Вы находитесь на странице: 1из 5

áèîõèìèß

Биохимия

УДК 616.432-008.931-02
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРИ СТРЕССЕ
А. Н. ВЕРНИГОРА
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского
Кафедра химии и теории и методики обучения химии
Обнаружено, что глюкокортикоиды, гидроксибутират натрия, верапамил, каптоприл и гуанидиноэтилмеркапто-
янтарная кислота предотвращают повышение активности карбоксипептидаз ��H���
��
и ��
N �������������������������
и ангиотензинпревращающе-
го фермента, вызванное внутрибрюшинной инъекцией физиологического раствора. Обсуждается роль ферментов
обмена нейропептидов в антистрессовом действии вышеуказанных препаратов, а также механизм влияния этих
веществ на активность исследуемых ферментов.
Важная роль в развитии стрессорных реакций при- МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
надлежит стресс-пептидам. Нейропептиды синтезиру- Исследование выполнено на самцах белых беспо-
ются в виде высокомолекулярных предшественников, родных крыс весом 150–180 г. В качестве контрольной
которые активируются при ограниченном расщепле- группы использовали интактных животных (n = 12).
нии протеолитическими ферментами [19]. В конечной Стресс вызывали внутрибрюшинной инъекцией 0,9 %
стадии процессинга участвует карбоксипептидаза H раствора NaCl в дозе 2 мл на кг веса (n = 10–12 для
(КПH, КФ 3.4.17.10) – экзопептидаза секреторных каждого временного интервала). Фармакологические
везикул, отщепляющая остатки аргинина и лизина с препараты вводили внутрибрюшинно в эквивалент-
C-конца пропептидов [1, 5]. В результате её действия ном количестве физраствора в следующих дозах: гид-
образуются зрелые секретируемые формы нейропеп- рокортизон – 100 мг на кг веса (n = 5–6 для каждой
тидов, в частности адренокортикотропин, β-эндорфин, временной группы), дексаметазон – 1 мг на кг веса
пролактин и др. [5]. То есть, КПH контролирует уро- (n = 5–6), гидроксибутират натрия – 100 мг на кг веса
вень активных форм этих пептидов. (n = 5), верапамил – 25 мг на кг веса (n = 5), ГЭМЯК –
Модификация и инактивация нейропептидов 1 мкмоль на кг веса (n = 9–10), каптоприл – 100 мкмоль
осуществляется также путём протеолитического рас- на кг веса (n = 9–10). Животных декапитировали через
щепления [19]. Одним из ферментов, расщепляющих 0,5, 4 и 24 ч после введения. Выделяли гипофиз и со-
вышеуказанные пептиды является ангиотензинпре- бирали кровь. Сыворотку получали стандартным спо-
вращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) [10]. В об- собом.
мене нейропептидов участвует и карбоксипептидаза N Активность КП����������������������������
H���������������������������
определяли по образованию
(КП���������������������
N��������������������
, КФ 3.4.17.3) [18]. дансил-Phe-Leu из дансил-Phe-Leu-Arg при pH 5,6
Показано, что АПФ, КП����������������������
H���������������������
и КП����������������
N���������������
вовлекаются в флюориметрически [7]. Активность КПN определя-
развитие стрессорных реакций [2]. Известно, что внут- ли по высвобождению аргинина из гиппурил-Arg при
pH 7,6 нингидриновым методом [4]. Активность АПФ
рибрюшинное введение физиологического раствора
определяли по образованию Gly-Arg из карбобензок-
является стрессирующим фактором для крыс [16] и,
си-Gly-Gly-Arg как ингибируемую каптоприлом при
как и другие виды стресса, вызывает повышение ак-
pH 7,6 по нингидриновой реакции [4]. Концентрацию
тивности вышеуказанных ферментов [3].
белка определяли методом Лоури [15]. Активность
Целью данной работы было исследование вли-
ферментов выражали в нмоль продукта, образовавше-
яния гидрокортизона, дексаметазона, верапамила, гося за 1 мин, на 1 мг белка.
гидроксибутирата натрия, каптоприла – высокоспе- Достоверность отличия между средними значения-
цифичного ингибитора АПФ, и гуанидиноэтилмер- ми показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.
каптоянтарной кислоты (ГЭМЯК) – высокоспеци-
фичного ингибитора КП��������������������������
H�������������������������
и КПN, на активность ан- РЕЗУЛЬТАТЫ
гиотензинпревращающего фермента, карбоксипепти- Внутрибрюшинная инъекция физиологическо-
даз H и N при стрессе, вызванном внутрибрюшинной го раствора вызывала повышение активности КП���� H���
и
инъекцией физраствора. Активность КП��������H�������
и АПФ АПФ через 0,5, 4 и 24 ч, КПN через 4 и 24 ч после вве-
исследовали в гипофизе – отделе, синтезирующем дения (рис.).
стресс-пептиды и отличающемся очень высокой по Введение гидрокортизона приводило к снижению
сравнению с остальными отделами мозга активнос- по сравнению с введением физраствора активности
тью этих ферментов [1, 5, 10], КПN – в сыворотке КПH через 4 и 24 ч, АПФ – через 0,5 ч, КПN – через
крови – единственном месте локализации карбокси- 4 и 24 ч после инъекции. Таким образом, введение гид-
пептидазы N в организме [18]. рокортизона снижало повышение активности КП���� H���
и

55
ÈÇÂÅÑÒÈß ÏÃÏÓ Åñòåñòâåííûå íàóêè ¹ 5 (9) 2007 ã.

56
áèîõèìèß

КП������������������������������������������������
N�����������������������������������������������
, вызванное стрессом введения, причём в случае у контрольной группы, через 4 ч – выше контроля и
КПH активность была ниже, чем у контрольных жи- не отличалась от активности при стрессе. Активность
вотных. КПN через 4 и 24 ч после введения верапамила была
При введении дексаметазона активность КПH промежуточной между активностью у контрольной и
была ниже активности у стрессированных животных стрессированной групп.
в случае всех исследованных промежутков времени, В случае введения ГЭМЯК активность КПH через
АПФ через 0,5 ч, а КПN через 4 и 24 ч после введе- 0,5 и 4 ч была ниже, чем при введении физраствора, че-
ния была ниже, чем при стрессе. При этом активность рез 24 ч не отличалась от неё. Через все исследованные
КПH снижалась ниже уровня контроля, АПФ остава- промежутки времени активность фермента не отли-
лась повышенной, а КП������������������������������
N�����������������������������
не отличалась от активности чалась от активности у контрольных животных. Ак-
у контрольной группы животных. тивность АПФ была ниже активности при инъекции
В случае воздействия гидроксибутирата натрия физиологического раствора и во всех случаях, кроме
активность КПH была ниже, чем при введении физрас- 4 ч после введения, ниже активности у контрольных
твора и ниже контроля; АПФ – ниже, чем при стрессе, животных. Активность КПN через 0,5 ч после введения
но через 0,5 и 4 ч не отличалась от контроля, а через была выше, чем при инъекции физраствора и у интак-
24 ч была повышенной по сравнению с контролем. тных животных, через 4 ч не отличалась от активности
Активность КПN через 4 ч после введения была выше у стрессированных и была выше активности у конт-
контроля и не отличалась от активности при стрессе, рольных крыс, через 24 ч была промежуточной между
через 24 ч – промежуточной между активностью у кон- активностью у этих групп животных. Таким образом,
трольной и стрессированной групп. высокоспецифичный ингибитор КПH ГЭМЯК, не вли-
При введении верапамила активность КПH была яющий на активность АПФ in vitro (табл.), in vivo по-
ниже, чем при инъекции физраствора. В случае всех давлял активность не только КПH, но и АПФ. ГЭМЯК,
исследованных интервалов времени она не отлича- которая in vitro ингибирует и КПN, хотя и в значитель-
лась от активности у контрольных крыс. Активность но меньшей степени, чем КПH (табл.), через короткий
АПФ через 0,5 и 24 ч была ниже активности у стрес- промежуток времени после введения повышала актив-
сированных животных и не отличалась от активности ность КПN, а при более длительных – подавляла.

Таблица.
Влияние фармакологических препаратов на активность ферментов обмена нейропептидов in vitro
(в % к контролю (100%), концентрации препаратов равны дозам, вводимым in vivo)
Препарат КПН КПN АПФ
Контроль 100 100 100
Гидрокортизон 94 103 90
Дексаметазон 84 110 91
Гидроксибутират натрия 90 111 88
Верапамил 96 113 113
ГЭМЯК 0 41 102
Каптоприл 99 106 0

При введении каптоприла наблюдалось сни- шение активности КПH, КПN и АПФ, вызванное инъ-
жение активности КПH через 4 ч после инъекции, екцией физраствора. Однако, динамика влияния этих
через 0,5 и 24 ч после введения каптоприл на актив- веществ зависит как от используемого препарата, так и
ность фермента не влиял. Активность АПФ в случае от исследуемого фермента. Внутрибрюшинная инъек-
введения каптоприла была существенно ниже, чем ция физиологического раствора является стрессирую-
при инъекции физраствора, и через 0,5 и 4 ч ниже, щим фактором для крыс [16] и, как и многие другие
чем у контрольной группы. Активность КПN через виды стресса, приводит к возрастанию активности ис-
4 и 24 ч после воздействия была промежуточной меж- следуемых ферментов [3]. Дексаметазон и гидрокорти-
ду активностью у стрессированных и интактных жи- зон подавляют секрецию стресс-пептидов по механиз-
вотных. Таким образом, высокоспецифичный ингиби- му обратной связи [17]. Таким образом, одним из воз-
тор АПФ при введении in vivo подавлял не только его можных механизмов воздействия глюкокортикоидов
активность, но и активность КПH и КПN, на которые на уровень стресс-пептидов является снижение актив-
in vitro не влиял (табл.). ности КПH – фермента, участвующего в образовании
активных форм этих пептидов [5]. Вместе с тем, при
ОБСУЖДЕНИЕ уменьшении секреции стресс-пептидов предотвраща-
Таким образом, все исследованные фармакологи- ется повышение их уровня и, следовательно, исчезает
ческие препараты, вне зависимости от механизма их необходимость в повышении активности АПФ и КПN,
действия, в той или иной мере предотвращают повы- которые участвуют в их деградации.

57
ÈÇÂÅÑÒÈß ÏÃÏÓ Åñòåñòâåííûå íàóêè ¹ 5 (9) 2007 ã.
Гидроксибутират натрия и верапамил обладают введении ГЭМЯК может приводить к изменению ак-
антистрессорным действием и вызывают снижение тивности АПФ и наоборот. Однако, если АПФ, яв-
активности исследуемых ферментов по сравнению с ляющийся мембраносвязанным эктопротеином [10],
крысами, подвергнувшихся воздействию только физ- доступен для действия веществ пептидной природы,
раствора. То есть, одним из возможных механизмов то КПH локализована внутри секреторных везикул
антистрессорного действия этих веществ является их [1, 5], и не доступна для действия пептидов, находя-
влияние на активность ферментов обмена стресс-пеп- щихся вне везикул. Вместе с тем, многие нейропеп-
тидов. тиды влияют на экспрессию генов, в том числе генов
Ингибиторы АПФ – каптоприл и карбокси- АПФ [8] и КПH [6, 14]. Таким образом, изменение
пептидазы H – ГЭМЯК также, в основном, вызыва- уровня нейропептидов вследствие ингибирования ак-
ют снижение активности исследуемых ферментов тивности одного из ферментов его специфичным ин-
(исключая КПN через 0,5 ч после введения). Известно, гибитором может приводить к изменению активности
что ингибиторы АПФ подавляют синтез и секрецию и другого фермента, посредством влияния этих нейро-
адренокортикотропина [21]. Поэтому представляет- пептидов на уровень экспрессии мРНК фермента. Бо-
ся интересным изучение антистрессорного действия лее того, вследствие эффекта обратной связи, по этому
ингибиторов ферментов обмена стресс-пептидов с це- механизму может изменяться и активность фермента,
лью получения направленных средств воздействия на подавляемого специфичным ингибитором. Этим, ве-
стресс-систему. роятно, объясняется длительный и фазный характер
Необходимо отметить, что в ряде случаев, особен- влияния данных ингибиторов, несмотря на то. Сход-
но при использовании ингибиторов, активность фер- ным образом на активность данных ферментов могут
ментов снижалась значительно ниже уровня нормы. влиять и другие исследуемые вещества, в особеннос-
То есть, данные вещества не являются специфичными ти глюкокортикоиды, которые, влияют на уровень не
стресс-протективными препаратами, нормализирую- только стресс-пептидов, но и многих других нейро-
щими функционирование системы стресс-пептидов, пептидов, в частности энкефалинов [11]. Последние
а просто подавляют выработку стресс-пептидов, как, вовлекаются в регуляцию уровня стресс-пептидов
возможно, и других нейропептидов, путём ингибиро- [17]. Таким образом, представляется вероятным, что
вания ферментов их обмена, обеспечивая таким спо- влияние исследуемых фармакологических препара-
собом антистрессовое действие. Следовательно, адап- тов на активность ферментов обмена стресс-пептидов
тогенное действие этих препаратов представляется опосредуется различными нейромедиаторными, в том
весьма проблематичным. числе и пептидергическими системами.
Вызывает интерес вопрос о механизмах влияния
исследуемых фармакологических препаратов на ак- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
тивность изучаемых ферментов. Не вызывает сом- 1. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Механизмы регуляции
нения, что влияние гидрокортизона, дексаметазона, активности и биологическая роль карбоксипептида-
гидроксибутирата натрия и верапамила на активность зы H – фермента процессинга нейропептидов // Био-
всех исследованных ферментов, ГЭМЯК на актив- химия. 1995. Т. 60. № 12. С. 1953–1963.
ность АПФ и каптоприла на активность КПH и КПN 2. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Никишин Н. Н. Об учас-
не связано с прямым влиянием указанных веществ на тии некоторых ферментов обмена нейропептидов в ме-
ферменты, так как in vitro они не влияют на их актив- ханизмах эмоционального стресса // Физиол. ж. 1995.
ность (табл.). Т. 81. № 5. С. 103–112.
Известно, что глюкокортикоиды регулируют ак- 3. Вернигора А. Н., Никишин Н. Н., Генгин М. Т. Влия-
ние внутрибрюшинного введения физиологического
тивность многих ферментов путём изменения экс-
раствора на поведение крыс в тесте «открытое поле» и
прессии их генов. Однако, исследования на культуре
активность ферментов, участвующих в обмене нейро-
AtT20 клеток показали, что глюкокортикоиды, изме-
пептидов // Физиол. ж. 1995. Т. 81. № 12. С. 121–125.
няя уровень мРНК проопиомеланокортина, не влия-
4. ����������
Генгин М.� �����������������������������������������
�����������������������������������������
Т., Вернигора А.�������������������������
 ������������������������
Н., Никишин Н.����������
 ���������
Н., Щети-
ют на уровень мРНК КПH [20]. Более того, участков нина Н.�������������������������������������������
 ������������������������������������������
В. Активность карбоксипептидазы N и ангио-
связывания стероидных гормонов в структуре гена тензинпревращающего фермента в сыворотке крови
КПH не обнаружено [12]. Вопрос о возможности вли- крыс в норме и при эмоциональном стрессе // Укр.
яния глюкокортикоидов на уровень экспрессии КПN и биохим. журн. 1994.
������ ����������������������
�����������������������
. 66. № 2. С����������
�����������
. 116–119.
АПФ остаётся пока открытым. 5. Fricker L. D. Peptide processing exopeptidases: amino- and
Что касается влияния каптоприла на активность carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis //
АПФ и ГЭМЯК на активность КПH, то здесь оно осу- Peptide biosynthesis and processing (Fricker L. D. ed.).
ществляется путём прямого ингибирования активнос- Florida: CRC Press, Boca Raton, 1991. P. 199–230.
ти ферментов. Однако, при действии каптоприла на 6. Fricker L. D., Rigual R. J., Diliberto E. J. Jr., Viveros O. H.
активность КПH и КПN, а также ГЭМЯК на актив- Reflex splanchnic nerve stimulation increases levels of
ность АПФ прямое ингибирование исключено. Извес- carboxypeptidase E mRNA and enzymatic activity in the
тно, что и КПH и АПФ ингибируются многими биоло- rat adrenal medulla // J. Neurochem. 1990. Vol. 55. ����� №����
2.
гически активными пептидами, в обмене которых они P. 461–467.
и участвуют [9, 13]. Поэтому изменение концентрации 7. Fricker L. D., Supattapone S., Snyder S. H. Enkephalin
нейропептидов в результате ингибирования КПH при convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxy-

58
áèîõèìèß

peptidase in adrenal chromaffin granules, brain and 15. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J.
pituitary gland // Life Sci. 1982. Vol. 31. P. 1841–1844. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol.
8. Goraya T. Y., Kessler S. P., Kumar R. S., Douglas J., Chem. 1951. Vol. 193. №����
�����
 1. P.
�����������
265–275.
Sen G. C. Identification of positive and negative transcrip- 16. Rosen A., Brodin K., Eneroth P., Brodin E. Short-term
tional regulatory elements of the rabbit angiotensin-con- restraint stress and sc saline injection alter the tissue-levels
verting enzyme gene // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. of substance P and cholecystokinin in the peri-aqueductal
№����
7. �������������
P. 1194–1201. gray and limbic regions of rat brain // Acta Physiol. Scand.
9. Hook V. Y. H., LaGamma E. F. Product inhibition of car- 1992. Vol. 146. №����
�����
3. P.
�����������
341–348.
boxypeptidase H // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. ������
№�����
26. 17. Shipston M. J. Mechanisms(s) of early glucocorticoid
P. 12583–12588. inhibition of adrenocorticotropin secretion from anterior-
10. Hooper N. M. Angiotensin converting enzyme: implica- pituitary corticotropes // Trends Endocrin. Met. 1995.
tions from molecular biology for its physiological func- Vol. 6. № 8. P. 261–266.
tions // Int. J. Biochem. 1991. Vol. 23. №������
�������
7/8. P.
�����������
641–647.
18. Skidgel R. A. Human carboxypeptidase N: lysine
11. Inturrisi C., Franklin S., Shapiro J., Calvano S., Yoburn B.
carboxypeptidase // Methods Enzymol. 1995. Vol. 248.
Adrenal enkephalin biosynthesis regulated by glucocorti-
P. 653–663.
coid // NIDA Res. Monogr. 1988. Vol. 81. P. 129–135.
19. Steiner D. F. The biosynthesis of biologically active
12. Jung Y. K., Kunczt C. J., Pearson R. K., Dixon J. E., Frick-
er L. D. Structural characterization of the rat carboxy- peptides: a perspective // Peptide Biosynthesis and
peptidase E gene. // Mol. Endocrinol. 1991. Vol. 5. №����
�����
9. Processing (Fricker L. D., ed.). Florida: CRC Press, Boca
P. 1257–1268. Raton, 1991. P. 1–16.
13. Kariya K., Okamoto H., Kaktmoto M., Tsuda Y., Okada Y. 20. Thiele E. A., Eipper B. A. Effect of secretagogues on
Inhibition of angiotensin converting enzyme of rat brain components of the secretory system in AtT-20 cells //
with the bradykinin and its fragments // Biochim. Biophys. Endocrinology. 1990. Vol. 126. № 2. P. 809–817.
Res. Commun. 1981. Vol. 100. P. 31–35. 21. Zacharieva S., Matrozov P., Stoeva I., Andonova K.
14. Laslop A., Tschernitz C. Effects of nerve growth factor on The effect of angiotensin-converting enzyme inhibition
the biosynthesis of chromogranin A and B, secretogranin on ACTH response to corticotropin-releasing hormone
II and carboxypeptidase H in rat PC12 cells // Neurosci. (CRH) in normal men // Horm. Metab. Res. 1991. Vol. 23.
1992. Vol. 49. №����
�����
2. �����������
P. 443–450. № 5. P. 245–246.

59