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DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CONSERVANTES EN ALIMENTOS

SÓLIDOS.

RESUMEN.

Los conservantes como los benzoatos, sorbatos, ácido ascórbico, entre otros, se
han utilizado ampliamente en las industrias alimentaria con el fin de mitigar las
pérdidas económicas ocasionadas por la descomposición natural de los alimentos,
prolongando la vida útil de los mismo; la cuantificación de estos conservantes se
hace entonces necesaria para los procesos de control de calidad y seguridad de los
consumidores, en la presente revisión hacemos un recuento de las principales
técnicas utilizadas y validadas para realizar cuantificaciones y detecciones de los
conservantes benzoatos, sorbatos y ácido ascórbico en alimentos sólidos haciendo
principal énfasis en métodos espectrofotométricos que garanticen una
cuantificación económica, fácil y confiable

PALABRAS CLAVES.

Conservantes, alimentos sólidos, ácido ascórbico, espectrofotometría, sorbatos,


benzoatos, propionatos, parabenos

OBJETIVO
Recopilar artículos que estandarice un método analítico, utilizando equipos como
espectrofotómetro, para la detección y cuantificación de conservantes en alimentos
sólidos

INTRODUCCIÓN.

Actualmente, las industrias de alimentos han incluido conservantes y aditivos para


mantener la consistencia, calidad y el tiempo de vida útil de los diferentes productos.
Con el aumento de la población y globalización del suministro de alimentos, la
demanda de producción y de consumidores ha aumentado, impulsando la
exportación, por lo tanto, la implementación de nuevas formas de frenar la
contaminación microbiana, física y química para garantizar la calidad (Surendran
Nair, Nair, Kollanoor Johny, & Venkitanarayanan, 2020)(1).

Los conservantes, son un tipo de sustancias que pueden retardar, inhibir o detener
los procesos de deterioro como fermentación, enmohecimiento, putrefacción y otras
alteraciones biológicas de los alimentos y bebida causadas por oxidación, hidrólisis
enzimática, luz, temperatura, humedad o microorganismos. Se pueden clasificar
como los empleados para el tratamiento externo de los alimentos y los utilizados
para su incorporación directa a los productos y bebidas (Carrillo Inungaray & Reyes
Munguía, 2014; Ng, Lyu, Mark, & Chen, 2019; OMS & FAO, 2012) (2) (3)(4).

El uso de los conservantes como ácido ascórbico, ácido Benzoico, sórbico,


propionato, parabenos entre otros, en los alimentos es reglamentado en todos los
porque su inclusión sólo se hará de ser necesario y como se indica la Norma, donde
se encuentran estipulados los límites de la cantidad que se puede añadir de un
conservante dependiendo el tipo de alimento que sea (Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura & Organización Mundial de la
Salud, 2018) (5).

Se ha de tener presente que los conservantes son sustancias tóxicas para los
microorganismos, por lo que sí afecta también a alguno de nuestros procesos
metabólicos, pueden detectarse cuadros de intoxicación, ya sea de tipo agudo o
crónico, debido a un efecto acumulativo por la ingesta diaria de productos con
agregados conservantes. En ocasiones, se utilizan para disimular un deterioro o
alteración de los alimentos, por esto se debe tener un buen control a nivel legal
donde se especifique que tipo de conservante y a que concentración se está
añadiendo a un alimento.

1. Métodos utilizados para la detección y cuantificación de conservantes


presentes en alimentos.

La mayoría de estos métodos se han desarrollado inicialmente para la detección y


cuantificación de aditivos, que se sabe que son tóxicos potenciales para los
consumidores. Con mayor frecuencia, la elección de varios análisis se determina en
función del estado de las muestras (sólido, líquido o gaseoso), el nivel esperado de
aditivos y, lo que es más importante, los niveles de sustancias interferentes
presentes en las muestras. Las principales estrategias analíticas incluyen la
cromatografía, la espectrometría de masas (MS), la electroforesis, la resonancia
electrónica de espín y los métodos de inyección de flujo, además de los
inmunoensayos y enzimas tradicionales.

1.1 Cromatografía para determinación de conservantes en alimentos.

La determinación de conservantes en alimentos se realiza comúnmente con


cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) con detección UV en diferentes
longitudes de ondas ya específicas para el conservante a detectar o cuantificar. Los
alimentos al tener en su composición gran variedad de elementos presentan
inconvenientes para la lectura de conservantes o cualquier otro compuesto de
interés en un espectrofotómetro ya que se pueden presentar interferencias, es por
esto que para poder hacer una medición y cuantificación adecuada por
espectrofotometria es necesario realizar una separación previa del componente a
analizar, por lo que los métodos cromatográficas han sido alto referente para este
tipo de análisis ya que permite realizar una separación del compuesto de las demás
interferencias presentes en el alimmejorar su rendimiento (Gómez Ruiz, Roux,
Courtois, & Bonazzi, 2016)(7)ento; los métodos HPLC son altamente selectivos y
sensibles por lo que en conju6gación con métodos espectrofotométricos y
titulaciones pueden

En forma general para una muestra entre 1 y 5 g de la muestra homogeneizada


son extraídos con 20ml de solución extractora, para la extracción de conservantes
se utilizan buffers de formiato de amonio y metanol (60:40 v/v) generalmente en
baño ultrasónico, calentando ligeramente. El buffer se ajustará a un pH de 4,8.
Pueden eliminarse otros aditivos que causen interferencias con 1 ml de Carrez I y 1
ml de Carrez II. EL análisis de 1g muestra equivale a 0,5-2g de conservante por kilo
o 0,05-0,2%). (“HPLC: Determinación de conservantes en alimentos y cosméticos,”
2019)(8).

1.2 Espectrometría de masas.


Esta técnica es utilizada para determinar de forma cualitativa compuestos de
interés, debido a esto es combinada con otros métodos que permitan una
cualificación y cuantificación, en este caso se combina con frecuencia con métodos
de espectrofotometría UV para realizar cuantificación de compuestos, el principio
básico de la espectrometría de masas consiste en la obtención de iones a partir de
moléculas orgánicas en fase gaseosa, una vez obtenidos estos iones se separan
de acuerdo con su carga y su masa y finalmente se hace una medición cuantitativa
por un equipo o método complementario. (Espectrometria de masas, n.d.)(9)

Esta técnica tiene la gran ventaja de que utiliza poca cantidad de solventes además
que simplifica la preparación de muestras y evita la necesidad de reactivos
particularmente peligrosos para el analista. (Djatmika, Hsieh, Chen, & Ding,
2016)(10)

1.3 Electroforesis capilar

Es una técnica donde la muestra es sometida a un campo eléctrico, las especies


iónicas de la muestra migran hacia un electrodo, cuando haya pasado un tiempo
correspondientes los componentes la muestra migran a diferentes velocidades y
causara una separación, en diferentes zonas. (de Jesus et al., 2018)(11)

2. Cualificación y Cuantificación de algunos conservantes utilizados en


alimentos sólidos.

2.1 Ácido ascórbico:

Conservante utilizado para bloquear el mecanismo químico de formación de


nitrosaminas las cuales se forman por la combinación de nitritos que están en los
embutidos, en altas concentraciones pueden tener efectos cancerígenos (3). Para
identificar ácido ascórbico se debe tener precaución en que la muestra no sufra
proceso de oxidación, ya que los resultados de las mediciones pueden salir
alterados, es por eso que la muestra de ácido ascórbico se diluye en ácido meta
fosfórico al 3% (p/v) dándole una estabilidad de 48 horas a temperatura ambiente.
La absorbancia de la mezcla se registra contra un tampón de malato 20 mM diluido
1/50 en ácido meta fosfórico, y se leyó a 243 nm, longitud de onda para la cual AA
exhibió la absorbancia máxima. Tras tener la lectura de absorbancia se utiliza una
curva de calibración para saber la concentración final de ácido ascórbico.(Gómez
Ruiz et al., 2016)(12)

2.2 Acido Benzoico, sorbico y sus sales:

Conservantes utilizados para evitar el crecimiento de bacterias, mohos y levaduras


utilizados en la industria de la panificación y repostería, quesos y mermeladas entre
otros productos, Los conservantes ácido benzoico y ácido sórbico se cuantifican
generalmente con técnicas de separación, como HPLC, siendo esta una técnica
costosa y laboriosa, pero efectivas (Fujiyoshi et al., 2018)(13) combinada con la
espectrometría de masas tienden a solucionar grandes problemas, ya que los
resultados falsos positivos tienen menos probabilidad de incidencia, además que la
gama de aplicación es especialmente amplia, (Santos et al., 2016)(14) para
identificar estos conservantes en muestras sólidas , se deben realizar extracciones
orgánicas utilizando metanol, hidróxido de sodio, y agua desionizada, además que
Carrez I y Carrez II que sirven para eliminar interferencias, se centrifuga y el
sobrenadante resultante se recoge y se inyecta en la columna del HPLC, en caso
de que la muestra quede muy concentrada se realizan diluciones previas con la fase
móvil. (Chaleshtori, Arian, & Chaleshtori, 2018)(3)

2.3 Propionato.

Conservante utilizado con el fin de evitar la contaminación por hongos en la industria


de panificación usada generalmente con productos que tienen levaduras ya que la
acción contra esta es mínima en comparación con otros conservantes. (Bermúdez
G., Espinoza, & Márquez, 2017)(16) Al tratarse de un compuesto con alto potencial
iónico, su cuantificación se realiza utilizando la técnica de electroforesis capilar en
conjugación con espectrofotometría UV, para la cuantificación de las muestras se
realiza una curva de calibración utilizando estándares de propionato de calcio, para
la separación del conservante se utilizan equipos compuestos con diodos, donde
la muestra tiene que estar en un pH de 5.8 en caso de no estar con este pH se
ajusta con ácido benzoico o NaOH, para inyectar la muestra en el equipo se debe
controlar la presión de inyección la cual está en un rango entre 5 a 50 mbar
para evitar variaciones y errores de lectura, después de realizar la separación se
lee la muestra a una longitud de onda de 235 nm (11)

2.4 Parabenos.

Son sobre todo eficaces frente a hongos y levaduras, pero también frente a
bacterias. Dentro de las bacterias, inhiben con mayor eficacia el crecimiento de las
gran positivas, son activos en medios neutros, además, son muy baratos de
producir. (Tecnologías, La, & Alimentaria, 2012)(17) Tienen amplia aplicación en
productos de la pesca como lo son los mariscos, para identificación y cuantificación
de estos conservantes se utiliza cromatografía de gases combinada con
espectrometría de masas, para poder realizar el análisis la muestra tiene que tener
un tratamiento previo en este caso la dispersión matricial en fase sólida que consiste
en la extracción con solventes, asistida por ultrasonidos, que facilitan el proceso de
difusión de los compuestos. (Stashenko, Martínez, & Castrillón, 2014) (18) tiene la
ventaja de ser una técnica donde la extracción, la limpieza y la filtración se realizan
en un solo paso, para no solo reducir los volúmenes de solvente necesarios, sino
también simplificar el procedimiento analítico, para el análisis se realizan patrones
de metilparabeno , etilparabeno, propilparabeno y butilparabeno (purezas de todos
los compuestos > 99%) con el fin de comparar la muestra con dichos patrones e
identificar la presencia de parabenos, la muestra debe estar libre de contaminantes
por lo que es recomendable realizar una limpieza al alimento antes de comenzar el
tratamiento (10).

Como se evidenció con el registro de los anteriores conservantes, en todos los


casos, hay inconvenientes en análisis debido a las diferentes interferencias que se
pueden presentar, lo que genera un reto en la preparación de la muestra para una
correcta cualificación y cuantificación de la sustancia de interés.

En esta revisión bibliográfica, se referencian diferentes métodos de cuantificación


y cualificación, que en su mayoría funcionan en conjunto de dos métodos, donde
inicialmente se da la preparación correcta de la muestra para eliminar mayor número
de interferencias, se realiza una cualificación de sustancias presentes por ejemplo
utilizando HPLC o electroforesis capilar y continuando con con cuantificación por
espectrofotometría .

Estudios encontrados por el método espectrofotométrico

Un estudio donde se realizó, una evaluación de conservantes de benzoato de sodio


y sorbato de potasio en 103 muestras de torta, pan tostado, pasta de tomate,
mayonesa salsa, Gaseosa suave y ensalada Olovieh en Kashan, por
espectrofotometría y alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC). Se encontró
que, los ósorbatos de potasio con concentración mayor al limite de cuantificación en
pan tostado (que varía de 2.5 a 415 mg / kg), torta (que varía de 5.4 a 700 mg / kg),
salsa de mayonesa (que varía de 125.92 a 334.99 mg / kg) y ensalada Olovieh (que
varía de 104,6 a 144,2 mg / kg) y sorbato de potasio no se detectó en muestras de
pasta de tomate (<LOQ 4 mg / kg o L)(18).

Otro artículo se evaluó ascórbico y ácido dehidroascórbico en matriz simple para


mediciones cinética y se validó en tampón de malato 20 mM (pH 3,8), demostrando
que, el mètodo espectrofotométrico es confiable con respecto a su linealidad, límites
de detección, fidelidad y precisión (19).
Figura 1. Corrección de los valores de contenido de ácido dehidroascórbico en
función de la concentración total en Ácido ascórbico + ácido dehidroascórbico: (A)
valores brutos de la absorbancia medidos a 243 nm cuando se aplica el modelo de
regresión de calibración calculado para ácido ascórbico; (B) modelos de regresión
lineal equipados con la misma pendiente única para todas las concentraciones
totales en ácido ascórbico + ácido dehidroascórbico; (C) modelos de regresión
lineal corregidos para tener una pendiente igual a 1; (D) Valores de ácido
dehidroascórbico corregidos por la intersección calculada en función de la
absorbancia total ( A total )
Se encontró un estudio donde determinan simultáneamente cuatro conservantes en
alimentos mediante calibración multivariada y redes neuronales artificiales, donde
analizan el ácido benzoico, el metilparabeno, propilparabeno y el ácido sórbico en
varias muestras comerciales de alimentos sòlidos, ademàs se comparan los
espectros UV encontrados con lo espectros UV teóricos. Los resultados
encontrados muestran que los espectros de estos compuestos se superponen con
los espectros teóricos (21).

Espectros de absorción de cuatro conservantes: (A) espectros UV convencionales


y (B) espectros de primera derivada. Ácido benzoico (BA), metilparabeno (MP),
propilparabeno (PP), ácido sórbico (SA) y blanco reactivo. Concentración: 2.0 μg
mL −1 para BA, MP y PP, y 1.0 μg mL −1 para SA a pH 2.21.

En un estudio realizado en Brasil, se determinó simultáneamente conservantes de


propionato y sorbato en muestras de pan utilizando electroforesis capilar con
detección espectrofotométrica de matriz de diodos (20). En este articulo utilizaron
reactivos de grado analítico, metanol, NaOH, HCl, acetato de sodio, propionato de
calcio, sorbato de potasio, l-histidina, ácido benzoico, bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB) y agua ultrapura.

Para la soluciones estándar, se prepararon soluciones madre de sorbato de potasio


y propionato de calcio, disolviendo cantidades de los reactivos sólidos de sorbato y
propionato en agua ultrapura para lograr una concentración final de 1.00 g/L.
Se realizaron diluciones de las soluciones madre, se prepararon soluciones
estándar que contenían ambos conservantes (0.083–100 mg/L para propionato y
0.03–10 mg/L para sorbato) para obtener curvas de calibración. Se añadió acetato
(10 mg/L) a todas las soluciones como patrón interno.

Las muestras. Se adquirieron cuatro muestras diferentes de pan blanco en rodajas


comerciales en los mercados locales de la ciudad de Campinas, estado de São
Paulo, Brasil.

Las muestras de pan se compraron en paquetes que contenían 500 g


(aproximadamente 15–20 rebanadas). Se colocaron cinco rebanadas de cada
muestra de pan dentro de bolsas de plástico selladas que luego se almacenaron en
un refrigerador (4 ° C) por hasta una semana.

La detección espectrofotométrica se realizó a 235 y 250 nm para propionato y


sorbato, respectivamente.

Para la preparación de la muestra

Se cortó una rebanada de muestra de pan en trozos pequeños con un cuchillo. A


continuación, se pesó 1 g de pan y se transfirió a un matraz Erlenmeyer de vidrio de
100 ml. Se añadió agua ultrapura a un volumen de 50 ml al matraz. La suspensión
formada se sonicó durante 10 minutos y se filtraron aproximadamente 5 ml del
extracto usando un filtro de membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (0,2
μm). Finalmente, el extracto acuoso filtrado se diluyó 2 veces con agua ultrapura,
se añadió el acetato estándar interno (10 mg/L) y se inyectó en el sistema
electroforesis capilar.

Resultados
Figura 1. Electrogramas con detección espectrofotométrica UV a (a) 250 y (b) 235
nm de (A) una solución estándar que contiene 40 mg/L de propionato , 4 mg/L de
sorbato y 10 mg/L de acetato y para ( B) un extracto acuoso de una muestra de pan.

El detector de matriz de diodos permitió la detección simultánea de los conservantes


a dos longitudes de onda diferentes (235 y 250 nm). Como el propionato y el acetato
carecen de un grupo cromóforo fuerte , se añadió ácido benzoico al electrolito de
fondo para aumentar la absorción UV de fondo , lo que permitió una detección
indirecta (picos negativos) de estos compuestos a 235 nm. En contraste, el sorbato
podría detectarse directamente (pico positivo) porque este conservante tiene una
absorbancia más alta a 250 nm que la del electrolito de fondo.

Los resultados demostraron que el método es confiable, rápido, simple y fácil para
la determinación simultánea de propionato y sorbato en el pan. Además, es
adecuado para la seguridad y el control de calidad con respecto a la adición de
propionato y sorbato en muestras de pan.

En otro artículo, se determinó ácido ascórbico por el método espectrofotométrico


donde se utilizó como muestra frutas y bayas (22).

Preparación de la muestra
La frutas y bayas se secaron y trituraron, luego se pesaron 10g y se añadió 50 ml
de agua destilada, se agitó durante 10 minutos y se filtró utilizando papel filtro
Procedimiento para la determinación del ácido ascórbico.

Se tomó una alícuota de 4,0 ml en un tubo, luego se agregaron 0.2 ml de la solución


de anión triyoduro (0.0001 mol/L ), 0.6 ml de solución tampón de acetato (pH 3.0),
0.2 ml de solución acuosa de colorante polimetina Astra Phloxine (0.001 mol/L) y se
mezclaron completamente. Como resultado, el ácido ascórbico reacciona con el
anión triyoduro para formar yoduro, que no forma un asociado iónico con polimetina
Astra Phloxine.

Resultados

Curva de calibración para la determinación espectrofotométrica del ácido ascórbico:

Se realizó a una longitud de onda 560nm, el volumen de fases acuosas fue de 5,0
ml; 500 μl de tetracloruro de carbono; se agitó en vórtex por 15 s 3000 rpm; se
centrifugó por 2 minutos, 2000 rpm.

A partir de la curva se encontró la concentración de ácido ascórbico, los resultados


mostraron una convergencia satisfactoria con el método de referencia, que se basa
en el uso de 2,6-diclorofenolindofenol. El método propuesto es más sensible y las
características metrológicas satisfactorias indican su uso práctico.
Este método es útil para alimentos como pan o carnes curadas, ya que tienen el
ácido ascórbico como conservante

Conclusiones

Se logró recopilar artículos donde utilicen el método espectrofotométrico, para la


detección y cuantificación de conservantes en alimentos sólidos.

En estos estudios, se desarrolló, optimizó y validó unos métodos simples, rápidos


y confiables para la determinación de los conservantes sorbato, benzoato y ácido
ascórbico en alimentos sólidos. El rendimiento analítico del método, particularmente
el tiempo de análisis muy corto, el bajo costo y el simple tratamiento previo de la
muestra, verifica su posible aplicabilidad para el análisis rutinario y automatizado de
estos conservantes en el control de calidad de los diferentes alimentos.

Validar los métodos analíticos que se utilizan en un experimento, resulta ser de los
procedimientos más significativos a la hora de brindar credibilidad y confiabilidad a
los estudios.

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