ADN RECOMBINANTE

La recombinación artificial de AND de diferentes organismos ha sido uno de los avances

más espectaculares de la biología molecular.
El “mapeo” de los cromosomas, es decir, la localización exacta de los genes que los
integran; el clonado de genes, esto es, el aislamiento y replicación controlada de un gen
determinado; la transmisión de información genética de una especia a otra, la
amplificación de segmentos del genoma, etc., son logros alcanzados en este campo. Los
métodos básicos utilizados en la recombinación tienen muy extensa aplicación gracias a
que el AND de todos los seres vivientes tiene el mismo patrón general de organización.
El descubrimiento de las endonucleasas de restricción y el conocimiento del mecanismo
de acción y duplicación de plásmidos y virus han sido factores decisivos en el desarrollo
experimental de estas técnicas
Plásmidos
Las bacterias, organismos procariotas, poseen un cromosoma constituido por una gran
molécula de AND circular, en la cual reside prácticamente toda la información genética
necesaria para su funcionamiento normal. En adición, muchas bacterias poseen otras
moléculas de ADN circular llamadas plásmidos. En general los plásmidos contienen
mucho menos información que el cromosoma
Los plásmidos se replican independientemente del ADN cromosomal; la información que
contienen se transmite no solo a las células hijas, sino también a otras bacterias, aun de
diferente especie, por pasaje a través de la membrana externa. Suelen existir varios de
estos plásmidos en una bacteria; algunos contienen genes que confieren resistencia a
antibióticos.
Un plásmido puede ser seccionado en un único sitio por una endonucleasa de restricción
si la secuencia especifica reconocida por la enzima se presenta solo una vez en su
molécula. Se produce apertura del circulo sin fragmentación del mismo.
La Escherichia coli, bacteria saprofita del intestino humano, ha sido una de las más
intensamente utilizadas en los estudios de plásmidos y ADN recombinante

Formación de ADN recombinante

 Para la preparación de ADN recombinante puede utilizarse plásmido tratados con
una endonucleasa de restricción que procede un corte en el ADN circular y
formación de dos extremos adhesivos.
 Con la misma enzima de restricción se trata ADN aislado de un organismo
“donante”. El ADN es seccionado en todos los sitios en donde exista la secuencia
de bases especifica de la endonucleasa. Se generan de este modo múltiples
fragmentos con extremos adhesivos.
  Se mezcla el ADN segmentado con los plásmidos abiertos y, gracias a la adhesión
de los extremos complementarios, se produce entonces la inserción del segmento
“foráneo” en la
 abertura producida en el plásmido. La unión entre las hebras de ambos ADN se
efectúa mediante ADN ligasas.
 El nuevo ADN recombinante circular se agrega a un cultivo de E. coli en presencia
de CaCl2 que permeabiliza la pared bacteriana.
 Las bacterias captan la nueva información genética, la replican y sintetizan las
proteínas codificadas en el trozo de ADN introducido.
 En los plásmidos se pueden insertar segmentos de ADN de hasta tres mil pares de
bases.
 Si se usa ADN de bacteriófagos como receptor del ADN foráneo, el ADN
recombinante puede ser “empaquetado” en la cubierta del fago si se lo mezcla con
las proteínas del virus. Estas se ensamblan espontáneamente in vitro y generan
partículas completas del fago, con capacidad para infectar E. coli e introducirle el
ADN recombinante.
 Para segmentos aún mayores se utilizan cósmidos, híbridos entre plásmidos y
fago lambda que contienen solo una pequeña parte del ADN del fago.
 Porciones genómicas más grandes han sido incorporadas en Sacaromyces
cerevisiae, ensamblando cromosomas artificiales de levadura que se replican en
cada ciclo de división.
La transferasa terminal
 Cataliza la adición sucesiva de nucleótidos por uniones fosfodiester al extremo 3’
de las cadenas de ADN.
 Emplea indistintamente dATP, dGTP, dTTP o dCTP y no requiere molde para el
ensamble.
 Permite construir extremos adhesivos en trozos de ADN cuyas dos hebras hayan
sido cortadas al mismo nivel.
 Al ADN “donante” se agregan, en los extremos 3’ de sus dos hebras, colas
formadas por un solo tipo de nucleótido. Por ejemplo, si se suministra solo dATP
como sustrato precursor, la transferasa terminal forma, a continuación de los
extremos 3’, cadenas constituidas exclusivamente por nucleótidos de adenina (Poli
A). Si el ADN del vector es tratado con transferasa terminal, con dTTP como
precursor, se formarán en los extremos 3’ sendas colas de poli T. “Donante” y
“receptor” poseen ahora extremos adhesivos, complementarios, que se aparearan
cuando ambos sean mezclados.
 Finalmente, la unión entre las hebras de los ADN adosados se obtiene por acción
de ADN ligasa.
 Con esta técnica se pueden asociar ácidos desoxirribonucleicos de muy diversa
procedencia.
Ingeniería genética
La transferencia de ADN permite introducir en una célula información genética que le
confiere nuevas propiedades.
Ejemplo
  Obtener bacterias que sintetizan proteínas de uso terapéutico a escala industrial
 Mejorar la capacidad de organismo animales o vegetales para producir alimentos.

Aplicación de técnicas de ADN recombinante

Producción de proteínas de uso terapéutico
La introducción en bacterias de información genética para elaborar proteínas humanas
tiene ya un importante desarrollo industrial. Se producen en cantidad proteínas de uso
terapéutico entre ella insulina, hormona de crecimiento, interferón, eritropoyetina, factor
VIII, interlequinas y factores estimulantes del crecimiento de colonias.
Producción de Vacunas
Tradicionalmente las vacunas se laboraban con agentes infecciosos muertos o atenuados
por distintos medios. El sistema inmune responde a proteínas antígenas de esos agentes
infecciosos con la producción de anticuerpos. La obtención de antígenos por técnicas de
ADN recombinante elimina los riesgos de las anteriores vacunas, pues permite suministrar
solo la proteína antígena, libre del agente infeccioso. La primera vacuna de este tipo en
uso es la de hepatitis B.
Terapia Génica
La introducción de genes normales en células con genes defectuosos.
Ejemplo
 Se incorporó in vitro el gen que codifica hipoxantina-guanina-fosforribosil
transferasa en células de T. conjuntivo de pacientes con enfermedad de Lesch-
Nyhan, carentes de esa enzima. Dichas células, en cultivo, son así “curadas” de su
defecto.
 Se realizó pruebas en pacientes con inmunodeficiencia severa combinada a los
cuales se les introdujo el gen normal de adenosina desaminasa en células de
medula ósea.
 La transferencia de genes a células somáticas corrige el defecto solo en el tejido
tratado.
 Las células germinales no son modificadas, eventualmente podría alcanzarse la
curación clínica, pero el individuo sigue transmitiendo la alteración a su
descendencia.
 Animales transgénicos: Son animales de laboratorio en los cuales se realiza la
transferencia de genes foráneos a pronúcleos de huevos fertilizados. Estos son
implantados en el útero de un animal receptor, donde se desarrollan individuos
que expresan el gen insertado.