8/21/2015

CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN

Se refiere a los procesos (conjunto de métodos)

empleados para crear copias idénticas de
fragmentos de ADN, copias idénticas de células o
copias idénticas de organismos

Se pueden clonar organismos

células
moléculas de ADN

CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos que

permiten identificar y purificar un fragmento de
ADN particular a partir de una mezcla compleja
de ADN, y luego reproducirlo en grandes
cantidades.

¿PARA QUÉ CLONAR ADN?

 Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos

de un gen específico
Identificar y analizar las secuencias reguladoras
que controlan la expresión (promotor) de un gen
Investigar la función de proteína/enzima/RNA
Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con
alguna patología de origen genético)

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CLONADO MOLECULAR

PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR

Obtención del ADN a clonar

 Elección de la fuente de ADN y de la metodología para
obtenerlo
 Purificación del ADN
 Digestión con las enzimas de restricción apropiadas

Obtención del vector

 Elección del vector apropiado
 Digestión del vector

Ligación
Introducción de la molécula de ADN recombinante
en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN)
 Identificación de las células que contienen el ADN
recombinante (SELECCIÓN)

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La estrategia depende tanto de la información de

partida como del objetivo final de mi clonado

¿Con qué información cuento antes de empezar?

- Secuencia de la proteína
- Ubicación en el genoma (positional cloning)
- Secuencia del mRNA
- Bibliotecas de cDNA o genómica
- Secuencias de ADN desconocidas o conocidas
- Producto de PCR

¿Cuál es la fuente del ADN?

-ADN (cromosomal, bibliotecas, etc)

-ARN
-PCR

Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca

(teniendo información de la secuencia de ADN)

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Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca

(teniendo información de proteína/anticuerpos)

Amplificación de secuencias de ADN por PCR

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Amplificación de secuencias de ADN por

PCR introduciendo sitios de restricción

Mediante el diseño
apropiado de los oligos
empleados para la
amplificación por PCR, se
pueden introducir los
sitios de reconocimiento
para las enzimas de
restricción necesarios
para el posterior clonado.

Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o

parcialmente desconocidas por PCR

No siempre conozco la secuencia completa que

quiero amplificar como para poder diseñar
oligonucleótidos específicos. Hay estrategias
para poder hacerlo (se verán en detalle en la
clase de PCR II):

- RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends):

Puede ser tanto 5´como 3´.
- PCR inversa
- Uso de oligonucleótidos degenerados

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RT-PCR:
Amplificación por
PCR cuando el
material de
partida es ARNm.

Trascripción
Reversa (RT)
seguida de PCR

CLONAR/AMPLIFICAR

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VECTORES
La elección del vector depende de:
 Tamaño del inserto
 Tamaño del vector
 Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
 Número de copias
 Eficiencia del método de transformación
 Qué tipo de experimentos se realizarán con el
inserto clonado:
1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos
de DNA
2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes
clonados
3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de
promotores y secuencias regulatorias de la expresión
génica

HERRAMIENTAS NECESARIAS PARA CLONAR

 Enzimas de restricción
 Vectores
 ADN Ligasa
 Células huésped
 Método de transformación
 Otras enzimas:

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OTRAS ENZIMAS

Removes phosphate groups from 5' ends of

Alkaline phosphatase
DNA ligase
DNA polymerase I
Exonuclease III
Polynucleotide kinase
RNase A
Taq DNA polymerase
DNA (prevents unwanted re-ligation of cut
DNA)
Joins compatible ends of DNA fragments
(blunt/blunt or complementary cohesive
ends). Uses ATP
Synthesises DNA complementary to a DNA
template in the 5'-to-3'direction. Starts
from an oligonucleotide primer with a 3' OH
end
Digests nucleotides progressiviely from a
DNA strand in the 3' -to-5' direction
Adds a phosphate group to the 5' end of
double- or single-stranded DNA or RNA.
Uses ATP
Nuclease which digests RNA, not DNA
Heat-stable DNA polymerase isolated from
a thermostable microbe (Thermus
aquaticus)

DIGESTIÓN DEL INSERTO Y DEL VECTOR

 Antes de realizar la ligación, el fragmento de

ADN que se quiere clonar y el vector donde se
va a insertar deben ser digeridos con enzimas
de restricción.
 La elección de las enzimas está relacionada
con la estrategia diseñada: vector elegido,
procedencia del inserto, etc.
 Es importante considerar la posibilidad de
modificar los extremos generados luego del
corte.

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Extremo 5´protruding

• 5' overhangs: La enzima corta asimétricamente

dentro del sitio de reconocimiento, generando un
extremo 5´saliente (protruding) simple hebra.
• Ej: Bam HI genera un extremo de este tipo al
digerir el ADN.

Extremo 3´protruding

• 3' overhangs: La enzima corta asimétricamente

dentro del sitio de reconocimiento, generando un
extremo 3´saliente (protruding) simple hebra.
• Ej: Kpn I genera un extremo de este tipo al digerir
el ADN.

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Extremos romos

• Romo (Blunt): La enzima corta las dos hebras del

ADN en sitios exactamente opuestos, generando
extremos romos, sin ninguna base saliente.
• SmaI genera un extremo de este tipo al digerir el
ADN.

Convertir un extremo 5’ protruding en romo

• Se pueden usar las

enzimas Klenow o T4
DNA polimerasa para
rellenar con dNTPs los
extremos salientes.
• Se usa para ligar
fragmentos que poseen
extremos que so son
compatibles.

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Convertir un extremo 3’ protruding en romo

• La enzima T4 DNA polimerasa tiene actividad

3’-5’ exonucleasa.
• En presencia de dNTPs en exceso, convierte
un extremo 3´saliente en romo.

LIGACIÓN

DIGESTION DEL INSERTO DIGESTION DEL VECTOR

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LIGACIÓN

La DNA Ligasa puede unir extremos romos

Fragmentos de ADN con extremos romos generados
por la misma enzima o por diferentes enzimas pueden
ser ligados. Si se ligan fragmentos provenientes de la
digestión con distintas enzimas, no se regenera
ninguno de los dos sitios originales.

• SmaI -CCC GGG- -CCCGGG-

-AAATTT-
• DraI -AAA TTT- -CCCTTT-
-AAAGGG-

• Las ligaciones que reconstituyen los sitios (CCCGGG or 
AAATTT) pueden ser re‐digeridas con estas enzimas
• Los productos de ligación mixtos (CCCTTT + AAAGGG) no 
pueden ser re‐digeridos.

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Cualquier extremo complementario puede

ser ligado, aún si provienen de la
digestión con dos enzimas diferentes

• BamHI -G GATCC-
-CCTAG
G-

• BglII -A GATCT-
-TCTAG A-

• Resultado -GGATCT- La secuencia regenerada ya

-CCTAGA- no es más palindrómica y no
puede ser digerida ni por
BamHI or BglII

FOSFATASA ALCALINA

• La Fosfatasa alcalina
remueve el grupo 5'
fosfato del ADN y
ARN. Es activa a PH
alcalino

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FOSFATASA ALCALINA

• ¿Para qué se usa en el clonado molecular?

Para remover los grupos 5' fosfato de los

vectores que han sido digeridos con enzimas
de restricción, lo que previene la capacidad
de re-ligarse de los vectores. Esto facilita la
capacidad de ligación a otros fragmentos de
ADN digeridos. Especialmente útil cuando se
hace la digestión con una sola enzima.

FOSFATASA ALCALINA

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LIGACIÓN

Extremos del DNA Requerimientos Comentarios

Romo (blunt) Alta concentración de DNAs Se obtienen muchos clones

y ligasa no-recombinantes. Los sitios
pueden ser eliminados.
Clonado de copias en tandem

Extremos salientes Se obtienen muchos clones

diferentes recombinantes. Se conservan
los sitios. Clonado
direccional.

Extremos salientes iguales Tratamiento del vector con Se conservan los sitios.
fosfatasa alcalina Clonado no-direccional.
Clonado de copias en tandem

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