DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS (Harrison 19

ed. Electrónica)

Para demostrar de manera directa o indirecta la presencia de virus, bacterias, hongos y parásitos
en tejidos, líquidos o excreciones
- En los laboratorios de microbiología clínica  preparar muestras y precisan la
susceptibilidad de patógenos a antibióticos.
- Basados en  microscopio, proliferación en medios y características fenotípicas
o perfiles de fermentación  bacterias
o efectos citopáticos de los cultivos hísticos  virus
o morfología microscópica  hongos y parásito

MÉTODOS DE DETECCIÓN
Metodologías  se basa en uso del sistema de detección electrónica que utilizan computadoras,
sondas de ácido nucleico dirigidas a DNA o RNA específicos  detección no visual de señales
biológicas.

SEÑALES BIOLÓGICAS

Es un material que puede ser diferenciado las veces que sea necesario de otras sustancias
presentes en el mismo entorno físico.
 Fundamentalmente  diferenciarlas del “ruido de fondo” y traducirlas en información con
significado.
 Ejemplos  componentes estructurales de bacterias, hongos y virus; antígenos específicos;
productos metabólicos terminales; secuencias DNA o RNA; enzimas; toxinas.

SISTEMAS DE DETECCIÓN

Se utiliza para captar una señal y diferenciar entre ella y el ruido de fondo  inmunofluorescencia;
quimioluminiscencia con sondas DNA/RNA, colorimetría, absorbencia lumínica, antígenos.

AMPLIFICACIÓN

Mejora la sensibilidad con la que pueden detectarse señales débiles.

La técnica más común  proliferación de una sola bacteria en una colonia circunscrita en la placa
de agar o en una suspensión que contenga muchos microorganismos idénticos.
- Ventaja  solo un medio apropiado Desventaja  tiempo prolongado necesario.

Amplificación específica rápida de señales biológicas  PCR (polimerasa), LCR (ligasa), TMA
(transcripción), enzimoinmunoanálisis, captura de anticuerpos, filtración y centrifugación selectiva.

DETECCIÓN DIRECTA
MICROSCOPIA

Permite contar a muy breve plazo con información diagnóstica útil  mayor claridad con tinción.

Preparación húmeda (mas sencillo)  para estudiar el LCR en busca de Cryptococcus neoformans,
con tinta china que sirva de fondo, contra el cual se visualizan hongos con grandes cápsulas.
Preparados húmedos con iluminación de campo oscuro  detectar espiroquetas obtenidas de
muestras de lesiones en genitales, identificar Borrelia o Leptospira en la sangre.

TINCIÓN

Técnica Gram
Diferencia entre microorganismos:
-Grampositivos  con paredes de peptidoglucanos gruesas
-Gramnegativos  los que tienen dichas paredes, pero delgadas y membrana externa que se
disuelve con alcohol o acetona.

Facilita la amplificación (microscopio) 400-1000X. 2 tipos  Monofásica simple y Diferenciales.

Clasificar a grupos microorganismos teñidos  estreptococos, estafilococos y clostridios.

Muy útil para el estudio de esputo en busca de polimorfonucleares y bacterias  ≥25

polimorfonucleares y <10 células epiteliales por campo de baja amplificación.

Tinción para acidorresistentes

Identifica a los que retienen la carbolfucsina después de disolución de su pared con un solvente
ácido/orgánico (especies de Mycobacterium)  en esputo, liquidos y muestras histicas
- permiten diferenciar entre Actinomyces y Nocardia u otros acidorresistente (parcial/total)

Tinciones con fluorocromo

Utiliza naranja de acridina  identificar leucocitos, levaduras y bacterias en líquidos corporales.
Colorantes especializados Dappe, detectar micoplasmas en cultivos celulares.

Colorantes inmunofluorescentes
Técnica directa con anticuerpos inmunofluorescentes  utiliza anticuerpos acoplados a un
compuesto fluorescente (fluoresceína) dirigidos contra un blanco antigénico específico para
visualizar los microorganismos o estructuras subcelulares.

Técnica indirecta de anticuerpos inmunofluorescentes  anticuerpo sin marcar (blanco) se une a

un antígeno específico  utilizan dos sistemas de anticuerpos para generar la señal que permita
detectar el antígeno.

Detectan  antígenos virales (citomegálico, herpético simple y tipo respiratorio), agentes

bacterianos difíciles de cultivar (Legionella pneumophila)

DETECCIÓN MACROSCÓPICA DE ANTÍGENO

Técnicas  aglutinación con látex y las de enzimoinmunoanálisis (rápidas y baratas)

Identificar  microorganismos, toxinas intracelulares y agentes virales (Streptococcus del grupo A,

virus de influenza y virus sincitial respiratorio) por medio de antígenos proteínicos y polisacáridos.

DETECCIÓN DE PATÓGENOS POR MEDIOS DE CULTIVO

OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Para el cultivo de bacterias, hongos y virus patógenos es necesario colocar y transporta la muestra
idónea en un medio adecuado para que prolifere  identificación satisfactoria del patógeno

Regla  Cuanto más pronto se realice la inoculación de la muestra en placas de medios

adecuados, mayor será la posibilidad de aislar bacterias patógenas. Aclarar los paradigmas/dudas
AISLAMIENTO DE BACTERIAS PATÓGENAS

Aislar patógenos sospechados en el material clínico depende de usar medios artificiales que
inducen la proliferación bacteriana in vitro  Como:
- compuestos de agar (no metabolizado por bacterias), nutrientes e
inhibidores de proliferación.
- Caldos  LCR, liquido de diálisis peritoneal  proliferar muestras de
escas bacterias
- 2 estrategias básicas de asilamiento bacteriana patógena:
1. Utilizar medios enriquecidos que inducen la proliferación de cualesquiera bacterias
que pudieran estar en la muestra (sangre, LCR), que presentes normalmente.
2. Usar medios selectivos para aislar (amplificar) especies específicas de bacterias (en
heces, secreciones de vías genitales, esputo)  que normalmente contienen bacterias
- Después de la incubación  las que proliferan en tales medios son definidos con mayor
detalle para saber si son patógenos

AISLAMIENTO DE AGENTES VIRALES

A menudo se intenta detectar los virus patógenos por medio de cultivo  amplificando hasta un
nivel detectable  se emplean diversas Técnicas:
- Monocapa de células de mamífero cultivadas  sensibles a la infección por el virus
sospechado.
- detectar el virus por observación directa de las células cultivadas  en busca de efectos
citopáticos o por detección inmunofluorescente de antígenos virales

Cultivos corrientes de virus  útiles en detección según su proliferacion:

- rápida (herpes simple) - con lentitud (citomegálico, varicela-zoster) + colorante antígenos

AUTOMATIZACIÓN DE LA DETECCIÓN MICROBIANA EN SANGRE

Patógenos en la sangre su detección es difícil porque su número en la muestra suele ser pequeño y
la integridad y la capacidad de ellos para reproducirse (réplica) pueden ser menoscabadas al ser
atacados por mecanismos de defensa humoral o antimicrobianos.

Los sistemas más comunes abarcan:

1. la medición de la tensión del gas en el espacio superior para detectar la producción del
mismo por la bacteria o su consumo
2. el uso de mecanismos ópticos de reflectancia con un diodo fotoemisor y un fotodiodo
utilizado para detectar un cambio colorimétrico en el indicador sensible a CO2

DETECCIÓN DE PATÓGENOS POR MÉTODOS SEROLÓGICOS

Permite contar con un marcador indirecto de infecciones pasadas o actuales por un virus
específico u otros patógenos  Brucella, Legionella, Rickettsia y Helicobacter pylori.

Señal biológica  anticuerpos IgM o IgG dirigidos al antígeno que expresa su superficie.

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN

Deducir la especie a que pertenecen por medio de las características detectables fácilmente
después de su proliferación en medios de agar (tamaño y color de la colonia, reacciones, etc).

Identificación definitiva  mediante métodos como:

- Fenotipificación clásica  mas utilizado, identificar antígenos proteínicos o de
carbohidratos, capacidad de metabolizar sustratos  para bacterias patogenas
- Cromatografía de gas y líquido  detectar productos metabólicos terminales
- de las fermentaciones bacterianas.
- Estudios de ácidos nucleicos  detectar y cuantificar secuencias de bases específicas de
DNA y de RNA para diagnóstico de infecciones por bacterias, virus, parásitos y hongos.
o Sondas para la detección directa de patógenos en muestras clínicas
o Estrategias de métodos de amplificación de ácidos nucleicos
o Estrategias cuantitativas de técnicas con ácidos nucleicos
o Aplicación de métodos de ácidos nucleicos
- Métodos para valorar susceptibilidad de bacterias  saber si los antimicrobianos inhiben
las actividades de bacterias específicas  cualitativamente o por concentración inhibidora
- Métodos de valoración de susceptibilidad de antimicóticos
- Métodos de valoración de antivirales