globules comptables et pour détruire des globules indésirables (globules rouges). Un simple
calcul, tenant compte du nombre d’éléments comptés, du volume utilisé par le comptage et de la dilution
éventuelle, permet d’obtenir le nombre de globules par µl de sang.
4.2 Sécurité
• Tous les échantillons de sang sont potentiellement infectieux. Respectez les précautions
universelles.
• L’acide acétique glacial (pour préparer le liquide de Türk) est inflammable, nocif et extrêmement
corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux. Manipulez ce produit avec précaution, loin d’une flamme,
fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique). Ne versez JAMAIS d’eau dans l’acide acétique glacial.
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L’addition d’une faible quantité d’eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire
exploser la bouteille.
4.3 Échantillon
• Conditions spéciales pour la préparation du patient: aucun
• Type d’échantillon: sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA dipotassique
• Volume de l’échantillon: 20 µl de sang total
• Stérilité: pas nécessaire
• Durée maximum entre la prise de sang et la mesure:
o le sang capillaire : immédiatement
o le sang veineux : au maximum 6 heures après le prélèvement
Pour éviter une hémolyse, ne réfrigérez pas et ne secouez pas le sang total
• Critères de rejet:
o des échantillons hémolysés ou coagulés
o des échantillons infectés par des bactéries ou des champignons
o des échantillons pas ou mal étiquetés
4.5 Procédure
• Préparez le liquide de Türk:
o Versez 96 ml d’eau distillé dans un flacon
o Ajoutez 3 ml d’acide acétique glacial
o Ajoutez 1 ml de violet de gentiane à 1% (ou 1 ml de bleu de méthylène aqueux)
NE verser JAMAIS d’eau dans l’acide acétique glacial, car cela peut produire suffisamment de
chaleur pour faire exploser la bouteille.
• Préparez l’échantillon:
o Versez 380 µl de liquide de Türk dans un tube à hémolyse en utilisant une pipette graduée
de 1 ml et un ballon à pipeter
o Inscrivez l’identifiant du patient sur le tube et la date de prélèvement
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o Aspirez du sang, à l’aide d’un dispositif de sécurité, jusqu’à la marque 0,02 de la pipette de
Sahli (= 20 µl). Ne laissez pas pénétrer de bulles d’air.
o Essuyez l’extérieur de la pipette avec du papier absorbant. Assurez-vous que le niveau du
sang coïncide avec le repère.
o Soufflez le sang dans le tube à hémolyse contenant le liquide de Türk. Rincez la pipette de
Sahli en aspirant et refoulant le liquide à trois reprises. La dilution du sang est de 1/20.
o Homogénéisez la dilution et attendez 3 minutes avant de remplir la cellule (temps de lyse
des globules rouges)
o Nettoyez immédiatement la pipette de Sahli (voir § 4.9 « Entretien »).
1. Facteur de dilution = 20
20 µl de sang + 380 µl de liquide de
Türk
2. Facteur de volume = 2,5
4 grands carrés de 0,1 mm3 = 0,4 mm3
et 1 mm3 = 1 µl. Alors pour convertir le
Surface : 3 mm x 3 mm soit 9 mm²
résultat par µl, on doit diviser par 0,4 ou
Profondeur : 0,1 mm.
multiplier par 2,5 Volume total : 0,9 mm³ ou µl
3. Le facteur de correction total est 50 (= 20 x 2,5)
Les valeurs de référence varient en fonction de la population et la méthode utilisée par le laboratoire.
Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour
l’hématologie le plus proche.
4.9 Entretien
• Nettoyage des pipettes de Sahli :
1. Trempage
Faire tremper les pipettes dans une solution désinfectante (0,5% eau de Javel)
pendant 4 heurs
2. Nettoyage
À l’aide d’une trompe à vide ou d’une poire en caoutchouc, aspirer dans chaque
pipette :
- de l’eau propre, de l’eau distillée si disponible en abondance (4 fois)
- de l’éthanol (1 fois)
- de l’air (pour un séchage aussi complet que possible)
3. Séchage
Si possible à l’incubateur, à 37°C, en y laissant les pipettes toute la nuit dans un
récipient garni de coton cadré, ou à l’air
Pipettes bouchées
Essayer d’enfoncer un crin de nylon fin (type 000) par le haut de la pipette tout en aspirant par
la pointe. En cas d’échec, laisser tremper pendant 12 heures dans un bécher de mélange sulfo-
chromique.
5. Enregistrements et archives
Registrez tous les résultats dans le registre de laboratoire.
Révision
Version initiale