More acidic activators could

prematurely detritylate phosphoramidite Same-species phosphoramidites couple

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O O
O
O O
HN HN
HN O
O O
N N
N HN
N O N O

Michael Jensen © 2008 O

O
HO
O

+ C+
O
O
N O

O
O
N
N

O O

O O O HN

O N
O P P O P O
O N O N N
O HN N O
O O P O
O
N O

N O
N N N O
HO
O
N
+ A ctiva to r
O
P
N
O

Side Reaction O
P
N
N
Addition (n+1)
Step 2 N
+ A ctiva to r

Coupling NH A

F in al p ro d u ct o f co u plin g step + b y-p ro d u cts

S O
NH N
N
- ++ N B
N P NH
N
O Same-species doublet couples to existing
S
N N 2 O growing oligo chain to generate ‘addition’
H
O HN
product (n+1)
O O
N
O
HN HN O
O N O
N O
N N O
HN

O N O N O N
O S H
O O
O O
+ + O N O
NH N N P N O O O P O
N N 2 C O
N O O O
H N O
NH
O N N NH
N O N
O N N O P O N
O O N N
P O O N N
N O
O N P O
O O
O
O O
O
- O
O O P N
-
+ HN
N N O
O
2 NH NH
2 S O O
N NH
O HN N N N N N O
S N N P O
H O
N N N N N
H
O
N NH N O D
N
N O
N N S O n + 1 M o le cu le o f D N A
N O O N
O S

Step 3
O P
XS NH N
O O
N N N
XS N

O
O
O A ) D iiso p ro p yla m in e , B )
C a p p in g
P N T e tra zo le , u n re a cte d
N NH p h o sp h o ra C ) m id ite a n d
O
N - D ) a ctiva te d
O N N N HN
p h o sp h o ra m id ite
2
P O
O 5' O H o f u n reacted so lid su p p o rt-b o u n d n u cleo tid e is cap p ed o ff fro m
O +
N O fu rth er co u p lin g step s
O
O S
N
NH O
NH N NH N
N N O
N N NH
N N N N
HO N
O Cap B O N
N N N
HO
O O
O O
O

NH O N O
O O
O
Cap A
O
NH

-
Step 1 O O O O

Chemical DNA
O
Deblock O
+
O
O
O H O O
H O O
Cl Cl
Cl O O O
O
O O +
O
N O
-

Synthesis Cycle
N
H

O
O
Cl O
OH
Cl N
Cl NH
Cl Cl O O N
N N N
O
O O
O O A c e tyla te d (c a p p e d nuc le o tid e ) is no
N lo ng e r re a c tive
NH O
N O
N N N H
O NH
O + O
O

O
O O
O
O O
NH HN
O
N

O
O
O
N O

I I Side Reaction
O N
O
Deletion (n-1)
NH H 2O
N NH O N
O O N
N N N
N Cl
N N N C
+
+ O
- O
P O
Cl O
HO Cl O
O
G e n e ra tio n o f (n -1 ) tru n ca te d o lig o n u cle o tid e s
+ O
O

O O
O NH
O
I I
N
O D im e th o xytrityl C a tio n is
NH
S o lid S u p p o rt = C o n tro lle d P o re G la ss (C P G ) b rig h t O ra n g e u se d fo r m e a su rin g O
co u p lin g e fficie n cy

Step 4
Oxidation O
B ase 1
HO
B ase 1

O O
D etritylatio n + D N A exten sio n to sequence completion
n-1 O lig o nuc le o tid e
O O

A ll s te p s a re re p e a te d fo llo w ing d e trityla tio n o f O O O

H2O O B ase 3
a d d itio na l nuc le o tid e until the s e q ue nc e is I
O
Cl c o m p le te I I P O I P
+ O HO
P O O
Cl
OH Cl Cl O + 1 . Inc o m p le te d e trityla tio n 2 . Inc o m p le te C a p p ing
Cl O H2O
O
O
O O
O P O
HN N B ase 1
O N N O
N B ase 2 O

Support-bound O
N O
N O
O
3 . Inc o m p le te O x id a tio n N O
O
Oligonucleotides O
O
O

P O
B ase 1
HO
B ase 1

O O O O O O
N I
NH
O
N N N
N
O P O N N
P O + + O O
N
O P O H O H
O O O H
+
O I
- + N
O + O O
O N
H
NH N N Cl Cl
O
Cl
N A cid cle a ve s w e a k p h o sp h ite
bond

P o s t-s yn th e s is
C le a va g e o f olig o n u c le o tid e fro m s u p p o rt
HO N u c le o tid e d e p ro te c tio n C a p R e m o va l
A

B io lo g ic a lly A va ila b le S in g le -s tra n d e d D N A

G
C

C ya n o e th yl C le a va g e
T

O
A
G

O O
C
T

HN
O
T

HN R N 5'
A

NH
G

N HO
C

N HN R O
A

+ - N N NH2
C

N O NH4 HO NH3
A

N
A

N O
T

O
B as e2 O
G

O
O O O N O
C

O O
O
T

N
NH
A

O N OH
G

N N N O OH
C

O P O B as e1
T

O O P O + -
O NH4 HO
T

O
O
A

O
G

O
C

HO NH2
NH
A

O 3'
N
C

N
N O
A

-
O
T

N O
R O
+ - O
NH4 HO HN + O O
O NH2 H O
O O
O N NH3 O
NH3 HN R
- OH
HO N
O N O NH
O B a se
O O
O N N NH2
NH
NH S ta nd a rd P ro te c ting G ro up s
- O P O
O O O
O
N -
O P O B Z (B e n zo yl): d A , d C O
O O
OH
N
O
O P O + R = NH
H2O NH2 iB (iso b u tyryl): d G N N NH2 O
O -
O
O H2N NH4
+
N +
O + H O
HO
O NH2
NH +

Final Product
N O
O - + R NH2
HO NH4
OH N OH

C leaved O lig o n u cleo tid e