РАЗДЕЛ 2

ОБЪЕКТЫ, УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная часть работы проводилась в оранжереях и

лабораториях отделов тропических и субтропических растений и
аллелопатии Национального ботанического сада им. Н. Н. Гришко НАН
Украины в период с 2004 по 2010 гг. В процессе выполнения работы
проводились вегетационные и лабораторные эксперименты, а также
исследования с использованием компьютерных систем получения, обработки
и накопления информации.
Объектами исследований были 6 сортов азалии индийской из
коллекции НБС НАН им. Н. Н. Гришко Украины: Apollo (кирпично-красный
с темно-пурурным крапом, ранний (X-XII)), Яблонька (розовый с пурурным
крапом и светло-пурпурной окантовкой, средний (I-II)), Подолянка (светло-
сиренево-розовый с пурурным крапом, средний (I-II)), Concinna (пурпурно-
красный, средне-поздний (II-III)), Hexe (пурпурно розовый, с пурурным
крапом средне-поздний (II-III)), Героям Войны (сиренево-розовый с
пурурным крапом, поздний (цветение – III-IV)).
Растения выращивались в условиях пассивного (защищенный грунт)
эксперимента при температурном режиме в пределах 12-14ºС – 28-32ºС в
зависимости от сезона и относительной влажности воздуха 65-90%.
Влажность почвенных субстратов поддерживалась на уровне 30-75% от
полной влагоемкости.
Освещение – естественное, в летние месяцы использовалось затенение
оранжерей на 50-70%. Растения выращивались в оранжереях при следующем
световом режиме: с ноября по январь – 1,6 клк, в феврале-апреле – 2,4-4,0
клк, в мае-августе – 7,4-7,6 клк, в сентябре-октябре – 5,0-2,7 клк.
Растения азалии выращивались в глиняных, пластмассовых и
деревянных контейнерах диаметром 10-120 мм. При уходе за растениями
использовались общепринятые методики.
 Рис. 2.1 Исследуемые сорта Azalea indica

Hexe Apollo

Подолянка Яблонька
 Concinna Героям Войны
Полив проводили декарбонизированой водопроводной водой.
Декарбонизация осуществлялась путем добавления в отстояную воду 20 мл
щавлевой кислоты на 1 м³ воды, доводя pH с 7,0-7,3 до 5,5-6,0. Контроль
кислотности осуществляли с помощью ионометра ЭВ-74.
Фенологические наблюдения с учетом биологических ритмов азалии
индийской проводились по методике Г.Ф.Лапина [71, 84].
Наблюдения за модельными растениями проводились в течение пяти
лет. В период прорастания, активного роста и цветения – ежедневно, в
остальное время – два раза в неделю.
При исследованиях биологии развития и определения этапов
органогенеза использовалась методика, разработанная в лаборатории
биологии развития МГУ им. Ломоносова []. Исследования начальных этапов
органогенеза проводились на свежем материале методом изучения
морфологического строения почек, препарированных под бинокулярным
микроскопом МБС-9. Анализ развития почек осуществлялся каждые 3-5 дней
в период интенсивного роста и 1 раз в две недели в остальное время.
 Для исследования анатомии листа отбирались взрослые,
дифференцированные листовые пластинки серединной формации из
среднего яруса кроны. Исследования проводились световой (микроскоп
МББ-1А) и электронной микроскопии (РЕММ-102 АО (АО Selmi, Украина))
[25]. Описание морфологии листа проводилось по атласу по описательной
морфологии высших растений [123], описание поверхности листовой
пластинки - согласно методике С.Ф. Захаревича [49].
Интенсивность светового потока определялась при помощи люксметра
Ю-116.
Содержание фотосинтетических пигментов определялось
спектрофотометрическим методом при помощи спектрофотометра СФ-21 по
методике Х.Н. Починка [94]. Измерения проводились при длине волны 440
(каротиноиды), 644 и 662 нм (хлорофиллы a и b). Экстракция проводилась
90%-ным ацетоном. Содержание пигментов выражалось в миллиграммах на
100 г сырого вещества.
 Определение содержания в растениях биогенных макро- и
микроэлементов осуществлялось по методике Г. Я. Ринькиса [99].
Степень адаптации растений к стресс-факторам определяли по
содержанию пролина [113]. Водный режим определяли по методике
Григорюка [35].
Экстракция аллелопатически активных веществ из образцов
растительного материала и почвы проводилась согласно общепринятым
методикам [37]. Аллелопатическая активность экстрактов и растворов
действующих веществ оценивалась методами биотестирования на
прорастание семян и рост корней проростков [37].
 Препараты НК из экспериментальных растений выделялись с помощью
известных методов, принципиально отличавшихся лишь по составу
используемых буферов. Для сравнения выхода полученных препаратов НК
экстракцию РНК и ДНК проводили раствором: 100 mM tris-HCl, pH 8; 200
mM LiCl; 100 mM EDTA; 20 mM ауринтрикарбоновая кислота (АТА); 100
mM 2-меркаптоэтанол [44]. Кроме того использовали буфер STEL: 0,2%
SDS;10 mM tris-HCl, pH 7,5; 10 mM EDTA; 100 mM LiCl [45], а также
растворы, разработанные НИИ Генетики: 1) STTEN – (6% сахароза, 4%
тритон Х-100, 40 mM tris-HCl, pH 8, 25 mM EDTA, 1 M NaCl) [46], 2) STTNE
– (6% сахароза, 0,2% tris-HCl, pH 8, 4% тритон Х-100, 2% Na ацетат, 0,4%
EDTA, 0,3% PAR) [47]. Общая схема выделения НК включала следующие
процедуры. Образец растительной ткани (0,5-1,0 г) замораживали, тщательно
растирали в жидком азоте, быстро добавляли к нему соответствующий буфер
(5,0 мл) и равный объем 80% фенола. После фенольной депротеинезации (20
мин.) суспензию дважды обрабатывали смесью фенол-хлороформ и один раз
хлороформом. Молекулы РНК и ДНК разделяли в присутствии 3 М LiCl в
течение 3-8 часов на льду. При это РНК выпадала в осадок, а надосадочная
жидкость содержала преимущественно ДНК, высокополимерные молекулы
которой наматывались на стеклянную палочку при добавлении 2,5 объема
этанола. Осадок РНК промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в
ТЕ-буфере.
Концентрацию НК и спектрофотометрический коэффициент Е 260/E280 в
образцах определяли при помощи спектрофотометра СФ-26 по методу [50].
Электрофорез препаратов НК в 0,8% агарозном геле в ТВЕ-буфере, рН 8;
аналитическую и препаративную рестрикцию плазмоидной ДНК
эндонуклеазами Bam HI, Smal, Hind III, XhoI, EcoRI, элюцию фрагмента
целевого гена из агрозного геля прорводили в соответствии с
рекомендациями [48].
 В гибридизационном анализе в качестве ДНК-зондов использовали: а)
Smal – фрагмент гена рибосомной 18S РНК гороха (800 bp) в составе
плазмиды Bluescript; б) фрагмент гена рибосомной 18S РНК крысы (5000 bp)
в составе pBR322 [52].
Рекомбинантную плазмиду pRrB3 клонировали в E. coli HB 101, а
плазмиду ETS – в E. coli JM 109 по методу [48].
Прцедура трансформации бактерий плазмидной ДНК включает
несколько этапов, проводившихся по [48]: Наращивали бактериальные
клетки, обрабатывали их 0,1 М СаCl2 при 0ºС (получение компетентных
клеток); осуществляли тепловую обработку смеси – 0,1 мл бактериальных
клеток + 0,1 мкг ДНК при 42ºС с дальнейшим посевом на питательную среду
LB с ампицилином (Ар); проводили отбор полученных трансформантов и
контролировали наличие в них рекомбинантных плазмид при помощи
щелочного скрининга. Для этого часть бактериальной колонии вносили в 50
мкл буфера (50 mM NaОН, 5 mM EDTA, 0,5% SDS), выдерживали 1 час при
68-70ºС и анализировали полученный лизат электрофорезом в 0,7% агрозном
геле.
Для получения ДНК рекомбинантных плазмид использовали щелочной
метод [48, 49], который прдусматривал наращивание клеточной биомассы, ее
обработку вначале лизоцимом (30 мин. при комнатной температуре), а потом
щелочным буфером (0,2N NaОН + 1% SDS) в течение 20 мин. и дальнейшую
нейтрализацию суспензии ацетатом калия. Отделение молекул плазмидной
ДНК от РНК осуществляли с помощью 3М LiCl или РНК-зы ("Sigma", США).
Все процедуры саузерн-dot-гибридизации проводили по [48].
Соответствующие аликвоты ДНК (3-5 мкг) в ТЕ-буфере денатурировали
в течение 10 мин. при 100ºС, быстро охлаждали, наносили на нейлоновые
фильтры Hybond N ("Amersham, Great Britain), фиксировали 3-5 мин.
ультрафиолетом (254 нм).
ДНК-зонды метили диоксигенином d UTP (Boehringer Mannheim) по
протоколу этой фирмы.
 Саузерн-гибридизацию осуществляли в течение 18-24 часов при 65ºС в
буфере 5xSSC, 5х раствор Денхардта, 0,2% SDS, 100 мкг/мл
денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтры отмывали при температуре
42ºС впоследовательно в течение 30 мин. в растворах 2xSSC, 1xSSC + 0,2%
SDS, при 60ºС – 0,2хSSC + 0,1% SDS [48].
Процедуры нозерн-dot-гибридизации проводили таким образом. По
рекомендациям [51] аликвоты суммарного препарата РНК (1 мкг, 3 мкг, 10
мкг) растворяли в буфере, содержащем 10xSSC и 18% формальдегида. Для
полной денатурации молекул РНК пробы выдерживали 10 мин. при 65ºС.
Быстро охлаждали на льду и наносили на нейлоновые фильтры Hybond N
("Amersham, Great Britain). Фиксацию препаратов РНК на фильтрах
осуществляли ультрафиолетом (254 нм) в течение 3-5 мин.
В качестве зондов в ДНК-РНК гибридизации использовали
рекомбинантные плазмиды: pВrB3, содержавшая фрагмент гена рибосомной
18S РНК крысы [52]; ETS, в составе которой присутствовал фрагмент гена
рибосомной 18S РНК гороха. ДНК-зонды метили диоксигенином d UTP
(Boehringer Mannheim) по протоколу этой фирмы.
Для гибридизации использовались буферы следующего состава а) 50%
формамид, 750 mM NaCl, 75 mM Na цитрат, 0,2% SDS, 0,1% Na пирофосфат,
1 мг/мл гепарина, 100 мкг/мл тимусной ДНК [51]; б) 5xSSC, 2% blockin'
reagent, 0,1 N – lauroylsarkosin Na, 0,02% SDS (протокол Boehringer
Mannheim). Гибридизацию проводили в течение 18-24 час. при 42ºС.
Фильтры отмывали дважды по 10 мин. в растворе 2xSSC + 0,1% SDS при
37ºС; 15 мин. – в 1xSSC + 0,1% SDS при 37ºС и дважды по 20 мин. в 0,1xSSC
+ 0,1% SDS при 42ºС.
Люминисцентную детекцию проводили с использованием CSPD
(протокол Boehringer Mannheim).
 Подготовленные таким образом фильтры помещали в кассету и
экспонировали на рентгеновскую пленку при комнатной температуре 3-24
часа. Пленки с люминисцентными сигналами сканировали на лазерном
денситометре (LKB Ultrascan Svedrig).
Компьютерную обработку данных проводили с использованием
программы "Scion Image".
Математическую обработку результатов исследований проводили по
методикам Г. Н. Зайцева [48]. Статистические ошибки в результатах опытов
не превышали 5%. В таблицах и рисунках приведены средние значения и
стандартные отклонения.