Juan Sebastián Carrero Sandoval *
Universidad Nacional de Colombia-Sede Bogotá, Facultad de
Ciencias, Departamento de Farmacia, Laboratorio de Técnicas básicas
en química, Bogotá D.C., Colombia.
*Autor para correspondencia: jcarrerosandoval2001@gmail.com
Colorimetría de diluciones de azul
de metileno
Resumen
En la vida cotidiana, vemos diversos
colores; sin embargo, no logramos
distinguir, al comparar dos tonos
similares de un mismo color, cuál es más
claro o más oscuro. La colorimetría nos
permite diferenciar estos “tonos” a partir
de sus longitudes de onda; en esta
práctica se buscaron afianzar los
conocimientos en la preparación de
diluciones, lo cual se consiguió mediante
la preparación de una dilución seriada de
azul de metileno; construir curvas de
calibración e interpretar la ecuación de la
recta y el coeficiente de correlación, que
se obtuvieron usando el programa Excel
a partir de los datos obtenidos
previamente con la ayuda de un
espectrofotómetro; y determinar la
concentración de una solución
empleando colorimetría, para lo que se
utilizó un espectrofotómetro y la ecuación
de la curva de calibración. Entre los
resultados, se obtuvo que la longitud de
onda que permite una mayor
absorbancia es 662,20 nm y que la
concentración y absorbancia de la
solución problema P:1 son 0,7488 g/L y
0,135 respectivamente.
Palabras clave: curva espectral, curva de
calibración, absorbancia, longitud de onda,
concentración
Colorimetry of dilutions of
methylene blue
Abstract
Day by day, we see diverse colors;
nevertheless, we are not able to tell
apart, when we compare two similar
tones of a same color, which is lighter or
darker. The colorimetric technique afford
us tell apart these “tones” based on their
wavelength; in this practice it was looked
for strengthen the knowledge about the
preparation of dilutions, which was gotten
by the preparation of a serial dilution of
methylene blue; build calibration curves
and interpret the linear equation and the
correlation coefficient, which were gotten
by the use of Excel programme, using
the dates taked before by the use of a
spectrophotometer; and determinate the
concentration of a solution using the
colorimetric technique, for what it was
used a spectrophotometer and the linear
equation of the calibration curve. As
results, we obtained that the wavelength
that allows the best absorbance is
662.20 nm and the concentration and
absorbance of the problem solution P:1 is
0.7488 mg/L and 0.135 respectively.
Key words: spectral curve, calibration curve,
absorbance, wavelength, concentration
7
 Introducción

La colorimetría es una técnica instrumental que tiene por objeto determinar la absorción
de luz visible de una muestra, esta técnica se realiza mediante el uso de un
espectrofotómetro, del que se hablara más en detalle en la sección de Materiales y
Métodos; en esta práctica se realizó la obtención de la absorbancia del azul de metileno a
diferentes concentraciones, mediante la preparación de una dilución seriada de esta
sustancia, a partir de la técnica de colorimetría. Sin embargo, no pudo haber sido posible
llevar a cabo esta práctica exitosamente sin antes conocer algunos conceptos claves.
La absorbancia se puede definir como la intensidad lumínica absorbida por una muestra,
la cual, como se comentó anteriormente es lo que buscamos determinar a partir del uso
del espectrofotómetro. Según la Ley de Lambert-Beer, la absorbancia depende de 3
fenómenos: la concentración, la distancia o recorrido, y el coeficiente de extinción. La
concentración, la cual también participa en los cálculos y resultados de esta práctica,
consiste en la cantidad de materiales de absorción que debe atravesar la luz en su
trayectoria. La distancia o recorrido, como su nombre lo indica, es la distancia que debe
atravesar la luz a través de la muestra. Finalmente, el coeficiente de extinción es la
probabilidad que hay de que el fotón de la longitud de onda utilizada pueda ser absorbida
por el material.
Para calcular la absorbancia de la muestra únicamente, debe realizarse un blanco de
reactivos cuyo objetivo es eliminar la absorbancia de los materiales externos a la muestra
a la hora de realizar el cálculo.
Debido a que la Ley de Lambert-Beer funciona únicamente dentro de una curva de
calibración, se tomaron concentraciones dentro de un rango determinado para la
construcción de la curva de calibración y la determinación de la ecuación de esta y su
coeficiente de correlación.
En esta práctica se busca afianzar los conocimientos en preparación de diluciones,
determinar la concentración de una solución problema empleando colorimetría, y construir
curvas de calibración, interpretando su ecuación y su coeficiente de correlación.

Materiales y Método
Azul de metileno

El reactivo utilizado fue el azul de metileno, el cual fue proporcionado por los profesores
encargados del laboratorio en solución de 5 mg/L de concentración.
Nombre de la sustancia Azul de metileno
Número CAS 61-73-4
Fórmula química C18H22Cl2N3S
Masa molar 319,85 g/mol
Descripción de peligros (9) Sólido misceláneo
Contaminante del agua
NFPA Salud: 1
Inflamabilidad:1
Reactividad:0
Frases R R36: Irrita los ojos
R43: Posibilidad de
sensibilización en
contacto con la piel
Frases S S26: En caso de

6
 contacto con los ojos,
lávense inmediata y
abundantemente con
agua y acúdase a un
médico
S29: No tirar al desagüe
S45: En caso de
accidente o malestar,
acúdase inmediatamente
al médico
S1/2: Consérvese bajo
llave y fuera del alcance
de los niños
Tratamiento de residuos Almacenar en el
recipiente destinado para
ello
Tabla 1. Ficha técnica del azul de metileno
Dilución seriada de azul de metileno

El laboratorio proporcionó una solución stock de concentración de 5,000 mg/L, a partir de

las cuales se formaron diluciones de 4,000; 3,000; 2,500; 2,000; 1,500; 1,000 mg/L
tomando alícuotas de la solución stock con una bureta de 25,000 Ml (purgada
anteriormente) tomando los volúmenes indicados en la Tabla 2, los cuales se llevaron a
un matraz aforado (purgado anteriormente) de 10,00 mL, a continuación, se llevó a
volumen mediante la adición de agua destilada. Se agitó el matraz vigorosamente para
terminar de diluir y finalmente se transvasó a un tubo de ensayo (purgado anteriormente),
el cual fue etiquetado de acuerdo a la concentración de la dilución que contenía.

Concentració Volumen Volumen

n del patrón de la de agua
(mg/L) solución (mL)
stock
(mL)
5,000 10,00 0,000
4,000 8,000 2,000
3,000 6,000 4,000
2,500 5,000 5,000
2,000 4,000 6,000
1,500 3,000 7,000
1,000 2,000 8,000
Tabla 2. Preparación de diluciones de azul de metileno
Construcción de la curva espectral

Para la construcción de la curva espectral se usó un espectrofotómetro, el cual se calibró

a partir de un blanco de reactivos (celda con agua destilada); una vez calibrado, se tomó
en una celda una muestra de la solución stock y se configuró el equipo en modo “Full
Spectrum”; una vez configurado en este modo, se inició el programa, el cual arrojó los
datos de la Tabla 3 (estos datos se tomaron cada 20 nm), y a partir de estos datos se
construyó, en el programa Excel, la curva espectral.
Cálculo de la absorbancia de la dilución seriada y construcción de la curva de
calibración

7
 Para calcular la absorbancia de la dilución seriada, debido a la “escasez” de celdas, se
llenaron estas partiendo de la dilución de menor concentración y continuando de manera
ascendente; adicionalmente, se configuró el espectrofotómetro en modo “Time based”,
utilizando la longitud de onda con mayor absorbancia. De esta manera, el
espectrofotómetro entregó los resultados de la absorbancia de cada dilución. A partir de
estos datos, se implementó el programa Excel para construir la curva de calibración.
Cálculo de la absorbancia y concentración de la muestra problema

Para los cálculos de la muestra problema, en este caso la muestra P:1, se tomó una
muestra de esta en una celda y se analizó en el espectrofotómetro, configurado en el
modo “Time based” y utilizando la longitud de onda de mayor absorbancia; el cual entregó
como resultado la absorbancia de la muestra problema. A partir de la curva de calibración,
construida anteriormente, se puede reemplazar el dato de absorbancia en la ecuación de
la recta y despejar la concentración.

Resultados y discusión
Análisis de las concentraciones de la dilución seriada

Los volúmenes que se tomaron de la solución stock y de agua, encontrados en la Tabla 2;

se lograron calcular a partir de la ecuación [V1*M1=V2*M2]; la cual se basa en el
conocimiento del volumen final o V2 el cual es el volumen del matraz aforado utilizado, y
de las concentraciones inicial (la de la solución stock) y final (establecidas antes de la
práctica), además estas dos se pueden relacionar por el concepto de factor de dilución.

Análisis y resultados de la curva espectral

Los resultados entregados por el espectrofotómetro acerca de la relación entre las

longitudes de onda y sus correspondientes absorbancias se encuentran en la Tabla 3.

Longitud de onda Absorbancia

(nm)
380,40 -0,029
400,50 -0,016
420,50 -0,017
440,60 -0,015
460,70 -0,009
480,80 0,001
500,00 0,010
520,40 0,022
540,10 0,055
560,60 0,110
580,30 0,187
600,00 0,326
620,00 0,398
640,00 0,502

6
 660,00 0,670
680,20 0,351
700,70 0,046
720,30 0,004
740,20 -0,004
760,10 -0,006
800,70 -0,010
820,60 -0,012
840,50 -0,011
860,70 -0,015
880,00 -0,017
899,30 -0,019
Tabla 3. Absorbancia de distintas longitudes de onda

0.800

0.700

0.600

0.500
Absorbancia

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000
300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00
-0.100
Longitud de onda (nm)

Gráfica 1. Curva espectral de azul de metileno

Se obtuvo que la longitud de onda que que la construcción de la curva espectral

tiene una mayor absorbancia es es bastante aproximada a lo real, debido
662,20 nm; y es la que se utilizará para a que se tomaron todos los valores
los cálculos de absorbancia que se entregados por el equipo, tomándolos
realicen durante el resto de la práctica. cada 20 nm.
Los resultados de la Tabla 3 se
Análisis del cálculo de la absorbancia
consiguen gracias a que el
de la dilución seriada y solución
espectrofotómetro dispara fotones a
problema, y la construcción de la
través de la muestra a diferentes
curva de calibración
longitudes de onda, calculando la
absorbancia de la muestra respecto a las Los resultados de la absorbancia de la
diferentes longitudes de onda. dilución seriada expuesta a una longitud
Adicionalmente, es importante mencionar

7
 de onda de 662,20 nm se encuentran concentraciones de azul de metileno en
relacionados a sus diferentes la Tabla 4.

Concentración del Absorbancia

patrón (mg/L)
5,000 0,682
4,000 0,577
3,000 0,449
2,500 0,366
2,000 0,312
1,500 0,235
1,000 0,191
Tabla 4. Absorbancia de diferentes concentraciones de azul de metileno en disolución

0.700

0.600
f(x) = 0.14 x + 0.02
0.500 R² = 0.99
Absorbancia

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500
Concentración (mg/L)

Gráfica 2. Curva de calibración

La muestra problema P:1, presentó una Sin embargo, es necesario aclarar que
absorbancia de 0,135; y su esta curva de calibración funciona
concentración, la cual es posible calcular únicamente con las disoluciones de azul
mediante la ecuación de la curva de de metileno que tengan una
calibración, es 0,7488 mg/L. concentración entre 5,000 mg/L y el
Adicionalmente, a partir de la ecuación blanco de reactivos, teniendo a que los
de la curva de calibración, teniendo en extremos no van a dar valores
cuenta que la absortividad molar es el exactamente precisos de acuerdo a la
mismo coeficiente de extinción y que el gráfica de la curva de calibración, debido
recorrido de la luz a través de la muestra a las limitaciones de la Ley de Beer-
se toma como 1,000 cm; se puede tomar Lambert.
la absortividad molar como la pendiente
Refiriéndonos al blanco de reactivos,
de la ecuación de la curva de calibración;
este se usa para calibrar el equipo de
es decir que la absortividad molar del
manera que, a la hora de calcular la
azul de metileno es 0,1407.

6
absorbancia de las distintas diluciones, [2] UNED. “Colorimetría”. Consultado el
elimine la absorbancia de los elementos 14-05-2019, de
externos a la sustancia de interés, en www2.uned.es/094258/contenido/tecnica
este caso, el azul de metileno. s/colorimetria/colorimetria.htm
Finalmente, es importante tener en [3] FANDOM. “Absorbancia”. Consultado
cuenta que hay sustancias que pueden el 07-05-2019, de
actuar como interferentes en la química.fandm.com/wiki/Absorbancia
colorimetría como pueden ser, en
[4] Universidad de Veracruz. “Ley de
términos generales, el ozono y
Bouger-Lambert-Beer”. (2014).
peróxidos, dióxidos que puedan
Consultado el 07-05-2019, de
producirse; para evitar este tipo de
www.uv.mx/files/2014/05/Ley-de-Bouger-
interferencias se realizan procedimientos
Lambert-Beer
específicos.
[5] Análisis Químico Instrumental.
Conclusiones
“Espectrofotometría”. (2014). Consultado
Se logró el afianzamiento de el 07-05-2019, de
conocimientos en preparación de lauraucros.blogspot.com/2014/10/espectr
diluciones mediante la preparación de ofotometria.html? m=1
una dilución seriada a partir de los datos [6] Universidad Nacional Heredia Costa
que se encuentran en la Tabla 2. Rica. “Hoja de seguridad Azul de
Adicionalmente, la obtención de los Metileno”. (2010).
resultados de absorbancia de las
distintas diluciones y el uso del programa [7] Departamento del Meta. “Método
Excel, permitió la construcción de curvas colorimétrico para determinación de cloro
de calibración; y la necesidad de hallar residual libre en aguas”. (2015).
resultados como la concentración de la
solución problema y la absortividad
molar, permitieron la interpretación de la
ecuación de la recta de la curva de
calibración y el coeficiente de
correlación. Finalmente, todo el
procedimiento de la obtención de la
curva espectral y en general la correcta
manipulación del espectrofotómetro,
permitió determinar la concentración de
una solución empleando la técnica de
colorimetría, que se pueden encontrar en
la Tabla 4.

Referencias

[1] M.J. Martínez; M.N. Calderón.

“Aspectos adicionales en el estudio de
disoluciones: cuantificación colorimétrica
de la concentración”