Patología General Grupo # 10

Universidad Católica de Honduras

Nuestra Señora Reina de la Paz
Campus San Pedro San Pablo

Diagnostico Genético Molecular

Integrantes:

Grupo # 10

Sindy Gabriela Adriano Merino. 1601-1998-00915

Martha Alejandra Fúnez. 0501-1997-07473
Iván Emanuel Caballero Paz. 0501-1999-04833
Julio César Orellana Rodríguez. 0501-1999-04513
Joseph Manuel Morales Ulloa. 0501-1995-07627
José Roberto Rodríguez. 0501-1996-12030

Asignatura:
Patología General

Catedrático:
Dr. Armando Palomo

Sección 1701

San Pedro Sula, Cortés 28 Febrero de 2019 1

Patología General Grupo # 10

Índice

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 3
DESARROLLO DEL TEMA ........................................................................................ 4
DIAGNOSTICO GENÉTICO MOLECULAR ........................................................... 4
Métodos diagnósticos e indicaciones para la realización de pruebas ............................... 4
Consideraciones clínicas................................................................................................... 4
Indicaciones para el análisis de alteraciones genéticas hereditarias ................................. 5
Indicaciones del análisis de alteraciones genéticas adquiridas ......................................... 6
PCR Y DETECCIÓN DE ALTERACIONES EN LA SECUENCIA DEL ADN. .... 7
ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS ALTERACIONES GENÓMICAS ............... 10
Hibridación in situ fluorescente (FISH) ......................................................................... 10
Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MPLA) .......................... 11
Inmunotransferencia de Southern ................................................................................... 12
Tecnología de matrices citogenómicas ........................................................................... 12
Hibridación genómica comparada basada en matrices (CGH de matrices) ................... 12
Matrices de genotipado de SNP (Polimorfismos de un solo Nucleótidos)..................... 13
MARCADORES DE POLIMORFISMOS Y DIAGNÓSTICO MOLECULAR ... 14
Polimorfismos y análisis pangenómico (GWAS) ........................................................... 15
ALTERACIONES EPIGENÉTICAS ......................................................................... 16
ANÁLISIS DEL ARN .................................................................................................. 17
SECUENCIACIÓN DE PRÓXIMA GENERACIÓN............................................... 17
Bioinformática ................................................................................................................ 18
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 20
REFERENCIAS............................................................................................................ 20

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Introducción

En la actualidad se conocen 8.000 enfermedades genéticas monogénicas. La mayoría de

ellas son heterogéneas, por lo que el diagnóstico molecular por técnicas convencionales
de secuenciación suele ser largo y costoso debido al gran número de genes implicados.
El tiempo estimado para el diagnóstico molecular se encuentra entre 1 y 10 años, y este
retraso impide que los pacientes reciban medidas terapéuticas y de rehabilitación
específicas, que sus familiares entren en programas preventivos y que reciban
asesoramiento genético.
Actualmente, el diagnóstico genético es aplicable principalmente a las enfermedades
monogénicas, que son aquellas en las que una mutación patogénica en un único gen (de
unos 25.000 genes que contiene nuestro genoma) es suficiente para causar la enfermedad.
En cambio, las enfermedades poligénicas, también denominadas multifactoriales o
complejas, son causadas tanto por factores genéticos, múltiples variantes de secuencia en
distintos genes que proporcionan un riesgo genético o predisposición a desarrollar la
enfermedad, como por factores ambientales.
La secuenciación masiva está cambiando el modelo de diagnóstico molecular de los
afectos, sin embargo, los médicos y profesionales de la salud se enfrentan al dilema de la
selección del método más eficiente, con el menor coste sanitario y con la mayor precisión
de sus resultados. El objetivo de este trabajo es revisar la tecnología de secuenciación
masiva y definir las ventajas y los problemas en su utilización.

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Desarrollo del tema

Diagnostico Genético Molecular

El naciente campo del diagnóstico molecular comenzó a gestarse en la segunda mitad del
siglo XX, con la aplicación de métodos de bajo rendimiento, como la determinación
convencional del cariotipo para el reconocimiento de los trastornos citogenéticos (p.
ej., el síndrome de Down) y las pruebas basadas en el ADN, como la
inmunotransferencia de Southern para el diagnóstico de la enfermedad de Huntington.

En la actualidad, con la conclusión del Proyecto Genoma Humano y con el desarrollo de

nuevas técnicas, cada vez más potentes, de análisis genético y genómico, los análisis
basados en ácidos nucleicos están empezando a adquirir una función cada vez más
importante en el diagnóstico y tratamiento de numerosas enfermedades.
Las técnicas de diagnóstico molecular han hallado aplicación en virtualmente todas las
áreas de la medicina, y su incorporación es cada vez más acelerada.

Métodos diagnósticos e indicaciones para la realización de pruebas

El número de técnicas y de indicaciones para realizar pruebas diagnósticas de genética

molecular en muestras de pacientes es abrumador, tanto para las anomalías genéticas
hereditarias como adquiridas. La elección de las más adecuadas resulta problemática,
tanto para los patólogos que diseñan las pruebas como para los médicos que necesitan
optar por la prueba óptima para sus pacientes.

Consideraciones clínicas

Desde el punto de vista de las pruebas analíticas, los patólogos se centran en aspectos
como la sensibilidad, especificidad, exactitud y reproducibilidad de los métodos, así como
en factores prácticos, como coste, mano de obra, fiabilidad y tiempo de obtención de
resultados. Para elegir la técnica diagnóstica apropiada, es esencial, en primer lugar,
conocer el espectro de las anomalías genéticas responsables de una enfermedad en la
población de pacientes en estudio.
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Indicaciones para el análisis de alteraciones genéticas hereditarias

Las pruebas para detectar alteraciones hereditarias pueden ser necesarias a cualquier edad,
en función de la presentación clínica, aunque, en general, la mayoría se efectúan en los
períodos prenatales o posnatal y en la infancia.

Las pruebas prenatales han de plantearse en todos los fetos con riesgo de anomalía
citogenética. Posibles indicaciones son:
 Edad avanzada de la madre.
 Progenitor portador conocido de un reordenamiento cromosómico equilibrado (ya que
ello aumenta sensiblemente la frecuencia de la segregación cromosómica anómala
durante la meiosis y el riesgo de aneuploidía en el óvulo fecundado).
 Anomalías fetales observadas en la ecografía.
 Pruebas sanguíneas de rutina maternas que indiquen riesgo aumentado de síndrome de
Down u otra trisomía.

Las pruebas prenatales también se han de considerar en niños con riesgo conocido de
otros trastornos genéticos (p. ej., fibrosis quística, atrofia muscular espinal), utilizando un
análisis dirigido basado en mutaciones o antecedentes familiares.
Más allá de las pruebas prenatales, los padres con riesgo conocido de tener un hijo con
trastornos genéticos pueden optar por las pruebas genéticas en embriones concebidos in
vitro antes de la implantación uterina, eliminando la posibilidad de transmisión
generacional de una enfermedad familiar.

En recién nacidos o niños, las indicaciones pueden ser las siguientes:

 Malformaciones congénitas múltiples.
 Sospecha de un síndrome metabólico.
 Retraso mental y/o retraso del desarrollo no explicados.
 Sospecha de aneuploidía (p. ej., rasgos de síndrome de Down) u otra
anomalía cromosómica sindrómica (p. ej., deleciones, inversiones).
 Sospecha de enfermedad monogénicas, previamente descrita o desconocida.

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Lógicamente, en pacientes de más edad, las pruebas se orientan hacia las enfermedades
genéticas que se manifiestan en épocas tardías de la vida. También en este caso, las
posibilidades son muchas, aunque entre las indicaciones más comunes cabe citar las
siguientes:

Síndromes de cáncer
hereditario Enfermedades monogénicas
en función de antecedentes atípicamente leves
familiares o de una (p. ej., fibrosis quística
presentación de cáncer atenuada).
inhabitual).

Trastornos
neurodegenerativos
enfermedad de Alzheimer
familiar, enfermedad de
Huntington).

Indicaciones del análisis de alteraciones genéticas adquiridas

En estos tiempos de tratamientos dirigidos de forma molecular, cada vez resulta más
importante identificar las secuencias de ácidos nucleicos o las aberraciones que son
específicas de trastornos adquiridos (p. ej., cáncer o enfermedad infecciosas).

El abordaje técnico es similar al empleado en los trastornos mendelianos en línea

germinal, y las indicaciones más frecuentes son:
Diagnóstico y tratamiento del cáncer
 Detección de mutaciones específicas adquiridas en el tumor y de alteraciones
citogenéticas específicas de algunos tumores (p. ej., fusión de genes BCR-ABL en la
leucemia mieloide crónica [LMC]).
 Determinación de la clonalidad como indicador de origen neoplásico de una lesión.
 Identificación de alteraciones genéticas específicas que pueden orientar las decisiones
terapéuticas directas (p. ej., amplificación de HER2 [nombre oficial, ERBB2] en el
cáncer de mama o mutaciones de EGFR [nombre oficial, ERBB1] en el carcinoma
pulmonar). 6
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 Determinación de la eficacia del tratamiento (p. ej., aplicación de la PCR para detectar
una enfermedad mínima residual en casos de LMC con BCR-ABL).
 Detección de mutaciones secundarias resistentes a fármacos en neoplasias malignas
tratadas con tratamientos individualizados genéticamente.
 Diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas
 Detección de material genético específico de un microorganismo para el diagnóstico
definitivo (p. ej., VIH, micobacterias, virus del papiloma humano, virus del herpes en
el sistema nervioso central).
 Identificación de alteraciones genéticas específicas en el genoma de los microbios
asociadas a resistencias farmacológicas.
 Determinación de la eficacia del tratamiento (p. ej., medida de la carga vírica en la
infección por el VIH, el virus de Epstein-Barr y el virus de la hepatitis C).

PCR y detección de alteraciones en la secuencia

del ADN.

Base del diagnóstico molecular en las últimas décadas: El análisis mediante PCR,
que implica síntesis de fragmentos de ADN relativamente cortos a partir de una plantilla
de ADN.

Se usan polimerasas de ADN termoestables adecuadas y ciclado térmico, el ADN diana

situado entre dos sitios cebadores designados, se amplifica exponencialmente a partir de
una secuencia tan reducida, simplificando de modo sustancial el análisis de la secuencia
secundario.

Opciones para el análisis de la secuencia secundario

 Secuenciación de Sanger
 Pirósecuenciación
 Extensión del cebador de una base
 Análisis de longitud de fragmentos de restricción.
 Análisis de longitud del amplicón
 Pcr en tiempo real
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Secuenciación de Sanger

El ADN amplificado se combina con:

 una ADN polimerasa

 un cebador de ADN
 nucleótidos y cuatro nucleótidos terminales. Señalados con diferentes
marcadores fluorescentes.
 Luego se produce una serie de moléculas de ADN de todas las longitudes
posibles.
 Después de la separación de tamaños por electroforesis capilar, la secuencia
exacta es «leída» y comparada con la secuencia normal, para la detección de
mutaciones.
 Es importante para el análisis de genes largos o múltiples.

Pirósecuenciación
 Esta técnica tiene la ventaja de que libera pirofosfato cuando un nucleótido se
incorpora a una cadena de ADN en desarrollo.
 Se efectúa en productos de PCR utilizando un único cebador de secuenciación,
en la reacción participan nucleótidos cicladores individuales, uno a la vez.
 Si uno o más nucleótidos se incorporan a la cadena de ADN creciente, se libera
pirofosfato luego interviene la luciferasa, productora de luz, medida con un
fotodetector.
 Puede llegar a detectar el 5% de los alelos mutados en un contexto de alelos
normales
 se utiliza en análisis de ADN obtenido de biopsias de cáncer.

Extensión del cebador de una base

 Útil para identificar mutaciones en una posición nucleotídica específica.

 esta técnica es muy sensible, detectando hasta el 1 o 2 % de los alelos mutados,
 desventaja: produce solamente un par de bases de datos secuenciados.

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Análisis de longitud de fragmentos de restricción

 Ventaja: digestión de ADN con ENDONUCLEASAS, conocidas como

enzimas de restricción, que reconocen y cortan el ADN en secuencias
específicas.
 es útil para el diagnóstico molecular cuando la mutación causal se registra en
una posición nucleotídica invariable.
 Mecanismo: Si se sabe que la mutación específica afecta a un sitio de
restricción, el producto de la PCR amplificado puede ser digerido, y los
productos de PCR normal y mutante generarán fragmentos que se identifican
como bandas distintas en la electroforesis.
Análisis de longitud del amplicón.

 Las mutaciones que afectan a la longitud del ADN como deleciones o

expansiones, pueden detectarse fácilmente mediante PCR.
 varias enfermedades, como el síndrome del cromosoma X frágil, se asocian a
alteraciones en las repeticiones de trinucleótidos.
 Inconveniente es que esta técnica no funciona si la expansión de repeticiones
nucleotídicas es tan grande que supera la capacidad de amplificación de la PCR
convencional, situación frecuente en trastornos por repeticiones de
trinucleótidos.
 En tal caso, debe efectuarse un análisis de inmunotransferencia de Southern
PCR en tiempo real

 Se emplean indicadores fluoróforos permiten detectar y cuantificar la

presencia de determinadas secuencias de ácidos nucleicos en «tiempo real»
 Se emplea: para valorar la frecuencia de células cancerosas portadoras de
lesiones genéticas características en sangre o tejidos, o la carga infecciosa de
ciertos virus.
 También se usa para detectar mutaciones puntuales somáticas en oncogenes
como el KRAS o el BRAF, aplicación en la que se cuenta con la ventaja de
evitar el análisis tras la PCR.

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Análisis molecular de las alteraciones genómicas

Tales alteraciones genómicas son susceptibles de estudio mediante diversas técnicas de

hibridación.
Un significativo número de lesiones se asocian a grandes deleciones, duplicaciones o
reordenamientos más complejos, que no son fáciles de analizar con los métodos de PCR
estándar.
Hibridación in situ fluorescente (FISH)

La FISH emplea sondas de ADN que reconocen secuencias específicas frente a

regiones particulares del cromosoma.
Los insertos de ADN humano en estos clones constan de entre 100.000 y 200.000 pares
de bases.
Estos clones del ADN se marcan con colorantes fluorescentes y se aplican sobre
extensiones de metafases o núcleos en interfase, pre tratados para «mezclar» el ADN
genómico.
La sonda se híbrida con su secuencia genómica homologa y, de este modo, marca una
región cromosómica específica, que se visualiza con un microscopio de fluorescencia.
Se utiliza para ciertos diagnósticos como:
Si se trata a un paciente con leucemia mieloide aguda con ácido retinoico, que solo resulta
eficaz para un subtipo específico de esta leucemia, que tiene una translocación
cromosómica que implica al gen del receptor del ácido retinoico.
 Se ha empleado, asimismo para:
- Detectar alteraciones numéricas en los cromosomas (aneuploidía).
- También para demostrar microdeleciones sutiles.
- En translocaciones complejas no detectadas en un
cariotipado convencional.
- También se aplica para el análisis de
amplificación génica.

La FISH se realiza sobre muestras prenatales, en células

de sangre periférica, en citologías por impronta de
biopsias de cáncer e incluso en tejidos de archivo.

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La pintura cromosómica es una ampliación de la FISH, en la que se preparan sondas

para cromosomas completos.
Esta limitación se ha superado mediante la introducción del cariotipado espectral
(llamado también FISH multicolor).
El uso de diferentes combinaciones de cinco fluorocromos en sondas específicas de cada
cromosoma permite la visualización de todo el genoma humano.
Es tan potente que se podría muy bien llamar cariotipado espectacular.
El número de cromosomas que se detectan simultáneamente con este sistema es limitado
por la disponibilidad de colorantes fluorescentes que emitan distintas longitudes de onda
de luz visible.
El cariotipado espectral es tan potente que se podría muy bien llamar cariotipado
espectacular.
Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MPLA)

La MPLA combina la hibridación de ADN, el ligamiento de ADN y la amplificación por

PCR para detectar deleciones y duplicaciones de cualquier tamaño.
I. Incluidas las anomalías excesivamente grandes para ser detectadas por PCR.
II. Las demasiado pequeñas para ser identificadas mediante FISH.
Una vez enlazadas, las sondas quedan unidas covalentemente a través de una reacción de
ligasa.
Las sondas también contienen secuencias adicionales en sus extremos, utilizadas como
secuencias cebadoras en una PCR.
Las sondas así ligadas generan una plantilla, que puede ser amplificada mediante PCR.
Dado que implica la amplificación de la PCR, la MLPA puede efectuarse con cantidades
muy pequeñas de ADN genómico.

En la Fibrosis Quística un juego de sondas para MPLA que cubra los coordinados
genómicos correspondientes a cada uno de los 27 exones del gen CFTR puede detectar
fácilmente las deleciones que afectan a uno o más exones.

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Inmunotransferencia de Southern

Los cambios en la estructura de loci específicos se pueden detectar mediante

inmunotransferencia de Southern.
Que consiste en:
 La hibridación de sondas radiomarcadas específicas para una secuencia con el
ADN genómico que se digiere previamente con enzimas de restricción
 Se separa mediante electroforesis en gel.
La sonda suele detectar una banda de línea germinal en individuos sanos y una banda de
tamaño diferente dependiendo de la anomalía genética.

Tecnología de matrices citogenómicas

Las anomalías genéticas también pueden detectarse sin conocerlas previamente,

utilizando la tecnología de micromatrices para proceder a un examen genómico global.
Las plataformas de primera generación fueron diseñadas para la hibridación genómica
comparada (CGH), en tanto que las más recientes incorporan abordajes de genotipado de
SNP (Polimorfismos de un solo Nucleótidos), que ofrecen numerosas ventajas.

Hibridación genómica comparada basada en matrices (CGH de matrices)

En la CGH de matrices, el ADN de prueba y un ADN de referencia (normal) se marcan

con dos colorantes fluorescentes distintos.
A continuación se cohibridan las muestran marcadas diferencialmente en un portaobjetos
que contiene las sondas de ADN que cubren todo el genoma humano a intervalos
regulares y que suelen cubrir los 22 autosomas y los cromosomas sexuales.
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En cada localización de sondas cromosómicas se compara el grado de unión del ADN

marcado en ambas muestras.
Si las contribuciones de las dos muestras son iguales (Diploides) todos los puntos de la
matriz mostrarán fluorescencia amarilla resultado de una mezcla igual de colorante verde
y rojo.
 Cuando la muestra en estudio presenta una deleción o duplicación focal.
 Las correspondientes manchas en las sondas muestran tendencia a colorearse de rojo
o verde (dependiendo de la ganancia o pérdida de material) lo que permite
determinaciones muy precisas de las variantes del número de copias en el genoma.

Matrices de genotipado de SNP (Polimorfismos de un solo Nucleótidos)

Algunos de los nuevos tipos de matrices genómicas se basan en un concepto similar, si

bien algunas o todas las sondas están diseñadas para identificar sitios de polimorfismos
de un solo nucleótido (SNP) en todo el genoma, lo que supone varias ventajas.

Los SNP son el tipo de polimorfismo más frecuente en el ADN, ya que se registran
aproximadamente cada 1.000 nucleótidos en el genoma.

Sirven como punto de referencia físico dentro del genoma y como marcador genético
cuya transmisión de padres a hijos se puede seguir.

Hay varias plataformas de pruebas que emplean diferentes metodologías y que permiten
analizar los SNP a lo largo del genoma sobre matrices.

Como las sondas de CGH, estos métodos relacionados con los SNP se usan para optar
por las variaciones del número de copias (CNV), aunque, al discriminar entre los alelos
de SNP en cada localización particular, también aportan datos sobre cigosidad.

La actual generación de matrices de SNP es ciertamente extensa; la mayor de ellas

contiene más de 4 millones de sondas de SNP.

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La actual generación de matrices de SNP es ciertamente extensa; la mayor de ellas

contiene más de 4 millones de sondas de SNP.

En el laboratorio clínico, las matrices de SNP se suelen utilizar para detectar anomalías
en el número de copias en pacientes pediátricos cuando el cariotipo es normal, pero se
sospecha alguna anomalía cromosómica estructural.

Entre las indicaciones habituales se cuentan:

 Malformaciones Congenitas
 Rasgos dismorficos
 Retraso del desarrollo

Marcadores de polimorfismos y diagnóstico molecular

La detección clínica de mutaciones específicas de enfermedad solo es posible si el gen

responsable del trastorno es localizado. Si la naturaleza exacta de la aberración genética
se desconoce, o la prueba para hallar el defecto primario es problemática o inviable, las
pruebas diagnostica aprovechan el fenómeno del ligamiento.

Los dos tipos de polimorfismos genéticos más útiles en el análisis de ligamiento son los
SNP y los polimorfismos de longitud repetida, conocidos como repeticiones de
minisatélite y microsatélite. Los polimorfismos de longitud repetida son ADN humano
que contiene secuencias repetitivas cortas. Estos se subdividen en función de su longitud
en repetición de microsatelite y minisatélite. Los micro satélites y minisatélites de menor
tamaño se distinguen con facilidad empleando cebadores de PCR que flanqueen la región
repetida.

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Las pruebas para detección de polimorfismos genéticos ayudan en muchos otros ámbitos
de la medicina como ser:
A. La determinación de la familiaridad y la identidad en el trasplante.
B. Genética del cáncer.
C. Estudios forenses.

Polimorfismos y análisis pangenómico (GWAS)

El análisis de ligamiento cuenta con un extenso y significativo historial como medio de

detección d en las pruebas analíticas. Numerosas enfermedades mendelianas se ubicaron
originalmente en las localizaciones cromosómicas candidatas mediante los árboles
genealógicos familiares, probando diversos loci, marcadores candidatos den busca de
desequilibrio de ligamiento.

Los estudios de ligamiento resultaron valiosos para identificar genes responsables de

distintos fenotipos en modelos animales de laboratorio.

LOS GWAS se examinan el genoma completo de extensas cohortes de pacientes con

y sin enfermedades (en vez de familias), a fin de detectar variantes genéticas o
polimorfismos sobrerrepresentados en los pacientes que padecen la enfermedad.

Manhattan plot de los resultados (log(p value)) del estudio de asociaci´on entre SNP y
desplazamiento del ab´omaso en vacas de raza Frisona Holandesa. La l´ınea roja indica el
umbral de significaci´on: −log(0.0001) = 4

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Alteraciones epigenéticas

La epigenética se define como el estudio de las modificaciones hereditarias del ADN

o de la cromatina, que no modifican la secuencia del ADN en sí misma.
Nuestros conocimientos acerca de estos tipos de alteraciones moleculares están
aumentando con rapidez, y resulta evidente que las modificaciones epigenéticas
son fundamentales para el desarrollo humano normal.
Incluidas la regulación de la expresión de genes específicos de tejidos, la inactivación
del cromosoma X y la impronta, y también para comprender las alteraciones celulares
implicadas en el envejecimiento y el cáncer.
La expresión genética se suele correlacionar con el nivel de metilación del ADN,
sobre todo de las citosinas situadas de forma específica en las regiones promotoras
ricas en dinucleótidos CG conocidas como islotes CpG.
Un número cada vez mayor de enfermedades debe ser sometido al análisis de la
metilación de promotores; por ejemplo, para el diagnóstico del síndrome del
cromosoma X frágil, en el que la hipermetilación determina el silenciamiento de
FMR1. El análisis de metilación resulta esencial también en el diagnóstico de los
síndromes de Prader-Willi y Angelman.
Dado que la secuenciación tradicional de Sanger no permite detectar por sí sola la
metilación del ADN, se han desarrollado otras técnicas para descubrir estas
modificaciones químicas.
Un abordaje frecuente es tratar el ADN genómico con bisulfito sódico, sustancia
química que convierte la citosina no metilada en uracilo, que actúa como la tiamina
en las reacciones en dirección 3.

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Análisis del ARN

 Dado que el ADN ejerce sus efectos celulares a través de la expresión de ARN, y que
el ARNm contiene las secuencias que codifican todos los genes expresados, en una
amplia variedad de aplicaciones diagnósticas el ARN reemplaza al ADN.
 La aplicación más importante es la detección y cuantificación de virus ARN, como
VIH y virus de la hepatitis C.
 En algunos casos, las células tumorales que son portadoras de translocaciones
cromosómicas concretas se detectan con una mayor sensibilidad mediante el análisis
del ARNm.
 El motivo fundamental es que la mayoría de las translocaciones se producen en
localizaciones dispersas dentro de intrones particulares.
 La PCR en tiempo real sobre ADNc es el método de elección para detectar
enfermedad mínima residual en pacientes con LMC y algunas otras neoplasias
hematológicas malignas.

Secuenciación de próxima generación

Secuenciación de próxima generación (NGS) es un término que designa diversas

nuevas tecnologías de secuenciación de ADN capaces de generar un gran volumen
de datos de secuencias de forma masivamente paralela.

En la PCR en emulsión (A), la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-agua

creada para encapsular complejos entre el ADN y nanoesferas, dentro de gotículas de
agua. (B), la secuenciación tiene lugar sobre una placa de vidrio, sobre la que están
dispuestos adaptadores complementarios a los adaptadores anclados en las secuencias
desnaturalizadas a secuenciar 17
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El factor fundamental que distingue la NGS de la secuenciación de Sanger tradicional lo

constituyen sus requerimientos de obtención de muestras. En tanto que la secuenciación
de Sanger necesita un ADN plantilla único simple y homogéneo.

La NSG no plantea tales necesidades, puesto que en ella se puede utilizar ADN de casi
cualquier procedencia.

Los instrumentos de NGS se ajustan bien a las muestras heterogéneas de ADN gracias a
la aplicación de los siguientes procesos básicos:
 Separación espacial. Al inicio del procedimiento, las moléculas de ADN de entrada
están físicamente aisladas entre sí en el espacio. Las especificaciones de este proceso
dependen de la plataforma.
 Amplificación local. Tras la separación, las moléculas de ADN individuales son
amplificadas in situ utilizando un número limitado de ciclos de PCR. La amplificación
es necesaria a fin de que se genere una señal suficiente para garantizar la detección y
la precisión
 Secuenciación en paralelo. Las moléculas de ADN amplificadas son secuenciadas
simultáneamente por adición de polimerasas y otros reactivos, con cada molécula
original separada y amplificada que ofrece una “lectura” correspondiente a su
secuencia. (Vinay Kumar, Abul K. Abbas, & Jon C .Aster, 2015)
Bioinformática

Los instrumentos de NGS generan una

sorprendente cantidad de secuencias de datos.
Por ejemplo, un nuevo instrumento es capaz de
analizar más de 500 millones de agregados de
ADN individuales y producir 180.000 millones
de pares de bases en poco más de 1 día.
Ello supone la posibilidad de secuenciar con alto
nivel de calidad un genoma humano completo.
El análisis necesario para comprender este
ingente volumen de datos es tan complejo que a menudo se requiere formación
especializada en bioinformática para asegurar su interpretación adecuada.
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Patología General Grupo # 10

Los pasos básicos necesarios para procesar este tipo de datos en un contexto de ADN
humano genérico:
 Alineación. La alineación es el proceso por medio del cual las lecturas de
secuenciación de una muestra (que individualmente no aportan información) son
ubicadas en el genoma de referencia adecuado, en el que pueden ser observadas e
interpretadas en el contexto adecuado.
 Detección de variantes. Este proceso consiste en «caminar» por el genoma de
referencia y evaluar todos los datos de la secuencia, situados en su correspondiente
posición, comparándolos con los del genoma de referencia. Cuantas más lecturas
cubran una determinada posición (profundidad de secuenciación).
 Anotación e interpretación de variantes. Las variantes detectadas pueden ser
anotadas a partir de distintas fuentes de información p. ej., nombres de genes, cambios
de codificación y predicciones de efectos de proteínas, identificado- res de SNP,
información de bases de datos sobre variantes tanto benignas como patológicas,
información clínica

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Conclusiones

El uso de análisis genéticos con fines diagnósticos está siendo integrado a la rutina
asistencial de forma exponencial en los últimos años, por lo que es importante que los
clínicos se familiaricen con las aproximaciones técnicas y las implicaciones éticas de
estos métodos.

Actualmente, el diagnóstico genético es aplicable principalmente a las enfermedades

monogénicas y se realiza mayoritariamente mediante secuenciación del gen causante
(diagnóstico directo) o mediante análisis de ligamiento (diagnóstico indirecto).

El resultado de un diagnóstico genético se caracteriza por ser vitalicio, por tener

importantes implicaciones para los miembros de una familia y por influir en las
decisiones reproductivas. Por ello, es esencial que siempre vaya acompañado del
correspondiente consejo genético o asesoramiento genético.

Referencias

Vinay Kumar, M. M., Abul K. Abbas, M., & Jon C .Aster, M. P. (2015). Patología

Estructural y Funcional. Barcelona, España: G e a Consultoría Editorial, s.l.

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