Actividad Experimental I

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Y CROMATOGRAFÍA DE CARBOHIDRATOS EN PAPEL

INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método eficaz para la separación de mezclas de
carbohidratos, lo cual hace factible su identificación si se aplican en la cromatografía
carbohidratos conocidos, a través de la comparación de la migración y directamente
por los valores de Rf.
Desde 1906, el botánico Tswett logró separar los pigmentos de las hojas por
percolación de su solución en éter de petróleo a través de una columna de
carbonato de calcio pulverizado, donde la materia colorante aparece dividida en
zonas diversamente coloreadas; sin embargo, este método no llamó
particularmente la atención del mundo científico hasta su nuevo descubrimiento y
perfeccionamiento por Kuhn y Lederer (1931). A partir de este momento no cesó de
extenderse el campo de sus aplicaciones y ha sido precisamente en química
biológica, vegetal y animal, donde han logrado sus éxitos más brillantes.

Hay dos tipos de cromatografías, en la cromatografía de papel la celulosa de

las fibras de papel está hidratada. A medida que un disolvente que contiene una
mezcla de diferentes sustancias asciende por capilaridad por el papel, mantenido
en posición vertical (o desciende en la cromatografía descendente), se producen
multitud de distribuciones microscópicas de las diferentes sustancias en estudio
entre la fase que fluye y la fase estacionaria acuosa, ligada a las fibras de papel. Al
final del proceso las diferentes sustancias han recorrido distancias diferentes desde
su origen. Las moléculas analizadas se caracterizan por su Rf, que es la relación de
la distancia recorrida por el soluto entre la distancia del origen al frente del solvente.

El análisis de la composición de carbohidratos de una muestra se complementa

siempre con la determinación de la concentración total de carbohidratos de dicha
muestra. Uno de los métodos empleados para ello es el de Nelson-Somogy que
consiste en hacer reaccionar un azúcar reductor con el ión cúprico en medio
alcalino, se forma óxido cuproso de color rojo que precipita y es insoluble (como en
el caso de la prueba de Fehling), como no puede valorarse fotométricamente, pero
si se trata con el reactivo de arsenomolibdato, se formará una solución con
intensidad de color proporcional a la concentración del precipitado cuproso. En este
método el factor limitante es el agente reductor (glucosa) estando los reactivos en
exceso, por lo que puede usarse para medir la cantidad de Cu 2O que es
proporcional a la cantidad de glucosa originalmente presente. La reacción se aplica
con buenos resultados a filtrados de sangre y otras soluciones, la sensibilidad es de
25 a 250 μg/ml.

OBJETIVOS
1. Identificar los azúcares que contiene una mezcla problema de
carbohidratos por medio de una cromatografía en papel.
2. Determinar la pureza de una muestra problema de carbohidratos por medio
de una cromatografía en papel.
3. Obtener la concentración de azúcares de una mezcla problema de
carbohidratos utilizando el método para determinar azucares reductores de
Nelson-Somogy
.
Material Reactivos
1 cámara cromatográfica. Mezcla (1) :
1 parrilla eléctrica. N- propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2).
8 tubos capilares. Mezcla (2) :
Papel Whatman del No. 3. Butanol-Acentona-agua (4:5:1)
1 Espectrofotómetro. Solución de NaOH 0.5 % en etanol.
1 vaso de precipitados 250 ml. Solución de NH4OH 2M.
1 vaso de precipitados de 100 ml Carbohidratos de referencia: sorbitol,
1 gradilla. dextrosa, fructosa, arabinosa, galactosa,
1 piseta con agua destilada. lactosa
1 pinza para tubos de ensayo. Solución de AgNO3.
10 tubos de ensayo de 15x100. Glucosa 100 g/ml.
3 pipetas de 10 ml. Reactivo de arsenomolibdato.
3 pipetas de 1 ml. Reactivo de cobre estabilizado en medio
4 tubos para microcentrífuga. alcalino.
1 gradilla para tubos de Material que deberá traer el alumno.
microcentrífuga. Papel aluminio.
Micropipetas de volumen variable Guantes de látex.
Hilo blanco y aguja
MÉTODO
A) Separación de carbohidratos por cromatografía en papel.

1. Prepare la cámara cromatográfica (de preferencia al menos dos horas antes

del inicio de la práctica) colocando una capa de 1 cm de la mezcla de N-
propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2). Cierre la cámara y deje saturar los
vapores por dos horas. Utilice guantes todo el tiempo de la práctica.
2. Corte una hoja de papel Whatman No. 1 de 25 cm de lado evitando tocar el
papel, use guantes de látex o nitrilo, corte y manipule sobre otro papel
ordinario.
3. En la base más angosta del papel trace con lápiz una línea horizontal a una
distancia de 3 cm de la base del cromatofolio (rectángulo del papel Whatman)
(Figura 1).
4. Marque la línea trazada cada 2 cm (aproximadamente), dejando libres 1.5
cm en cada borde lateral de la hoja (Figura 1).
5. Numere los puntos anteriores del 1 al 9.
6. Con un tubo capilar deposite una gota de la solución patrón de carbohidratos
en su respectiva marca (Figura 1), procurando que el diámetro de la gota no
sea mayor de 0.5 cm. Utilice un tubo capilar diferente para cada muestra. El
orden de las aplicaciones será el siguiente:

1 Ribosa
2 Dextrosa
3 Problema 1 (Jarabe fructosado)
4 Fructosa
5 Problema 2 (Mezcla de azúcares)
6 Arabinosa
7 Galactosa
8 Lactosa
9 Sacarosa
 1.5 cm

Figura 1. Toma de muestra y sembrado en cromatofolio de las muestras

patrón y problema de carbohidratos.

7. Permita el secado de la primera aplicación y en el mismo orden aplique una

segunda vez de la misma manera que el punto anterior. Repetirá este punto
hasta que haya aplicado 4 veces cada patrón de carbohidratos.
8. Una vez secas las muestras en el cromatofolio, haga un cilindro dejando las
muestras al interior. Utilizando hilo blanco y aguja, zurza el cilindro haciendo
puntadas a lo largo de las dos hojas sin que estas se toquen entre si (Figura
2).
9. Introduzca los cromatofolios en la cámara dentro del recipiente con el
solvente de corrida con las muestras en la parte inferior para desarrollar
cromatografía ascendente (Figura 2).
10. Retire el cromatograma cuando el frente del solvente llegue a 1 ó 2 cm del
borde superior (aproximadamente 12 a 15 h después de iniciada separación
a 25oC)
11. Con cuidado, marque con lápiz hasta donde llego frente del solvente en el
cromatofolio y déjelo secar a temperatura ambiente en la campana de
extracción de vapores.

Figura 2. Colocación de los cromatofolios en la cámara de cromatografía.

12. Utilizando guantes, rocíe el cromatrograma dentro de la campana de

extracción de vapores con una solución de nitrato de plata (AgNO3) 0.0025%
en acetona.
13. Deje secar el cromatograma al aire dentro de la campana de extracción de
vapores. Una vez seco, utilizando guantes, sumerja el cromatrograma en una
solución de hidróxido de sodio NaOH 0.5% en etanol.
14. Deje secar el cromatograma al aire dentro de la campana de extracción de
vapores. Una vez seco el cromatograma, marque el centro de las marcas de
los carbohidratos revelados y obtenga los valores de Rf. Construya una tabla
de valores de Rf, para los diferentes azúcares.
 15. Determine los valores de Rf de la muestra problema e identifique los
carbohidratos presentes.

B) Cuantificación de azúcares reductores por el método de Nelson-Somogyi.

1. Etiquete tubos de ensayo grandes (15 x 150 mm) del 1 al 8.
2. Agregue los siguientes reactivos a cada tubo:

Tubo

Reactivo 1 2 3 4 5 6 7 8
Patrón de glucosa 100 g/ml - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 - -

Muestra problema (ml) - - - - - - 0.10 0.20

(Jarabe Karo Bebé)
0.4 mg de jarabe x ml

Agua destilada (ml) 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.40 0.30

Reactivo de cobre (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

3. Tape cada tubo con papel aluminio e incúbelos en ebullición a baño María
durante 20 minutos. Enfríelos a temperatura ambiente.
4. Agregue a cada tubo 0.5 ml de reactivo de arsenomolibdato y agite
perfectamente.
5. Agregue a cada tubo 3.5 ml de agua destilada.
6. Mezcle por inversión cada tubo asegurándose que el contenido quede
homogéneo y hasta que ya no se desprendan gases, puede observar esto
por la formación de burbujas en la solución. Mida la absorbancia a 660 nm
de longitud de onda (A660) utilizando el tubo 1 como blanco de reactivos.
7. Realice la gráfica de calibración para la glucosa con los datos de los tubos 2
a 6 utilizando las abscisas para la concentración de glucosa y la ordenada
para la absorbancia.
8. Interpole en la curva patrón el valor de A660 de los tubos problema (7 y 8) y
determine la concentración.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el valor de Rf para los carbohidratos y la muestra problema?
Rf = distancia de migración del carbohidrato / distancia de migración del solvente

Distancia de Rf
migración:
Solvente
1. Ribosa
2. Dextrosa
3. Problema 1 (jarabe Karo Bebé)
4. Fructosa
5. Problema 2 (mezcla de azúcares)
6. Arabinosa
7. Galactosa
8. Lactosa
9. Sacarosa

2. ¿Qué carbohidratos están presentes en la muestra problema1 y en la muestra

problema 2?
3. ¿A qué se deben los valores de Rf para cada carbohidrato?
4. ¿Corresponde el contenido de carbohidratos encontrado en la muestra
problema del jarabe a lo reportado en la etiqueta del producto (ver lista de
reactivos)?
5. ¿Todos los carbohidratos reaccionaron con el nitrato de plata? ¿Por qué?

BIBLIOGRAFÍA
• Berg JM, Stryer L y Tymoczko. 2008. Bioquímica. 6a ed. Ed. REVERTÉ S.
A. Barcelona España.
• Haer, F. 1969. An Introduction to chromatography. Ann Arbor Science Pub.
Michigan.
APÉNDICE

• Reactivo de cobre estabilizado en medio alcalino.

En 400 ml de agua destilada disolver poco a poco 40 g de carbonato de sodio
anhidro, añadir 7.5 g de ácido tartárico y disolver; enfriar si es necesario.
Agregar 4.5 g de sulfato de cobre (CuSO4•5H2O) y disolver, aforar a 1 L con
agua destilada. Envasar en frasco ámbar y dejar reposar 2 semanas antes
de usar. Almacene a temperatura ambiente.

• Ortoarseniato disódico 12%

En 50 ml de agua destilada disolver 12 g de NaHAsO 4, aforar a 100 ml con
agua destilada. Almacenar a temperatura ambiente.

• Reactivo de Arsenomolibdato
Disuelva 50 g de molibdato de amonio en 900 ml de agua destilada,
lentamente, añadir 42 ml de H2SO4 concentrado y agregar 50 ml de solución
de ortoarseniato disódico al 12% (NaHAsO4). Mezclar bien e incubar a 37°C
durante 24 a 48 h antes de su uso. Almacene en frasco ámbar a temperatura
ambiente.

• Patrón de glucosa 100 μg/ml

Pesar 0.01 g de glucosa, disolver y aforar a 100 ml con agua destilada.
Almacene en refrigeración.

• Mezcla de n-propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2)

Mezclar 7 partes de N-propanol con 1 parte de acetato de etilo y 2 partes de
agua destilada.

• Hidróxido de Sodio (NaOH) 0.5% en etanol

Disolver 0.5 g de hidróxido de sodio (NaOH) en etanol 96% y aforar con
etanol 96% a 100 ml

• Hidróxido de amonio (NH4OH) 2M

Medir 23.22 ml de hidróxido de amonio (NH4OH) y aforar a 100 ml con agua
destilada.

• Solución acuosa saturada de nitrato de plata (AgNO3)

Disuelva 9 g de nitrato de plata (AgNO3) en 10 ml de agua destilada. La
solución precipitará cuando esté saturada, indicando así que está lista para
 su uso. Si no precipitara, agregar poco a poco pequeñas cantidades de
AgNO3, hasta que la solución quede saturada.

• Revelador de nitrato de plata (AgNO3) en acetona

Mezclar 1 ml de la solución acuosa saturada de nitrato de plata (AgNO3), en
200 ml de acetona.

• Carbohidratos de referencia
Pesar 20 mg de Ribosa, Dextrosa, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Lactosa
y Sacarosa. Disolver por separado en 5 ml de agua destilada. Almacene en
refrigeración. Hacer alícuotas de 400 μl de cada uno por grupo.

• Preparación de muestra problema (Jarabe Fructosado, Miel Karo)

4mg/ml
Pesar 4 g de Jarabe y aforar a 200 ml (Solución Stock). Tomar 4 ml de la
solución stock y aforar a 200 ml.