Вы находитесь на странице: 1из 7

I S S N 0 2 3 3 - 7 6 5 7 . Биополимеры и клетка. 1996. Т. 12.

№ 3

Изучение возможности применения гравиметрического


преобразователя для создания биосенсоров
1 1
С. В. П а ц к о в с к и й * , А. П . С о л д а т к и н , А. В. Е л ь с к а я

Киевский университет им. Тараса Шевченко


252017 Киев, ул. Владимирская, 64

и н с т и т у т молекулярной биологии и генетики НАН Украины


2 5 2 1 4 3 Киев, ул. Академика Заболотного, 150

. ш——
В работе рассмотрены несколько различных подходов к использованию гравимет­
рических преобразователей на основе кристалла кварца в плане создания иммун­
ных и хемо-биосенсоров. Исследованы условия работы пьезокристаллов в раство­
рах и предложены практические схемы генераторов, позволяющие работать в
средах с повышенной вязкостью. Показаны преимущества резонансного метода
проведения гравиметрических измерений при работе в проточной системе. Об­
суждены результаты, полученные при выполнении модельных экспериментов, и
подтверждена перспективность развития данного метода для создания иммуно­
сенсоров.

Введение. Схематически хемо-биосенсоры являются относительно простыми


и з м е р и т е л ь н ы м и приборами, включающими в себя активный чувствитель­
ный м а т е р и а л и преобразователь. Сравнительная дешевизна, экспрессность
и селективность проводимых с помощью сенсоров анализов ставят их в один
ряд с общеприменимыми биохимическими методами, а создание м а л о р а з ­
мерных сенсоров (при использовании микроэлектронной технологии) делает
возможным широкое применение анализов in vivo. Н а практике исследова­
тели продолжают поиски оптимальной комбинации активное вещество
(ферменты, а н т и т е л а , антигены, бактерии, к л е т к и , различные типы пол­
имеров) — и преобразователь (ионоселективные электроды, кондуктометри-
ческие, магнитные, оптические сенсоры). Необходимость повышения чувст­
вительности преобразователей, чаще всего используемых при создании
потенциометрических и емкостных иммуносенсоров, определила особое
в н и м а н и е к другим типам трансдъюсеров, в том числе и к гравиметрическим
сенсорам на основе пьезоэлектрических кристаллов.
О т к р ы т и е пьезоэлектричества относится к 1880 году, когда Ж а к и Пьер
К ю р и исследовали механические характеристики кристалла кварца под
воздействием н а п р я ж е н и я . В последующем было открыто множество пьезо­
э л е к т р и ч е с к и х материалов, среди которых кристалл кварца по чувствитель­
ности з а н и м а е т далеко не первое место. Но относительная дешевизна
производства, простота технологии и приемлемые физические х а р а к т е р и ­
стики к в а р ц а «АТ» среза обусловливают широкое использование кристаллов
к в а р ц а (в основном к а к газовых сенсоров) в различных отраслях н а у к и и
промышленности [ 1 — 3 ] . Ц е л ь ю данной работы является исследование
•Correspondence address.

© С. В. ПАЦКОВСКИЙ, А П. СОЛДАТКИН, А. В ЕЛЬСКАЯ, 1996

34
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЯ ДЛЯ БИОСЕНСОРОВ

возможности использования пьезокристалла кварца в растворах к а к грави­


метрического сенсора, а т а к ж е создание методик и установок, позволяющих
разрабатывать на этой основе различные типы химических и биологических
сенсоров. Особенное внимание уделяется вопросу разработки системы для
создания гравиметрического иммуносенсора.
М а т е р и а л ы и методы. В работе использовали промышленные к в а р ц е ­
вые структуры ф и р м ы «Filips» с различными основными частотами: 6, 9 и
10 МГц. Д л я работы в растворах в качестве материала электрода кварца в
основном применяли золото и в некоторых случаях — серебро. Резонансная
частота колебаний пьезокристалла кварца изменяется вследствие адсорбции
вещества на поверхность электрода кристалла, поэтому ее измерение и
составляет основу работы гравиметрического сенсора. Зависимость частоты
от сорбируемой массы может быть выражена уравнением

где AF — изменение частоты; F — основная частота кристалла; Am —


b

масса, адсорбируемая на поверхности на единицу площади электрода [4 ].


Чувствительность метода очень высокая, уменьшение частоты на 1 Гц
2
соответствует адсорбируемой массе 5,46 н г / с м при основной частоте
кристалла 9 МГц. С другой стороны, в а ж н у ю роль играет простота создания
колебательных контуров на основе кристалла кварца и высокая точность
существующих методов измерения частоты. Вследствие этого гравиметриче­
ский метод получил большое распространение при а н а л и з е состава газовых
смесей. Однако при проведении гравиметрического а н а л и з а в жидкости,
когда кристалл погружен в раствор, частота колебаний существенно зависит
от природы исследуемой среды. Учет факторов, определяющих в данном
случае частоту, важен с точки зрения как понимания механизма колебания
кристалла в жидкости, т а к и возможности практического п р и м е н е н и я
гравиметрических методов при создании сенсоров для проведения а н а л и з о в
в жидкости. Б р у к е н ш т е й н и Ш е й [5 ] предложили следующее уравнение д л я
описания колебаний кристалла кварца в растворах:

Здесь 7j — вязкость жидкости; р — плотность раствора и п — число поверх­


ностей кристалла, контактирующего с раствором.
Н а рис. 1 показана стандартная эквивалентная цепь пьезокристалла
к в а р ц а , на рис. 2 — зависимость спектра проводимости от характеристик

Рис. і . АТ-резонатор, стандартная эквивалентная цепь


Рис. 2. Типичный спектр проводимости для пьезокристалла кварца: 1 — в бидистиллированной
воде; 2 — на воздухе
ПАІЖОВСКЛЙ С В. И ДР.

о к р у ж а ю щ е й среды, в данном случае при измерении на воздухе и в


бидистиллированной воде. Можно отметить существенное смещение м а к с и ­
мальной а м п л и т у д ы резонансной кривой как по частоте, так и по абсолют­
ной в е л и ч и н е , что в конечном счете приводит к понижению добротности
колебательного контура на основе кварца. Как следствие вышеизложенного,
оказалось, что схемотехнические решения генераторов, используемые для
и з м е р е н и я резонансной частоты при анализе в газовых средах, в растворах
н е п р и м е н и м ы , тем более для случая проводящих растворов при п=2 [6 ].
Одним довольно э ф ф е к т и в н ы м и простым решением данной проблемы
является измерение электромеханических параметров кристалла кварца на
воздухе до и после модификации поверхности пьезокристалла, проведенной
в жидкости. Д а н н ы й принцип применен при разработке прототипа грави­
метрического иммуносенсора. В. эксперименте использовали кристалл к в а р ­
ца с основной рабочей частотой 10 МГц и диаметром золотого электрода
3 мм. Первоначально золотой электрод промывали в 95 % - м растворе
этанола, затем в бидистиллированой воде и высушивали при температуре
200 °С в инертной атмосфере.
Непосредственно после очистки кристалл погружали в 50 мМ к а л и й -
ф о с ф а т н ы й б у ф е р , содержащий 0,5 м г / м л протеина А на 2 ч для сорбции
белка на поверхности электрода. Последующую промывку проводили в
ф о с ф а т н о м буфере, рН 7,4, а затем в том ж е буфере, содержащем 5 % БСА,
для блокировки неспецифических центров связывания рабочей поверхности.
В д а л ь н е й ш е м эксперимент развивался по двум направлениям. В первом
случае после высушивания измеряли основную частоту резонанса и м а к с и ­
м а л ь н у ю амплитуду резонансной кривой. Во втором случае кристалл кварца
п о м е щ а л и в раствор, содержащий 10 м к г / м л IgG кролика, на 1 ч и после
промывки и высушивания регистрировали характеристики пьезокристалла.
П о л у ч е н н ы е результаты представлены на рис. 3. Средняя величина сдвига
резонансной частоты составила около 108 Гц, а уменьшение максимальлной
1
а м п л и т у д ы резонансной кривой произошло на 4,9 Ом" . Несмотря на
высокую чувствительность и экономичность, данный метод не является
о п т и м а л ь н ы м , поскольку не позволяет осуществлять непрерывные и з м е р е ­
н и я в растворах и, следовательно, исследовать кинетические характеристи­
ки прохождения биохимических реакций. Д л я иммуносенсоров это особенно
а к т у а л ь н о , т а к к а к достижение равновесного состояния в процессе образо­
в а н и я комплекса антиген — антитело происходит за часы, а измерением
начального участка кинетической кривой можно повысить на порядки
экспрессность метода.
Д л я р е ш е н и я этой проблемы в лаборатории были рассчитаны схемы,
п о з в о л я ю щ и е получать стабильную частоту и устойчивую работу в средах

Рис. 3. Гравиметрические измерения системы протеин А — IgG кролика на воздухе: 1—


измерение параметров пьезокристалла с поверхностью электрода, модифицированного протеи­
ном А; 2 — после прохождения взаимодействия протеин А — IgG кролика (а — измерение
основной частоты; б — измерение максимальной амплитуды резонансной кривой)

36
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЯ ДЛЯ БИОСЕНСОРОВ

с повышенными к о э ф ф и ц и е н т а м и вязкости и при этом достаточно простые


для повторения и использования в биолабораториях (рис. 4 ) .

Рис. 4. Схемы кварцевых генераторов, позволяющие работать в средах с повышенной


вязкостью

Поскольку для возбуждения кристалла кварца используются м е т а л л и ­


ческие электроды (серебро, золото, рис. 5 ) , то при работе в проводящих
растворах (например, при создании иммунобиосенсоров) появляется с у щ е ­
ственная п а р а з и т н а я емкость Ср (см. рис. 1), резко у м е н ь ш а ю щ а я доброт­
ность системы. Н а рис. 5 изображены два способа з а к р ы в а н и я нерабочей
стороны кварца, устраняющие электрический контакт между электродами и
при этом сохраняющие относительную механическую «свободу» колебаний.
В первом случае применяли химически неактивную полимерную п л е н к у ,
которая с помощью герметика закрывала один из электродов кварца. П р и
этом необходимо отсутствие механического контакта между пленкой и
поверхностью электрода. В противном случае резкое ухудшение э л е к т р о м е ­
ханических характеристик делает невозможной работу кристалла в жидкой
среде. Другой, более перспективный метод, заключается в создании с п е ц и -

Рис. 5. Применение пьезокристалла кварца в растворах с повышенной проводимостью: а, б —


в непроточной и проточной системах соответственно

37
~ПА1ЖОВСКИЙ с. в И ДР.

альной системы, позволяющей производить оперативную смену пьезокри-


сталлов, а т а к ж е работать в режиме проточной системы (рис. 5, б).
Т е м не м е н е е , ' следует отметить, что в каждом конкретном случае
работы над созданием сенсоров для анализа в жидкостях на основе грави­
метрического метода необходимы либо соответствующая модификация и
подстройка схемы генератора, либо применение других подходов измерения
характеристик пьезокристаллов [7]. Одним из таких подходов является
резонансный метод. В данном случае с помощью фазочувствительных
нановольтметров измеряются параметры эквивалентной цепи пьезокристал­
л а (в частности, проводимость) при сканировании частоты прикладываемого
н а п р я ж е н и я (см. рис. 2 ) . Компьютерная обработка получаемой резонансной
кривой позволяет в ходе эксперимента рассчитывать как дрейф основной
резонансной частоты кристалла, так и изменение максимальной амплитуды
сигнала, которая в некоторых случаях является основным информационным
откликом системы.
Приведеннук) методику вместе с традиционной (измерение резонансной
частоты) применяли при исследовании прохождения неспецифической сор­
бции БСА на поверхности золотого электрода пьезокристалла (рис. 5, а ) .
Временные зависимости основной частоты кварца и максимальной а м п л и т у ­
ды резонансной кривой показаны на рис. 6. Измерения проводили в 5 мМ

Рис. 6. Гравиметрические
исследования н е с п е ц и ф и ­
ческой сорбции БСА на
поверхность электрода
кварца

н а т р и й - ф о с ф а т н о м буфере при добавлении 1 м г / м л БСА. Р е з у л ь т а т ы


подтверждают высокую чувствительность методов и их перспективность в
п л а н е работы над биоиммуносенсорами при а н а л и з е в жидкостях. С другой
стороны, проведенные измерения показали, что для повышения э ф ф е к т и в ­
ности, с н и ж е н и я трудоемкости в процессе снятия калибровочных кривых, а
т а к ж е д л я возможности работы в составе автоматизированных измеритель­
ных систем необходимо применение проточной системы.
П р о т о ч н а я система, изображенная на рис. 5, б, была использована при
работе над созданием химических сенсоров на органические соединения
(например, хлороформ). При этом изначально поверхность электрода к в а р ­
ца п о к р ы в а л и полимером, способным специфически взаимодействовать с
а н а л и з и р у е м ы м веществом, затем пьезокристалл кварца помещали в про­
т о ч н у ю систему и измеряли резонансные кривые с помощью измерителя
Н Р 4 1 9 . После покрытия полимером поверхности электрода происходил
сдвиг измеренной на воздухе частоты на величину, равную 40 кГц для
6 МГц к в а р ц а . Последующий сдвиг частоты, а т а к ж е максимальной а м п л и ­
туды резонансной кривой наблюдался при помещении кристалла кварца в
проточную систему (рис. 7),
Н а рис. 8 показаны результаты исследования сорбции хлороформа на
поверхность электрода кварца, покрытого полимером. В этом случае и з м е -

Ji:
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЯ ДЛЯ БИОСЕНСОРОВ

Рис. 7. Изменение спектра


проводимости пьезокри-
сталла кварца при покры­
тии электрода полимером
полиэтеруретаном: 1 — и з ­
мерения на воздухе; 2 — в
бидистиллированной воде

Рис. 8. Гравиметрические исследования сорбции хлороформа на поверхности кристалла


кварца, покрытой полимером полиэтеруретаном (концентрационные зависимости: а — макси­
мальной амплитуды резонансной кривой; б — основной частоты кварца)

рение зависимости максимальной амплитуды резонансной кривой от к о н ­


ц е н т р а ц и и субстрата является более эффективным методом, чем измерение
частоты, как по соотношению сигнал — шум, так и по динамическому
диапазону измеряемых концентраций. Поэтому следует отметить, что
применение резонансного метода во многих случаях может быть единствен­
но возможным и удобным вариантом гравиметрических измерений, несмот­
ря на необходимость применения более сложной измерительной а п п а р а т у р ы
и обязательного компьютерного управления сбором и обработкой результа­
тов. А совмещение данного подхода с кинетическим режимом проведения
а н а л и з а (использование проточной системы) дает э ф ф е к т и в н у ю систему для
исследования и разработки различных видов иммуносенсоров.
З а к л ю ч е н и е . В данной работе показано несколько подходов и методов
проведения гравиметрического анализа в жидких средах, которые могут
быть э ф ф е к т и в н о использоваться при создании различных типов биохемо-
сенсоров и иммуносенсоров. Сравнивая полученные гравиметрическим м е ­
тодом результаты с соответствующими результатами, полученными потен-
циометрическим [8 ] и емкостным методами [9 ], можно сделать вывод о
преимуществе и перспективности гравиметрического метода, в особенности
при работе над иммуносенсорами. Актуальность данного метода з а к л ю ч а е т ­
ся еще и в том, что существует целый ряд гравиметрических приборов,

39
ПАНКОВСКИЙ с. В. И ДР.

использующих э ф ф е к т распространения поверхностных акустических волн.


Д а н н ы е преобразователи работают на более высоких частотах (до 1 Г Г ц ) ,
что соответственно повышает и чувствительность метода. В то ж е время
современная микроэлектронная технология позволяет создавать массивы
чувствительных элементов на одной подложке, что дает возможность
реализовать д и ф ф е р е н ц и а л ь н ы й либо мультисенсорный подход для д а л ь н е й ­
шего повышения селективности и чувствительности метода и расширения
области его применения,

С. В. Пацкоеський, О. П. Солдаткін, Г. В. Єльська

Вивчення можливості застосування гравіметричного перетворювача для створення біосенсорів

Резюме

У роботі розглянуто декілька різних підходів щодо використання гравіметричних


перетворювачів на основі кристала кварцу в плані створення імунних та хемо-біосенсорів.
Досліджено умови роботи п'єзокристалів у розчинах та запропоновано практичні схеми
генераторів, що дозволяють працювати в середовищах з підвищеною в'язкістю. Показано
переваги резонансного методу проведення гравіметричних вимірів за роботи у проточній
системі. Обговорено результати, отримані при здійсненні модельних експериментів, і
підтверджено перспективність розвитку даного методу для створення імуносенсорів.

S. V. Patskovsky, A. P. Soldatkin, А. V. El'skaya

Investigation on possibility of gravimetric transducer application for biosensors creation

Summary

Several different approaches using gravimetric transducers based on Quartz crystal for development of
immuno and chemo-biosensors are presented. Conditions for oscillation of piezocrystals in liquids are
discussed and practical oscillator circuits, which ensure work in high viscosity medium are offered. The
resonance method of gravimetrical measurement is shown to be advantageous in solution over the widely
used conventional oscillation method. The results of model experiments confirm perspectivity of this
method development for immunosensors creation.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Guilbault G. G. Application of piezoelectric quartz crystal microbalances.— New York: Elsevier,


1984.—Vol. 7 . — P . 8 — 1 0 .
2. Janata J., Bezegh A. Chemical sensors / / Anal. C h e m . — 1 9 8 8 . — 6 0 . — P . 6 2 .
3. Schierbaum K. D. Gerlach F. Haug A/., Gopel W. Selective detection of organic molecules with
f t

polymer and supramolecular compounds: application of capacitance, quartz microbalance and


calorimetric transducers / / Sensors and Actuators A . — 1 9 9 2 . — 3 1 . — P . 1 3 0 — 1 3 7 .
4. Sauerbrey G. Z. Use of a quartz vibrator for weighing thin films on a microbalance / / Z.
Phyzik.—1959.—155.—P. 206—210.
5. Bruckenstein S. Shay M. Mass sensitivity of the crystal microbalance in liguid media / /
t

Electrochim. A c t a . — 1 9 8 5 . — 2 . — P . 295.
6. Barnes C. Development of quartz crystal oscillators for under-liquid sensing / / Sensors and
Actuators A . — 1 9 9 1 . — P . 5 9 — 6 9 .
7. Kurosawa S. et al Resonant frequency of a piezoelectric quartz crystal in contact with solutions
/ / Anal. chim. a c t a . — 1 9 9 3 . — 2 7 4 . — P . 2 0 9 — 2 1 7 .
8. Schasfoort R. В. M., Bergveld P., Kooyman R. P. Я . , Greve / . Possibilities and limitations of
direct detection of protein charges by means of an immunological field-effect transistor / /
Ibid.—1990.—28.—P. 323—329.
9. Bataillard P. et al Direct detection of immunospecies by capacitance measurements / / Anal.
Chem.—1988.—60.—P. 2374—2379.
удк 541.13:577.004.14 Поступила в редакцию 12.02.96

40'