El crecimiento de un biofilm

1. Cultivar una cultura de la de tipo salvaje aeruginosa Pseudomonas o cepa

mutante durante la noche en un medio rico (LB es decir)
2. Diluir el 1:100 noche sobre la cultura en un nuevo medio para los ensayos
de biofilm. Un biofilm estándar medio de cultivo de P. aeruginosa es M63 medio
mínimo suplementado con sulfato de magnesio, la glucosa y los ácidos casamino
(véase el cuadro). Como un biofilm, la promoción de alternativas de medio que
estimula el menor crecimiento del plancton y biofilms más robusta, la glucosa y los
ácidos casamino puede ser sustituida por arginina como el carbón y la única
fuente de energía.
3. Añadir 100 ml de la dilución por pocillo en una placa de 96 pocillos. Para los
ensayos cuantitativos, por lo general utilizan pozos 4-8 replicar para cada
tratamiento.
4. Incubar la placa de microtitulación de 4.24 horas a 37 ° C.

2. Tinción de la biopelícula

1. Después de la incubación, volcado a las células girando el plato una y

sacudir el líquido.
2. Suavemente sumergir la placa en una pequeña tina de agua (es decir,
utilizar los fondos de cajas de puntas para pipeta P1000 pipetmen como la
bañera). Sacuda el agua. Repita este proceso por segunda vez. Este paso ayuda
a eliminar las células sueltas y componentes de los medios de comunicación que
se puede teñir en el siguiente paso, y reduce significativamente la tinción de fondo.
3. Añadir 125 l de una solución al 0,1% de cristal violeta en el agua a cada
pocillo de la placa de microtitulación. Use guantes y una bata de laboratorio al
hacer la solución. Tenga cuidado al peso de la CV como el polvo es higroscópico y
fácilmente las manchas de la ropa, piel, etc
4. Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15
min.
5. Enjuague la placa de 3-4 veces con agua por inmersión en una tina de agua
como se indicó anteriormente, sacudir y secar con fuerza en una pila de toallas de
papel para eliminar la placa de todas las células y el exceso de tinte.
6. Gire la placa de microtitulación boca abajo y en seco por unas horas o toda
la noche.
7. Para los ensayos cualitativos, los pozos pueden ser fotografiados cuando
se seca.

3. La cuantificación de la biopelícula
1. Añadir 125 l de 30% de ácido acético en agua a cada pocillo de la placa de
microtitulación para solubilizar el CV.
2. Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15
min.
3. Transferencia de 125 l de la CV solubiliza a un nuevo plato de
microtitulación de fondo plano.
4. Cuantificar la absorbancia en un lector de placas a 550 nm utilizando 30%
de ácido acético en agua como blanco.

4. Los resultados representativos:

Figura 1. Muestra un resultado representativo para los ensayos de la formación

del biofilm realizado por Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
fluorescens y Staphylococcus aureus. (A) A la vista lateral del pozo con un biofilm
de P. aeruginosa (8 horas, 37 ° C). (B) A la vista lateral del pozo con un biofilm
de P. fluorescens (6 horas, 30 ° C). (C) Una visión de arriba hacia abajo de la
formación de biopelículas de S. aureus en una placa de microtitulación de fondo
plano (dos pozos, 24 horas, 37 ° C). P. aeruginosa y P. fluorescens son
organismos móviles y forman un biofilm en la interfase aire-líquido. S. aureus es
no móviles y forma una biopelícula sobre el fondo del pozo.

DISCUSSION

Este método puede ser modificado para su uso con una amplia variedad de
especies microbianas. Microbios móviles suelen adherirse a las paredes y / o en el
fondo de los pozos, mientras que los no-móviles microbios normalmente se
adhieren al fondo de los pozos. Las condiciones óptimas para la formación de
biofilm (es decir, el medio de cultivo, temperatura, tiempo de incubación) debe ser
determinada empíricamente para cada microbio. Recomiendo la realización de
múltiples repeticiones para cada cepa o condición (4-8), y que incluye un control
positivo, y si es posible, un control negativo en cada plato.

DISCLOSURES

No hay conflictos de interés declarado.

ACKNOWLEDGMENTS

Mi agradecimiento a Sherry Kuchma, Pete Newell y Robert Shanks para ofrecer

las imágenes en la Figura 1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención
R01AI083256 de la GAO

MATERIALS

Catalog
Name Company Comments
Number

Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be au
1 X M63
room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.

Fisher
KH2PO4 P285-500
Scientific

Fisher
K2HPO4 P288-500
Scientific

Sigma-
(NH4)2SO4 A5132
Aldrich

Magnesium Fisher
M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
sulfate Scientific

Fisher
Glucose D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Scientific

BD
Casamino acids 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Biosciences

Sigma-
Arginine A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace g
Aldrich

BD
Microtiter plates 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Biosciences

Microtiter plate BD
353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
lids Biosciences
 Sigma-
Crystal violet 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.
Aldrich

os biofilms son comunidades de microorganismos adheridos a las superficies, que

se puede encontrar en los centros médicos, industriales y naturales. De hecho, la
vida en una biopelícula probablemente representa el modo predominante de
crecimiento de los microbios en la mayoría de entornos. Biofilms maduros tienen
algunas características distintas. Microbios biofilm son típicamente rodeados por
una matriz extracelular que proporciona la estructura y la protección a la
comunidad. Los microbios que crecen en un biofilm también tienen una
arquitectura característica generalmente compuesto por macrocolonies (que
contiene miles de células), rodeada de canales llenos de líquido. Biofilm crecido
microbios también son conocidos por su resistencia a una amplia gama de
agentes antimicrobianos, como los antibióticos clínicamente relevantes.

El ensayo de placa de microtitulación es una herramienta importante para el

estudio de las primeras etapas de formación del biofilm, y se ha aplicado
principalmente para el estudio de las biopelículas bacterianas, aunque este
ensayo también se ha utilizado para estudiar la formación de biopelículas fúngicas.
Debido a que esta prueba se utiliza estática, el crecimiento de lotes condiciones,
que no permite la formación de las biopelículas maduras típicamente asociados
con los sistemas de celda de flujo. Sin embargo, el ensayo ha sido eficaz en la
identificación de muchos factores necesarios para el inicio de la formación del
biofilm (es decir, los flagelos, pili, adhesinas, enzimas que participan en cíclica-di-
GMP vinculante y el metabolismo) y así como los genes implicados en la
producción de polisacáridos extracelulares. Además, los trabajos publicados
indican que los biofilms cultivadas en placas de microtitulación se desarrollan
algunas de las propiedades de los biofilms maduros, con una tolerancia de
antibióticos y la resistencia a los efectores del sistema inmune.

Este ensayo de microtitulación plato sencillo permite la formación de un biofilm en

la pared y / o fondo de un plato de microtitulación. La naturaleza de alto
rendimiento de la prueba lo hace útil para las pantallas de genética, así como la
formación de biofilm por pruebas de múltiples cepas en condiciones de
crecimiento diferentes. Las variantes de este ensayo se han utilizado para evaluar
la formación de biofilm principios para una amplia variedad de microbios,
incluyendo pero no limitado a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli,
staphylocci, enterococos, micobacterias y hongos.

En el protocolo descrito aquí, nos centraremos en el uso de este ensayo para

estudiar la formación de biofilm por el organismo Pseudomonas
aeruginosa modelo. En este ensayo, la extensión de la formación de biopelículas
se mide utilizando el colorante cristal violeta (CV). Sin embargo, una serie de
manchas de colorimetría y metabólicas se han reportado para la cuantificación de
la formación de biopelículas utilizando el ensayo de placa de microtitulación. La
 facilidad, bajo coste y la flexibilidad del ensayo de placa de microtitulación se ha
convertido en una herramienta fundamental para el estudio de las biopelículas.

PROTOCOL

1. El crecimiento de un biofilm

1. Cultivar una cultura de la de tipo salvaje aeruginosa Pseudomonas o cepa

mutante durante la noche en un medio rico (LB es decir)
2. Diluir el 1:100 noche sobre la cultura en un nuevo medio para los ensayos
de biofilm. Un biofilm estándar medio de cultivo de P. aeruginosa es M63 medio
mínimo suplementado con sulfato de magnesio, la glucosa y los ácidos casamino
(véase el cuadro). Como un biofilm, la promoción de alternativas de medio que
estimula el menor crecimiento del plancton y biofilms más robusta, la glucosa y los
ácidos casamino puede ser sustituida por arginina como el carbón y la única
fuente de energía.
3. Añadir 100 ml de la dilución por pocillo en una placa de 96 pocillos. Para los
ensayos cuantitativos, por lo general utilizan pozos 4-8 replicar para cada
tratamiento.
4. Incubar la placa de microtitulación de 4.24 horas a 37 ° C.

2. Tinción de la biopelícula

1. Después de la incubación, volcado a las células girando el plato una y

sacudir el líquido.
2. Suavemente sumergir la placa en una pequeña tina de agua (es decir,
utilizar los fondos de cajas de puntas para pipeta P1000 pipetmen como la
bañera). Sacuda el agua. Repita este proceso por segunda vez. Este paso ayuda
a eliminar las células sueltas y componentes de los medios de comunicación que
se puede teñir en el siguiente paso, y reduce significativamente la tinción de fondo.
3. Añadir 125 l de una solución al 0,1% de cristal violeta en el agua a cada
pocillo de la placa de microtitulación. Use guantes y una bata de laboratorio al
hacer la solución. Tenga cuidado al peso de la CV como el polvo es higroscópico y
fácilmente las manchas de la ropa, piel, etc
4. Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15
min.
5. Enjuague la placa de 3-4 veces con agua por inmersión en una tina de agua
como se indicó anteriormente, sacudir y secar con fuerza en una pila de toallas de
papel para eliminar la placa de todas las células y el exceso de tinte.
6. Gire la placa de microtitulación boca abajo y en seco por unas horas o toda
la noche.
7. Para los ensayos cualitativos, los pozos pueden ser fotografiados cuando
se seca.

3. La cuantificación de la biopelícula

1. Añadir 125 l de 30% de ácido acético en agua a cada pocillo de la placa de

microtitulación para solubilizar el CV.
2. Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10-15
min.
3. Transferencia de 125 l de la CV solubiliza a un nuevo plato de
microtitulación de fondo plano.
4. Cuantificar la absorbancia en un lector de placas a 550 nm utilizando 30%
de ácido acético en agua como blanco.

4. Los resultados representativos:

Figura 1. Muestra un resultado representativo para los ensayos de la formación

del biofilm realizado por Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
fluorescens y Staphylococcus aureus. (A) A la vista lateral del pozo con un biofilm
de P. aeruginosa (8 horas, 37 ° C). (B) A la vista lateral del pozo con un biofilm
de P. fluorescens (6 horas, 30 ° C). (C) Una visión de arriba hacia abajo de la
formación de biopelículas de S. aureus en una placa de microtitulación de fondo
plano (dos pozos, 24 horas, 37 ° C). P. aeruginosa y P. fluorescens son
organismos móviles y forman un biofilm en la interfase aire-líquido. S. aureus es
no móviles y forma una biopelícula sobre el fondo del pozo.

DISCUSSION

Este método puede ser modificado para su uso con una amplia variedad de
especies microbianas. Microbios móviles suelen adherirse a las paredes y / o en el
fondo de los pozos, mientras que los no-móviles microbios normalmente se
adhieren al fondo de los pozos. Las condiciones óptimas para la formación de
biofilm (es decir, el medio de cultivo, temperatura, tiempo de incubación) debe ser
determinada empíricamente para cada microbio. Recomiendo la realización de
múltiples repeticiones para cada cepa o condición (4-8), y que incluye un control
positivo, y si es posible, un control negativo en cada plato.
DISCLOSURES

No hay conflictos de interés declarado.

ACKNOWLEDGMENTS

Mi agradecimiento a Sherry Kuchma, Pete Newell y Robert Shanks para ofrecer

las imágenes en la Figura 1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención
R01AI083256 de la GAO

MATERIALS

Catalog
Name Company Comments
Number

Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be au
1 X M63
room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.

Fisher
KH2PO4 P285-500
Scientific

Fisher
K2HPO4 P288-500
Scientific

Sigma-
(NH4)2SO4 A5132
Aldrich

Magnesium Fisher
M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
sulfate Scientific

Fisher
Glucose D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Scientific

BD
Casamino acids 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Biosciences

Sigma-
Arginine A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace g
Aldrich

Microtiter plates BD 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Biosciences
 Microtiter plate BD
353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
lids Biosciences

Sigma-
Crystal violet 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.
Aldrich

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REFERENCES

1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas

fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a
genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. Academic Press. San
Diego, CA. 91-109 (1999).
3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic
resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory
system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas
aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
5. Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from
reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas
aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
6. Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G.
A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic
surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
7. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse
regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa
PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
8. Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition
from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas
fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted
protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
9. Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing
Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm
 production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide
intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
10. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form
biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli
expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
11. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule
inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents
Chemother. 51, 3582-3590 (2007

PROTOCOLO #2

Inocular cada bacteria de interés en un cultivo de 3 a 5 ml y crecer en fase estacionaria

2 Diluir cultivos 1: 100 en el medio deseado. Pipetee 100 μl de cada cultivo diluido en cada uno de
los cuatro pocillos en una placa de microtitulación nueva que no ha sido tratada con cultivo de
tejidos. Cubra la placa e incube a la temperatura de crecimiento óptima durante el tiempo
deseado

Las tapas para los platos de microtitulación pueden reutilizarse. Limpie las tapas con etanol al 70%
(v / v) y seque al aire antes de cada experimento.
El curso de tiempo para el apego varía según el organismo y debe determinarse empíricamente,
aunque al usar este sistema, se formarán muchos organismos comúnmente estudiados

una biopelícula dentro de las 48 horas

Para pantallas grandes (> 20 cepas o especies):

1b. Inocular las células directamente en placas de microtitulación estériles llenas con 100 μl del
medio apropiado por pocillo, utilizando cuatro pocillos por cepa o especie. Incubar durante la
noche.

2b. Inocular las placas de ensayo de biopelícula directamente en 100 μl de medio por pocillo de los
cultivos de placas de microtitulación durante la noche usando un colector de inoculación estéril de
96 puntas. Cubra las placas de ensayo e incube a la temperatura de crecimiento óptima durante la
cantidad de tiempo deseada.

3. Instale cuatro bandejas pequeñas en una serie y agregue 1 a 2 pulgadas de agua del grifo a las
últimas tres.

La primera bandeja se usa para recoger los desechos, mientras que las otras se usan para lavar las
placas de ensayo.

5. Retire las bacterias planctónicas de cada plato de microtitulación (paso 2a o 2b) agitando
rápidamente el plato sobre la bandeja de desechos. Para lavar los pozos, sumerja la placa
en la primera bandeja de agua y luego agite vigorosamente el líquido sobre la bandeja de
desechos. Reemplace el agua cuando esté turbia.

6. Agregue 125 μl de solución de cristal violeta al 0.1% a cada pocillo. Mancha 10 min a
temperatura ambiente.

7. Agite cada plato de microtitulación sobre la bandeja de desechos para eliminar la solución
de cristal violeta. Lave los platos sucesivamente en cada una de las siguientes dos
bandejas de agua (es decir, las dos que no se usaron en el paso 4) y agite la mayor
cantidad de líquido posible después de cada lavado. Este paso eliminará cualquier cristal
violeta que no manche específicamente las bacterias adherentes . Las bandejas de lavado
se pueden reutilizar para varias placas, pero el agua se debe reemplazar cuando su color
se vuelve oscuro o cuando se observa que la eficiencia de los lavados disminuye.

8. Invierta cada plato de microtitulación y golpee vigorosamente las toallas de papel para
eliminar cualquier exceso de líquido. Permita que las placas se sequen al aire.
9. En esta etapa, la tinción es estable y las placas secas se pueden almacenar a temperatura
ambiente durante al menos varias semanas.
10. 8. Agregue 200 μl de ácido acético al 30% (u otro solvente apropiado) a cada pocillo
teñido. Permita que el tinte se solubilice cubriendo las placas e incubando de 10 a 15
minutos a temperatura ambiente. El 30% de ácido acético parece solubilizar más
eficientemente la mancha CV que la anterior .recomienda etanol al 95%, y lo hace desde
una gama más amplia de microbios. Se pueden usar varios reactivos para solubilizar
biofilms. Algunas sugerencias se enumeran en la Tabla 1B.1.1, pero los solventes deben
ser probados empíricamente para cada organismo.