Вы находитесь на странице: 1из 327

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

НАГЛЯДНАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Rolf D. Schmid

Taschenatlas
der Biotechnologie
und Gentechnik
2. Auflage

143 Farbtafeln von Ruth Hammelehle

WILEY-VCH
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Р. Шмид

НАГЛЯДНАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
Перевод с немецкого
А. А. Виноградовой
и канд. биол. наук А. А. Синюшина

под редакцией
канд. хим. наук Т. П. Мосоловой
и канд. биол. наук А. А. Синюшина

2-е издание (электронное)

Москва
БИНОМ. Лаборатория знаний
2015
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

УДК 577.1
ББК 30.16я2
Ш73

Шмид Р.
Ш73 Наглядная биотехнология и генетическая инженерия [Элек-
тронный ресурс] / Р. Шмид ; пер. с нем. — 2-е изд. (эл.). — Элек-
трон. текстовые дан. (1 файл pdf : 327 с.). — М. : БИНОМ. Лабо-
ратория знаний, 2015. — Систем. требования: Adobe Reader XI ;
экран 10".
ISBN 978-5-9963-2407-1
В справочном издании немецкого автора в наглядной форме изложены
основные принципы биотехнологических методов и методов генетической
инженерии. Книга построена, как атлас — на каждом развороте помещены
иллюстрации для презентации темы и краткий текст, где даны определения,
термины и понятия. Несмотря на краткость изложения, наиболее трудные
вопросы раскрыты детально и четко. Имеется указатель микроорганизмов.
Для студентов биологических, биолого-химических, химико-техноло-
гических, медицинских и фармацевтических вузов, а также научных
работников.
УДК 577.1
ББК 30.16я2

Деривативное электронное издание на основе печатного аналога:


Наглядная биотехнология и генетическая инженерия / Р. Шмид ; пер.
с нем. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. — 324 с. : ил. —
ISBN 978-5-94774-767-6.

В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных


техническими средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать
от нарушителя возмещения убытков или выплаты компенсации


c Originally published in the German language
by WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Boschstraße 12, D-69469 Weinheim, Federal
Republic of Germany, under the title
“Taschenatlas der Biotechnologie
und Gentechnik”. Copyright 2006
by WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
All Rights Reserved.
This EBook published under license
with the original publisher.

c Перевод на русский язык, БИНОМ.
ISBN 978-5-9963-2407-1 Лаборатория знаний, 2014
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Предисловие

Биотехнология – междисциплинарная область зна- Я выражаю персональную благодарность своим


ния, и в XXI в. она займет ключевые позиции в цикле коллегам, которые просматривали материал целых
естественных наук. тем или отдельных разделов этой книги и внесли су-
Биотехнологам необходимо хорошо знать не щественные замечания и исправления. Среди них:
только биологию, но и молекулярную генетику и ци- Макс Рёр (Вена), Франк Эмде (Бонн), Мария-Регина
тологию, генетику и молекулярную медицину, виру- Кула и Герман Зам (Юлих), Ан-Пинг Ценг (Браун-
сологию, микробиологию и биохимию, технологию швейг), Фолькер Каше (Гамбург–Гарбург), Петер
производства ферментных препаратов и других био- Дюрре (Ульм), Ульф Шталь, Эдельтрауд Маст-Гер-
технологических производственных процессов. С лах и Дитрих Кнорр (Берлин), Удо Грефе (Йена),
биоинформатикой и системной биологией тесно свя- Гюнтер Шмидт-Кастнер (Вупперталь), Карл-Хейнц
заны компьютерные и информационные технологии. Маурер (Дюссельдорф), Вольфганг Барц и Алек-
Поэтому неудивительно, что до сих пор не существу- сандр Штайнбюхель (Мюнстер), Фридер Шеллер
ет кратких и содержательных учебных пособий по (Потсдам), Бертольд Хок и Вольфганг Людвиг
биотехнологии, которые охватывали бы эту дисцип- (Вайенштефан), Рейнхард Кремер (Кёльн), Томас
лину во всем ее многообразии. По каждому из раз- фон Шелль, Ханс-Иоахим Кнакмус, Карл-Генрих Эн-
делов этой книги, например разведение животных и гессер, Йорг Метцгер, Петер Шойрих, Ульрих Эй-
растений, биоинформатика, читатель может найти зель, Матиас Ройс, Петер Штадлер, Клаус Маух,
более полную информацию в специальных, часто Кристоф Зилдатк, Михель Тумм и Йозеф Альтенбух-
многотомных изданиях. нер (Штутгарт), Гельмут Гельдерман, Рольф Клаус,
Как показывает мой собственный опыт и много- Герд Вебер и Рольф Блайх (Штутгарт–Хохенхайм),
летний опыт преподавания студентам, новый матери- Гельмут Улих (Брейзах), Иоахим Зидель, Клаус Вал-
ал интересно иметь перед собой как целостную кар- лериус, Антон Хазельбек и Ульрих Бейрендт (Пенц-
тину; это и мотивирует на дальнейшее изучение берг), Вольфганг Войллебен и Клаус Шульдт (Тюбин-
тысяч деталей, на первый взгляд кажущихся несвя- ген), Рольф Вернер (Биберах), Виланд Вольф и
занными. Андреас Лоренц (Лаупхайм), Франк-Андреас Гункель
Предлагаемая читателю книга как раз и есть та- (Вупперталь), Михель Брёкер (Марбург), Бернард
кое нужное целостное руководство и одновременно Гауэр, Вольфганг Пресслер и Дитер Йан (Людвигсха-
это детализированный подробный справочник. До- фен), Дитер Мангольд и Юлия Шулер (Маннхайм),
статочно познакомиться с оглавлением (пивоваре- Франк Цохер и Пауль Хаберманн (Хёхст), Тильманн
ние, этиловый спирт, рекомбинантные вакцины, ге- Шпеллиг (Бергкамен), Дитер Остерхельт, Фридрих
ном человека, протеомика и др.). Каждая тема Лоттшпайх и Бернд Генсбахер (Мюнхен). В заключе-
представлена кратким текстом и понятными иллюст- ние хочу поблагодарить сотрудников института, в ко-
рациями. Для каждой темы приведены ссылки на тором я работаю, за терпение и понимание, про-
оригинальную литературу – главы из научных моно- явленные при ответах на мои бесконечные вопросы;
графий и научные статьи. Принятый в книге подход к это – Ютта Шмитт, Изабелла Кауфман, Маркус Эн-
подаче материала связан с неизбежным риском цельбергер, Тиль Бахманн и Юрген Плайс.
чрезмерно краткого изложения, но дает возмож- Я был бы удивлен, если несмотря на многосто-
ность осветить основные положения и продемон- роннюю помощь при написании этой книги, в ней не
стрировать взаимосвязи между разными темами. осталось неясностей и ошибок. Я прошу благосклон-
Я надеюсь, что мне удалось хотя бы отчасти до- ных читателей связываться непосредственно со мной
стичь поставленной цели. Читатель получил исчерпы- при желании высказать свои замечания, указать на
вающий путеводитель в науку биотехнологию для того, неточности и ошибки. Моя электронная почта
чтобы не только ориентироваться в лабиринте терми- ‹www.itb.uni-stuttgardt.de/taschenatlas›. При пере-
нологии, полной англицизмов, но и, хочется думать, издании этой книги я постараюсь учесть все замеча-
увлечься этой наукой. Большой вклад в подготовку ния и по возможности улучшить книгу.
представленного в книге материала внесла Рут Хамме-
леле. Она подготовила логически построенные и эсте- Штутгарт, декабрь 2001
тически выдержанные схемы, придавшие достаточно Рольф Д. Шмид
краткому тексту «второе измерение».
Выходу этой книги в свет, безусловно, весьма спо-
собствовали редакторы Барбара Фрундер, Утте
Рольфс и Карин Дембовски, которых я рад сердечно
поблагодарить за более чем добросовестное исполне-
ние своих обязанностей и очень ценные замечания. 5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Предисловие ко 2-му изданию

За пять лет, которые прошли с момента выхода в свет Увеличение температуры атмосферы вызывает тревогу
первого издания биотехнология и методы генетиче- общества, и для сохранения «космического корабля»
ской инженерии стремительно развивались. Валовый под названием «Земля» требуются новые альтернатив-
продукт биоинженерных производств постоянно уве- ные источники энергии, а также новые технологии.
личивается и теперь уже превышает суммарный Биоэтанол и «биодизель» получают из растительного
продукт традиционных производств, основанных на сырья, их используют как топливо. Подобные «белые»
ферментации. За это время объем производства биотехнологии имеют большое будущее.
L-глутаминовой кислоты удвоился, достигнув 1,5 млн При подготовке второго издания материал книги
тонн в год, что связано не только с изменившимися был полностью переработан и дополнен. Во 2-е изда-
вкусовыми предпочтениями населения, но и с тем, что ние включены четыре новых раздела: тканевая инже-
на мировой рынок вышел Китай. Последовательности нерия, РНК, системная биология и «белая» биотехно-
многих геномов пока не расшифрованы, хотя для бо- логия.
лее десяти растений и животных и сотен микроорга- Хочу искренне поблагодарить за предоставление
низмов они уже известны. Геномный анализ привел к ценных материалов о производственных разработках
новым открытиям – например, к пониманию роли ма- биотехнологов Ваандера Ритхорста (Sandoz), Бер-
лых интерферирующих РНК (siRNA). В сочетании с нарда Хауэра и Уве Пресслера (BASF), Андреаса
протеомикой и метаболомикой геномный анализ поз- Лойхтенбергера (Degussa) и Карлхайнца Маурера
волил изучать процессы жизнедеятельности организ- (Henkel). За информацию об академических исследо-
мов в рамках подхода системной биологии. В настоя- ваниях я особенно благодарен Сюзане Грэбли (Йена),
щее время расшифровка генома любого человека Сибилле Туде (Штутгарт), Вольфгангу Войллебену
оценивается в ~1500 евро. Благодаря геномному (Тюбинген), Матиасу Ройсу, Клаусу Пфиценмайеру и
анализу стали понятны причины возникновения многих Клаусу Мауху (Штутгарт).
заболеваний, а также процессы старения и нарушения Кроме того, я признателен Рут Хамелеле и Бер-
обмена веществ. В медицине уже применяются гене- нарду Вальтеру (Firma epline, Kirchheim o.T.) за пре-
тические методы персональной диагностики и генная восходный графический и полиграфический дизайн,
терапия, на основе анализа генома могут быть сдела- а также д-ру Роми Кирстен за поддержку со стороны
ны даже рекомендации по питанию. издательства.
В последние годы промышленная биотехнология
развивается на фоне роста цен на нефть и продолжаю- Штутгарт, осень 2005
щейся активной индустриализации нашей планеты. Рольф Д. Шмид

6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Введение

Настоящая книга, построенная, как атлас, предна- генетической инженерии препаратах, новейших спо-
значена для тех студентов, изучающих биологию, собах получения эмбриональных и стволовых клеток
биохимию и биотехнологию, которые хотят получить из эмбрионов и зрелых организмов, возможностях
первые представления о всем многообразии совре- рекомбинантных антител и применении биосенсоров.
менной биотехнологии. Модули текста и иллюстра- В следующем большом разделе – «Биотехнология в
ций, указатель* и список литературы – все это сельском хозяйстве», описываются современные ме-
должно помочь читателю в углубленном изучении тоды селекции животных и растений.
предмета. В 143 цветных иллюстрациях содержится Вторая половина книги посвящена научным осно-
информация по различным аспектам биотехнологии вам биотехнологии и биотехнических методов. Там
и методам генетической инженерии, а сопутствую- вы найдете раздел «Основы микробиологии», затем
щий текст дополняет и поясняет эти сведения. Для «Основы биотехнологических методов», а также
того чтобы облегчить поиск, на поля вынесены заго- «Молекулярно-генетические методы».
ловки основных тем. Наконец, следует очень интересный раздел «Тен-
Книга начинается с краткого исторического обзо- денции развития», где рассмотрены, например, ис-
ра. Так как биотехнология имеет прикладное (ком- следования в области протеомики, системной биоло-
мерческое) значение, читатель найдет в книге неко- гии и «белой» биотехнологии.
торые рыночные показатели. Изложение начинается В последних разделах обсуждаются вопросы
с разделов, посвященных биотехнологии пищевых безопасности, этики и экономические аспекты.
продуктов, спиртов, кислот и аминокислот, а затем Для дальнейшего изучения предлагается обшир-
уже антибиотиков, специальных продуктов, фермен- ная литература, сгруппированная в соответствии с ос-
тов и, наконец, пекарских и кормовых дрожжей. Опи- новными разделами книги. Помимо этого, имеются
санием очистки сточных вод начинается раздел ссылки на веб-сайты.
«Биотехнология и окружающая среда». Затем следу- Мне остается лишь пожелать читателям с удо-
ет большой раздел «Биотехнология в медицине», в вольствием приступить к изучению этой увлекатель-
котором изложены сведения о получаемых методами ной области науки и добиться в этом успеха.

* В русском издании имеется указатель микроорганизмов. 7


Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

История биотехнологии Этапы развития биотехнологии

ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА. Наука, которую мы с вами разработанных Такамине, ознаменовало переход на


называем биотехнологией, ведет свою историю с глу- новый уровень в технологии производства крахмала
бокой древности. Вероятно, первыми биотехнологи- и солода. Успехи биотехнологии впервые получили
ческими открытиями были наблюдения о том, что признание широкой общественности в 1900 г., когда
продукты питания сохраняются продолжительное стало очевидным преимущество биотехнологической
время в высушенном, засоленном или засахаренном очистки воды в борьбе с распространением эпиде-
виде, а также о специфическом «божественном» мий. В период Первой мировой войны был сделан це-
действии сброженных фруктовых соков. По дошед- лый ряд важнейших открытий. В Германии Карл Ней-
шим до нас древним документам, зарождение горо- берг разработал метод получения глицерина из
дов сопровождалось развитием различных ремесел дрожжей; Хаим Вейцман, эмигрировавший из России
по хлебопечению, пивоварению, виноделию и сыро- в Англию, предложил способ производства ацетона,
варению, а также по выделке кожи. Монастыри За- основанный на анаэробной ферментации бактериями
падной Европы в средние века были центрами ремес- рода Clostridium. Ацетон и глицерин служили сырьем
ленничества, поэтому именно там происходило при получении взрывчатых веществ (нитроглицерина
усовершенствование биотехнологических процессов и кордита), поэтому усовершенствование их произ-
(в частности, виноделия, хлебопечения и пивоваре- водства в военное время имело особенно важное
ния). Появление крепкого пива вызвало некоторые значение. Способ Нейберга и Вейцмана получил ши-
отступления от строгой жизни по религиозным кано- рокую известность и по сути стал основой фермента-
нам, поскольку во время поста разрешалось пить пи- тивных технологий. Символичным признанием заслуг
во. Современная биотехнология берет свое начало с Вейцмана стало его избрание первым президентом
конца XIX в., и на развитие науки очень сильно повли- созданного в соответствии с декларацией А.Д. Баль-
яли Первая и Вторая мировые войны: ученые активно фура в 1948 г. государства Израиль. В послевоен-
занимались разработкой новых антибиотиков и спо- ные годы технология производства ацетона с помо-
собов производства растворителей (что было проди- щью клеток Clostridium не потеряла своей
ктовано военными нуждами). Современная биотехно- актуальности; для растворения лака стали широко
логия обязана своими успехами в основном применять побочный продукт ферментативной реак-
открытиям в биохимии, генетике и клеточной биоло- ции 1-бутанол. В 1922 г. Александр Флеминг слу-
гии, разработке методов генетической инженерии чайно обнаружил антибактериальное действие пени-
(1970-е гг.), а также появлению новых направлений, циллина. Хоуард Уолтер Флори выделил это
в частности биоинформатики и протеомики. Наблю- вещество и впервые применил в медицине. Вторая
даемые темпы развития биотехнологической науки мировая война способствовала активному поиску и
позволяют предположить, что она станет «наукой но- промышленному производству антибиотиков, и к
вого тысячелетия». 1950 г. их число превысило 1000. Антибиотики
ПИОНЕРЫ БИОТЕХНОЛОГИИ. Биотехнология – при- очень широко используются в медицине, в животно-
кладная наука, и многие биотехнологические задачи водстве и растениеводстве. С 1950 г. благодаря тех-
имеют важное экономическое значение. Француз- ническим достижениям появилась аналитическая
ский химик Луи Пастер в 1864 г. доказал, что броже- биотехнология: ферменты и антитела стали приме-
ние вызывают микроорганизмы. Чтобы наблюдать за няться для высокочувствительного анализа пищевых
этим процессом, он использовал микроскоп. Предло- продуктов и медицинской диагностики. В последние
женные Пастером методы получения чистых культур 30 лет в связи с надвигающимся нефтяным кризи-
микроорганизмов и стерилизации питательных сред сом и ввиду неуклонно растущего населения Земли
(пастеризация) заложили основы прикладной микро- особый интерес вызывает получение из биомассы
биологии. Первыми успехами в исследованиях и раз- таких энергоносителей, как этанол и метанол.
работке методов борьбы с патогенными микроорга-
низмами мы также обязаны Пастеру и его научной
школе. В начале ХХ в. немецкий химик Отто Рём и
японский ученый Йокиши Такамине предложили ис-
пользовать для технологических целей ферменты,
полученные из отходов мясной промышленности или
из культуральной жидкости после культивирования
плесневых грибов. Открытие Рёма позволило значи-
тельно усовершенствовать процесс выделки кожи (до
этого времени в качестве источника ферментов ис-
8 пользовали экскременты собак). Введение методов,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнология – древняя наука


1 3
2

1 Пивоварение
2 Хлебопечение
3 Выделка кожи

Древность Сбраживание соков с получением этанола


Получение кисломолочных продуктов и дрожжевого теста
Выделка кожи с использованием экскрементов собак
1650 «Орлеанский» способ получения уксусной кислоты
Ок. 1680 Антоний Левенгук впервые наблюдал бактериальные клетки в оптический (световой) микроскоп
1867 Луи Пастер разделил культуры пивных дрожжей и уксуснокислых бактерий
Ок. 1890 Луи Пастер и Роберт Кох разработали первые вакцины
1900 Йокише Такамине использовал α-амилазу в технологических целях
1908 Отто Рём применил животные протеиназы для получения стирального порошка
1916 Хаим Вейцман разработал ферментативный метод получения бутанола и ацетона
С 1920 Получение лимонной кислоты путем ферментативного процесса с помощью Aspergillus niger
1928/29 Александр Флеминг открыл антибактериальное действие пенициллина
1943 Зельман Ваксман выделил стрептомицин
С 1949 Микробная трансформация стероидов в промышленных масштабах
С 1957 Получение глутаминовой кислоты ферментацией с Corynebacterium glutamicum
С 1960 Микробные протеиназы добавляют в стиральные порошки
С 1965 Применение микробного реннина в сыроварении
С 1970 Полученный ферментативными методами «сироп с повышенным содержанием фруктозы»
заменяет сахар в производстве безалкогольных напитков
1972/73 Стэнли Коэн и Герберт Бойер разработали стратегию переноса генов с помощью плазмидных
векторов
1975 Цезарь Мильштейн и Георг Келлер получили моноклональные антитела с использованием гибрида
С 1977 Производство рекомбинантных белков в бактериальных клетках
1982 Получены первые трансгенные растения, устойчивые к гербицидам, и трансгенные животные
(нокаутные линии мышей)
1985 Кэри Муллис разработал метод быстрой амплификации ДНК – метод ПЦР
С 1990 Начало реализации проекта «Геном человека»
1995 Трансгенные томаты разрешены к свободной продаже в США и Великобритании
С 1995 Попытки генной терапии на человеке
1996 Установлена нуклеотидная последовательность генома пекарских дрожжей
1996 Родилась овечка Долли – первое клонированное млекопитающее
1998 В базах данных содержится информация о последовательностях различных ДНК общим
размером 2 млрд п.н.
1999 Геном дрозофилы размером 1,6 млрд п.н. полностью прочитан за четыре месяца
1999 Получена культура клеток человека
1999 Годовой объем мирового рынка рекомбинантных белков для фармакологии превысил
10 млрд долл. США
2001 Опубликована расшифрованная последовательность генома человека длиной более 3 млрд п.н.
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

История биотехнологии Биотехнология сегодня

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОЛО- пии? Насколько приемлемы генетические методы


ГИЯ. В 1973 г. Стэнли Коэну и Герберту Бойеру в усовершенствования растений и животных в соответ-
Сан-Франциско удалось впервые ввести чужеродный ствии с нашими экономическими потребностями и
ген в бактериальную клетку и осуществить его экс- изменившимися условиями окружающей среды? Ка-
прессию. Спустя всего лишь 10 лет первый медицин- кими должны быть экономические отношения между
ский препарат, полученный методами генетической развивающимися и индустриально развитыми стра-
инженерии, был допущен к применению, а в настоя- нами в период расцвета биотехнологии? Каковы эко-
щее время число таких препаратов уже превысило логические последствия вмешательства человека в
несколько десятков. Среди них такие важные лекар- биологическое разнообразие видов на Земле? Отве-
ственные препараты, как инсулин (применяют при са- ты на эти и многие другие этические вопросы еще не
харном диабете), эритропоэтин (при малокровии), найдены. Возможность расширения функциональных
фактор VIII (при заболеваниях крови) и β-интерферон способностей человека – лишь вопрос времени, и
(при рассеянном склерозе). Сотни других препаратов вскоре этическая сторона биотехнологии также ста-
находятся на стадиях разработки и клинических ис- нет предметом дискуссии.
пытаний. В последнее время методы генетической ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Многие современные
инженерии находят применение не только в медици- фармацевтические препараты представляют собой
не, но и в сельском хозяйстве. Так, в странах Север- рекомбинантные белки или созданы с применением
ной Америки широкое распространение получили методов генетической инженерии. Знание структуры
трансгенные растения, обладающие повышенной ус- генома человека и принципов его функционирования
тойчивостью к насекомым или к действию гербици- играет все большую роль в медицинской диагности-
дов. Современные генно-инженерные технологии ке. Методы генетической инженерии получают все
позволяют получать растения с улучшенными пище- более широкое распространение в животноводстве,
выми показателями или со специфическими декора- растениеводстве, а также в пищевой промышленно-
тивными характеристиками, а также создавать сорта сти. Объем рынка продукции генетических техноло-
древесины, обладающие новыми свойствами. В хи- гий составляет около 30 млрд долларов США
мической промышленности все большее значение (2004 г.) и продолжает стремительно увеличивать-
приобретает биокатализ – использование микроорга- ся. Эти данные относятся только к традиционной
низмов или ферментов для осуществления стадий продукции, получаемой путем ферментации без уче-
химического синтеза. Центральным направлением та производства алкогольных напитков.
современной генетической инженерии, несомненно,
является исследование генома. К настоящему вре-
мени удалось секвенировать геномы более 200 мик-
роорганизмов и некоторых высших животных, в том
числе человека. Полученная информация использу-
ется при разработке новых лекарств, а также при
изучении молекулярных основ сложных болезней с
помощью функционального анализа генома (протео-
мика). Методы генной терапии позволяют осуществ-
лять замену поврежденных генов, являющихся при-
чиной заболевания, на «здоровые». Разработки в
этой области подкрепляются исследованиями в кле-
точной биологии, которая также стремительно разви-
вается в последнее время.
ЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Овца Долли, родившаяся в
1996 г., – первое клонированное млекопитающее,
генетически полностью идентичное своей биологиче-
ской матери. Ее появление вызвало бурную общест-
венную реакцию, особенно в связи с фантастически-
ми темпами развития эмбриологии в последние
десятилетия. На какой стадии эмбрион может счи-
таться человеком? Каково наше отношение к клони-
рованию человека? Что такое болезнь с точки зрения
индивидуума и общества? Как меняется возрастная
10 структура популяции в связи с успехами генной тера-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Направления современной биотехнологии


Здоровье • Пища
Экологически чистые технологии • Рациональное ведение сельского хозяйства

Фармацевтическая
продукция

Трансгенные
Диагностика растения
генетических
заболеваний
Генная
терапия

Здоровое
питание

Биологическая
защита растений Продукты
повседневного
потребления
Трансгенные
животные Охрана
окружающей
среды

Этические вопросы

Микробиология Биоинформатика
Биохимия Клеточная Биотехнологии
биология Генетика

Рынок некоторых продуктов биотехнологии (на 2004 г.)


Объем Объем мирового Рыночная цена,
производства, т рынка, евро евро/кг
Пиво 155 000 000 450 млрд 2,50
Этанол 35 000 000 9 млрд 0,25
Глутаминовая кислота 1 500 000 1 500 млн 1,00
Лимонная кислота 1 200 000 1 200 млн 1,00
Протеазы для стиральных порошков 1 000 300 млн 3,00
Цефалоспорины – 9 млрд –
Аспартам 30 000 150 млн 5,00
Тетрациклины 4 500 900 млн 20,00
Инсулин 8 1 млрд 125,00
Эритропоэтин 0,025 10 млрд 400 000,00
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнологическое производство пищевых продуктов Алкогольные напитки

ВВЕДЕНИЕ. Напитки, содержащие этиловый спирт, в той винограда, или при помощи культуры чистых винных
или иной мере распространены во всех мировых культу- дрожжей определенного штамма (Saccharomyces cerevi-
рах. В Западной Европе это пиво, вино, сброженные siae или S.ellipsoideus). Продолжительность брожения со-
фруктовые соки и игристые вина, а в странах Азии это, ставляет от нескольких дней до нескольких месяцев в за-
прежде всего, рисовая водка сакэ. Во многих регионах висимости от состава сусла и температуры ферментации.
существуют традиции получения своеобразных, харак- При изготовлении сухих вин сахар сбраживается полно-
терных только для этой местности напитков, в которых в стью, а полусладких и сладких вин – брожение прерывают
разных концентрациях содержится этанол: в Средней искусственно. При необходимости продлить процесс бро-
Азии это кумыс, получаемый из молока кобыл, в Вос- жения, в среду культивирования добавляют сусло, предва-
точной Европе – квас, на Ближнем Востоке – пиво на рительно законсервированное обработкой СО2 под давле-
основе проса, а в странах Южной Америки – пиво, полу- нием 8 бар. Вина различают по содержанию сахара и
чаемое путем сбраживания сока агавы. спирта. Сухие вина содержат не более 9 г сахара/л, полу-
ВИНО. Вино получают путем сбраживания виноградного сухие – не более 18 г/л, а десертные вина – свыше 18 г/л.
сока с помощью дрожжей. На вкусовые качества вина (бу- Содержание спирта в вине также определяет его принад-
кет) оказывают влияние множество факторов, среди кото- лежность к тому или иному сорту: если вино готовят без
рых наиболее важными являются сорт винограда, условия внесения в сусло добавок, содержание спирта в нем не
его выращивания, погодные условия, при которых произ- может быть выше 12% об.; в крепленые вина добавлен
водится сбор винограда и, конечно, технология приготов- этиловый спирт (более 12% об.). Молодое вино выдер-
ления вина. Виноделие включает несколько стадий. Пер- живают. Совокупность химических, биологических и фи-
вая стадия – это предподготовка: сбор винограда, его зических процессов, которые протекают при выдержива-
дробление и прессование, то есть получение сока, после- нии вина, способствует созреванию его вкуса; при этом
дующая переработка (различна для красного и белого ви- необходимо, чтобы рН >3,2 – такие условия благопри-
на) и сбраживание сока с образованием молодого вина. ятствуют росту молочнокислых бактерий, которые в ходе
Вторая стадия – обработка вина, его выдерживание и роз- малатно-лактозной ферментации превращают яблочную
лив. В процессе дробления и прессования ягоды освобож- кислоту в значительно более слабую молочную кислоту
даются от косточек и кожицы (мезги). В случае белых вин и СО2.
мезгу быстро отделяют от сусла, а при традиционной тех- ИГРИСТЫЕ ВИНА получают из столовых (натуральных) вин.
нологии переработки по «красному способу» без разделе- В вино добавляют 1–3% сахарозы и дрожжи. Сбражива-
ния выдерживают при температуре 20 °С для того, чтобы ние, осуществляемое в бутылках или закрытых резервуа-
антоцианы, содержащиеся в кожице ягод, перешли в сок. рах, протекает с образованием этанола и СО2. При темпе-
В современном производстве применяют и другие спосо- ратуре 20 °С избыточное давление в бутылках с готовым
бы извлечения красящих веществ из мезги: например, на- игристым вином должно составлять не менее 3 бар.
гревание до 40–50 °С или добавление пектиназ к мезге КРЕПКИЕ СПИРТНЫЕ НАПИТКИ с содержанием спирта
приводит к быстрому высвобождению антоцианов в рас- 30–60% получают в результате сбраживания сахаросо-
твор. Высококачественные (сортовые) вина изготавлива- держащих экстрактов зерна, корнеплодов и фруктов и по-
ют, как правило, из одного сорта винограда, однако допу- следующей дистилляции. Сырьем для бренди и коньяков
скается смешивание сусла, полученного из различных служит виноград, для корна и виски – кукуруза, водки –
сортов (купажные вина); в неурожайные годы это вызвано картофель, текилы – сок агавы и т.д.
необходимостью. В зависимости от технологии к получен- РИСОВАЯ ВОДКА (САКЭ). Производство рисовой водки в
ному суслу добавляют сахар, кислоты, небольшие количе- большей мере напоминает пивоварение, чем виноделие,
ства CaCO3 для нейтрализации кислоты и также неболь- так как сбраживаемым углеводом является крахмал, одна-
шие количества SO2 или пиросульфита калия (этап ко в отличие от производства пива процесс ферментации
сульфитирования). Эти добавки улучшают вкусовые каче- при получении сакэ осуществляется в анаэробных услови-
ства вина, предотвращают рост нежелательных аэробных ях. Сваренный на пару рис размельчают и смешивают со
микроорганизмов (таких как уксуснокислые бактерии или спорами гриба Aspergillus oryzae; в результате инкубации в
плесневые грибы) при брожении, препятствуют окислению течение нескольких дней при высокой влажности и темпе-
натуральных красящих веществ и ароматизаторов и инги- ратуре 30 °С происходит частичный гидролиз крахмала
бируют фенолоксидазу – фермент, в результате действия под действием ферментов гриба. Продукт (коджи) смеши-
которого вино при сбраживании приобретает коричневый вают с распаренным рисом и засевают штаммом дрожжей
цвет. Традиционно брожение проводили в деревянных (мото). Брожение продолжается в течение 20 дней при
бочках, однако в современном производстве чаще исполь- 25 °С, и к концу ферментации сакэ содержит не менее
зуют резервуары из полимерных материалов или высоко- 20% спирта. Перед продажей концентрацию спирта дово-
качественной стали. Брожение может происходить с уча- дят до 16% по объему, напиток фильтруют и пастеризуют.
12 стием диких штаммов дрожжей, содержащихся в кожице
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Алкогольные напитки
Пиво При прорастании зерен ячменя содержащийся в них крахмал гидролизуется под действием
ферментов, затем полученные сахара сбраживают дрожжами
Вино Сбраживание виноградного сока дрожжами
Игристое вино Дополнительное сбраживание вина, к которому добавляют сахар и дрожжи
(шампанское)
Сидр Сбраживание яблочного сока дрожжами
Сакэ Крахмал, содержащийся в зернах риса, гидролизуется под действием ферментов
гриба Aspergillus oryzae, а затем полученные сахара сбраживают дрожжами
Виски Экстракты из ячменя, пшеницы, ржи или кукурузы сбраживается, а затем подвергается
дистилляции
Водка Экстракт картофеля или пшеницы сбраживается, а затем подвергается дистилляции

Объем мирового рынка алкогольных напитков


Пиво Вино Сакэ
Всего произведено 1 550 млн Всего произведено 261 млн
в 2004 г. гектолитров в 2002 г. гектолитров

Из них: Из них: Япония 8,4 млн


Китай 277 млн Франция 53 млн (2004) гектолитров
США 238 млн Италия 51 млн
Германия 105 млн Испания 31 млн
Бразилия 90 млн США 20 млн
Япония 70 млн Аргентина 16 млн
Великобритания 58 млн Австралия 10 млн
Россия 838 млн Германия 9 млн

Общая схема производства пива, вина и сакэ


Созревание в специ-
Молодое альных условиях
Ячмень, солод, вода Пиво
пиво
Сусло, коджи Спиртовое
Мальтоза, Созревание в специ-
брожение Молодое альных условиях
Отжатый виноградный сок другие сахара, Вино
вкусовые добавки, Дрожжи, вино
хмель Zymomonas Созревание в специ-
Распаренный рис, вода, альных условиях
Мороми Сакэ
споры Aspergillus oryzae

Схема процесса получения вина


Плоды винограда 2 1 Получение сока
Добавление 2 Переработка сока
1 Подготовка сахара
виноградного сырья: 3 Брожение сока
удаление плодоножек,
дробление ягод 4 Созревание в специ-
альных условиях
1 Получение сусла:
сок, кожица
и косточки ягод
~97% массы
Сульфитирование вина

Центрифуга
3 Спиртовое брожение
CO2

Выжимки
Фильтровальный пресс
3 Дополнительное
брожение
Добавление виноградного сусла в деревянных бочках
1 Брожение сусла

Получение
красных вин
Получение
белых вин Розлив в бутылки (частично или полностью 4 Добавление
автоматизированный процесс) стабилизаторов 13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнологическое производство пищевых продуктов Пивоварение

ВВЕДЕНИЕ. Пиво – один из самых древних алкогольных то есть «экстрактивности начального сусла» разделяют
напитков; в наши дни пиво не утратило своей популяр- сорта с содержанием более 16%, 11–14%, 7–8% и
ности. Его получают из ячменного сусла с помощью 2–5,5%. Сорта пива различаются а) по составу сырья и
пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Объем степени очистки конечного продукта; б) по используе-
мирового производства пива в 2004 г. достиг мым дрожжевым культурам: либо это дрожжи, осущест-
1,6 млрд гектолитров (160 млн тонн). Основные вляющие «верховое» брожение, которые в процессе
страны-производители пива – Китай, США и Герма- ферментации остаются во взвешенном состоянии и не
ния. В Германии с 1516 г. закон разрешал использо- сбраживают дисахарид мелибиозу, либо дрожжи, осу-
вать в пивоварении только ячменный солод, хмель, ществляющие «низовое» брожение, которые оседают на
воду и дрожжи, а для пшеничного пива – пшеничный дно и обладают способностью сбраживать мелибиозу;
солод. В других странах в качестве источника крахма- в) по режиму ферментации (время и температура) и по-
ла и ферментов наравне с ячменем и пшеницей слу- следующего выдерживания.
жат и другие зерновые культуры (например, просо ПИВО С ПОНИЖЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АЛКОГОЛЯ
или сорго), а также допустимы некоторые добавки, в И БЕЗАЛКОГОЛЬНОЕ ПИВО. Для производства таких
том числе ферменты. Современная технология пиво- сортов пива разработаны два технологических под-
варения позволяет получать легкое пиво со снижен- хода: 1) экстрактивность начального сусла состав-
ным содержанием алкоголя, а также безалкогольные ляет 7–8%, и процесс сбраживания останавливают,
сорта. В Германии на долю таких сортов приходится когда содержание алкоголя достигнет 0,5%; 2) из
около 3% объема производства. обычного пива с экстрактивностью начального сусла
ПРОИЗВОДСТВО ПИВА. Прежде всего получают солод. 12–13% удаляют спирт путем вакуумного выпарива-
Для этого ячмень инкубируют в определенных условиях ния или специального фильтрования. В настоящее
до прорастания зерна. На этой (первой) стадии происхо- время ведется разработка биореактора с иммобили-
дит активация ферментов; пророщенное зерно сушат. зованными дрожжевыми клетками, в котором про-
Затем солод затирают – нагревают и выдерживают при цесс останавливается автоматически при содержа-
строго определенной температуре: при этом происходит нии алкоголя 0,5%.
частичный гидролиз белков и углеводов, катализируе- НОВОЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ ПИВОВАРЕНИЯ. Современ-
мый ферментами. Полученный водный экстракт, называ- ная биотехнология пивоварения развивается по сле-
емый пивным суслом, кипятят около 2 часов, добавляя в дующим направлениям: а) получение трансгенного
него хмель, который придает пиву характерный горькова- ячменя с ферментами, обладающими улучшенными
тый вкус, а содержащиеся в хмеле дубильные вещества свойствами, например с термостабильной β-глюкана-
служат в качестве консервирующих агентов и облегчают зой; б) применение молочнокислых бактерий в каче-
фильтрацию. При кипячении пивное сусло в значитель- стве стартовой культуры для сбраживания солода с
ной степени концентрируется, затем в пивное сусло вно- целью предотвратить заражение солода грибами рода
сят клетки определенного штамма дрожжей и культиви- Fusarium и другими микроорганизмами; в) сокраще-
руют сначала в аэробных, а затем в анаэробных условиях ние времени выдерживания пива, необходимого для
в течение нескольких дней. Дрожжи превращают сахара разложения диацетилов, посредством добавления
в спирт и углекислый газ. В зависимости от выбранной бактериальной α-ацетолактатдекарбоксилазы – фер-
технологии в конце ферментации содержание спирта со- мента, который переводит α-ацетолактат непосредст-
ставляет 2–18% объема сусла. Для окончательного со- венно в ацетат, минуя стадию образования диацети-
зревания пиво выдерживают при температуре около 0 °С лов; г) использование рекомбинантных штаммов
от нескольких дней до нескольких недель. При этом оса- S. cerevisiae, синтезирующих α-ацетолактатдекарбок-
ждаются вещества, вызывающие помутнение пива, а не- силазу или амилазы. При ферментации, осуществля-
приятный привкус, обусловленный образованием диаце- емой такими штаммами, становится возможным по-
тила, исчезает в результате разложения диацетила на лучать сорта пива с низким содержанием углеводов.
ацетоин и 2,3-бутандиол. Использование на дальнейших Технологический процесс пивоварения также непре-
стадиях различных добавок, в том числе ферментов, рывно совершенствуется: так, продолжительный этап
значительно влияет на вкусовые качества пива. После созревания пива, необходимый для приобретения им
фильтрации пиво, предназначенное для продажи на экс- специфических вкусовых качеств, в современном
порт, пастеризуют. производстве заменен кратковременным нагревани-
СОРТА ПИВА. Известно несколько вариантов классифи- ем до 90 °С и последующим созреванием в биореак-
кации сортов пива: в зависимости от использованной торе с иммобилизованными дрожжевыми клетками
культуры дрожжей выделяют сорта низового (лагер, на протяжении всего двух часов.
пилзнер) и верхового брожения (вайс, альт, кельш, пор-
14 тер, эль и стаут). По исходному содержанию сусла,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Схема процесса пивоварения


5 6 1 Солод 10 Воздух
1
2 Мельница 11 Дрожжи
грубого помола 12 Резервуар
3 7 3 Вода для брожения
2 4 4 Затирание солода 13 Резервуар
5 Очистка для хранения
8 14 Фильтр
6 Хмель
12 7 Кипячение сусла 15 Резервуар
13 11 10 под давлением
8 Гидроциклонный чан
15 16 Розлив
14 9 Пластинчатые
9 теплообменники
16

Стадия Процедура Условия/особенности


1 Соложение Проращивание Около 8 сут. при 10–18 °С, рН 7,0: происходит активация
зерен ячменя амилаз и протеаз
Высушивание Сушка Постепенное повышение температуры до 125 °С, содержание
солода проросших зерен воды после высушивания не превышает 1,5–3%; такой солод
может храниться длительное время
Удаление ростков Отшелушивание Ростки поступают на корм скоту
ростков
4 Затирание солода Повторная акти- Амилазы, содержащиеся в солоде, гидролизуют крахмал
вация ферментов до декстринов и мальтозы
солода, гидролиз
крахмала
5 Фильтрация Удаление высоко- Удаление нерастворимых компонентов (пивной дробины)
молекулярных
веществ
6, Кипячение сусла Добавление Раствор солода кипятят с хмелем 1,5–2,5 часа. При этом
7 с хмелем веществ, опреде- происходит инактивация ферментов солода, растворение
ляющих специ- добавленных веществ, придающих пряный аромат, гидролиз
фический аромат многих белков, концентрирование раствора и его стерилизация
пива
8 Осветление сусла Вращение сусла
Удаление денатурированных белков и других полимеров
в результате вращения сусла
9 Охлаждение сусла Охлаждение Удаление других белков и полимеров
11 Внесение культуры Инокуляция В сусло добавляют клетки чистой культуры
дрожжей Saccharomyces cerevisiae
12 Основное брожение Брожение «Низовое» брожение: 8–10 сут. при 5–10 °С;
с образованием «верховое» брожение осуществляется дрожжами в присутствии
молодого пива молочнокислых бактерий: 2–3 сут. при 10–25 °С
Удаление клеток В случае низового брожения применяют декантацию,
дрожжей при верховом брожении дрожжи удаляют с поверхности
13 Дозревание Несколько дней–недель при 0 °С. Осаждаются вещества, вызыва-
ющие помутнение пива, а диацетил превращается в ацетоин
14 Фильтрация, Экспортные сорта пива (16)
пастеризация

Рекомбинантные штаммы дрожжей


Крахмал, Мальтоза,
глюканы глюкоза Пируват α-ацетолактат L-Валин
Экспрессия 1
Экспрессия α-ацето-
амилазы, Ацетальдегид Диацетил лактатдекарбоксилазы
глюканазы
2
Этанол Ацетоин 2,3-Бутандиол

Процесс созревания пива с использованием иммобилизованных дрожжей


Реакция 1 Реакция 2

удаление прогревание созревание в проточном


из основного дальнейшая
клеток при 90 °С реакторе с иммобилизованными
ферментера в течение 10 мин обработка
дрожжей дрожжами при 15 °С в течение 2 ч
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнологическое производство пищевых продуктов Ферментация в пищевой промышленности

ВВЕДЕНИЕ. Процессы ферментации с ипользова- ментация приводит к образованию молочнокислого


нием микроорганизмов нашли широкое применение сгустка, из которого вызревает сыр. В производстве
в производстве пищевых продуктов. Реакции, осу- сыров используют самые разные микроорганизмы,
ществляемые микроорганизмами, используются при чаще всего Penicillum (камамбер, рокфор), Streptococ-
консервировании, рН среды понижается в результа- cus (эмменталь) и Lactococcus (гарцер). Разнообразие
те молочнокислого брожения (в квашеной капусте), сортов сыра объясняется различным происхождением
после частичного гидролиза в присутствии микроор- молока (коровье, козье или овечье), технологией про-
ганизмов (хлебная закваска, колбасные изделия, изводства (аэробные, анаэробные или смешанные ус-
темпех) продукты лучше усваиваются организмом, ловия роста бактериальной культуры), а также мето-
для улучшения вкуса (кисломолочные продукты), а дами введения стартовых культур (поверхностное
также для получения соусов (соевый соус, мисо из нанесение или внутреннее впрыскивание).
риса). В развитых странах примерно треть всех про- КАКИЕ ПРОДУКТЫ ПОЛУЧАЮТ ПУТЕМ ФЕРМЕНТА-
дуктов питания получают путем ферментации, осу- ЦИИ НЕ В ЕВРОПЕЙСКИХ СТРАНАХ. В китайской кухне
ществляемой определенными штаммами микроорга- традиционно используется так называемый красный
низмов. рис (ang-kak). Его получают, добавляя к влажному
СТАРТОВЫЕ КУЛЬТУРЫ. В пищевой промышленно- рису споры Monascus purpureus. Благодаря антимик-
сти используются самые разнообразные микроорга- робным свойствам красный рис получил широкое
низмы. Они служат в качестве стартовых культур при распространение в качестве приправы, его также
приготовлении кисломолочных продуктов, различных применяют при нарушениях пищеварения. В восточ-
сортов хлеба (закваски), выпечки (пекарские дрож- ной кухне готовят кишк (kishk), для этого набухшие
жи), в пивоварении (пивные дрожжи) и виноделии. зерна пшеницы подвергают ферментации бактерия-
Стартовая культура может содержать только один ми, обитающими в кислом молоке. Японская припра-
штамм микроорганизмов, различные микроорганиз- ва мисо получается в результате добавления к пропа-
мы одного вида и смешанные культуры. Наиболее ренному риса грибов Aspergillus oryzae. По очень
важным критерием качества культуры является вы- древнему рецепту китайской кухни до сих пор готовят
сокая скорость ферментации и получение желаемого соевый соус – белковый гидролизат, обладающий
продукта, например обладающего устойчивостью к сильным ароматом. Для этого в смесь соевой муки и
антибиотикам или фаговой инфекции. Объем рынка пшеничных отрубей впрыскивают культуры грибов
стартовых культур в мире составляет сотни миллио- Aspergillus oryzae; в условиях повышенной влажности
нов долларов США. при температуре 35 °С образуется поверхностная
ПРОИЗВОДСТВО КОЛБАС. Сырокопченые колбасы культура. После добавления равного объема водного
(они могут храниться вне холодильной камеры) гото- раствора соли смесь подвергают ферментации мо-
вят со стартовой культурой стафилококковых бакте- лочнокислыми бактериями или дрожжами в течение
рий (Staphylococcus carnosus) и лактобактерий, а года при комнатной температуре. Путем фермента-
также бактерий рода Penicillium. Гликоген мышечной ции соевых бобов или пропаренного риса под дейст-
ткани перерабатывается микроорганизмами с обра- вием грибов Rhizopus oligosporus готовят темпех
зованием молочной кислоты, это позволяет снизить (tempeh) – основную пищу населения Индонезии и
уровень рН ниже 5 и предотвратить рост многих дру- Малайзии.
гих микроорганизмов. В кислой среде белок мышеч-
ной ткани (изоэлектрическая точка 5,3) переходит в
желеобразное состояние. Продукты ферментативных
превращений жиров и белков обеспечивают специ-
фический вкус колбасного изделия. При изготовле-
нии соленых колбас (поваренная соль, нитраты и ни-
триты в качестве консервантов) используют
стафилококковые бактерии или лактобактерии,
устойчивые к повышенному содержанию соли.
СЫРОВАРЕНИЕ. В 1994 г. мировое производство сыра
достигло 14,6 млн т в год, при этом около 6 млн т сы-
ра было произведено в странах Европейского союза
(ЕС). В Европе производится более 1000 сортов сыра.
Чтобы приготовить сыр, молоко сбраживают, добавляя
в него сычужный фермент или рекомбинантный химо-
16 зин. Спровоцированная стартовыми культурами фер-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Получение стартовых культур


День 1 День 2 День 3 День 4
Если культура хранилась
в замороженном или жидком виде,
ее пересевают ежедневно

Вариант 1:
Для проверки
стартовой культуры –
проведение тестов.
Занимает до 3 сут.

Вариант 2:
Использование
без предварительной
проверки
Промышленный ферментер
«Предкультура»
Среда, содержащая фосфаты
Питьевая вода для снижения риска фаговой инфекции

К промышленному ферментеру
Резервуар
(9 000 л) Насос

Производство сыра
Сырое молоко Внесение стартовой Свертывание молока Добавление соли
пастеризация культуры (закваски) добавление сычужного Удаление придание формы,
созревание фермента, перемеши- сыворотки прессование, высу-
вание, отстаивание шивание, созревание

Производство соевого соуса


Коджи Мороми Окончательная подготовка
Соевая мука, пшеничные отруби, Добавление равного объема перед употреблением в пищу
твердофазная ферментация солевого раствора; Фильтрация,
с Aspergillus oryzae, длительное созревание пастеризация,
72 ч, 35 °С, 90% влажности консервирование

Традиционные продукты, получаемые путем ферментации в незападноевропейских странах


Продукт Страна Использование Сырье Микроорганизмы
Коджи (Koji) Япония Предшественник Соя, пшеница, Aspergillus oryzae,
соевого соуса и мисо распаренный рис Aspergillus sojae
Шойю Япония Темные соусы Kоджи Pediococcus sp.
(соевый соус)
Мисо Япония Светлые соусы Коджи Aspergillus
(соевая Молочнокислые бактерии
паста)
Тофу (Tofu), Япония, Коагулированный Соевые бобы, Mucor sufu и др.
суфу (Sufu) Китай белок соевое молоко
Натто Япония Острые соусы Распаренные в еловой Bacillus natto
(Natto) хвое соевые бобы

Темпех Индонезия Гарниры Вареные соевые бобы Rhizopus oligosporus


(Tempeh) в банановых листьях

Анг-как Индонезия, Приправы, пищевой Распаренный рис Monascus purpureus


(Ang-kak) Китай краситель, в терапии
желудочных расстройств
Гари (Gari) Нигерия Гарниры Маниок Geotrichum, Corynebacterium
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотехнологическое производство пищевых продуктов Пищевые продукты и молочнокислое брожение

ВВЕДЕНИЕ. История использования человеком про- ЗАКВАШИВАНИЕ ОВОЩЕЙ И ОВОЩНЫХ СОКОВ.


цессов молочнокислого брожения молока (кисломо- В Германии особой популярностью пользуются ква-
лочные продукты), овощей (квашеная капуста) и кор- шеная капуста и соленые огурцы (заготавливаются и
мов для скота (силос) насчитывает сотни, а для реализуются через торговую сеть около 200 000 т в
некоторых процессов и тысячи лет. Луи Пастер, впер- год). Для заквашивания обычно используют бело-
вые выделивший молочнокислые бактерии в 1856 г., кочанную капусту, которую помещают в бочки вме-
заложил основы для понимания биохимии этого важ- стимостью до 100 т. Как правило, процесс брожения
ного процесса. Продукты, получаемые в результате осуществляется разнообразными микроорганизмами
молочнокислого брожения, обладают хорошими вку- (бактериями, дрожжами и грибами) в результате
совыми качествами и долго хранятся, так как сниже- спонтанного заражения, однако в некоторых случаях
ние pH, происходящее в процессе брожения, препят- брожение инициируют добавлением закваски (стар-
ствует развитию других микроорганизмов. товых культур). В качестве других примеров исполь-
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ. Группа молочнокис- зования в пищу овощей, подвергшихся молочнокис-
лых бактерий весьма гетерогенна по морфологии лому брожению, можно привести квашеную свеклу
клеток, однако физиология ее представителей опи- (Польша и Россия) и кимчи (кислая китайская капус-
сана достаточно однозначно: все молочнокислые та или редька, Корея). Овощные соки, подвергшиеся
бактерии окрашиваются по методу Грама и являются ферментации молочнокислыми бактериями, особен-
облигатными аэробами, т. е. они не синтезируют но богаты витаминами и минеральными веществами,
гемсодержащие белки (каталазы), однако могут рас- хорошо усваиваются организмом и хранятся продол-
ти в присутствии кислорода. Молочнокислые бакте- жительное время (например, морковный и томатный
рии расщепляют лактозу до глюкозы и галактозы, а соки).
затем превращают их в лактат. При «гомофермента- ЗАКВАСКА. В отличие от пшеничной муки, использу-
тивном» молочнокислом брожении (также называ- емой для приготовления дрожжевого теста, ржаная
емом гликолизом), которое осуществляют Strepto- мука закисает при рН <4,3; это позволяет получать
coccus pyogenes, Lactobacillus casei и Lactococcus своеобразную корочку при выпекании хлеба из ржа-
lactis, из 1 моль глюкозы образуется 2 моль лакта- ной муки. В закваске для теста при рН 4,2 наряду с
та, а при «гетероферментативном» брожении, осу- молочнокислыми бактериями содержатся дрожжи.
ществляемом Leuconostoc mesenteroides и Lactoba- СИЛОСОВАНИЕ – распространенный способ заготовки
cillus brevis, – только 1 моль лактата. От наличия сочных кормов, в частности, кормовой свеклы. Си-
лактатрацемазы в клетках бактерий зависит образу- лосную культуру измельчают, а затем помещают в
ется ли L-(+)-молочная кислота (обычно выход специальные хранилища с ограниченным доступом
50–90%), D-(–)-молочная кислота или их рацемат. воздуха. В таких условиях осуществляется процесс
Физиологическую ценность кисломолочных продуктов молочнокислого брожения. Если молочная кислота
трудно переоценить: в них нет лактозы и они содержат образуется в недостаточных количествах, силос мо-
белки, уже подвергшиеся мягкому гидролизу. жет оказаться зараженным маслянокислыми бакте-
КИСЛОМОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. Среди кисломолоч- риями, в том числе представителями клостридий.
ных продуктов в Европе наиболее распространены В этом случае бактерии могут попасть в молоко ко-
простокваша, сметана, йогурт, кефир и пахта (<1% ров, которые питались зараженным силосом. Как
жира). Эти продукты получаются при бактериальном правило, в силосе присутствует психотрофный пато-
заражении сырого молока в естественных условиях ген Listeria monocytоgenes, который в случае несо-
хранения. В йогурте содержание L-(+)-молочной ки- блюдения правил пастеризации может активно раз-
слоты более 95%. Этот продукт производят, множаться на пищевых продуктах (в мягких сырах,
используя Lactobacillus acidophilus или облигатно ана- мясном фарше и зеленом салате) при длительном
эробный штамм L. bifidus, обнаруженный в кишечной хранении в холодильнике.
флоре грудных младенцев. Йогурты особенно
хорошо усваиваются организмом и оказывают стиму-
лирующее действие на иммунную систему.
В результате реакций, осуществляемых бактери-
альными протеазами и липазами, кисломолочные
продукты приобретают своеобразный вкус. Наиболее
важными микроорганизмами для производства мо-
лочных продуктов являются стрептококки, лактоба-
ктерии, Leuconostoc и дрожжи.
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Молочнокислое брожение
Бактерии, осуществляющие Бактерии, осуществляющие
гомоферментативное молочнокислое брожение гетероферментативное молочнокислое брожение
Lactococcus lactis L. salivarius Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus pyogenes L. casei Leuconostoc lactis
Lactobacillus delbrueckii и др. Lactobacillus brevis
L. helveticus и др.

Гомоферментативное Лактоза Гетероферментативное


брожение брожение

2 молекулы Гликолиз Глюкоза Пентозофосфатный путь Лактат Ацетат/этанол CO2


лактата C6 C3 C2 C1
2 × C3

Кислое тесто
Пшеница Рожь
Доля мировой территории, 33 <3
занятой под злаковые культуры (%)
Основной тип теста Дрожжевое тесто Кислое тесто
Вещество, удерживающее газы при выпекании Клейковина (глютен) Пентозан, белки после закисания теста
Плотность хлеба (объем/масса) 3,5 2,0

Исходная закваска 0,5 кг

6 ч, 27 °С
Тесто быстрой закваски 3,4 кг

9 ч, 30 °С
Ржаная Тесто основной закваски 25,5 кг Вода
мука
3 ч, 28 °С
Тесто конечной закваски 81 кг
Опара,
Хлеб из кислого формовка, Кислое тесто 160 кг
теста выпечка

Квашеная капуста, йогурт и силос


Квашеная капуста Силос
Нарезанная 2–2,5% Рост популяции бактерий и образование кислоты
белокочанная поваренной в процессе ферментации
капуста соли
Спонтанное закисание
Анаэробная ферментация в бочках
объемом до 100 т, 18–20 °С
2,0
При концентрации молочной кислоты 108
> 1,5% отфильтровывают, пастеризуют 1,6
и готовят к продаже
Число клеток

Кислота, %

Йогурт 107 1,2


Молоко
Гомогенизированное, пастеризованное; 0,8
возможны добавки, например кусочки фруктов 106
0,4
Термостатный способ Резервуарный способ
Добавление Заполнение больших 105
стартовых культур*, резервуаров, добавле- 2 4 6 8 10 12 14
расфасовка для ние стартовых культур*, сут.
продажи, инкубация, инкубация, охлаждение
охлаждение до 4 °С до 4 °С, расфасовка Аэробные штаммы
для продажи
Гетероферментативные молочнокислые бактерии
Гомоферментативные молочнокислые бактерии
* Например, Lactobacillus bulgaricus,
Образование кислоты
L. acidophilus, Streptococcus thermophilus 19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Этиловый спирт

ВВЕДЕНИЕ. Этиловый спирт (этанол) используется как клеток дрожжей катаболитами. При концентрации глю-
сырье в химическом производстве, как растворитель, а козы >0,1%, поэтому в промышленном процессе эта-
также как топливо. В 2004 г. мировое производство эта- нола применяют специальные методы контроля концен-
нола составило 45 млрд л (34,6 млн т), из которых трации глюкозы в среде («fed-batch»). Другой причиной
лишь 2,3 млрд л были получены из этилена – продукта замедления роста дрожжей может быть высокая кон-
переработки нефти и природного газа. Более двух центрация этанола, поэтому из культуральной среды
третей этанола, поступающего на рынок, получают из следует непрерывно удалять этанол (через 72 ч его кон-
глюкозы биотехнологическими методами с помощью центрация достигает ≥8% об.) путем азеотропной пере-
анаэробных дрожжей и бактерий. Традиционная техно- гонки. При этом получают 95%-й этанол, который годит-
логия производства этанола использовалась во многих ся в качестве топлива. Абсолютный (100%) этанол
странах, затем стало экономически выгоднее получать получают путем специальных методов дистилляции,
этанол из продуктов переработки нефти. В последние фильтрации через молекулярные или мембранные
годы в связи со значительным ростом мировых цен на фильтры. При повторном использовании культуры вре-
нефть все чаще обращают вниимание на биотехнологи- мя ферментации сокращается, например, по методу
ческие подходы как резервную стратегию. Брожение мо- Мелле-Войно дрожжевые клетки концентрируют цент-
жет снова стать основным способом промышленного по- рифугированием, полученной суспензией засевают дру-
лучения этанола лишь при условии очень низких цен на гой биореактор. Промышленная технология может быть
биомассу или слишком высоких цен на энергоносители. усовершенствована, если будет разработана непрерыв-
С 1975 г. в Бразилии и США этанол используют в каче- ная технология брожения. Теоретически такой процесс
стве топлива для двигателей внутренного сгорания. возможен, однако его практическое воплощение связа-
МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Для получения но с преодолением больших технических проблем. Пер-
этанола путем спиртового брожения самое важное спективно использование иммобилизованных дрожже-
значение имеют пекарские дрожжи Saccharomyces вых и бактериальных клеток.
cerevisiae. При гликолизе 1 моль D-глюкозы дает ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. Основным сырьем для
2 моль этанола. В бактериях Zymomonas mobilis, производства этанола являются меласса из сахарной
выделенных из сока агавы, этанол образуется в кето- свеклы (Бразилия) или кукурузный крахмал (США).
дезоксифосфоглюконатном пути (пути Энтнера–Дудо- В мире насчитывается более 700 крупных фирм, про-
рова). Оба этих микроорганизма не имеют ферментов изводящих этанол путем ферментации в периодиче-
для расщепления полисахаридов, поэтому перед тем, ском режиме. С 1975 г. в Бразилии осуществляется
как добавлять в питательную среду углеводы, их рас- масштабное производство этилового спирта из мелас-
щепляют до моносахаридов подходящими фермен- сы по простой технологии (периодическая фермента-
тами. Другой биотехнологический метод получения ция, дистилляция). Эту технологию применяют более
этанола основан на применении рекомбинантных 100 крупных производителей этанола; в настоящее
штаммов-суперпродуцентов, которые в результате время производство этилового спирта в Бразилии дос-
клонирования новых генов приобретают способность тигло 12 млрд л в год. В США с 1975 г. на некоторых
перерабатывать такие дешевые виды сырья, как крах- автозаправочных станциях продают автомобильное
мал, целлюлоза или гемицеллюлоза. Особый интерес топливо – смесь этанола (9:1; так называемый «газо-
представляют термофильные анаэробные бактерии хол»). В США производство этанола с использованием
Thermoanaerobacter ethanolicus, которые могут рас- осахаренного кукурузного крахмала в качестве пита-
щеплять многие углеводы. Оптимальные условия для тельной среды для роста дрожжей осуществляется с
роста этого микроорганизма – температура 69 °С, применением более сложных технологий (фермента-
рН среды 4,5–9,5. ция в периодическом режиме, мембранная очистка) и
ПЕРЕРАБОТКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТАЦИИ. достигло 10,6 млрд л в год (2003). В Бразилии и в
В основе промышленной технологии получения этанола США отходы промышленного получения этанола ис-
лежит процесс брожения, который осуществляется в пользуются как кормовые добавки. В Японии разрабо-
биореакторах объемом до 500 м3 в периодическом ре- тана экономичная технология с несколькими вариан-
жиме. В стандартных асептических условиях клетки тами непрерывного технологического процесса, где
дрожжей Saccharomyces cerevisiae менее подвержены применяются иммобилизованные клетки дрожжей. В
заражению молочнокислыми бактериями, чем Zymomo- экспериментальной установке, работающей в непре-
nas mobilis. В качестве бактериальной культуры исполь- рывном режиме, за 200 суток был получен 10%-й эта-
зуют дрожжи, выращенные на обогащенной сахарами нол, который очищали на мембранных фильтрах.
среде. Через 14–20 ч выход этанола достигает макси-
мума (~90% теоретического значения). Процесс обра-
20 зования этанола замедляется из-за подавления роста
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Этанол
С2Н6О
MR 46,07 Ткип 78,32 °С Промышленное получение: Н3С—СН2—ОН
D. 0,79367 (15 °С) Код CAS* 64-17-5 в основном гидратацией этилена
* Регистрационный номер Chemical Abstract Service. – Прим. ред.

Получение из мелассы
Воздух* Охлаждение
СО2 + воздух
Питательные S. cerevisiae
вещества, Резервуар
Меласса вода Центрифуга для этанола

Сепара- Вакуумная
тор** дистилляционная
колонна
Стерилизация (ректификация
в вакууме)
Возврат клеток
в производственный цикл
Пар
Отходы: Вода
кормовые Испаритель
добавки Стриппинг-
колонна
Вода
* Только во время роста Пар
** Экстрактор/установка для дистилляции/мембраны

Ферментация и дальнейшая переработка Этанол


Питательные вещества 1 2
Сахарный тростник, меласса
из сахарной свеклы или осахаренный
кукурузный крахмал, соли

Клеточный реактор Биореактор


Иммобилизованные Объем до 500 м3,
клетки, ферментация ферментация в непрерыв-
в непрерывном ном или периодическом
режиме режиме

Удаление этанола Происхождение атомов углерода в молекуле этанола


при сбраживании глюкозы
Дистилляция или первапорация
1 Saccharomyces cerevisiae Гликолиз
Переработка отходов
2 Zymomonas mobilis путь Энтнера–Дудорова
Кормовые добавки для скота

Организм Система Содержание Скорость Содержание Концентрация Максимальный


глюкозы, истощения, клеток, этанола, выход
г/л ч–1 г/л г/л продукта, г/л
1 Saccharomyces Без возврата 100 0,17 12 41 7,0
cerevisiae клеток в цикл
1 S. cerevisiae С возвратом 100 0,08 50 43 29
клеток в цикл
2 S. cerevisiae С возвратом 150 0,53 48 60,5 32
клеток в цикл
1 S. cerevisiae С возвратом клеток 334 0,23 124 110–160 82
в цикл, вакуум (6,7 кПа)
3 Zymomonas С возвратом 100 2,7 38 44,5 120
mobilis клеток в цикл
1 ATCC 4126; 2 NRLL Y-132; 3 ATCC 10988 – штаммы микроорганизмов 21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты 1-Бутанол, ацетон

ВВЕДЕНИЕ. 1-Бутанол имеет очень важное значение обеспечивают дальнейшие превращения ацетил-КоА
как растворитель лаков, используемых при покраске в С2-, С3- или С4-соединения. В реакции, катализиру-
автомобилей, а также как сырье в промышленном син- емой гидрогеназой, молекулярный водород служит
тезе (в реакциях этерификации). Объем мирового донором электронов. Знание механизмов регуляции
производства бутанола составляет 1,2 млн т в год. Ра- активности этого фермента может позволить осуще-
ньше бутанол служил сырьем при получении синтети- ствлять контроль за составом конечного продукта
ческого каучука из бутадиена. Ацетон также очень (metabolic engineering), поэтому в настоящее время
важный растворитель. В мире за год производится ведутся активные исследования, посвященные изу-
около 3 млн т ацетона. В современном производстве чению гидрогеназы. Геном C. acetobutyliсum полно-
основным источником сырья для синтеза этих соеди- стью прочитан, и с этим микроорганизмом возможны
нений служат продукты нефтехимической промышлен- генетические манипуляции. Так, разработаны чел-
ности. До 1950 г. ацетон и 1-бутанол получали в ос- ночные векторы для C. acetobutyliсum и Escherichia
новном при сбраживании мелассы или крахмала с coli и Bacillus subtilis, а также системы с использова-
помощью анаэробных бактерий рода Clostridium. нием транспозонов и специфических фагов. Метода-
В связи с новыми возможностями, которые открыва- ми генетической инженерии на основе диких и мутан-
ются в эпоху развития биотехнологии, ферментатив- тных штаммов удалось значительно повысить выход
ных методов получения ацетона и 1-бутанола вновь ацетона и 1-бутанола.
приобрели значение после их оптимизации и рассмат- ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ПРОЦЕСС И ПЕРВИЧНАЯ ОБРА-
риваются в качестве «резервных» технологий. БОТКА. В течение более 40 лет ферментативное по-
МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Среди немного- лучение ацетона и 1-бутанола с помощью C. acetobu-
численных бактерий-продуцентов ацетона и 1-бута- tyliсum в промышленных масштабах осуществляли в
нола наиболее важное значение в производственных ферментерах с рабочим объемом более 100 м3. При
технологиях имеют анаэробные бактерии рода Clo- этом около 60% производственных затрат приходи-
stridium. В ацетоно-бутиловом брожении можно вы- лось на закупку сырья, а примерно 12% – на энерге-
делить две фазы: первая – бактерии активно размно- тические расходы при дистилляции. В современном
жаются, и в среде накапливаются ацетат и бутират, производстве используются двустадийные технологии
что приводит к понижению рН до 5,0. При таком низ- с возвратом клеток в производственный цикл,
ком рН размножение бактерий практически заканчи- непрерывная ферментация, технологии с иммобили-
вается, и брожение переходит во вторую фазу – на- зацией клеток, а также усовершенствованные техно-
копление 1-бутанола и ацетона, образующихся из логии выделения продуктов ферментации (первапора-
имеющихся в среде углеводов и накопленных в пер- ция, обратный осмос). Традиционные технологии,
вой фазе кислот. Состав конечного продукта зависит которые применялись в Северной Америке и ЮАР, с
от используемого бактериального штамма. Наиболее периодическим режимом культивирования клеток на
хорошо изучена физиология Clostridium acetobutyli- кукурузном крахмале или мелассе в качестве сырья
сum, который обладает самой высокой продуктив- менее выгоден по сравнению с получением ацетона и
ностью, а также достаточно устойчив к токсичному 1-бутанола из продуктов нефтехимии. Экономическая
действию 1-бутанола. При сбраживании 100 г глюко- целесообразность использования той или иной техно-
зы с помощью Clostridium acetobutyliсum образуется логии определяется расходом сырья (кг продукта/кг
38 г смеси бутанола и ацетона в соотношении 3:1. сахара) и продуктивность (кг продукта/(час⋅литр
Многие представители рода Clostridium содержат культуры)). Технология совершенствуется по двум
амилазы, амилоглюкозидазы и другие внеклеточные направлениям. Во-первых, генно-инженерными ме-
деполимеразы, поэтому для их культивирования тодами удалось получить штаммы, устойчивые к ток-
можно использовать такое дешевое питательное ве- сичному действию ацетона и 1-бутанола, а изучение
щество, как крахмал. Перспективным признано при- биохимических и физиологических особенностей
менение лактозы (в виде молочной сыворотки). К на- жизнедеятельности микроорганизмов привело к соз-
стоящему времени изучены механизмы действия и данию новых штаммов-суперпродуцентов. Во-вторых,
регуляции практически всех ферментов, участвую- можно повысить эффективность производства путем
щих в биосинтезе ацетона и 1-бутанола, гены боль- совершенствования самого технологического процес-
шинства этих ферментов уже клонированы. При гли- са, в том числе условий ферментации и выделения
колизе из глюкозы образуется пируват, который под продуктов. На фоне постоянно растущих цен на
действием фермента пируват : ферредоксин-оксидо- нефть метод ферментативного получения ацетона и
редуктазы декарбоксилируется с образованием аце- 1-бутанола, вероятно, вновь приобретет важное зна-
тил-КоА. Продуцируемые в процессе гликолиза вос- чение.
22 становительные эквиваленты (прежде всего NADH)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

1-Бутанол Ацетон
С4Н10О Н3С—СН2—СН2—СН2—ОН С3Н6О Н3С—СО—СН3

MR 74,12 MR 58,08
d 0,81 d 0,7908
Ткип 117–118 °С Ткип 56 °С
Код CAS 71-36-3 Код CAS 67-64-1
Химический синтез: Каталитическое дегидрирование 2-пропанола
гидроформилирование пропилена Прямое окисление пропилена
с последующим гидрированием Расщепление кумолгидропероксида

Биосинтез
Глюкоза Крахмал, сыворотка и т. д.
1 Пируват : ферредоксин-
оксидоредуктаза
2 лактат 2 пируват 2 Гидрогеназа
3 Тиолаза
2 4 КоА-трансфераза/
1 2 Н2 + 2 СО2
ацетацетат-декарбоксилаза
5 Альдегид/
2 ацетат 2-ацетил-КоА 2 этанол алкогольдегидрогеназа
6 Две гидрогеназы,
3 кротоназа
СО2
7 Бутиральдегиддегидрогеназа
и бутанолдегидрогеназа
ацетоацетил- ацетон 2-пропанол
КоА 4 5
Гены всех указанных
6 ферментов клонированы
7
бутират бутирил-КоА 1-бутанол

Ферментация и первичная обработка


Споры Сбраживание глюкозы под действием
Clostridium acetobutylicum
Суспензия в образце почвы
Фаза Фаза образования
Концентрация глюкозы в среде, %

образования растворителей
Жидкая культура кислот рН
Анаэробные условия, 100 рН 5,0
24 ч при 37 °С мг продукта/мл культуры
Бутанол
80 4,0
Биореактор
объемом 15 м3 60
Пропускание СО2,
18 ч при 37 °С 40 Бутират
Ацетат
Биореактор 20 Ацетон
объемом 700 м3
6% меласса, Глюкоза
50–60 ч при 37 °С 0
0 8 16 24 32 40 48 Время, ч
Непрерывная
дистилляция Микроорганизм Выход продукта, %
Затем фракционная 1-Бутанол Ацетон 2-Пропанол Этанол
перегонка
Clostridium acetobutylicum 30,2 14,0 – 5,0
C. beijerinckii 67,9 6,0 – –
Около 38 кг C. puniceum 75,6 16,8 – –
смеси 1-бутанол : ацетон C. tetanomorphum 47,1 – – 42,7
(3 : 1) из 100 кг глюкозы
C. butyricum 17,0 – 7,0 –
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Уксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ. Уксус в качестве вкусовой добавки или сутствие этанола бактерии рода Acetobacter окисля-
консерванта использовался в Европе еще в античные ют уксусную кислоту до углекислого газа.
времена. Он также находит широкое применение и в ФЕРМЕНТАЦИЯ И ПЕРЕРАБОТКА. Для получения стар-
классической кухне народов Азии. По традиционной товой культуры Acetobacter sp. в пилотном фермен-
технологии уксус получали из вина. Один из знаме- тере клетки культивируют на сусле (вино или спирт,
нитых примеров – бальзамический уксус, который 1%-ная уксусная кислота, питательные вещества).
является своеобразной «кулинарной достопримеча- После начала образования кислоты устанавливают
тельностью» города Модена (Италия). Во Франции в повторяющийся цикл: когда концентрация спирта
XVIII в., когда еще трудно было говорить о развитии снижается до 0,2% (воздух в ферментере встроен
промышленности, существовал так называемый датчик), более половины культуральной жидкости
«стружечный» способ получения уксуса – разведен- удаляют, и добавляют новое сусло. Для интенсивной
ное вино наливали в бочки с древесной стружкой, аэрации без вспенивания жидкости (воздух в фермен-
вымоченной в уксусе. В 1856 г. Луи Пастер обнару- тер подают со скоростью, равной 1/10 объема фер-
жил микроорганизмы, осуществляющие уксуснокис- ментера в минуту) служат специальные мешалки,
лое брожение – уксуснокислые бактерии. К 1868 г., сконструированные Фрингсом. Тепло, выделяемое
изучая различные среды роста, он получил чистую бактериями в результате метаболизма, отводится си-
культуру этих бактерий и таким образом заложил ос- стемой охлаждения. Средняя эффективность процес-
новы технологического метода получения винного ук- са в ферментере объемом 100 м3 составляет 1,6 г/л.
суса (содержание уксусной кислоты около 6%). Сто- Раствор уксусной кислоты из ферментера пропускают
ловый уксус – 5%-й раствор уксусной кислоты, как через мембранные фильтры, пастеризуют и разводят
правило, получают ферментацией ректификата (эта- до концентрации столового уксуса. При использова-
нола). Мировое производство уксусной кислоты со- нии специальных штаммов и регулировании условий
ставляет несколько млрд литров в год. В США в ферментации образуется 17,5%-й уксус, а более кон-
больших количествах используется ацетат кальция- центрированный уксус для производства консервов
магния (температура плавления –7,7 °С), получен- получают двухступенчатой ферментацией. Около
ный биотехнологическим методом, как реагент для 70% всего производимого в мире столового уксуса
борьбы с обледенением на автотрассах (Cryotech получают в ферментерах, изобретенных Фрингсом
CMAТМ). Химический реактив «ледяная уксусная кис- (способ Фрингса). Их количество в мире превыша-
лота» (99,7%, рКа 5,6) производят из этилена или ет 700. Альтернативой биореактору Фрингса являет-
метанола. ся эрлифтный реактор с иммобилизованными уксус-
МИКРООРГАНИЗМЫ В БИОСИНТЕЗЕ. Способностью нокислыми бактериями: этот метод позволяет
осуществлять неполное окисление этанола с образо- получать высокий выход продукта (свыше 100 г/л),
ванием уксусной кислоты обладают лишь немногие однако пока редко используется в промышленных
микроорганизмы, в частности, некоторые штаммы масштабах.
Gluconobacter и Acetobacter. Принадлежность бакте-
рий к тому или иному штамму определить очень
сложно из-за быстро меняющегося фенотипа, поэто-
му с этой целью используют анализ последователь-
ностей 16S-рРНК или плазмид. Окисление этанола
происходит в реакциях, катализируемых мембранос-
вязанными ферментами алкогольдегидрогеназой
и альдегиддегидрогеназой. В клетках Acetobacter
альдегиддегидрогеназа несет в качестве простетиче-
ской группы пирроллхинолинхинон (ПХХ), а альдегид-
дегидрогеназа наряду с пирроллхинолинхиноном
содержит еще гем. Перенос электронов на терми-
нальную оксидазу происходит через образование
убихинона. Уксуснокислые бактерии осуществляют
гликолиз, образующиеся молекулы пирувата посту-
пают в цикл лимонной кислоты. Уксуснокислые бак-
терии чрезвычайно требовательны к высокой концен-
трации кислорода в среде роста: прерывание аэрации
всего на несколько минут приводит к значительному
24 снижению эффективности окисления этанола. В от-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Уксусная кислота
С2Н4О2
Н3С—СОOН
MR 60,05 Химический синтез:
Ткип 117,9 °С
pKa 4,76 (25 °С) окисление этилена
Код CAS 67-19-7 или реакция СО с метанолом

Биосинтез с участием Acetobacter sp.


Алкогольдегидрогеназа Альдегиддегидрогеназа
С2Н5ОН Н3С—СНО Н3С—СОOН
(ацетальдегид) (уксусная кислота)

Н2О + СО2
«полное окисление»
Мембраносвязанные ПХХ-зависимые дегидрогеназы передают на убихинон
высвобождаемые при окислении электроны, которые затем поступают
на терминальную оксидазу – также мембраносвязанный фермент. Пирроллхинолинхинон (ПХХ)

Ферментация и дальнейшая переработка

Система охлаждения
Аппарат Фрингса
Вино

94% этанол
Аварийный блок питания

Резервуары Питательные
для разбавления Мембранный фильтр вещества
уксусной кислоты

Смеши-
вание
с водой Сусло

Резервуары
для хранения
уксусной кислоты
Розлив
уксуса
Розлив пастеризованного уксуса
Пастеризация

Другие технологии получения уксусной кислоты


Максимальное Продуктивность Особенности
содержание процесса,
уксусной кислоты, % л/м3 в сут.
Стандартный метод 15 35–50 Простой технологический процесс
(с периодическим режимом)
Одностадийный процесс 18,5 30–50 Высокая концентрация конечного
с высоким выходом продукта, низкие затраты на хранение
уксусной кислоты и транспортировку
Двухстадийный процесс Более 20 30–50 Высокая концентрация конечного
с высоким выходом продукта, низкие затраты на хранение
уксусной кислоты и транспортировку
Непрерывный Более 10 До 60 Высокая концентрация конечного
ферментативный продукта, более низкие затраты
процесс на хранение и транспортировку
Иммобилизованные Менее 9 – Эрлифтные реакторы;
уксуснокислые бактерии работают на протяжении 460 сут.
(стадия испытаний)
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Лимонная кислота

ВВЕДЕНИЕ. В 1822 г. Карл Вильгельм Шееле впер- ПРОМЫШЛЕННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ИЗ САХАРОВ. Для
вые выделил D-лимонную кислоту из лимонного со- промышленного производства лимонной кислоты ис-
ка и изучил ее свойства. Значительные количества пользуют твердофазную ферментацию сахаров под
этой кислоты содержатся во многих фруктовых со- действием A. niger. В открытые металлические ре-
ках. Хансу Кребсу принадлежит одно из самых заме- зервуары, устойчивые к кислой среде, помещают
чательных открытий в биохимии: в 1937 г. он пока- раствор сахаров и споры гриба. Для дополнительной
зал, что лимонная кислота является ключевым аэрации и отведения тепла в суспензию пропускают
соединением аэробного обмена веществ (цикл три- воздух с интенсивностью до 10 объемов ферментера
карбоновых кислот, цикл Кребса). За сутки в орга- в минуту. Через пять суток образуется хорошо разви-
низме взрослого человека образуется около 1,5 кг тый мицелий, в котором активируется синтез лимон-
лимонной кислоты, которая затем подвергается ной кислоты (продолжительность всего процесса
дальнейшим превращениям. Лимонная кислота – 8 сут.). После удаления мицелия проводят экстрак-
сильная кислота с трехступенчатой диссоциацией: цию горячей водой и осаждение цитрата. Выход про-
рКа при 25 °С составляют 3,13, 4,78 и 6,43 соот- дукта достигает 50 г/кг сахара. В современной
ветственно. В 1%-м растворе лимонной кислоты промышленности цитрат получают в башенных био-
рН 2,2. Наличие трех карбоксильных и одной гидро- реакторах или реакторах с механическим перемеши-
ксильной группы определяет способность лимонной ванием в стерильных условиях. Объем таких реакто-
кислоты к образованию комплексов с двух- и трехва- ров от 100 до 500 м3. рН продукта на выходе ~2,0,
лентными катионами. Промышленное получение ли- поэтому ферментеры должны быть выполнены из ус-
монной кислоты основано на ферментативном про- тойчивой к агрессивной среде высококачественной
цессе. Мировое производство лимонной кислоты стали. В качестве экономически выгодного сырья ис-
составляет 1 200 000 т в год (2005), объем рын- пользуют гидролизат крахмала или дешевые источ-
ка – около 1 200 млрд долларов США. Лимонная ники сахарозы. Эффективность образования цитрата
кислота используется как подкислитель и консерви- зависит от содержания ионов марганца в среде:
рующий агент в пищевой промышленности, компле- в среде с низким содержанием марганца (менее
ксообразователь в металлургии, средство для смяг- 2 мкг/л) синтезируется большое количество продук-
чения воды при производстве стиральных порошков та. Наращивание клеточной массы завершается че-
и для неотложной помощи при тяжелых отравлениях рез 48 ч роста при рН 5. Последующее искусствен-
солями металлов. ное закисление среды до рН 2,5, добавление сахаров
МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Некоторые плес- при непрерывной ферментации и интенсификация
невые грибы, в частности Aspergillus niger, в услови- аэрации способствуют образованию лимонной кисло-
ях избытка глюкозы и интенсивной аэрации во время ты. Продукт выделяется клетками во внеклеточную
экспоненциальной фазы роста и после ее окончания среду. В расчете на потребленную глюкозу выход ли-
выделяют в среду значительное количество лимон- монной кислоты более 80%. По завершении фер-
ной кислоты. Несмотря на то что многие промежу- ментации мицелий отфильтровывают, в раствор цит-
точные продукты цикла Кребса оказывают регулятор- рата добавляют Ca(OH)2, далее цитрат кальция
ное влияние на другие процессы обмена веществ, переводят в кислоту серной кислотой. Сырой продукт
возможно создание штаммов A. niger – суперпроду- обрабатывают активированным углем и пропускают
центов лимонной кислоты. Во-первых, запас оксало- через ионообменную колонку. В растворе кристалли-
ацетата постоянно растет за счет активности находя- зуется очень чистая лимонная кислота. Расход гипса
щиейся в цитоплазме пируваткарбоксилазы, которая более 1 т/т лимонной кислоты. В настоящее время
катализирует присоединение молекулы СО2 к пиру- большое распространение получает другой более
вату с образованием оксалоацетата (анаплеротиче- экономичный способ очистки лимонной кислоты: по-
ская, т. е. возмещающая реакция). Во-вторых, ли- сле реакции цитрата с трилауриламином продукт эк-
монная кислота синтезируется в митохондриях, страгируют с помощью алканов и 1-октанола. Раство-
секретируется в цитоплазму, а затем выводится из рители и трилауриламин можно вновь использовать
клетки. Причина существования такого направленно- после соответствующей обработки. В последние годы
го транспорта в том, что цитоплазматическая малат- был разработан метод получения D-лимонной кисло-
дегидрогеназа катализирует превращение оксалоаце- ты из фракций нефти с помощью особого штамма
тата в яблочную кислоту, молекулы которой дрожжей. Проект был доведен до этапа создания пи-
проникают в митохондрии, заменяя молекулы лимон- лотной установки, однако в связи с резким повыше-
ной кислоты (принцип антипорта). нием цен на нефть пока отложен.

26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Лимонная кислота
С6Н8О7 Код СAS 77-92-9
MR 192,12
Растворимость 600 г/л воды (20 °С)
Кислотные свойства рKa1 = 3,128 (25 °С); в 1%-м водном растворе лимонной кислоты рН 2,2
Комплексообразование (lgK): Fe3+ 12,5, Ca2+ 4,68, Cu2+ 3,98 (при 20 °С)

Источники и применение
Источники г/кг Пищевая и косметическая
промышленность
Лимоны 40–80 65%
Грейпфруты 12–21
Малина 10–13 Медицина 10%
Черная смородина 15-30
Клубника 6–8
Томаты 2,5 Техника 25%

Биосинтез в Aspergillus niger


Глюкоза Промышленное Воздух
получение цитрата: СО2 + воздух
Фосфоенолпируват Aspergillus niger
Ме- Питательные
ласса вещества, вода
Пируват

Ацетил-КоА
Стерилизация
1 3

Цитрат Ферментер Клеточная


Оксалоацетат
4 масса
2 Са(ОН)2
цис-Аконитат Известь
Малат

Изоцитрат фильтрация осаждение Фильтры


Фумарат
H2SO4 CaSO4

Сукцинат 2-Оксоглутарат

Анаплеротические реакции
цикла трикабоновых кислот: осаждение фильтрация
1 Пируваткарбоксилаза (в цитоплазме)
2 Малатдегидрогеназа (в цитоплазме) Центрифуги- Кристаллизация Концентри-
рование рование
3 Цитратсинтаза (в митохондриях)
4 Цитрат/малат-антипортер
(мембрана митохондрий) Кристаллическая лимонная кислота

Ферментация и переработка

Инокулят, Предфер- Основная Удаление Очистка


питательная ментация ферментация мицелия
среда Осаждение: Выход
Биореактор Биореактор объемом Вращающиеся 1. Са(ОН)2 лимонной
Крахмал, объемом 400 м3 из кислото- фильтры 2. Н2SO4 кислоты –
меласса, 40 м3 устойчивого мате- 3. пере- более 200 г/л
источник риала, 8 сут. при кристал-
азота, соли 32 °С; после завер- через 150 ч
лизация ферментации
шения фазы роста
закисление среды
от pH 5,0 до 2,0
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Молочная и глюконовая кислоты

ВВЕДЕНИЕ. Объем мирового производства молочной ФЕРМЕНТАЦИЯ И ПЕРЕРАБОТКА. В последнее время


кислоты за 2001 г. составил 860 000 т, из которых метод ферментативного получения молочной кислоты
30 000 т получены путем ферментации. Благодаря составляет конкуренцию химическому синтезу (путем
умеренно кислому вкусу и консервирующим свойст- гидратирования акриловой кислоты или присоедине-
вам молочная кислота находит широкое применение ния HCN к ацетальдегиду). В зависимости от доступ-
в пищевой промышленности (до 85% всего произве- ного источника углерода выбирают различные штам-
денного объема). Молочная кислота технической чи- мы Lactobacillus: если в питательную среду добавляют
стоты используется в кожевенном и текстильном декстрозу или раствор других сахаров, используют
производствах, а также служит сырьем для синтеза штаммы L. delbrueckii или L. leichmannii, а в случае ро-
полимеров, поддающихся биологической деградации, ста на сыворотке – L. bulgaricus. Наряду с сахарами
например полилактидов. Ежегодно в мире произво- (12–18%) питательная среда должна содержать ис-
дится более 100 000 т L-молочной кислоты, которая точник азота, фосфаты и витамины группы В. Фер-
идет на производство полиэфирного волокна (Nature ментацию проводят в условиях ограниченного доступа
WorksТМ), которое разлагается под действием микро- кислорода при температуре 45–50 °С в течение
организмов. Производство D-глюконовой кислоты, ее 2–6 сут. в зависимости от начальной концентрации
натриевой соли и δ-лактона – изомера D-глюконовой субстрата. Добавление CaCO3, нейтрализующего кис-
кислоты составляет 60 000 т в год. δ-Лактон также лоту, обеспечивает постоянство рН 5,5–6,0. После
применяется в пищевой промышленности в качестве отделения клеточной массы лактат кальция переводят
мягкого подкислителя. При лечении болезней, свя- в молочную кислоту серной кислотой. Далее молоч-
занных с недостатком Ca2+ и Fe3+ в организме, в ную кислоту подвергают очистке с применением од-
растворы для инфузии добавляют глюконаты кальция ной из двух методик – пропускают через ионообмен-
и железа, так как эти соли не токсичны и очень хоро- ную колонку или перегоняют метиллактат (эфир
шо растворимы в воде. Глюконовая кислота – силь- молочной кислоты и метанола). В стадии разработки
ный комплексообразователь в щелочных условиях, находятся другие методики получения чистой молоч-
поэтому значительная часть (около 50%) глюконо- ной кислоты: экстракция растворителями, мембран-
вой кислоты в виде натриевой соли используется в ное фильтрование и хроматографическая очистка са-
технических целях – как средство для очистки сте- мой молочной кислоты без стадии образования
кол, удаления ржавчины и разрыхления цемента, а кальциевой соли. D-Глюконовую кислоту получают из
также в текстильной промышленности для предот- D-глюкозы в ферментерах большого объема с исполь-
вращения загрязнения тканей солями металлов. рКа зованием Aspergillus niger. При рН >3 в клетках
D-глюконовой кислоты 3,7. грибных гиф образуется фермент клеточной стенки
МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. Для промышлен- глюкозооксидаза, которая окисляет D-глюкозу до
ного прозводства молочной кислоты используют D-глюконо-5-лактона. Этот лактон гидролизуется са-
штаммы Lactobacillus. Выбор того или иного штамма мопроизвольно или под действием лактоназы до D-
зависит от наиболее доступного источника углерода. глюконовой кислоты. Ферментацию с целью получе-
Полное превращение субстрата происходит только в ния натриевых и кальциевых солей глюконовой
случае гомоферментативного молочнокислого бро- кислоты проводят при интенсивной аэрации на среде,
жения – из 1 моль D-глюкозы образуется 2 моль содержащей 11–25% глюкозы. рН среды поддержи-
L-молочной кислоты. Процесс неполного окисления вается в интервале 4,5–6,5 путем добавления рас-
D-глюкозы – образование D-глюконовой кислоты – кислителей (Na2CO3/NaOH или CaCO3). По окончании
описан для некоторых грибов (Aspergillus niger, неко- ферментации, чтобы выделить соль, среду концент-
торых представителей рода Penicillium), а также рируют, продукт сушат; в случае же свободной кисло-
для уксуснокислых бактерий рода Gluconobacter. ты и лактона используют ионообменники для очистки
У грибов реакцию катализирует глюкозооксидаза – продукта.
флавинсодержащий фермент, локализованный в
клеточной стенке. В условиях промышленной фер-
ментации глюкозооксидаза обнаруживается и в сре-
де роста гриба. Штаммы Gluconobacter осуществля-
ют неполное окисление D-глюкозы с помощью
мембраносвязанного фермента D-глюкозодегидроге-
назы. Так же, как алкоголь- и альдегиддегидрогеназы
уксуснокислых бактерий, D-глюкозодегидрогеназа в
клетках Gluconobacter является ПХХ-зависимым
28 ферментом.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

D-молочная кислота, L-молочная кислота D-глюконовая кислота


С3Н6О3 С6Н12О7
MR 90,08 MR 196,16
pKa 3,80 (25 °С) pKa 3,7 (25 °С)
(S)-форма
Код CAS 50-21-5 Код CAS 526-95-4
10326-41-7 (R)-форма
79-33-4 (S)-форма

Химический синтез(реакция HCN с ацетальдегидом)


приводит к образованию рацемата

Биосинтез
L-молочная кислота (Lactobacillus delbrueckii)
D-глюкоза 2 Пируват 2 L-лактат

2 NADH

D-глюконовая кислота (Aspergillus niger)

Глюкозооксидаза

β-D-Глюкоза FAD FADH2 D-Глюконо-5-лактон

D-Глюконовая кислота

Каталаза

Ферментация и переработка
L-молочная кислота

Инокулят Биореактор Очистка


Lactobacillus Объем более 100 м3, Осаждение Bыход продукта
декстроза, раствор кальциевой соли, 2–3 кг/(м3⋅ч)
сахаров, 50 °С, рН 5,5–6,0 переосаждение,
перекристаллизация

D-глюконовая кислота

Инокулят Биореактор Очистка


Aspergillus niger Объем более 100 м3, Отделение клеток,
декстроза, раствор концентрирование, Выход продукта
сахаров, 33 °С, рН 6,5 добавление NaOH, более 13 кг/(м3⋅ч)
высушивание

29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Аминокислоты

ВВЕДЕНИЕ. Аминокислоты стали получать в промыш- кристаллизации или экстракции спиртом отделяют
ленности около 50 лет назад, после того как были гидрофобные аминокислоты L-фенилаланин, L-лей-
изучены важнейшие этапы обмена веществ. цин и L-изолейцин. Затем проводят ионообменную
После этого некоторые аминокислоты стали исполь- хроматографию, разделяя растворимые аминокисло-
зоваться в медицине, например для приготовления ты на основную, кислую и нейтральную фракции, ко-
инфузионных растворов, другие (L-метионин, L-лизин торые далее перекристаллизовывают и подвергают
и L-треонин) – в качестве кормовых добавок. Объем хроматографической очистке. Химический синтез
производства аминокислот значительно увеличился с аминокислот всегда приводит к образованию рацема-
тех пор, как было обнаружено, что L-глутамат может та (смеси L- и D-изомеров аминокислот), который
усиливать вкус, а дипептид аспартам обладает выра- также находит применение. Например, L,D-метионин
женным сладким вкусом. Молекулы всех белков по- применяется в качестве кормовой добавки, L,D-ала-
строены из 20 протеиногенных аминокислот. Некото- нин добавляют во фруктовые соки для смягчения вку-
рые аминокислоты не могут синтезироваться в са. Для разделения рацематов аминокислот на L- и
организме, а должны поступать вместе с пищей (не- D-изомеры в молекулу аминокислоты вводят еще
заменимые аминокислоты). Для человека и многих один хиральный центр при Сα-атоме. Такие реакции
сельскохозяйственных животных незаменимыми биотрансформации осуществляют в ферментере или
аминокислотами являются L-метионин, L-лизин, аро- клеточном реакторе. Биокатализатором могут слу-
матические аминокислоты (L-фенилаланин, L-тиро- жить очищенные ферменты или целые клетки, со-
зин, L-триптофан) и гидрофобные аминокислоты держащие необходимый фермент. Экономически
(L-валин, L-лейцин и L-изолейцин). В природе также выгодно использовать иммобилизованные биокатали-
встречаются «небелковые» аминокислоты, например заторы, которые позволяют проводить реакцию не-
D-изомеры аминокислот. Их используют в синтетиче- прерывно в течение длительного срока. Успех про-
ской химии, в том числе при производстве полусинте- мышленного получения аминокислот объясняется
тических антибиотиков. тем, что химический синтез соединений-предшест-
ЭКОНОМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ. Производство амино- венников относительно дешев. Кроме того, для про-
кислот составляет более 2 000 000 т/год, что оце- изводства практически всех протеиногенных амино-
нивается в сумму более 4 млрд долларов США. кислот разработаны методы ферментации, и имеются
Значительная часть предприятий, производящих штаммы, позволяющие получать большие количества
аминокислоты, расположена в азиатском регио- продукта. Во многих случаях такой подход экономиче-
не. Лидирует производство L-глутамата натрия ски оправдан. Широко используются штаммы, усовер-
(более 1 500 000 т/год), за ним следуют производ- шенствованные методами генетической инженерии.
ства L-лизина (700 000 т/год) и L-метионина К настоящему времени закончено секвенирование ге-
(600 000 т/год). L-Аспарагиновая кислота и L-фени- нома Corynebacterium glutamicum. Полученная гене-
лаланин – сырье для получения подсластителя ас- тическая информация поможет ускорить создание но-
партама – производятся в количествах 10 000 т/год. вых высокопродуктивных штаммов. Во многих
Около 65% производимых аминокислот использу- случаях уже клонированы целые опероны, ответст-
ются в пищевой промышленности, 30% – как кормо- венные за биосинтез аминокислот. Изучаются воз-
вые добавки для скота и лишь 5% аминокислот по- можности управления обменом веществ клетки мето-
сле дополнительной очистки применяют в дами так называемой метаболической инженерии.
медицинских целях, прежде всего для инфузионных
растворов, а также в производстве косметических
препаратов.
ПОЛУЧЕНИЕ. Существует четыре промышленных
метода получения аминокислот: 1) экстракция из
гидролизата белка; 2) химический синтез; 3) био-
трансформация соединений-предшественников в
ферментере или клеточном реакторе; 4) микробная
ферментация.
Экстракцией из белкого гидролизата в промыш-
ленности получают прежде всего L-цистеин, L-цис-
тин, L-лейцин, L-аспарагин, L-аргинин и L-тирозин.
В качестве сырья используют растительные белки
или отходы мясной промышленности, которые под-
30 вергают кислотному гидролизу, после чего путем
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Аминокислоты, получаемые промышленным путем


Аминокислота Объем Цена, Метод получения Основные применения
произ- доллар
водства, США/кг
т/год
Протеиногенные аминокислоты
L-Глутамат > 1 500 000 1 Ферментация Усилитель вкуса
L-Лизин 700 000 2 Ферментация, Кормовая добавка
ферментный реактор
L-Метионин 600 000 2 Химический синтез Кормовая добавка
L-Треонин 55 000 5 Ферментация Кормовая добавка
L-Аспартат 15 000 10 Хиральный пул, биореактор Аспартам™
L-Глицин 15 000 10 Химический синтез Подсластитель
L-Фенилаланин 10 000 10 Ферментация, Аспартам™, медицина
ферментный реактор
L-Аргинин 1 000 20 Ферментация, хиральный пул Медицина, косметика
L-Триптофан 1 400 20 Ферментация, Кормовая добавка
ферментный реактор
Другие аминокислоты 5 000 Хиральный пул, ферментация, Медицина и др.
ферментный или биореактор
Небелковые аминокислоты
D-Фенилглицин, D- гидроксифенилглицин Химический синтез Предшественники ампи-
циллина и амоксициллина
Гидрокситриптофан Химический синтез Антидепрессант
Окситриптан™

Биосинтез
Глюкоза (C6) – источник углерода
Глицин (C2N)
Гистидин (C6N3) Пентоза (C5)

Триоза (C3) Серин (C3N)


Тетроза (C4)
Фенилаланин (C9N)
Цистеин (C3NS)
Тирозин (C9N) Шикимовая кислота (C7)
Триптофан (C11N2)
Аланин (C3N) Пируват (C3) (C5) Валин (C5N)
Лизин (C6N2) Диаминопимели-
новая кислота (C7N2) Ацетил-КоА (C2) Лейцин (C5N)

Метионин (C5NS)

Аспарагиновая Оксалоацетат (C4)


кислота (C4N) Цитрат (C6)
Пролин (C5N)

Треонин (C4N) Глутамат (C5N)

Изолейцин (C6N) 2-Оксоглутарат (C5) Аргинин (C6N4)

Методы получения
Белки Гидролиз, разделение
(хиральный пул)

Глюкоза и другие Ферментация


источники углерода L-Аминокислоты

Ферментный или биореактор


Химическое
сырье Химический синтез Ферментный реактор
L,D-Аминокислоты
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты L-Глутаминовая кислота

ВВЕДЕНИЕ. В 1908 г. японские ученые установили, ферментов, участвующих в глиоксилатном цикле,


что L-глутаминовая кислота, содержащаяся в водо- зависит от концентрации метаболитов, конечных про-
рослях Konbu, может усиливать вкус. Промышленное дуктов, а также NH+ +
4 и NAD / NADH, поэтому можно
производство L-глутаминовой кислоты из кислотного «искусственно» менять их активность. Выход продукта
гидролизата клейковины пшеницы и соевого белка в штаммах-продуцентах глутамата можно повысить
было начато уже в 1909 г. на фирме Ajinоmoto. методами генетической инженерии. В настоящее вре-
В 1957 г. сотрудник фирмы Киова Хакко обнаружил, мя геном C. glutamicum полностью расшифрован и ак-
что при выращивании Corynebacterium glutamicum в тивно изучается. В частности, исследуют зависимость
сахаросодержащей среде накапливается L-глутами- выхода продукта от введения в геном мультикопийных
новая кислота. В настоящее время в результате усо- кассет, несущих ген глутаматдегидрогеназы.
вершенствования штамма и оптимизации технологии ФЕРМЕНТАЦИЯ И ПЕРВИЧНАЯ ПЕРЕРАБОТКА. В каче-
ферментации удается получать до 150 г глутамата из стве сырья для производства глутамата используют
1 л культуры. мелассу или гидролизат крахмала. В оптимальных
МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. В клетках C. glu- условиях культивирования высокопродуктивные
tamicum L-глутаминовая кислота образуется при транс- штаммы C. glutamicum перерабатывают до 60–70%
аминировании 2-оксоглутаровой кислоты, которая по- исходного сырья. Источником азота служат соли ам-
лучается при окислении изолимонной кислоты в цик- мония и аммиак. При выборе условий роста необхо-
ле Кребса. В диком штамме окисление дикарбоновых димо оптимизировать концентрацию биотина в среде,
продуктов цикла Кребса строго регулируется. Изуче- а рН среды поддерживать в диапазоне 7,0–8,0. Для
ние генома C. glutamicum и способов регуляции актив- синтеза глутамата очень важна аэрация клеточной
ности ферментов привело к созданию нового штамма, культуры: оптимальное значение kd составляет
в котором: 1) возросла секреция глутамата в среду 3,5 ⋅ 10–6 моль кислорода/(атм мин мл). Фермента-
роста; 2) изменены пути регуляции активности неко- цию в промышленных масштабах проводят в реакто-
торых ферментов, участвующих в биосинтезе L-глута- рах с рабочим объемом до 500 м3. Как правило,
миновой кислоты; 3) активированы некоторые побоч- сначала проводят предферментацию, а затем фер-
ные пути обмена веществ. ментацию воздушно-проточным способом. Чтобы из-
Приведем разъяснения. бежать ингибирования катаболитами, после образо-
1. Количество глутамата в культуральной жидко- вания достаточного количества клеток (14 ч роста)
сти в большой степени зависит от скорости секре- в среде поддерживают постоянный уровень глюкозы,
ции, и, следовательно, от проницаемости цитоплаз- не превышающий 0,5%. После удаления клеток
матической мембраны. Проницаемость мембран ультрафильтрацией глутамат выделяют из культу-
может изменяться. Например, для увеличения про- ральной жидкости методами ионообменной или
ницаемости ограничивают доступ биотина, жирных абсорбционной хроматографии (150 г/л через 60 ч
кислот или глицерина (для ауксотрофов по жирным роста).
кислотам или по глицерину соответственно). Добав- ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. L-Глутамат использует-
ление в среду пенициллина также приводит к повы- ся в основном в пищевой промышленности как уси-
шению проницаемости клеточной стенки, так как пе- литель вкуса, чаще всего в комбинации с нуклеози-
нициллин препятствует ее образованию. дами. В 2004 г. путем ферментации было получено
2. В промышленных штаммах C. glutamicum 1 500 000 т L-глутамата. Рыночная стоимость L-глу-
активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы значитель- тамата составляет 1000 долларов США за тонну,
но ниже активности L-глутаматдегидрогеназы (KМ а объем рынка достигает 1,5 млрд долларов США.
различаются примерно в 70 раз, Vmax – примерно в Основные производства расположены в странах
150 раз). азиатского региона.
3. К наиболее важным анаплеротическим реак-
циям относятся карбоксилирование фосфоенолпиру-
вата и активация глиоксилатного цикла (в растениях
и бактериях). Обе реакции приводят к образованию
оксалоацетата, предшественника цитрата, кроме то-
го, в результате этих реакций происходит включение
дикарбоновых (С2) продуктов гликолиза в цикл ли-
монной кислоты. Фосфоенолпируваткарбоксилаза
использует в качестве кофактора биотин, следова-
тельно, изменяя количество биотина, можно регули-
32 ровать активность фермента. Активность многих
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

L-Глутаминовая кислота
С5Н9NO4 Код СAS 56-86-0 (L)-форма
MR 147,13
Тпл 247–249°С
Растворимость 600 г/л воды (2 S)-форма, L-форма

Биосинтез и штаммы-суперпродуценты глутамата


Глюкоза Ферменты Ген
Регуляция
по принципу 1 Фосфоенолпируват- ppc
обратной карбоксилаза (PEPC)
Фосфоенолпируват
связи или 2 Пируваткиназа pyk
1 2 репрессия
Пируват 3 Пируваткарбоксилаза pyk
4 4 Пируватдегидрогеназа pdh
Ацетил-КоА Ацетат 5 Цитратсинтаза gltA
6 Aконитаза citB
3
5 7 Изоцитратдегидрогеназа icd

L-Аспартат Оксалоацетат Цитрат 8 L-Глутаматдегидрогеназа (GDH) gdh


6
9 α-Кетоглутарат- aceE
11 цис-Аконитат дегидрогеназа (KDH)
Малат Глиоксилат 10 Изоцитратлиаза (ICL) aceE
10 11 Малатсинтетаза (MS) aceB
Фумарат Изоцитрат
Штаммы-суперпродуценты:
7
1. Повышенная активность PEPC, GDH, ICL, MS
Сукцинат 2-Оксоглутарат 2. Сниженная активность или инактивация
9 8 KDH
3. Нарушение регуляции активности PEPC
L-Глутамат по механизму обратной связи посредством
L-глутамата

Усиление секреции Клеточная стенка


Клеточная мембрана
После добавления
Ацетил- биотина Малонил- Жирные
КоА Ограничение доступа KоА кислоты
ненасыщенных жирных кислот
Глюкоза Фосфо-
Глицерин липиды

L-Глутамат Инозит

Изменение интенсивности транспорта через мембрану


Нарушение синтеза клеточной стенки под действием пенициллина
L-Глутамат

Ферментация и первичная переработка


Посевной материал, Ферментация Удаление Концентри- Обработка
предферментация клеток рование
Биореактор до 500 м3, Высушивание Выход
Постепенное источник углерода – Пресс-фильтр Ультра- распылением
увеличение объема или ультра- фильтрация продукта:
меласса или или кристал- ~150 г/л
культуры в реакторе гидролизат крахмала, фильтрация лизация через
источник азота – 40–60 ч
аммиак, наличие
биотина
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин

ВВЕДЕНИЕ. Основное применение D,L-метионин, cum в качестве источника углерода добавляют рас-
L-лизин и L-треонин находят в составе пищевых и творы сахаров. Уровень биотина в среде поддержива-
кормовых добавок. Это незаменимые аминокислоты ют на постоянном уровне – около 30 мкг/л. После
для человека и многих сельскохозяйственных живот- окончания синтеза и удаления клеток L-лизин выделя-
ных, т. е. они не образуются в организме и должны ют на ионообменной колонке или путем распылитель-
поступать вместе с пищей. D,L-Метионин, L-лизин и ной сушки. Еще одна технология получения L-лизина
L-треонин содержатся в белках кукурузы, сои, овса, основана на использовании клеток Cryptococcus lau-
ячменя, ржи и риса, однако их содержание недоста- rentii. В настоящее время эта технология практиче-
точно для полноценного питания. Поэтому вегетари- ски не реализуется, так как не может конкурировать
анцам рекомендуется дополнительно принимать пре- с технологией с использованием C. glutamicum. Тех-
параты L-метионина, L-лизина и L-треонина. При нология заключается в производстве L-лизина из
откорме скота эти аминокислоты особенно важны: D,L-α-амино-ε-капролактама в биореакторе, в кото-
когда основой питания животных являются рис и рый добавлены высушенные ацетоном клетки Crypto-
рожь, прибавка в весе достигается только coccus laurentii. Дешевым сырьем в данном случае
в том случае, если в корм добавляют L-лизин и являются отходы производства нейлона, селектив-
L-треонин, а когда животных кормят в основном куку- ный гидролиз которых приводит к образованию
рузой, в их рацион необходимо добавлять D,L-метио- D,L-α-амино-ε-капролактама, который в свою оче-
нин, L-лизин и L-треонин. В промышленности эти редь подвергается рацемизации ферментом D-ами-
аминокислоты получают ферментацией или химиче- нокапролактамрацемазой, выделенной из штамма
ским синтезом. Achromobacter obae.
D,L-МЕТИОНИН. Химический синтез D,L-метионина, L-ТРЕОНИН. Мутантные штаммы Escherichia coli с из-
L-лизина и L-треонина включает пять стадий. В каче- мененным путем регуляции биосинтеза являются ос-
стве исходных веществ используют акролеин, метан- новными промышленными продуцентами L-треонина.
тиол и синильную кислоту. Одним из промежуточных Максимальный выход продукта составляет 80 г/л че-
продуктов синтеза является гидантоин – консервант, рез 30 ч роста. Уже клонированы гены оперона, от-
использующийся при производстве шампуней и мою- вечающего за биосинтез треонина, и в настоящее
щих средств. В процессе химического синтеза обра- время ведутся работы, направленные на получение
зуется рацемат, в разделении которого нет необходи- штаммов с еще более высоким выходом продукта.
мости, поскольку в организме высших животных После отделения клеток проводят ультрафильтрацию
D-метионин превращается в L-метионин. культуральной жидкости, а затем L-треонин очищают
L-ЛИЗИН. В промышленом производстве L-лизина кристаллизацией.
используются штаммы Corynebacterium glutamicum. ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. В 2004 г. было произ-
L-Лизин образуется из диаминопимелиновой кисло- ведено 600 000 т D,L-метионина, 700 000 т L-лизи-
ты, которая в свою очередь получается из оксалоаце- на и 55 000 т L-треонина. Метионин получают преи-
тата в результате многоступенчатой реакции конде- мущественно путем химического синтеза, а L-лизин и
нсации аспарагиновой кислоты и пирувата. В диких L-треонин – ферментацией. Стоимость этих амино-
штаммах в качестве побочных продуктов этой много- кислот 1000–2000 долл. США/т, а объем продаж до-
стадийной реакции образуются предшественники стигает 500 млн долл. В последнее время наряду с
L-треонина и L-метионина, что снижает выход L-лизи- традиционным производством аминокислот для кор-
на. В штаммах-суперпродуцентах этот побочный путь мовых добавок развивается новая технология –
блокирован благодаря мутациям в генах соответству- выращивание трансгенных растений с измененным
ющих ферментов (используют также ауксотрофные аминокислотным составом. Такие растения в перспе-
мутантные штаммы, для метаболизма которых необ- ктиве могут использоваться непосредственно для от-
ходимо присутствие специфических веществ, напри- корма скота.
мер гомосерина). В настоящее время клонированы
гены почти всех ферментов, участвующих в биосин-
тезе L-лизина и его регуляции, поэтому методы гене-
тической инженерии играют решающую роль в полу-
чении штаммов, характеризующихся высоким
уровнем синтеза L-лизина. В современном производ-
стве используются штаммы, в которых выход проду-
кта достигает 120 г/л через 60 ч роста. Как правило,
применяют воздушно-проточную ферментацию в реа-
34 кторах объемом до 500 м3. В среду роста C. glutami-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

D,L-Метионин L-Лизин L-Треонин

С5Н11NO2S С6Н14N2O2 С4Н9NO3


MR 149,21 MR 146,19 MR 119,12
Код CAS 63-68-3 Код CAS 56-87-1 Код CAS 72-19-5

Аминокислоты в кормах
Пшеница
без добавок
L-лизин 0,25%
L-лизин 0,4% + L-треонин 0,4%

Кукуруза
без добавок
L-лизин 0,05%
L-лизин 0,4% + L-триптофан 0,35%

Рис
без добавок
L-лизин 0,1%
L-лизин 0,2% + L-треонин 0,1%
Для сравнения: казеин без добавок
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Относительная пищевая ценность при откорме свиней

Биосинтез и штаммы-суперпродуценты
Синтез L-лизина в клетках
Corynebacterium glutamicum Мутанты с заблокированными побочными процессами
в среде с L-гомосерином

2 1
Полуальдегид
Аспарагиновая Аспартилфосфат аспарагиновой кислоты L-Гомосерин L-Треонин
кислота
2 Дегидродипиколиновая
кислота 2-Оксо-
масляная
Диаминопимелиновая кислота
Ингибирование кислота
Репрессия L-Лизин L-Метионин L-Изолейцин
В мутантных штаммах нет ингибирования L-лизином и L-треонином

Производство L-лизина
Основной метод получения: ферментация
Штаммы- Предфер- Основная Удаление Очистка Выход
суперпродуценты ментация ферментация клеток L-лизина
Мутанты по регулятор- 30 м3, 500 м3, декстроза, Сепаратор Ионообменная 120 г/л
ным ферментам или декстроза, соевая мука, или ультра- хроматография, через
ауксотрофные мутанты соевая оптимизирован- фильтрация перекристалли- 80 ч
Corynebacterium мука ные условия зация или сушка фермен-
glutamicum массопереноса распылением тации

Другая технология: каскадная реакция в биореакторе

1 2 1 ACL-рацемаза:
Achromobacter obae

ACL-гидролаза:
2 Cryptococcus laurentii
D-α-амино- L-α-амино- L-лизин
ε-капролактам (ACL) ε-капролактам
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Аспартам™, L-фенилаланин и L-аспарагиновая кислота

ВВЕДЕНИЕ. Аспартам (метиловый эфир L-α-аспартил- используют штаммы-суперпродуценты E. coli или ко-
L-фенилаланина) – это низкокалорийный искусствен- ринебактерий. В этих организмах биосинтез L-фени-
ный подсластитель, который по сладости в 200 раз лаланина из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпиру-
превосходит сахар, полученный из сахарной свеклы. вата протекает в несколько стадий. В качестве
Объем производства аспартама составляет 30 000 т/г промежуточных соединений образуются шикимовая,
(2004). Исходными веществами для синтеза аспарта- префеновая и фенилпировиноградная кислоты, в ди-
ма являются L-аспарагиновая кислота и L-фенилала- ком штамме они предшественники L-триптофана и
нин. При химическом синтезе аспартама требуются L-тирозина. Однако в промышленности используют
дополнительные затраты на введение защитных групп мутантные ауксотрофные штаммы, в которых актив-
в молекулы исходных веществ, поэтому в настоящее ность ключевых ферментов строго регулируется.
время применяют ферментативные методы получения Практически все гены, продукты которых участвуют в
этого продукта. биосинтезе L-фенилаланина, к настоящему времени
L-АСПАРАГИНОВАЯ КИСЛОТА. Одним из методов по- клонированы. Это позволяет получать новые штам-
лучения L-аспарагиновой кислоты является экстрак- мы-суперпродуценты, применяя генно-инженерные
ция из белкового гидролизата, однако экономиче- методы. Так, выход L-фенилаланина в одном из ре-
ски более выгодным оказался синтез клетками комбинантных штаммов Brevibacterium fermentum
Escherichia coli из фумаровой кислоты в присутст- составляет 45 г на литр клеточной культуры. После
вии аммиака. Реакцию осуществляет фермент ас- завершения ферментации по воздушно-проточному
партаза, находящаяся в клетках микроорганизма. способу клетки отделяют, а затем концентрируют
Как правило, для выращивания клеток используют культуральную жидкость ульрафильтрацией. Для
реактор, в котором бактерии иммобилизованы на κ- окончательной очистки L-фенилаланина применяют
каррагинане или полиакриламиде. Выход продукта в ионообменную хроматографию или кристаллизацию.
такой системе достигает 140 г/(л ⋅ ч), а срок служ- АСПАРТАМТМ. Для синтеза аспартама из L-аспараги-
бы биокатализатора на основе иммобилизованных новой кислоты и L-фенилаланина необходимо снача-
клеток составляет два года. Использование субли- ла ввести в исходные молекулы пять защитных
мированных клеток промышленных штаммов позво- групп, а в конце синтеза их удалить. Такой метод зна-
ляет получать до 166 г L-аспарагиновой кислоты с чительно сложнее синтеза с использованием протеи-
литра клеточной культуры. В лабораторных услови- назы. В обычных условиях протеолитические фер-
ях удалось получить штамм E. coli с плазмидой, не- менты катализируют гидролиз пептидных связей,
сущей ген аспартазы (aspA). В таком штамме выход однако возможно сдвинуть равновесие в сторону
L-аспарагиновой кислоты увеличивается в 30 раз. образования пептидной связи. Так, в концентриро-
L-ФЕНИЛАЛАНИН. Традиционно производство L-фе- ванных растворах, содержащих L-аспарагиновую кис-
нилаланина осуществлялось в ферментативных реак- лоту (в которой аминогруппа защищена бензилокси-
торах на доступном сырье. В последнее время в свя- карбонилом) и метиловый эфир L-фенилаланина,
зи с развитием молекулярно-биологических методов, протеиназа катализирует образование малораство-
позволяющих получать генетически модифицирован- римого пептида, который выпадает в осадок. Особен-
ные штаммы-суперпродуценты, все шире используют но важно, что в этой реакции принимает участие
ферментацию. Распространение ферментативных только α-карбоксильная группа L-аспарагиновой кис-
методов объясняется доступностью и невысокой сто- лоты, так как изомер аспартама – метиловый эфир
имостью синтетического сырья, а также выгодным L-β-аспартил-L-фенилаланина – обладает сильно вы-
соотношением между производственными площадя- раженным горьким вкусом. В промышленном произ-
ми, временными затратами и выходом продукта. Для водстве, как правило, используют иммобилизован-
производства L-фенилаланина наиболее выгодным ную протеиназу термолизин, выделенную из Bacillus
оказалось использование биореактора, в котором в thermoproteolyticus. Этот фермент устойчив к высо-
присутствии аммиака происходит аминирование ко- ким температурам и может осуществлять реакцию
ричной кислоты под действием фермента фенилала- при 70 °С, что значительно повышает эффектив-
нинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. В таком ность процесса (выход продукта достигает 30 г/л).
реакторе выход продукта достигает 50 г/л, а эффек- Образовавшийся аспартам в значительной степени
тивность переработки сырья составляет 83%. Пер- отделен от побочных продуктов, так что для оконча-
спективным также считается метод расщепления тельной очистки от примеси исходных веществ дос-
D,L-5-бензилгидантоина ферментами L-гидантоина- таточно ионообменной хроматографии.
зой и L-N-карбамоилазой, выделенными из Flavobac-
terium ammoniagenes. Для ферментации в биореакто-
36 рах в современном производстве, как правило,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

L-Фенилаланин L-Аспарагиновая α-Аспартам


кислота

С9Н11NO2 С4Н7NO4 С14Н18N2O5


MR 165,19 MR 133,10 MR 294,31
Тпл 310–312 °C Код CAS 56-84-8 Максимальная 40 мг/кг
Код CAS 63-91-2 суточная доза
Код CAS 22389-47-0

Получение L-фенилаланина
Наиболее распространенный метод – ферментация
Штаммы-суперпродуценты: Источник С: глюкоза Более 40 г/л
коринебактерии Очистка: использование мембран, через 60 ч роста
или E. coli ионообменная хроматография,
перекристаллизация

Другой метод – ферментативный реактор


Добавление аммиака Иммобилизованный фермент Около 50 г/л при 83%
к транс-коричной кислоте L-фенилаланин-аммиаклиаза конверсии сырья
из Rhodotorula glutinis

Получение L-аспарагиновой кислоты


Многоступенчатая реакция в биореакторе Очистка
Выход 90–95%,
Иммобилизованные клетки E. coli; Добавление H2SO4 при 15 °С срок службы клеток
1,2 М фумаровая кислота, аммиак, (рН 2,8) приводит к выпадению E. coli 2 года
рН 8,5, 37°С аспарагиновой кислоты в осадок

Аспартаза (иммобилизованные клетки E. coli)

Получение α-аспартама
L-Z-аспарагиновая кислота + D,L-фенилаланин-ОМе
рацемизация
иммобилизованый
термолизин
(60 °С, 2 ч) D-фенилаланин-ОМе

L-Z-α-аспартил-L-фенилаланин-ОМе

гидрирование ZH
ферментативный катализ
химические реакции
L-α-аспартил-L-фенилаланин-ОМе
α-Аспартам Z = бензилоксикарбонил

Подсластитель Химическое строение Относительная


сладость
Сахароза Дисахарид 1
Цикламат Синтетическая циклогексилсульфаминовая кислота, натриевая соль 40
α-Аспартам Дипептид, метиловый эфир 200
Стевиозид Гликозилированный дитерпен 300
Сахарин Синтетический имид 2-сульфобензойной кислоты, натриевая соль 450
Тауматин Негликозилированный белок – одна полипептидная цепь
из 208 аминокислотных остатков 2500
Монеллин Негликозилированный белок – две полипептидные цепи
из 44 и 50 аминокислотных остатков 2500
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Спирты, кислоты и аминокислоты Получение L-аминокислот


путем ферментативной трансформации
ВВЕДЕНИЕ. Как мы уже видели на примере L-лизина, оксинитрилазы – ферменты из растительных тканей.
L-аспарагиновой кислоты и L-фенилаланина, тот или В настоящее время R- и S-оксинитрилазы получены в
иной энантиомер аминокислоты можно получить виде рекомбинантных белков в клетках E. coli; при
путем ферментативных превращений предшествен- этом ген R-оксинитрилазы клонирован из маниока, а
ников. В отличие от ферментации использование ген S-оксинитрилазы – из миндаля. Определена про-
энантиоспецифичных ферментов позволяет синтези- странственная структура обоих ферментов и с помо-
ровать небелковые аминокислоты. Для этой цели щью методов белковой инженерии предприняты
наиболее широко используют гидролазы, селективно попытки усовершенствовать ферменты для промыш-
расщепляющие определенные энантиомеры в раце- ленного применения.
мате. В качестве примера можно привести эстеразы, ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНО-
аминоацилазы, амидазы и гидантоиназы. Недостаток ВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ. На примере стереоселектив-
метода заключается в необходимости удаления ного синтеза L-лейцина из α-оксоизокапроновой
«неправильного» энантиомера из реакционной смеси, кислоты видно, что для восстановительного амини-
его рацемизации и повторного введения в реакцию. рования с помощью L-лейциндегидрогеназы из Bacil-
В другом методе используются реакции присоеди- lus sp. кроме NH3 необходим NADH. Ввиду высокой
нения, катализируемые лиазами (например, окси- стоимости кофермента необходимо создать систему
нитрилазами), или окислительно-восстановитель- его регенерации. Очень элегантно эта проблема ре-
ные реакции, катализируемые оксидоредуктазами; шена в случае формиатдегидрогеназы из Candida boi-
в этих реакциях образуются только «правильные» dinii: CO2 – один из побочных продуктов реакции –
энантиомеры. сдвигает равновесие в сторону образования L-лейци-
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ. Наиболее хоро- на. Использование NADH, связанного с полиэтиленг-
шо изучены и активно применяются в современных ликолем (ПЭГ), позволяет получать до 600 000 мо-
промышленных процессах аминоацилазы и гидантои- лярных эквивалентов продукта из одного моля NADH.
назы. Для осуществления гидролиза рацемата В промышленности восстановление NADH в окисли-
N-ациламинокислот используют иммобилизованную тельно-восстановительных реакциях происходит на
ацилазу, выделенную из Aspergillus oryzae или Baсil- неизменяющемся коэнзиме в порционном режиме.
lus thermoglucosidius. В реакции участвуют только Еще более интенсивно подобный процесс происходит
L-энантиомеры, а N-ацил-D-аминокислоты, оставши- с участием измененных (путем Protein Design или на-
еся в реакционной смеси после кристаллизации правленной эволюции) ферментов в генетически мо-
L-аминокислот, подвергают термической рацемиза- дифицированных микроорганизмах.
ции и снова вводят в реакцию. Таким способом еже-
годно производят сотни тонн L-метионина, L-тирози-
на, L-пролина и L-валина для медицинских нужд.
Аналогичным образом можно получать и D-амино-
кислоты, однако более выгодно использовать
доступные предшественники аминокислот – гидан-
тоины. После расщепления гидантоинов специфиче-
скими гидантоиназами образуются N-карбамоил-
аминокислоты, которые в свою очередь могут быть
превращены в D- или L-аминокислоты при помощи
карбамоилаз. «Ложный» гидантоин прекращает фер-
ментативную рацемизацию и в ходе оптимизирован-
ного путем генетических технологий ферментативно-
го каскада приводит к количественному выходу
абиогенных L- и D-аминокислот. Свойство «непра-
вильного» гидантоина рацемизоваться при
рН 8,5 легло в основу нового метода, перспективно-
го для промышленного получения D-фенилглицина
и 4-гидроксифенилглицина – важных предшествен-
ников полусинтетических пенициллинов ампицилли-
на и амоксициллина.
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ.
Для осуществления реакций, специфичных для
38 R- и S-энантиомеров, используют соответствующие
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Наиболее хорошо изученные реакции


Тип реакции Класс фермента Комментарий
Гидролиз рацемических Гидролазы Простая, широко применяемая, но дорогостоящая реакция, так как
смесей предшествеников «неправильный» энантиомер необходимо вновь рацемизировать
Присоединение Лиазы Простая реакция с количественным выходом;
HCN или NH3 недостаток – малый выбор ферментов
по карбонильной группе
Восстановительное Дегидрогеназы Образуется только один энантиомер, однако это процесс
аминирование дорогой из-за затрат на системы регенерации кофакторов
α-оксокарбоновых кислот

1 Гидантоиназы
1 2
2 Карбамоилазы
3 Эстеразы
(R1 = OR, R2 = H)
4 Аминоацилазы
(R1 = OH, R2 = Acyl)
3 4 5
5 Амидазы
(R1 = NH2, R2 = H)
6 Оксинитрилазы
L-Аминокислота
Например,
6 L- или S-специфические
ферменты
Ферментативный Реакции химического
катализ синтеза

Энантиоселективное расщепление D,L-N-ациламинокислот

N-Ацетил-D,L-аминокислоты

Рацеми-
Кристаллизатор зация
Иммоби-
лизован-
ная амино-
ацилаза N-Ацетил-
Сепаратор D-аминокислота
Испаритель
(растворитель, Не кристаллизуется
уксусная кислота) L-Аминокислота
Кристаллизуется

Восстановительное аминирование α-оксокарбоновых кислот


Мембранный ферментный реактор
Лейциндегидрогеназа, обладающая широкой
субстратной специфичностью, осуществляет реакцию
аминирования не только лейцина, L-Лейциндегидрогеназа
но и других α-оксокарбоновых кислот. α-Оксо- L-Лейцин
При этом образуются небелковые аминокислоты, изокап-
например L-лейцин. ронат
до 106 циклов
Лейциндегидрогеназа Относительная KM, mM ПЭГ-NADH ПЭГ-NADH+
из Bacillus sphaericus активность
α-оксоизокапронат 100 0,31 Муравьиная
α-оксоизовалериат 126 1,4 СО2
Формиатдегидрогеназа кислота
α-оксовалериат 76 1,7
α-оксобутират 57 7,7 Мембрана для
α-оксокапронат 46 7,0 ультрафильтрации
ПЭГ-NADH – синтетическое производное NADH с MR = 3000. Многие дегидрогеназы способны использовать
его в качестве кофактора. Для удерживания ПЭГ-NADH в реакционной смеси используют ультрафильтрацию.
Реакция протекает со свободным NADH и расходованием продукта.
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Антибиотики: источники,


применение и механизмы действия
ВВЕДЕНИЕ. Еще в 1928 г. Александр Флеминг обнару- для борьбы с микробными инфекциями, при этом
жил явление, приведшее к открытию антибиотиков: на различают антибиотики с широким спектром дейст-
культуре стафилококка он заметил грибковую инфек- вия (например, цефалоспорин и тетрациклин) и селе-
цию, остановившую рост бактерий. Лишь 10 лет спу- ктивные антибиотики, которые действуют на опреде-
стя Говарду Флори удалось изучить структуру веще- ленных возбудителей болезней (например,
ства, вызвавшего остановку роста стафилококковых рифампицин активен против легочной формы тубер-
бактерий – пенициллина. Успешные испытания дейст- кулеза, амфотерицин В – против грибковых инфек-
вия пенициллина на лабораторных животных, воз- ций). Для терапии рака применяют так называемые
можно, вскоре привели бы к его использованию и для «противоопухолевые» антибиотики (в частности,
лечения людей, однако эти исследования, проводив- адриамицин) – токсичные вещества, действующие
шиеся в рамках большого американо-британского как цитостатики. В растениеводстве в качестве пес-
проекта, были прерваны Второй мировой войной. За тицидов также используют антибиотики (бластици-
1945 г. в мире было произведено несколько кило- дин S и казугамицин): они эффективны в очень низ-
граммов бензилпенициллина. Однако пенициллин ких концентрациях и практически безвредны для
действует исключительно на грамположительные бак- теплокровных организмов. Некоторые антибиотики
терии, среди которых не столь часто встречаются воз- применяют в качестве консервантов при изготовле-
будители заболеваний человека. В 1947 г. Зельман нии пищевых продуктов, например пимарицин ис-
Ваксман обнаружил в культуре Streptomyces пользуется в сыроварении для защиты от грибковой
griseus антибиотик (стрептомицин), который действо- инфекции. Существуют так называемые «кормовые»
вал на грамотрицательные бактерии. В течение пос- антибиотики – те, что добавляют в корм сельскохо-
ледующих лет путем систематического скрининга бы- зяйственных животных для лучшего усвоения пищи
ло выявлено множество новых антибиотиков и и быстрой прибавки в весе. Исключительно важной
разработаны способы их промышленого получения. задачей представляется разработка новых антибио-
В результате слишком широкого и зачастую неумест- тиков, которые препятствуют возникновению новых
ного применения антибиотиков, как в медицинских це- штаммов микроорганизмов, устойчивых к ранее при-
лях, так и в кормовых добавках, стали появляться но- менявшимся антибиотикам (в том числе монензин –
вые микроорганизмы – возбудители заболеваний, препарат, добавляемый в корм сельскохозяйствен-
обладающие устойчивостью к уже известным анти- ных птиц). В биохимических и молекулярных иссле-
биотикам. Поэтому ведутся разработки новых анти- дованиях антибиотики используются как селектив-
биотиков, а также осуществляются попытки строго ог- ные ингибиторы различных клеточных функций.
раничить область применения уже существующих. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ. Антимикробное действие ан-
Для поиска новых антибиотиков используют скрининг, тибиотиков обусловлено подавлением следующих
слияние клеток продуцентов различных антибиотиков функций клеток микроорганизма: 1) биосинтез и
и проводят поиск новых мишеней действия антибио- функционирование генов; 2) биосинтез клеточных
тиков на основе анализа генома патогенных микроор- компонентов; 3) биосинтез и функционирование бел-
ганизмов (gene shuffling). ков; 4) биосинтез и функционирование клеточной
ИСТОЧНИКИ. На сегодняшний день более 8000 анти- мембраны; 5) биосинтез клеточной стенки. Как пра-
биотиков выделены из микроорганизмов, а около вило, действие антибиотика является результатом
4000 получены из других организмов: лишайников, сложной цепи его взаимодействий с клеточными
растений и животных. Наиболее важным и широким компонентами. У микроорганизмов существует гене-
классом продуцентов антибиотиков являются гри- тически запрограммированный механизм приспособ-
бы – актиномицеты. ления к изменяющимся условиям среды, поэтому
ПРИМЕНЕНИЕ. Промышленным способом сейчас создание новых антибиотиков и появление новых ре-
получают около 200 антибиотиков, при этом боль- зистентных штаммов микроорганизмов происходят
шинство препаратов являются полусинтетическими практически в одно и то же время.
природными соединениями, т. е. биологическую ак-
тивность которых как антибиотиков удалось проявить
путем изменений в их молекуле, вносимых химиче-
скими или биотехнологическими методами. Пример-
но две трети объема мирового рынка (32 млрд долл.
США) приходится на β-лактамные антибиотики (пе-
нициллины и цефалоспорины), объем их производст-
ва составляет более 50 000 т/г. Значительное
40 количество антибиотиков используются в медицине
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Источники антибиотиков* Объем рынка некоторых антибиотиков*


Таксономи- Относительная Тип антибиотика Объем рынка
ческая доля (%) (109 долл. США)
группа
Цефалоспорины 9,0
Актиномицеты 50 Пенициллины/ингибиторы лактамаз 6,9
Бактерии 10 Хинолон (синтетический) 5,8
Грибы 20 Макролиды 5,7
Лишайники 1 Пептидные антибиотики, гликопептиды 0,1
Аминогликозиды 0,8
Водоросли 2
Тетрациклины 0,9
Растения 15 Другие вещества 2,5
Животные 2 Всего 31,7
* Из примерно 25 000 биологически активных веществ * Данные 2004 г.

Классификация антибиотиков на основе химического строения


1 Углеводные Аминогликозиды Стрептомицин (медицина),
антибиотики казугамицин (фунгицид на рисовых плантациях)
2 Макроциклические Макролидные, полиеновые Эритромицин (медицина),
лактоны антибиотики, ансамицины пимарицин (сыроварение),
рифампицин (лечение туберкулеза)

3 Семейство хинона Тетрациклины Тетрациклин, хлортетрациклин (медицина,


консервант для пищевых продуктов)
Антрациклины Доксорубицин (противоопухолевая терапия)

4 Аминокислотные Производные аминокислот Циклоспорин (трансплантация органов),


и пептидные фосфинотрицин (растениеводство)
антибиотики β-Лактамные антибиотики Пенициллин, цефалоспорин (медицина),
Пептидные антибиотики бацитрацин (медицина),
виргиниамицин (откорм скота)
Хромопептиды Актиномицин (противоопухолевая терапия)
Гликопептиды Блеомицин (противоопухолевая терапия),
ванкомицин (медицина), авопарцин (скотоводство)

5 N-Содержащие гетеро- Нуклеозидные антибиотики Полиоксины, бластицидин S


циклические соединения (фунгицид в растениеводстве)
6 О-Содержащие гетеро- Полиэфирные антибиотики Монензин (птицеводство)
циклические соединения

7 Алициклические Производные циклоалканов Циклогексимид (фунгицид)


антибиотики
8 Ароматические Производные бензола Хлорамфеникол (медицина),
антибиотики гризеофульвин (фунгицид)

Мишени действия антибиотиков

70S-Субъединица Новосинте-
Полиеновые Клеточная β-Лактамные Клеточная рибосомы
Антрациклины антибиотики стенка антибиотики мембрана зированный
белок
30S

Репликация Трансляция
ДНК
50S

Транскрипция тРНК

Аминокислоты Эритромицин
мРНК Рифампицин Тетрациклин
Стрептомицин Хлорамфеникол
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам

СКРИНИНГ. Скрининг бактериальных штаммов с це- ков – продуктов вторичного обмена веществ – начи-
лью выявления антимикробной активности осуществ- нается после того, как клетки достигли стационарной
ляют по их влиянию на поведение контрольного фазы роста. Как правило, антибиотики являются вне-
штамма. После того как на штамме выявлена анти- клеточными продуктами аэробного обмена веществ и
микробная активность, антибиотик выделяют, очища- плохо растворяются в воде. По окончании цикла фер-
ют и анализируют его структуру. Как правило, у ново- ментации клетки удаляют центрифугированием, из
го антибиотика строение молекулы похоже на среды экстрагируют растворенные в ней питательные
строение уже изученных веществ. Чтобы увеличить вещества (эти два этапа выделения продукта можно
эффективность поиска штаммов-продуцентов анти- объединять), а затем продукт очищают перекристал-
биотиков, разрабатывают новые методы скрининга, лизацией или хроматографически. Промышленные
например с использованием биохимических или био- процессы получения, очистки и подготовки антибио-
логических чипов, применяют новые химико-анали- тиков, которые используются в медицинских целях,
тические методы, а также ищут возможные мишени ведутся под строгим контролем в полном соответст-
для действия антибиотика (в библиотеках синтезиро- вии с сертифицированными правилами организации
ванных соединений ищут вещества, действующие на производства и контроля качества лекарственных
определенную функцию микроорганизма). средств (Good Manufacturing Practice, ISO 9000).
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ШТАММОВ. Антибиотики УСТОЙЧИВОСТЬ (РЕЗИСТЕНТНОСТЬ) К АНТИБИОТИ-
являются продуктами вторичного обмена веществ КАМ. Микроорганизмы, обладающие устойчивостью
у микроорганизмов и выделяются в среду роста к антибиотикам, весьма распространены, и это стало
в очень небольших количествах (несколько милли- главной медицинской проблемой. Неуклонно растет
граммов на литр культуральной жидкости). Поэтому, число штаммов Salmonella, Escherichia coli, стафило-
если обнаруженный антибиотик представляет инте- кокков, стрептококков, а в последнее время и Myco-
рес, то перед исследователем встает задача повы- bacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза),
сить уровень его синтеза. Усовершенствование устойчивых к целому ряду антибиотиков. Самые важ-
штамма заключается в многократном повторении ак- ные механизмы, обеспечивающие устойчивость мик-
тов мутагенеза с последующей селекцией и обрат- роорганизма к действию антибиотиков, следующие:
ным «скрещиванием». Таким образом удается повы- а) нарушение процесса поступления антибиотика в
сить выход антибиотика в 103–106 раз по сравнению клетку или ускоренное выведение его из клетки (на-
с диким штаммом. Методы генетической инженерии, пример, в результате изменения проницаемости
например, введение дополнительных копий генов мембраны); б) специфические изменения структур,
ферментов, играющих ключевую роль в синтезе являющихся мишенью действия антибиотика (изме-
антибиотиков, также позволяют получать новые нения сайта связывания в рибосоме или молекуле
штаммы-суперпродуценты. ДНК); в) генетически запрограммированные фер-
ФЕРМЕНТАЦИЯ И ПЕРЕРАБОТКА. У большинства анти- ментативные реакции, обеспечивающие устойчи-
биотиков весьма сложная структурная формула, ча- вость к антибиотику. Некоторые генетические дефек-
сто с несколькими стереоцентрами, поэтому химиче- ты могут распространяться среди различных видов
ский синтез редко используется для их производства. микроорганизмов с помощью плазмид, фагов или
Промышленное получение антибиотиков осуществля- транспозонов. Таким образом, после обнаружения
ется ферментацией в биореакторах. Питательная сре- нового антибиотика надо продолжить исследования,
да содержит такие недорогие источники углерода и чтобы найти его аналоги на основе существующих ан-
азота, как меласса, лактоза и соевая мука. По мере тибиотиков, применяемых, например, в сельском хо-
замедления роста из-за исчерпания питательных ве- зяйстве для улучшения роста и профилактики забо-
ществ клеточная культура переходит в идиофазу: леваний скота. Такие аналоги понадобятся для
именно тогда синтезируются антибиотики. Большин- борьбы с патогенами, устойчивыми к действию суще-
ство штаммов-продуцентов антибиотиков устойчивы к ствующих антибиотиков.
своим катаболитам только в этом состоянии, поэтому
для предотвращения самоуничтожения система
должна быстро достичь идиофазы, а затем культиви-
ровать микроорганизмы в этой фазе. Если в качестве
продуцента антибиотиков используют грибы, или ак-
тиномицеты, наряду с оптимизацией состава пита-
тельной среды особое внимание уделяют концентра-
ции кислорода, так как клетки мицелия весьма
42 чувствительны к аэрации. Образование антибиоти-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Скрининг и отбор
1 1 Пробы микроорганизмов (мазки):
Плесневые грибы,
синтезирующие 6 2 6 2 1 Staphylococcus aureus
антибиотик (грамположительная
Питательная бактерия)
5 3среда на агаре5 3 2 Streptococcus sp.
(грамположительная
4 4 бактерия)
1 Гризеофульвин 3 Escherichia coli
Пенициллин G
6 2 (грамотрицательная
бактерия)
4 Pseudomonas aeruginosa
Агар, на котором (грамотрицательная
Замедленный
растет контрольный 5 3 бактерия)
микроорганизм
рост 4 5 Candida albicans (дрожжи)
контрольного
микроорганизма Тетрациклин 6 Trichophyton rubrum (грибы)

Усовершенствование штаммов
Гибрид

скрещивание
F7

Обратное
50 000
Пенициллин

F6 40 000

Выход продукта (ед./мл)


F5

Мутагенез и селекция
30 000

F4
20 000
F3
Выход продукта
в мутанте F2 10 000
Мутант, выбранный для
следующего раунда
скрещивания F1 0
1940 50 60 70 80
F1–F7 – дочерние поколения Дикий штамм

Устойчивость к антибиотику
а Изменение мишени действия антибиотика б Ферментативные модификации
или выведение антибиотика из клетки
Ингиби- Белок, связывающийся с антибиотиком
рование
Клеточная АТРаза, осу-
стенка ществляющая
Ингибирование выведение
отсутствует

Ингиби- Ингиби- Плазмида


рование рование Модифицирующие
отсут- РНК-поли- ферменты
ствует Ингиби- мераза
рование
ДНК-топо- Ферменты,
изомераза ДНК разрушающие
антибиотик
Ингибирование
отсутствует
Активная Формы
Разные антибиотики Неактивная антибиотиков
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики β-Лактамные антибиотики:


структура, биосинтез и механизм действия
ВВЕДЕНИЕ. Благодаря высокой эффективности дейст- третьего поколения имеют широкий спектр действия,
вия, низкой токсичности, а также наличию разработан- включающий и грамположительные, и грамотрица-
ных методов химического и ферментативного получе- тельные бактерии, и практически не вызывают по-
ния β-лактамные антибиотики (производные бочных эффектов у пациентов.
пенициллина и цефалоспорина) нашли наиболее ши- БИОСИНТЕЗ. В геноме P. chrysogenum найдены три
рокое применение в современной медицине. Мировое гена, продукты которых участвуют в биосинтезе
производство β-лактамных антибиотиков составляет изопенициллина N. Эти гены расположены рядом друг
30 000 т, а около 50% всего рынка антибиотиков при- с другом и образуют так называемый генный кластер.
ходится на долю цефалоспорина. В то время как Продукт одного из этих генов – синтетаза – обеспечи-
цефалоспорин используется только для лечения чело- вает присоединение L-валина и L-цистеина к L-α-ами-
века, пенициллин применяют и в ветеринарии. Наибо- ноадипиновой кислоте. Образовавшийся трипептид
лее важными веществами, из которых получают полу- под действием другой синтетазы превращается в изо-
синтетические β-лактамные антибиотики, являются пенициллин N, содержащий β-лактамное кольцо.
пенициллин G (бензилпенициллин) и цефалоспорин С. На следующем этапе происходит обмен боковой це-
При внесении изменений в молекулярную структуру пи (L-α-аминоадипила) на другие ацильные группы.
этих антибиотиков меняются фармакологические Эту реакцию катализирует ацил-КоА:изопеницил-
свойства и расширяется спектр действия нового анти- лин-N-ацилтрансфераза. Для получения цефалос-
биотика. Важными характеристиками антибиотиков яв- поринов осуществляют расширение гетероцикла
ляются их стабильность в кислых условиях среды изопенициллина N при участии фермента экспанда-
(в желудочно-кишечном тракте – при пероральном зы. О-Ацилтрансфераза, выделенная из A. chryso-
введении), а также устойчивость к действию β-лакта- genum, модифицирует только 3-ацетоксиметильную
мазы – основного фермента, который обеспечивает группу, не затрагивая N-ациламиногруппу. У A. chry-
резистентность бактерий к действию антибиотиков. sogenum (в отличие от P. chrysogenum) гены,
Как правило, ген β-лактамазы находится в плазмид- продукты которых участвуют в биосинтезе цефалос-
ной ДНК бактерий. порина С, расположены на двух различных хромосо-
ПЕНИЦИЛЛИН. Грибы вида Penicillium chrysogenum мах. Эти гены уже клонированы, и ведутся исследо-
продуцируют изопенициллин N, имеющий в боковой вания с целью осуществления направленной
цепи L-α-аминоадипиновую кислоту. Добавление к (искусственной) регуляции биосинтеза антибиотиков.
среде роста веществ-предшественников, ацильная МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ β-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИ-
группа которых участвует в реакции трансацетилиро- КОВ. β-Лактамные антибиотики препятствуют образо-
вания, позволяет получать производные пеницилли- ванию поперечных пептидных связей в молекуле му-
на, обладающие различными фармакологическими реина – основного компонента клеточных стенок
свойствами. Так, в присутствии фенилуксусной кис- бактерий. Таким образом, антибиотики этой группы
лоты образуется пенициллин G. Это вещество и полу- действуют на микроорганизмы, содержащие в клеточ-
чаемая из него 6-аминопенициллановая кислота ной стенке муреин. Для человека нежелательные по-
(6-АРА) – важнейшие промежуточные продукты при бочные эффекты от приема антибиотиков связаны с
производстве полусинтетических пенициллинов и це- возможными нарушениями баланса кишечной флоры
фалоспоринов. и возникновением аллергических реакций.
ЦЕФАЛОСПОРИН. Цефалоспорин С был впервые опи-
сан в 1953 г. как новый ряд β-лактамного антибиоти-
ка, образующегося в Acremonium chrysogenum
(ранее Cephalosporium acremonium). A. chrysogenum
не имеет собственной N-трансацетилазы, поэтому,
в отличие от биосинтеза пенициллинов, в этом слу-
чае нет возможности обеспечить биосинтез новых
фармакологических продуктов добавлением в среду
роста тех или иных веществ. Полусинтетические це-
фалоспорины получают двумя способами: из 7-ами-
ноцефалоспорановой кислоты (7-АСА), которая обра-
зуется при удалении амидной боковой цепи
цефалоспорина С, и ее 3-дезацетоксипроизводного
(7-ADCA). В настоящее время существует уже три
поколения цефалоспоринов, различающиеся по спе-
44 цифичности действия. Цефалоспорины второго и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Пенициллин
R Название Свойства

Изопенициллин N
Пенициллин G Неустойчив в кислой среде,
чувствителен к β-лактамазе

Ампициллин Устойчив в кислой среде,


Ациль- β-Лактам- Тиазолиди- чувствителен к β-лактамазе,
ная ное кольцо новое кольцо действует также на грам-
группа отрицательные бактерии

Амоксициллин Устойчив в кислой среде,


6β-Аминопеницилла- чувствителен к β-лактамазе,
новая кислота (6-АРА) широкий спектр действия,
высокая степень резорбции

Цефалоспорины
R1/R2 Название Свойства

Цефалоспорин С Неустойчив в кислой


среде, чувствителен
к β-лактамазе

Ациль- β-Лактам- Дигидротиази- Цефаклор Устойчив в кислой


ная ное кольцо новое кольцо среде, не чувствите-
группа лен к β-лактамазе,
широкий спектр
7β-Аминоцефалоспорановая действия
кислота (7-АСА,
R2 = CH2–O–CO–CH3) Цефотаксим Устойчив в кислой
среде, не чувствите-
7β-Аминодезацетоксицефало- лен к β-лактамазе,
спорановая кислота (7-АDСА, очень широкий
R2 = CH3) спектр действия

Биoсинтез и структура генных кластеров


L-α-Аминоадипиновая кислота + L-Цистеин + L-Валин Фермент/ген
1 ACVS pcbAB δ-L-α-Аминоадипил-L-цис-
1 теинил-D-валин-синтетаза
2 IPNA pcbC Изопенициллин-
N-синтетаза
3 AT penDE Ацил-КоА: изопенициллин-
N-ацилтрансфераза
4 IPNE cefD Изопенициллин-
N-эпимераза
δ-L-α-Аминоадипил-L-цистеинил-D-валин 5 REX/H cefEF Экспандаза/гидроксилаза
6 AT cefG Ацил-КоА: цефалоспоран-
2 ацилтрансфераза

Изопенициллин N Дезацетоксицефалоспорин C
4, 5
3 6
Пенициллин G Цефалоспорин C
Структура генных кластеров
P. chrysogenum A. chrysogenum

pcbAB pcbC penDE pcbAB pcbC cefEF cefG


45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики β-Лактамные антибиотики: промышленное получение

ВВЕДЕНИЕ. В молекуле пенициллина в гетероцикле для производства полусинтетических пенициллинов


три стереоспецифических центра, следовательно, и цефалоспоринов. В современном производстве хи-
при химическом синтезе могут образовываться во- мический гидролиз практически полностью заменен
семь стереоизомеров (3(S):5(R):6(R)), из которых на ферментативный гидролиз под действием иммо-
лишь один стереоизомер проявляет биологическую билизованной пенициллин-G-амидазы из E. coli. Оп-
активность. По сравнению с химическим синтезом тимальными условиями для реакции гидролиза явля-
ферментация с использованием оптимизированных ются рН 7,5–8,0 и температура 35–40 °С. Высокая
штаммов Penicillium chrysogenum представляется стабильность фермента позволяет повторять цикл
значительно более выгодной с экономической точки до 1000 раз, поэтому реакцию проводят в непрерыв-
зрения. Добавление в среду роста алифатических ном режиме. В результате последующей очистки
или ароматических карбоновых кислот позволяет по- продукта осаждением и фильтрацией получают
лучать различные производные – предшественники 6-АРА высокой степени чистоты, а затем ее либо
других антибиотиков, среди которых наибольшее подвергают ацилированию по положению 6 для полу-
значение имеют пенициллины V и G. Пенициллин G чения полусинтетических пенициллинов, либо пре-
используется для производства 6-аминопеницилла- вращают в 7-ADCA – промежуточное соединение в
новой кислоты (6-АРА) – важнейшего продукта при синтезе цефалоспоринов.
получении полусинтетических пенициллинов и цефа- ЦЕФАЛОСПОРИНЫ И 7-A(D)CA. Метод ферментатив-
лоспоринов. ного получения цефалоспоринов с использованием
ПЕНИЦИЛЛИН G И 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВАЯ КИС- Acremonium chrysogenum аналогичен описанному
ЛОТА (6-АРА). В промышленности при получении пе- выше способу производства пенициллинов, однако
нициллина G используют штаммы-суперпродуценты в случае цефалоспоринов выход продукта несколько
P. chrysogenum, культуру которых выращивают в био- ниже. A. chrysogenum не имеет собственной N-транс-
реакторах с рабочим объемом до 200 м3. Чтобы из- ацетилазы, поэтому все полусинтетические антибио-
бежать подавления роста клеток катаболитами, фер- тики ряда цефалоспоринов синтезируют на основе
ментацию осуществляют в непрерывном режиме, 7-аминоспорановой кислоты (7-АСА) или ее дезаце-
т. е. в биореактор постоянно подают свежую культу- токсипроизводного (7-ADCA). 7-ACA получают путем
ральную среду. Для образования и роста мицелия гидролиза в мягких условиях. По экономическим и
грибов необходимо хорошее снабжение кислородом, экологическим причинам все большее распростране-
поэтому в ферментерах предусмотрены специальные ние приобретает двухстадийный процесс. Получение
приспособления для аэрации и тщательного переме- 7-АСА начинается с иммобилизованной оксидазы D-
шивания культуры. Сложная питательная среда аминокислот. На этой стадии путем окислительного
содержит лактозу в качестве источника углерода, дезаминирования образуется α-кетоадипил-7-ACA,
а жидкий кукурузный экстракт служит источником которая спонтанно декарбоксилируется до глутарил-
азота. Синтез антибиотиков начинается примерно че- 7-ACA. В ходе реакции, катализируемой иммобили-
рез 40 ч, т. е. по окончании фазы роста. Идиофаза – зованной глутарил-7-ACA-ацилазой, образуется
период, когда происходит синтез антибиотиков, – 7-ACA. Из нее можно получить до 50 полусинтетиче-
длится около 100 ч, и в это время в среду добавля- ских цефалоспоринов. Одностадийный гидролиз осу-
ют фенилуксусную кислоту. Клетки секретируют пе- ществляют с использованием цефалоспорин-7-аци-
нициллин G в культуральный бульон. После отделе- лазы. Для получения 7-ADCA и производных
ния мицелия фильтрацией или центрифугированием цефалоспоринов используют рекомбинантные штам-
культуральную жидкость подвергают двухстадийной мы Penicillium chrysogenum, в которых клонирован ген
экстракции с использованием амилацетата (или бу- экспандазы из Acremonium chrysogenum или Strepto-
тилацетата) при рН 2,5–3,0 и 0–3 °С. Метод основан myces clavuligerus. Образующаяся адипил-ADCA рас-
на том, что большинство антибиотиков хорошо рас- щепляется амидазой (например, из Pseudomonas
творяются в органических растворителях, практиче- diminuta). Расширение кольца пенициллина до деза-
ски не смешивающихся с водой. Непрерывную экс- цетоксицефалоспорина также возможно во внекле-
тракцию антибиотика из водной фазы в органическую точных условиях с использованием иммобилизован-
можно осуществлять в противоточном режиме, при ных ферментов.
котором две жидкие фазы движутся в противополож-
ных направлениях. Затем первичный продукт (около
3 т/сут. в биореакторе с объемом 110 м3) перекри-
сталлизовывают. Следующий этап переработки за-
ключается в гидролизе пенициллина G с образовани-
46 ем 6-АРА – важнейшего соединения, необходимого
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Методы синтеза
Penicillium chrysogenum Ферментация Дополнительные
На среде с фенилуксусной кислотой Ферментативный катализ химические реакции
Acremoneum chrysogenum
Экспандаза; Ферментация
глутариловая
кислота

Пенициллин G
Иммобили- Цефалоспорин С
зованная Глутарил-3-дезацетокси-
пенициллин-G- Иммобили-
амидаза цефалоспорин* зованный
фермент

6-Аминопенициллановая 7-Аминодезацетоксицефало- 7-Аминоцефало-


кислота (6-АРА) спорановая кислота (7-ADCA) спорановая кислота (7-АСА)

Полусинтетические пенициллины Полусинтетические цефалоспорины


* Производное 7-ADCA за счет расширения цикла пенициллина (in vivo) или 6-АDA (биотехнологическим путем)

Промышленное получение β-лактамных антибиотиков


Антибиотики пенициллинового ряда Антибиотики цефалоспоринового ряда
Посевной материал Посевной материал
Суспензия спор P. chrysogenum Суспензия спор А. chrysogenum

Предферментация, ферментация Предферментация, ферментация


Лактоза, жидкий кукурузный экстракт, CaCO3; Ферментация с добавлением субстрата, усиленное
ферментация с добавлением субстрата (глюкозы), снабжение кислородом в течение 120 ч;
усиленное снабжение кислородом; добавление добавление жирных кислот, например
веществ-предшественников, например D-фенил- метилолеата, приводит к повышению выхода
уксусной кислоты, приводит к образованию био- продукта; > 17 г/л после 150 ч ферментации
синтетических пенициллинов;
выход: > 30 г/л после 120 ч ферментации

Первичная обработка Первичная обработка


1) Отделение мицелия 1) Отделение мицелия
2) Экстракция в противотоке с использованием 2) Ионообменная хроматография, осаждение
амилацетата или бутилацетата или адсорбция на амберлите ХАD

Ферментативный гидролиз Реакция Химический гидролиз


с образованием 6-АРА расширения кольца с образованием 7-АСА
Иммобилизованная Четырехстадийная Иммобилизованные оксидаза
пенициллин-G-амидаза из E. coli, химическая реакция, D-аминокислот и глютарил-
в непрерывном режиме, при 37 °C выход ~ 70% 7-АСА-ацилаза, выход > 90%

Полусинтетические пенициллины Полусинтетические цефалоспорины


Присоединение ацильных боковых групп Присоединение ацильных боковых групп
(реакция Шоттена–Баумана) (реакция Шоттена–Баумана)
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Пептидные антибиотики


и антибиотики – производные аминокислот
ВВЕДЕНИЕ. В предыдущем разделе обсуждались ме- организмов. Нерибосомный синтез пептидов возмо-
тоды получения β-лактамных антибиотиков – важней- жен благодаря функционированию специальных фер-
шей группы антибиотиков, применяемых в медицине. ментных комплексов – синтетаз, по строению сход-
В настоящее время продемонстрировано антимикроб- ных с синтетазой жирных кислот у эукариот.
ное действие более 500 веществ, состоящих из пеп- В этих ферментативных реакциях образуются корот-
тидов или являющихся производными аминокислот. кие линейные полипептиды, которые затем замыка-
Некоторые из этих соединений используются в меди- ются в цикл, образуя, например, лантибиотики. Раз-
цине, в частности для стимуляции заживления ран, мер таких пептидов, как правило, не превышает
а другие нашли применение в сельском хозяйстве. 20 аминокислотных остатков. Они формируют в
К этой группе антибиотиков относятся циклосерин, фосфолипидной мембране каналы, проницаемые
фосфинотрицин, циклические пептидные антибиотики для катионов. Кроме того, в их состав часто входят
(грамицидин, бацитрацин), хелатообразующие пепти- небелковые аминокислоты, а также дополнительные
ды (блеомицин), хромопептиды (актиномицин), а так- структурные элементы. Большинство пептидных ан-
же депсипептиды (виргиниамицин). Большинство тибиотиков, синтезированных вне рибосом, являют-
этих соединений получают из клеток стрептомицетов, ся сильными токсинами, поэтому они применяются
а некоторые – из других грамположительных микро- лишь для специальных целей, например для зажив-
организмов, в том числе стрептококков и бацилл. ления ран или ожогов. Бацитрацин применяется в
АНТИБИОТИКИ – ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТ. качестве кормовой добавки; циклоспорин из Tolypoc-
Образующийся в процессе жизнедеятельности Strep- ladium inflatum – иммуносупрессор (назначается при
tomyces orchidaceus D-циклосерин представляет трансплантации органов). Колистин (полимиксин Е)
собой аналог D-аланина – вещества, входящего в со- из клеток Bacillus polymyxa иногда используется
став муреина клеточной стенки бактерий. Антибак- как антибактериальный препарат при лечении
териальное действие D-циклосерина заключается инфекций, вызванных грамотрицательными бакте-
в ингибировании аланинрацемазы, участвующей риями. Цитостатик блеомицин, образующийся в
в синтезе муреина. В отличие от многих других анти- клетках Streptomyces verticillus, относится к важ-
биотиков D-циклосерин действует на Mycobacterium ным препаратам противораковой терапии. Блеоми-
tuberculosis, поэтому в сочетании с рифампицином цин в комплексе с Fe2+ способен действовать в
он показан при лечении туберкулеза легких (заме- качестве ДНКазы, т. е. осуществлять разрывы в дву-
тим, что в Западной Европе в последние годы цепочечной ДНК. Актиномицин, синтезирующийся
туберкулез почти не встречается). Аланил-аланил- многими штаммами Streptomyces, узнает в молекуле
фосфинотрицин, выделенный из Streptomyces ДНК палиндромную последовательность 5'-TGAC-3'
hygroscopicus, является аналогом L-глутамина и ин- и взаимодействует с нею, блокируя трансляцию
гибирует глутаминсинтетазу растений. Промышлен- ДНК, и в результате останавливает транскрипцию
ное получение фосфинотрицина (Glyphosat®, Ba- (при высоких концентрациях – репликацию). Ранее
sta®) основано на химическом синтезе этого актиномицин использовался в противораковой тера-
соединения. Клонирование гена ацетилтрансферазы пии. В антибиотиках группы депсипептидов, действу-
из S. hygroscopicus в сельскохозяйственных растени- ющих на грамположительные бактерии, аминокис-
ях обеспечивает устойчивость трансгенных растений лотные остатки соединены между собой поочередно
к фосфинотрицину. эфирными и амидными связями. Один из предста-
ПЕПТИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ. Пептидные антибиотики вителей этого ряда препаратов виргиниамицин –
синтезируются как на рибосомах, так и вне их. Син- продукт жизнедеятельности Streptomyces virginiae и
тез на рибосомах приводит к образованию линейных широко применяется при откорме скота и в птице-
полипептидов, которые подвергаются посттрансля- водческом хозяйстве. Ряд сидерохромов представ-
ционным модификациям. Примером такой модифи- лен пептидными антибиотиками, содержащими ионы
кации может служить реакция эпимеризации – пре- железа и гидроксамовую кислоту. Они используются
вращение L-аминокислоты в D-аминокислоту. Так, при лечении заболеваний, связанных с нарушениями
низин – пептидный антибиотик, образующийся на обмена железа.
рибосомах в клетках некоторых штаммов молочно-
кислых бактерий. Его антимикробное действие за-
ключается в ингибировании образования цитоплаз-
матической мембраны грамотрицательных бактерий,
поэтому препарат низина используют в производстве
кисломолочных продуктов в качестве консервирую-
48 щего средства, препятствующего росту других микро-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики – производные аминокислот


С5Н12NO4Р С3Н6N2O2
MR 181,13 MR 102,09
Код CAS 35597-44-5 Код CAS 68-41-7
(S)-Форма

Фосфинотрицин Циклосерин

Циклические пептидные антибиотики

Циклоспорин А
С62Н111N11O12
Бацитрацин
MR 1202,63 Код CAS 59865-13-3
С66Н103N17O16S MR 1422,71
Abu L-Аминомасляная кислота
хорошо растворим в воде Код CAS 1405-87-4 Sar Саркозин
MeBmt Бутенилдиметилтреонин
MeLeu N-Метиллейцин
Грамицидин А,
А- и B-цепи
в фосфолипидной Антибиотик Метод получения
мембране (1MAG) Фосфинотрицин В основном химический
синтез
Бацитрацин А Bacillus licheniformis
Полимиксин Bacillus polymyxa
Грамицидин Bacillus sp.
Блеомицин Streptomyces verticillus
Циклоспорин Tolypocladium inflatum
Виргиниамицин Streptomyces virginiae
Валиномицин Streptomyces fulvisimus
вид сбоку вид сверху

Ферментация Биосинтез грамицидина S (Bacillus brevis)


(производство
бацитрацина):

Предферментация
Реактор 1–3 м3,
6 ч при 37 °С

Биореактор L-Phe D-Фенил-


aланин (D-Phe)
Около 100 м3, 30 ч при
7 °С, сахароза, отходы L-Пролин (Pro)
переработки сои, соли L-Валин (Val)
L-Орнитин (Orn)
Обработка L-Лейцин (Leu)
Для медицинских целей:
экстракция 1-бутанолом,
ионообменная
хроматография;
Производство кормовой Грами-
добавки: высушивание цидин S
биомассы распылением
GS1 = синтетаза 1, 130 кДа
9 г/л за 30 ч GS2 = синтетаза 2, 500 кДа Пантеин 49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики

ВВЕДЕНИЕ. Здесь мы рассмотрим следующие анти- этого антибиотика сходен с действием хлорамфени-
биотики: гликопептидный антибиотик ванкомицин, кола: линкомицин связывается с 50S-субъединицей
который активен против штаммов Staphylococсus au- прокариотической рибосомы и препятствует дальней-
reus, устойчивых к действию метициллина; его ана- шему росту пептидной цепи. К настоящему времени
лог авопарцин, применяемый в качестве кормовой зарегистрировано множество штаммов, обладающих
добавки; гликозид линкомицин, очень эффективно устойчивостью к линкомицину. В таких клетках линко-
действующий против грамположительных энтеробак- мицин либо подвергается ферментативному разруше-
терий; а также монензин, который используют на нию, либо в результате метилирования происходят
птицефабриках для профилактики инфекций, вызы- такие изменения рРНК, что линкомицин не взаимо-
ваемых простейшими. Несмотря на то что нуклеозид- действует с 50S-субъединицей прокариотической
ные антибиотики – природные соединения, в медици- рибосомы.
не используются только продукты химического МОНЕНЗИН – полиэфирный антибиотик, который полу-
синтеза. В качестве примера нуклеозидного антибио- чают в процессе ферментации, осуществляемой
тика здесь рассмотрен ацикловир – аналог гуанози- Streptomyces cinnamonensis. Путь биосинтеза монен-
на, применяемый для лечения вирусного менингита. зина аналогичен синтезу поликетидных антибиотиков
ВАНКОМИЦИН И АВОПАРЦИН. Ванкомицин, проду- из ацетата, пропионата и бутирата. Молекулы монен-
центом которого является Amycolatopsis orientalis, зина встраиваются в мембрану и функционируют как
применяется в борьбе с энтерококковыми бактерия- ионофоры: они обеспечивают поступление ионов Na+
ми, устойчивыми к действию пенициллина, напри- в клетку и таким образом вызывают осмотический
мер при септическом эндокардите. Этот антибиотик лизис клетки. Такой механизм объясняет чрезвычайно
часто используется для лечения пациентов, страда- широкий круг организмов, для которых действие мо-
ющих аллергией на β-лактамные антибиотики. Ван- нензина является токсичным: к ним относятся не толь-
комицин оказывает негативное действие на почки, ко бактерии и грибы, но и простейшие, например
поэтому при лечении этим антибиотиком необходи- Eimeria sp. и Toxoplasma sp., вызывающие заболева-
мо следить за функцией почек. Как и в случае β-ла- ния на птицефермах. Из-за высокой токсичности мо-
ктамных антибиотиков, действие ванкомицина на нензин не используется в медицине, однако находит
микроорганизмы заключается в ингибировании обра- широкое применение в качестве кормовой добавки при
зования клеточной стенки бактерий в результате свя- разведении кур и крупного рогатого скота. На долю мо-
зывания антибиотика с UDP-мурамилпентапептидом. нензина и его структурного аналога салиномицина при-
В штаммах, устойчивых к действию ванкомицина, ходится до 80% объема мирового рынка антибиоти-
реализуется путь синтеза клеточной стенки с други- ков. Производство монензина превышает 3000 т/год,
ми промежуточными продуктами, не вступающими а рыночный оборот составляет 200 млн долл. США.
в реакцию с этим антибиотиком. Устойчивость к ан- НУКЛЕОЗИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ. Нуклеозидные анти-
тибиотику, возможно, возникает в результате гори- биотики пока находят лишь ограниченное примене-
зонтального переноса генетической информации ние. Аналог цитозина, бластицидин S, образующийся
посредством транспозонов между людьми, а также в Streptomyces griseochromogenes, используют при
домашними животными. Авопарцин – продукт жиз- выращивании риса в качестве фунгицида, препятст-
недеятельности Streptomyces candidus, по структу- вующего возникновению мучнистой росы. Действие
ре очень близкий к ванкомицину – в странах ЕС при- бластицидина S основано на ингибировании связыва-
меняется в качестве кормовой добавки. ния аминоацил-тРНК с рибосомой. В лечении забо-
Эксперименты на изолированных транспозонах, леваний, вызванных вирусами герпеса, таких как эн-
обеспечивающих устойчивость к ванкомицину и цефалит, важная роль принадлежит ацикловиру –
авопарцину, показали, что, возможно, в организме синтетическому аналогу гуанозина.
человека штаммы энтеробактерий, устойчивые к
действию этих антибиотиков, возникают по такому
же механизму передачи генетической информации.
По этой причине в некоторых странах (например, в
Дании) авопарцин был запрещен; согласно клиниче-
ским наблюдениям, случаи резистентности к ванко-
мицину стали реже.
ЛИНКОМИЦИН – антибиотик, образующийся в Strep-
tomyces lincolnensis и действующий против грамполо-
жительных бактерий. Основное применение линко-
50 мицина связано с ветеринарией. Механизм действия
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Гликопептидные, гликозидные и нуклеозидные антибиотики


a Ванкомицин б Бластицидин S

в Ацикловир

д Линкомицин

г Монензин А

a б в г д
С66Н75Сl2N9O24 С17Н26N8O5 С8Н11N5O3 С36Н62O11 С18Н34N2O6S
MR 1449,27 422,44 225,21 670,90 406,56
Код CAS 1404-90-6 2079-00-7 59277-89-3 17090-79-8 154-21-2

Антибиотик Микроорганизмы, исполь- Объем мирового Применение


зуемые при ферментации рынка
Ванкомицин Amycolatopsis orientalis Медицина
Авопарцин Streptomyces candidus Кормовая добавка
Монензин S. cinnamonensis Более 3000 т в год, Профилактика протозойных
200 млн долл. США инфекций у кур
Бластицидин S S. griseochromogenes Защита растений от грибковых
инфекций (фунгицид)
Ацикловир Химический синтез Медицина: противовирусный препарат
Линкомицин S. lincolnensis Ветеринария

Проблема устойчивости (резистентности) к антибиотикам


Антибиотики

Корм сельскохозяйст- Клиническая


венных животных медицина

Рост числа
Сельскохозяйственные Техническая, резистентных
и домашние животные, питьевая и водо- Инфекции штаммов
отходы/сточные воды проводная вода, микро-
орошение организмов
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Аминогликозидные антибиотики

ВВЕДЕНИЕ. Открытие стрептомицина, сделанное те многократного повторения раундов мутагенеза с


Зельманом Ваксманом в 1943 г., явилось важной последующим отбором мутантов удается повысить
вехой в изучении антибиотиков. Этот препарат был выход продукта, например стрептомицина: в диком
впервые успешно применен для лечения туберкуле- штамме синтезируется нескольких миллиграммов на
за, вызываемого Mycobacterium tuberculosum, – од- литр, а в штаммах-суперпродуцентах выход антибио-
ного из широко распространенных и наиболее опас- тика превышает 10 г/л после 120 ч роста. В про-
ных заболеваний человека. Стрептомицин, как и мышленности для выращивания культуры использу-
большинство аминогликозидных антибиотиков, ока- ют биореакторы с большим рабочим объемом.
зывает различные побочные эффекты, связанные с В качестве источника углерода служат глюкоза, крах-
нарушениями слуха и работы почек, поэтому в насто- мал или декстрин, а источником азота – соевая мука.
ящее время для лечения туберкулеза используют Аминогликозидные антибиотики, в частности гента-
другие антибиотики (гидразид изоникотиновой кисло- мицин, выделяются в среду роста, после того как рН
ты, рифампицин, а ранее часто применяли циклосе- среды доводен до 2,0. После отделения клеточной
рин). Молекулы аминогликозидных антибиотиков со- массы следует концентрирование культуральной
стоят из кольца аминоциклитола (например, жидкости, из которой в дальнейшем методом ионо-
2-дезоксистрептамин), которое связано с другими обменной хроматографии получают очищенный анти-
остатками аминосахаров гликозидными связями. биотик.
Аминогликозидные антибиотики, как правило, имеют МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИ-
широкий спектр действия, в том числе они эффек- БИОТИКАМ. Антимикробный эффект аминогликозид-
тивны против грамотрицательных бактерий, поэтому ных антибиотиков объясняется тем, что их молекулы
несмотря на относительно высокую токсичность их связываются с 30S-субъединицей прокариотической
широко используют в медицине, например при тяже- рибосомы и вызывают ошибки трансляции, приводя-
лых инфекциях. Другой областью применения ами- щие к остановке синтеза полипептидных цепей.
ногликозидных антибиотиков является сельское хо- Некоторые антибиотики группы аминогликозидов
зяйство, где они служат для защиты растений. специфически взаимодействуют с РНК интронов
Объем рынка аминогликозидных антибиотиков дости- I группы. Недостаток аминогликозидных антибиоти-
гает 800 млн долл. США в год. В медицинских целях ков заключается в том, что микроорганизмы доста-
наиболее важное значение имеют следующие анти- точно быстро вырабатывают механизм устойчивости
биотики группы аминогликозидов: гентамицин, не- к их действию. В результате ферментативного ацети-
омицин, тобрамицин, позднее гентамицин, канами- лирования, фосфорилирования или аденилирования
цин, полусинтетические продукты сизомицин и гидроксильных групп в структуре рибосомы, ее свя-
амикацин, а в специальных случаях – стрептомицин. зывание с молекулами антибиотика нарушается.
Спектиномицин используют при лечении заболева- Ферменты, осуществляющие такие специфические
ний, вызванных штаммами Neisseria gonorrhoeае, ус- модификации, закодированы в плазмиде или хромо-
тойчивыми к пенициллину. Касугамицин применяют соме микроорганизма.
при выращивании риса для профилактики мучнистой ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫЕ АНТИ-
росы, а гидромицин используют в ветеринарии. БИОТИКИ. Путем химических превращений амино-
БИОСИНТЕЗ. Большинство аминогликозидных анти- кислот получают, как правило, полусинтетические
биотиков образуются в прокариотических организ- аминогликозидные антибиотики (сизомицин, амика-
мах – представителях Streptomyces и Micromono- цин, тобрамицин). Несмотря на то что многие гены
spora. Биосинтез аминогликозидных антибиотиков ферментов, участвующих в биосинтезе аминоглико-
включает множество стадий (например, в случае зидных антибиотиков, клонированы, в настоящее
стрептомицина их насчитывается 24), при этом время синтез с использованием этих ферментов в
D-глюкоза связывается с нуклеозидом, затем обра- промышленных масштабах экономически невыгоден.
зуется аминоциклитольное кольцо, к которому через Это объясняется прежде всего чрезвычайно сложны-
гликозидные связи присоединяются специфические ми механизмами регуляции активности ферментов
сахара (С-разветвленные сахара, аминосахара). биосинтеза.
В синтезе стрептомицина принимают участие 33 бел-
ка, гены которых образуют крупный генный кластер
размером 30–40 т.п.н. на хромосоме S. griseus.
Многие из этих генов клонированы.
ПОЛУЧЕНИЕ. Для получения более высоких выходов
аминогликозидных антибиотиков постоянно ведется
52 работа по созданию новых штаммов. Так, в результа-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Аминогликозидные антибиотики

Стрептомицин MR 581,58 Тобрамицин MR 467,51


С21Н39N7O12 КодCAS 57-92-1 С18Н37N5O9 Код CAS 32986-56-4

Антибиотик Продуцент Объем рынка Применение


в 2004 г.
(млн долл. США)
Стрептомицин Streptomyces griseus Антибиотик широкого спектра действия,
в том числе против Mycobacterium tuberculosum
Тобрамицин S. tenebrarius 220 Антибиотик широкого спектра действия
Гентамицин Micromonospora purpurea Антибиотик широкого спектра действия
Амикацин* S. kanamyceticus 50 Антибиотик широкого спектра действия
Нетилмицин* M. purpurea Антибиотик широкого спектра действия
Неомицин S. fradiae Кожные инфекции
Касугамицин S. kasugaensis Используется при выращивании риса,
действует против мучнистой росы
Валидамицин S. hygroscopicus Используется при выращивании риса
* Химическое производное

Биосинтез стрептомицина
мио-Инозит- Стрептидин-
1-фосфат 6-фосфат
4-О-α-L-Дигидро-
стрептозил-1D-стреп-
Глю- Глюкозо- 4-Оксо-6-дезокси- Тимидинфосфат- тидин-6-фосфат
коза 6-фосфат D-глюкозо-dTDP L-дигидро-
стрептоза
UDP-N-Метил-D-глюкоз- NDP-N-Метил-
амин-6-фосфат L-глюкозамин

Весь процесс синтеза стрептомицина протекает Дигидрострепто-


с участием 33 ферментов. Их гены образуют генный Стрептомицин
мицин-6-фосфат
кластер размером 30–40 т.п.н. Большинство
этих генов в настоящее время клонировано. Цитоплазматическая мембрана

Производство
Предфер- Основная ферментация Отделение Очистка
ментация клеточной Выход
Непрерывный процесс в реакторе массы Ионообменная
Инокуля- объемом до 150 м3, 28–30 °С в течение хроматография, продукта –
ция 70–120 ч, глюкоза и декстрины, соевая Закисление перекристал- более 10 г/л
мука, 1–3 г/л NaCl, микроэлементы, среды лизация после 120 ч
подача кислорода с интенсивностью до рН 2 ферментации
0,5–1 объем реактора в минуту
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Тетрациклины, хиноны, хинолоны


и другие ароматические антибиотики
ВВЕДЕНИЕ. Благодаря широкому спектру действия анти- Хинолоны. Бактерицидный эффект налидиксовой кис-
биотики группы тетрациклинов находят широкое приме- лоты – промежуточного продукта химического синтеза
нение как в медицине, так и в ветеринарии (2004 г.: антималярийного препарата хлороквина – был открыт
880 млн долл.). Производные налидиксовой кислоты еще в 1962 г., однако лишь в 1977 г. удалось пока-
(антибиотики ряда хинолонов) также обладают широким зать, что механизм действия этого антибиотика за-
антимикробным спектром действия и после лактамных ключается в ингибировании бактериальной топоизо-
антибиотиков являются наиболее часто используемыми меразы (гиразы А). Структуры прокариотической и
в современной медицине. Объем рынка хинолонов в эукариотической топоизомераз значительно отлича-
2004 г. превысил 5,8 млрд долл. США. ются, поэтому антибиотики ряда хинолонов не взаимо-
Тетрациклины. С тех пор как в 1945 г. впервые был действует с эукариотическим ферментом, а значит
описан хлортетрациклин, продукт жизнедеятельности обладают низкой токсичностью для человека. Для хи-
Streptomyces aureofaciens, появилось множество про- нолоновых антибиотиков характерен широкий спектр
изводных тетрациклина. Для человека эти вещества антимикробного действия: грамположительные и гра-
слаботоксичны, но эффективно действуют против мотрицательные бактерии, микобактерии, хламидии,
грамотрицательных и грамположительных бактерий, анаэробные бактерии и др. Развитие резистентности у
риккетсий, микоплазм, лептоспир, спирохет и некото- микроорганизмов может быть результатом модифика-
рых крупных вирусов. Антимикробное действие анти- ций гиразы или пониженной проницаемости клеточной
биотиков тетрациклинового ряда основано на том, что мембраны для молекул антибиотика. Поскольку гены,
они связываются с 70S-субъединицей прокариотиче- ответственные за возникновение такой резистентно-
ской рибосомы и тем самым препятствуют синтезу сти, находятся в хромосоме, а не в плазмиде, образо-
белка. К сожалению, в некоторых странах неумеренное вание новых устойчивых штаммов протекает чрезвы-
добавление этих антибиотиков в корма в птицеводстве чайно медленно. Из более чем 5000 производных
и свиноводстве привело к появлению резистентных хинолона, получаемых исключительно методом хими-
штаммов, число которых неуклонно растет. Наиболее ческого синтеза, многие находят широкое применение в
часто механизм устойчивости к действию антибиотика медицине, например ципрофлоксацин (Ciprobay®), дей-
заключается в изменении свойств внешней клеточной ствующий против Bacillus anthracis.
оболочки, в результате чего антибиотик не проникает Хлорамфеникол был выделен из Streptomyces vene-
внутрь клетки. Кроме того, в клетке могут синтезиро- zuelae еще в 1950 г., однако в современном произ-
ваться так называемые тет-белки, которые осуществ- водстве этот антибиотик получают исключительно ме-
ляют активный транспорт молекул антибиотика из клет- тодом химического синтеза. Предшественник хлорам-
ки. Гены таких белков находятся в плазмидах. феникола хоризмовая кислота образуется как проме-
Тетрациклины образуются в процессе жизнедеятельно- жуточный продукт при биосинтезе ароматических
сти стрептомицетов. Биосинтез включает более 70 ре- аминокислот. Хлорамфеникол был первым антибиоти-
акций, в результате которых из глюкозы образуются ком с широким спектром антимикробного действия; он
поликетидные производные, в том числе окситетрацик- активен против многих грамотрицательных и грамполо-
лин. В промышленности для получения тетрациклиновых жительных бактерий, актиномицетов, риккетсий и
антибиотиков клетки штаммов-суперпродуцентов культи- крупных вирусов. Однако из-за нежелательных побоч-
вируют в биореакторах с большим рабочим объемом. ных эффектов, в том числе затрагивающих костный
Для получения высоких выходов продукта (до 25 г/л) не- мозг, в современной медицине хлорамфеникол ис-
обходимо, чтобы в среде поддерживался высокий уро- пользуется только в качестве резервного препарата
вень кислорода, а концентрация фосфатов не превышала при лечении тифа и инфекционных заболеваний, вы-
оптимального значения. После проведения ферментации званных шигеллами и риккетсиями. Механизм дейст-
клетки удаляют из культуральной жидкости, методом вия заключается в связывании молекул антибиотика с
многоступенчатой экстракции н-бутилацетатом выделяют 50S-субъединицей 70S-рибосом, что приводит к инги-
антибиотик, а затем очищают его посредством ионооб- бированию активности пептидилтрансферазы.
менной хроматографии. Гризеофульвин – производное бензофурана, применя-
Антрациклины. Действие антрациклиновых гликози- ется в качестве фунгицида. Действие гризеофульвина
дов, например доксорубицина (адриамицина), заклю- заключается в том, что он препятствует митозу в кле-
чается в ингибировании ферментов-топоизомераз тках грибов, в результате чего образуются морфологи-
путем интеркаляции, что приводит к прекращению чески измененные и функционально неполноценные
репликации ДНК. В клинической медицине эти пре- гифы. Этот антибиотик получают путем ферментации и
параты используют при лечении злокачественных используют для лечения грибковых заболеваний кожи
опухолей. Промышленное получение антрациклино- человека, а также для защиты растений от различных
54 вых антибиотиков основано на ферментации. заболеваний типа мучнистой росы.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Хиноидные и ароматические антибиотики

Продуцент Применение

(Хлор-)тетрациклин Streptomyces aureofaciens Антибиотик широкого спектра действия;


Окситетрациклин Streptomyces rimosus используется в медицине и ветеринарии
Антрациклины S. peucetius Терапия онкологических заболеваний
Хинолоны Химический синтез Антибиотик широкого спектра действия;
используется в медицине и скотоводстве
Хлорамфеникол Химический синтез Антибиотик широкого спектра действия
Гризеофульвин Penicillium griseofulvum Борьба с грибковыми заболеваниями растений

Тетрациклины Доксорубицин – представитель антрациклинов

С1 из С1 из
ацетата ацетата

Хлортетрациклин С27Н29NO11
С22Н23ClN2O8 Тетрациклин H H MR 543,53
MR 478,89 Хлортетрациклин Cl H Tпл 204–205 °С
Код CAS 57-62-5 Окситетрациклин H OH Код CAS 23214-92-8
Налидиксовая кислота Хлорамфеникол Гризеофульвин
и ципрофлоксацин – хинолиновые
антибиотики С1 из ацетата

из р-Аминофенилаланина

Налидиксовая N СН3 Н СН3 С11Н12Cl2N2O5 С17Н17ClO2


кислота
Ципрофлоксацин CH С4Н9N2 F С3Н5 MR 323,13 Код CAS 56-75-7 MR 352,77 Код CAS 126-07-8

ori

Streptomyces
Концентрация, мг/л

rimosus

Кластер генов, Линейная хромосома


участвующих ~ 8 млн п.н.,
Хлорид в биосинтезе Содержание GC ~ 71%
Тетрациклин окситетрациклина
(~ 30 т.п.н.)
Хлортетрациклин
Объем мицелия
Поликетидсинтаза
Hестабильные
Гены теломерные участки
0 20 40 60 80 100 120 ч устойчивости (~ 550 т.п.н.)

Ферментация и очистка хлортетрациклина


Предфер- Биореактор Выделение и очистка
ментация Выход
Объем до 150 м3, сахароза, Удаление мицелия при пропускании продукта
Штамм-супер- жидкий кукурузный экстракт, культуры через фильтровальный пресс ~ 10 г/л
продуцент соли, аэрация с интенсивностью или сепаратор; многостадийная после 140 ч
Streptomyces 1 объем реактора/мин, экстракция н-бутилацетатом, очистка ферментации
aureofaciens 28 °С, рН 5,8–6,0; 60–65 ч ионообменной хроматографией
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Поликетидные антибиотики

ВВЕДЕНИЕ. К этой обширной группе относятся макро- рые синтезируются только дрожжами и грибами. Та-
лидные, полиеновые, макротетролидные и ансамици- ким образом, антибиотики класса полиенов не эффе-
новые антибиотики. Общим в их структуре является ктивны в борьбе с бактериями. Амфотерицин В и ни-
наличие макроциклического лактонового или лактам- статин используются при грибковой инфекции
ного кольца, которое образуется из длинной цепи ос- Candida albicans, а пимарицин – в производстве сыра
татка полигидроксижирной кислоты с концевой гид- в качестве консерванта. Полиеновые антибиотики об-
роксильной или аминогруппой. Циклическая ладают нефро- и гепатотоксичными свойствами, поэ-
молекула может содержать остатки редких сахаров тому их применяют только при тяжелых заболевани-
(макролидные антибиотики), ароматические хромо- ях. Химическая лабильность этих антибиотиков не
форные группы (ансамицин), участки, представляю- позволяет использовать их в качестве противогриб-
щие собой диены (полиеновые антибиотики) или кового средства для защиты растений.
иметь структуру полилактона (макротетролидные ан- АНСАМИЦИН – это макролактамный антибиотик, со-
тибиотики). Большинство поликетидных антибиоти- держащий молекулу ароматического хромофора.
ков образуются в клетках стрептомицетов как вторич- Важнейший заменитель ансамицина – рифамицин –
ные метаболиты. Препараты поликетидных синтезируется в Amycolatopsis mediterranei. Оба они
антибиотиков применяются в медицине, животновод- эффективно действуют против грамположительных
стве и пищевой промышленности. Объем рынка мак- бактерий и микобактерий. Рифампицин – полусинте-
ролидных антибиотиков медицинского назначения в тический антибиотик, в настоящее время является
2004 г. составил 5,7 млрд долл. США. важнейшим препаратом, используемым для лечения
МАКРОЛИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ – это липофильные туберкулеза (возбудитель – Mycobacterium tubercu-
вещества с сильновыраженными основными свойства- losis) и проказы. Механизм действия рифампицина
ми. Они представляют собой 10–60-членные макро- заключается в связывании β-субъединицы ДНК-за-
циклические лактоны. Синтез этих молекул происхо- висимой РНК-полимеразы бактерий. Таким образом,
дит в ходе повторяющихся циклов конденсации антибиотик препятствует процессу транскрипции в
аналогично синтезу длинноцепочечных жирных кис- бактериальной клетке. Связывания рифампицина с
лот: наращивание цепи происходит в реакциях, катали- эукариотическими РНК-полимеразами не происхо-
зируемых поликетидсинтазой. Макролидные антибио- дит, поэтому антибиотик успешно используется для
тики слаботоксичны, поэтому их применяют в лечения человека. Устойчивость некоторых штаммов
педиатрии. Механизм действия заключается в ингиби- к действию рифампицина вызвана изменениями
ровании синтеза белка в клетках грамположительных структуры РНК-полимеразы в результате мутаций.
микроорганизмов: молекула антибиотика связывается ФЕРМЕНТАЦИЯ И ОЧИСТКА. Для промышленного
с 50S-субъединицей бактериальной рибосомы, что производства поликетидных антибиотиков осуществ-
препятствует процессу транслокации растущей поли- ляют ферментацию в биореакторах большого объема
пептидной цепи. Устойчивость некоторых штаммов к с использованием штаммов-суперпродуцентов. Так,
действию макролидных антибиотиков связана с мети- для получения эритромицина применяют штамм Sac-
лированием 23S-рРНК: вероятно, из-за этого не про- charopolyspora erythraea (прежнее название – Strep-
исходит связывания молекулы антибиотика с рибосо- tomyces erythreus), позволяющий получать до 7 г
мой. Азитромицин, кларитромицин, эритромицин и продукта с литра среды после 72 ч ферментации. Ан-
спирамицин используют для лечения бактериальных тибиотики выделяются во внеклеточную среду,
инфекций дыхательных путей. Структурно сходный ти- откуда их экстрагируют с помощью растворителей,
лозин благодаря своей высокой эффективности был а затем очищают хроматографическими методами.
использован против микоплазмоза как добавка к кор-
му свиней, что привело к его запрету в странах ЕС (но
не в США) из-за высокого риска развития устойчиво-
сти патогена.
ПОЛИЕНОВЫЕ АНТИБИОТИКИ – продукты вторичного
метаболизма стрептомицетов; в молекуле этих анти-
биотиков имеется 26–38-членное лактоновое коль-
цо, в которое встроена 3–7-членная молекула диена.
Диены могут содержать различные боковые группы,
в частности остатки аминосахаров, присоединенные
гликозидной связью. Действие полиеновых антибио-
тиков объясняется их взаимодействием с микостеро-
56 лами (например, эргостеролом) – веществами, кото-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Поликетидные антибиотики
а б Рифампицин
в Рифамицин

Эритромицин

a С37Н67NO13 б С43Н58N4O12
MR 733,94 MR 822,95
Код CAS 114-07-8 Код CAS 13292-46-1
в С37Н47NO12 г С47Н73NO17
MR 697,78 MR 924,09,
Код CAS 6998-60-3 Код CAS 1397-89-31
Амфотерицин В

Биосинтез эритромицина А
1 × пропионовая кислота 6 × сукцинил-KоА

1 × пропионил-KоА 6 × 2-метилмалонил-KоА 2 × D-глюкоза


2 × дТТФ*

2 × дТДФ-глюкоза

Гидрокси-
лирование Поликетид, связанный с ферментом
(предполагаемая стадия)

дТДФ-D-дезозамин
Гликози-
лирование
дТДФ-L-микароза
2 × дТДФ-4-оксо-
Эритромицин С Эритромицин А 6-дезокси-D-глюкоза
Метилирование микарозы
* дТТФ – дезокситимидинтрифосфат

Получение
Эритромицин Рифамицин/Рифампицин
Ферментация Ферментация
Штамм-суперпродуцент Saccharopolyspora erythrаea, Штамм-суперпродуцент Amycolatopsis mediterranei,
непрерывная ферментация в биореакторе объемом непрерывная ферментация в биореакторе объемом
более 120 м3, глюкоза, соевая мука, микроэлементы, более 120 м3, глюкоза, соевая мука, микроэлементы,
0,2–0,5% пропанол, 33 °С, 70–120 ч 0,2–0,5% пропанол, 33 °С, 70–120 ч

Отделение клеточной массы с помощью фильтровального пресса или в сепараторах

Выделение и очистка
Экстракция в противотоке уксуснокислого эфира масляной кислоты,
хроматографические методы, перекристаллизация
Выход продукта ~ 7 г/л эритромицина после 72 ч Выход продукта ~ 7 г/л рифамицина после 72 ч

Четырехстадийный синтез рифампицина


по методу Манниха
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Антибиотики Получение новых антибиотиков

ВВЕДЕНИЕ. Несмотря на значительные успехи меди- ОБРАТНАЯ ГЕНЕТИКА. Если в определенном организ-
цины, связанные с использованием антибиотиков, ме установлена нуклеотидная последовательность
и большое число новых лекарств, обладающих анти- гена фермента, участвующего в биосинтезе антибио-
биотическим действием, в современном мире расп- тика, эта информация может послужить для поиска
ространяются инфекционные заболевания, уже счи- генов, кодирующих ту же ферментативную активно-
тавшиеся полностью побежденными, например сть в геномной ДНК других организмов. Так была по-
туберкулез, стрептококковые и стафилококковые ин- лучена важная информация о взаиморасположении
фекции. Появление новых форм возбудителей забо- генов, ответственных за синтез макролидных анти-
леваний объясняется возникновением устойчивости биотиков.
микроорганизмов к используемому антибиотику (ан- КОМБИНАТОРНЫЙ БИОСИНТЕЗ. Примером может
тибиотикам). Гены, обеспечивающие такую устойчи- служить получение новых макролидных антибиотиков
вость, распространяются посредством плазмид и/или с измененными свойствами. Гены, кодирующие три
транспозонов; таким образом возможна передача ге- фермента комплекса поликетидсинтазы, катализиру-
нетического материала как между сходными (при ющей наращивание углеродной цепи, организованы в
конъюгации), так и между различными (при фаговой виде кластера. Аналогичным образом расположены и
инфекции) организмами. Важной проблемой при по- гены ферментов, определяющих модификации поли-
иске новых антибиотиков, как правило, является их кетидной цепи. Клонирование всех этих генов позво-
высокая токсичность для человека. Грибы, дрожжи и лило осуществить обмен генами между кластерами,
простейшие – эукариоты, и для них характерны общие и рекомбинантные ДНК в составе плазмид вновь бы-
для эукариот особенности обмена веществ, поэтому ли внесены в клетки организма-хозяина. Так было
большинство веществ, токсичных для этих возбудите- получено несколько новых макролидных антибиоти-
лей заболеваний, оказываются токсичными и для че- ков, не найденных в природе и обладающих специфи-
ловека. Очевидно, что актуальность задачи создания ческими свойствами.
новых антибиотиков не ослабевает. ПОИСК НОВЫХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИО-
НОВЫЕ СТРАТЕГИИ СКРИНИНГА. Использование клас- ТИКОВ МЕТОДАМИ ГЕНОМНОГО АНАЛИЗА. С каждым
сического метода скринига, в частности с применени- годом увеличивается число микроорганизмов,
ем биочипов, приводит к тому, что из 10 проанализи- для которых нуклеотидная последовательность гено-
рованных веществ 9 имеют новую, ранее неизвестную ма полностью известна. В качестве примера приве-
структуру, но вовсе не обязательно новые свойства. дем несколько микроорганизмов – возбудителей
Таким образом, очевидна необходимость разработки заболеваний человека, геном которых в настоящее
новых подходов к поиску веществ, обладающих анти- время секвенирован: Haemophilus influenzae
биотическим действием. Приведем несколько приме- (1,83 млн п.н., хронический бронхит), Helicobacter
ров принципиально новых стратегий. pylori (1,67 млн п.н., язвенные заболевания), Borellia
а) «Биосинтез, направляемый предшественни- burgdorferi (0,91 млн п.н., бореллиоз), Mycobacte-
ком» – полусинтетический метод, при котором в rium tuberculosum (4,41 млн п.н., туберкулез), Trepo-
среду роста микроорганизма-продуцента добавляют nema pallidum (1,14 млн п.н., сифилис), Chlamydia
вещества-предшественники антибиотика. trachomatis (1,04 млн п.н., инфекционные заболева-
б) Скрининг среди малоизученных микроорга- ния глаз). Анализ генома позволяет выявлять осо-
низмов, например миксобактерий, редких актино- бенности метаболизма или сигнальные пути, специ-
мицетов, лишайников или губок. фические для патогенного организма. Впоследствии
в) Усовершенствование технологии микрочипов. эта информация может служить для создания анти-
г) Поиск промежуточных продуктов биосинтеза биотиков, действующих на новые «мишени». Так, в
антибиотиков. настоящее время проводятся работы по созданию ан-
д) Осуществление генетической рекомбинации тибиотика, действующего против Helicobacter pylori:
между различными продуцентами антибиотиков. по данным геномного анализа предполагаемой ми-
е) Поиск предшественников антибиотиков мето- шенью действия этого нового антибиотика могут быть
дами «обратной генетики». ферменты – участники обмена никеля в микроорга-
ж) Осуществление рекомбинации генов – участ- низме.
ников биосинтеза антибиотиков в системе in vitro, и
использование полученных ферментов в синтезе
новых веществ in vivo (комбинаторный биосинтез).
з) Поиск новых мишеней действия антибиоти-
ков на основе анализа генома патогенных микроор-
58 ганизмов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Вещества-предшественники в биосинтезе антибиотиков


Антибиотик Продуцент Структурные элементы
Пенициллины Penicillium chrysogenum Разнообразные алифатические, ациклические
и ароматические карбоновые кислоты
Цефалоспорин Acremonium chrysogenum S-Карбоксиметил-L-цистеин
Блеомицин Streptomyces sp. Модифицированные амины
Бацитрацин Bacillus licheniformis D-алло-Аминокислоты
Стрептомицин Streptomyces griseus 2-Дезоксистрептидин

Комбинаторный биосинтез макролидных антибиотиков


а Образование мультиферментного комплекса дезоксиэритронолид-В-синтазы (DEBS) 1–3
Ген eryAI Ген eryAII Ген eryAIII
Транскрипция и трансляция

Начало Модуль 2 Модуль 4 Модуль 6


Модуль 1 Модуль 3 Модуль 5 Конец

Генный кластер
Мультиферментный комплекс
Функциональные единицы
мультиферментного комплекса

Ацетилтрансфераза 6-Дезоксиэритро-
Белок – переносчик нолид В (7)
ацильной группы Дегидратаза Замыкание
Кетоацилсинтаза Еноилредуктаза кольца
Кеторедуктаза Тиоэстераза

б Многообразие вариантов, полученных методом комбинаторного биосинтеза


Продукт
Экспрессия,
ферментация
Вариант 1

Вариант 2

Вариант 3

Вариант 4
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Витамины

ВВЕДЕНИЕ. Витамины используются как лекарствен- ва-предшественники – соли кобальта и 5,6-диметил-


ные препараты, а также как пищевые и кормовые до- бензимидазол. Через 120 ч после начала фермента-
бавки. Мировой объем рынка витаминов составляет ции содержание витамина В12 в среде может достигать
около 3 млрд долл. США в год. Большинство витами- 150 мг/л. К настоящему времени клонированы все ге-
нов получают путем химического синтеза или экс- ны Propionibacterium shermanii, продукты которых уча-
тракции из растительного материала. Биотехнологи- ствуют в биосинтезе витамина В12, а методами мета-
ческим путем производятся витамины В2, В12 и С. болической инженерии ведутся работы по созданию
ВИТАМИН В2 (РИБОФЛАВИН). Рибофлавин в форме новых штаммов-суперпродуцентов.
ФМН или ФАД – важнейший кофермент в окисли- ВИТАМИН С (L-АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА). Аскорби-
тельно-восстановительных процессах. В свободном новая кислота является «физиологическим восстано-
виде рибофлавин присутствует только в молоке. Не- вителем» и участвует во многих реакциях как кофак-
достаток этого витамина в пище приводит к кожным тор, а также служит в качестве антиоксиданта,
патологиям, нарушению роста и глазным болезням. восстанавливающего кислородные радикалы. Дефи-
У животных рибофлавин образуется в сложной много- цит витамина С приводит к возникновению цинги
стадийной реакции из гуанозинтрифосфата. В про- (скорбута) – заболевания соединительной ткани. Ас-
мышленности витамин В2 получают одним из трех корбиновая кислота продается в аптеках, ее также
способов: химическим синтезом, ферментацией или добавляют в продукты питания в качестве антиокси-
химико-ферментативным методом. В последние годы данта. Годовое производство витамина С достигает
по экологическим и экономическим соображениям 95 000 т. Промышленный способ получения аскор-
стали использовать ферментативные технологии. Ри- биновой кислоты из D-глюкозы основан на комбина-
бофлавин производят путем ферментации штам- ции химического синтеза и ферментации. По методу
мами-суперпродуцентами Ashbya gossypii. В биореак- Рейхштейна–Грюсснера реакция окисления D-сорби-
тор в качестве источника углерода добавляют та в L-сорбозу осуществляется в непрерывном режи-
мелассу, а в качестве источника азота – соевая мука; ме с помощью иммобилизованных клеток Acetobac-
выход рибофлавина составляет до 15 г/л за 72 ч. ter suboxydans в две стадии. При этом необходима
После удаления клеток продукт очищают хроматогра- интенсивная и постоянная подача воздуха в реактор.
фически. При химико-ферментативном методе полу- Через 24 ч ферментации выход продукта практиче-
чения витамина В2 аллоксазиновое кольцо синтезиру- ски количественный. По методу Соноямы происходит
ют химическим способом, а затем также путем окисление D-глюкозы клетками Erwinia sp. до 2,5-ди-
химической реакции соединяют его с остатком D-ри- окси-D-глюкозы с последующим восстановлением до
бозы, которую в свою очередь получают из D-глюкозы 2-оксо-L-гулоновой кислоты с помощью Corynebacte-
в клетках мутантных штаммов Bacillus pumilus. Такой rium sp.; эффективность переработки сырья
метод пока не нашел широкого применения в про- на первой стадии составляет 94% через 24 ч, а на
мышленности. второй – 92% через 66 ч. Затем образовавшаяся
ВИТАМИН В12 (ЦИАНОКОБАЛАМИН). В качестве ко- 2-оксо-L-гулоновая кислота легко превращается в
фермента производное витамина В12 (5'-дезокси- кислых условиях в L-аскорбиновую. Гены ферментов,
аденозилкобаламин) участвует в чрезвычайно важ- которые осуществляют две указанные реакции, в на-
ных реакциях метилирования и изомеризации. Этот стоящее время клонированы, и специалистами фир-
витамин является необходимым компонентом пищи мы Genentech получен рекомбинантный штамм Erwi-
человека и большинства животных. При недостатке nia herbicola, который осуществляет весь процесс
витамина В12 в пище может развиться так превращения D-глюкозы в 2-оксо-L-гулоновую кисло-
называемая злокачественная (пернициозная) ане- ту с последующим окислением в L-аскорбиновую ки-
мия. Около половины производимого в мире витами- слоту. Однако рост клеток полученного рекомбинант-
на В12 используется в качестве кормовых добавок ного штамма Erwinia herbicola значительно
при разведении сельскохозяйственных животных. замедляется в присутствии D-глюкозы, поэтому пока
Биосинтез из почти 30 реакций включает стадию об- этот метод получения витамина С экономически не-
разования 5'-дезоксиаденозилкобаламина через выгоден.
5-амино-4-оксовалериановую (δ-аминолевулиновую)
кислоту при конденсации сукцинил-КоА и глицина.
Промышленное производство витамина В12 осущест-
вляется исключительно ферментацией с использова-
нием Propionibacterium shermanii или Pseudomonas
denitrificans. В биореакторы в качестве сырья добав-
60 ляют мелассу и аммонийные соли, а также вещест-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Витамины
С17Н20N4O6
MR 376,36
Код CAS 83-88-5

L-аскорбиновая кислота
(витамин С)

С6Н8O6
MR 176,13
Код CAS 50-81-7 Рибофлавин
(витамин В2)

Способы промышленного получения и объемы производства


Витамин Объем Способ получения Применение
производства,
т (2004 г.)

А и про-А β-Каротин 2 900 Химический синтез Корм для животных, краситель


В1 Тиамин 3 300 Химический синтез Корм для животных, здравоохранение
В2 Рибофлавин 4 000 Ферментация (100%) Корм для животных, здравоохранение
В6 Пиридоксаль 3 400 Химический синтез Корм для животных, здравоохранение
В12 Кобаламин 23 Ферментация Медицина, корм для животных
С Аскорбиновая 95 000 Химико-ферментативный Пищевая добавка, здравоохранение
кислота способ
D3 Кальциферол 45 000 Химический синтез Медицина
(из дегидрохолестерина)
Е α-Токоферол 25 000 Химический синтез. Корм для животных,
3 500 Экстракция из растительных пищевая добавка
масел и водорослей

Биотехнологические пути получения рибофлавина


Меласса, источник азота, соли D-Глюкоза Фенилендиамин + аллоксан
Bacillus pumilus
Ashbya gossypii
Bacillus sp.
D-Рибоза
Candida sp.

Рибофлавин
(витамин В2)

Химический синтез (более не применяется)


Ферментация или биотрансформация Аллоксазин

Синтез L-аскорбиновой кислоты


D-Глюкоза Химический синтез
Erwinia herbicola Ферментация
или биотрансформация
D-Сорбит 2,5-Диоксо-D-глюконовая кислота
Acetobacter Corynebacterium sp.
suboxydans
L-Сорбоза 2-Оксо-L-гулоновая L-Аскорбиновая кислота (витамин С)
кислота

Метод Рейхштейна–Грюсснера Метод с рекомбинантным штаммом Erwinia herbicola,


Метод Соноямы разработанный фирмой Genentech
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Нуклеозиды и нуклеотиды

ВВЕДЕНИЕ. Уже более 100 лет в Японии известны в триалкилфосфате наконец превращается в
вкусовые качества грибов, сушеной рыбы, некоторых 5'-ИМФ. Однако в настоящее время 5'-ИМФ чаще
водорослей и других природных продуктов, которые всего получают с помощью мутантных штаммов
содержат 5'-нуклеотиды. Добавление очень неболь- Corynebacterium ammoniagenes, которые выделяют
ших количеств 5'-нуклеотидов (0,0005–0,001%) и этот продукт во внеклеточное пространство. Штам-
глутамата натрия в супы, соусы и другие блюда при- мы-суперпродуценты обладают целым рядом особен-
водит к улучшению вкуса пищи и позволяет удалить ностей, отличающих их от клеток дикого типа: в них
неприятные привкусы, например привкус продуктов блокирован процесс расщепления 5'-ИМФ, они не-
после хранения в металлической таре. Интересно, чувствительны к концентрации Mn2+ в среде, а, кро-
что свойством изменять вкус пищи обладают только ме того, их плазматическая мембрана является бо-
инозин-5'-монофосфат, гуанозин-5'-монофосфат и лее проницаемой для 5'-ИМФ. Особенно высокие
ксантин-5'-монофосфат (ИМФ, ГМФ и КМФ соот- выходы продукта (до 30 г/л) были получены при ис-
ветственно), в то время как аденозин-5'-монофос- пользовании клеток, в геном которых клонированы
фат, его 2'-, 3'-изомеры, 5'-дезоксирибонуклеотиды несколько копий гена PRPP-трансферазы – ключево-
и нуклеозиды в этом отношении инертны. С 1960 г. го фермента синтеза 5'-ИМФ.
производство 5'-ИМФ и 5'-ГМФ достигло промыш- ПОЛУЧЕНИЕ 5'-ГМФ. Самым распространенным спо-
ленных масштабов и в настоящее время составляет собом получения 5'-ГМФ является синтез 5-амино-
несколько тысяч тонн в год. Предприятия-изготови- 4-имидазолкарбоксиамид-1-рибозид-5'-фосфата
тели этих веществ расположены главным образом в (AICAR) в клетках штаммов Bacillus megaterium, аук-
азиатских странах. сотрофных по пуринам, с последующим химическим
СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА. Наиболее распространен- превращением этого вещества в 5'-ГМФ. Другой ме-
ными способами производства 5'-ИМФ и 5'-ГМФ тод производства 5'-ГМФ основан на использовании
являются ферментативный гидролиз РНК и фермен- мутантных штаммов Bacillus, в которых блокирован
тация. процесс расщепления 5'-ГМФ и искусственно повы-
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ РНК. Наиболее дос- шено содержание ксантинмонофосфатов. Выходы
тупным источником ДНК и РНК являются дрожжи. продукта достигают 40 г/л.
Так, в среде с пониженным отношением С/N (мелас- ДРУГИЕ НУКЛЕОТИДЫ. ATФ, цАМФ, NAD+/NADH,
са и отходы целлюлозной промышленности) содер- NADP+/NADPH, FAD и кофермент А широко использу-
жание РНК в клетках дрожжей Candida utilis на ран- ются в биохимических исследованиях. Как правило,
них стадиях роста достигает 10–15% сухой массы и их получают ферментацией с мутантными штаммами
может быть еще выше при добавлении в среду Zn2+ или в ферментативных реакциях веществ-предшест-
и фосфатов. Дрожжи культивируют в аэробных усло- венников, синтезированных химическим путем.
виях в эрлифтных биореакторах. После отделения Например, NAD+ и кофермент А образуются в резуль-
клеточной массы РНК экстрагируют горячим щелоч- тате ферментации в клетках мутантных штаммов Brevi-
ным раствором поваренной соли (5–20% NaCl, bacterium ammoniagenes с выходом продукта до 2 г/л.
100 °С) 8 ч. Затем РНК осаждают, добавляя HCl или
этанол. Ферментативный гидролиз РНК осуществля-
ет нуклеаза P1, выделенная из Penicillium citrinum
или Streptomyces aureus и предварительно очищен-
ная от неспецифических 5'-нуклеозидаз и фосфатаз.
5'-ИМФ и 5'-ГМФ из гидролизата выделяют адсорб-
цией на активированном угле, ионообменной хрома-
тографией и осаждением метанолом.
ПОЛУЧЕНИЕ 5'-ИМФ. Классическим способом полу-
чения 5'-ИМФ является выделение инозина из кле-
ток Bacillus sp. и других грамположительных бакте-
рий. Инозин, который накапливается в среде роста,
может быть отделен от других компонентов осажде-
нием при рН 11. Использование ауксотрофных по
аденину мутантов, в которых методами генетической
инженерии увеличена проницаемость клеточной
мембраны, при оптимальных условиях ферментации
позволяет получать до 35 г/л инозина. Перекристал-
62 лизованный инозин при переработке раствором PCl3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Инозин-5'-монофосфат Гуанозин-5'-монофосфат

С10Н13N4O6P R = NH2: гуанозин-5'-монофосфат (5'-ГМФ)


MR 348,21 С10Н14N5O8P MR 363,22 Код CAS 85-32-5
Код CAS 131-99-7 R = OH: ксантин-5'-монофосфат

Получение и объемы производства


Нуклеозид Объем Способ получения Применение
производства,
т/год
5'-ИМФ 2000 Ферментативный гидролиз РНК из дрожжей, Усилители вкуса
5'-ГМФ 1000 ферментация инозина/гуанозина и их
фосфорилирование; прямое получение
5'-ИМФ ферментацией
Инозин 25 Ферментация Медицина
Оротовая кислота 20 Ферментация Терапия заболеваний печени
Аденин, 22 Ферментация Медицина
аденозин, АТФ

Содержание ДНК и РНК в различных микроорганизмах


Бактерии Дрожжи Грибы
ДНК* 0,37–4,5 0,03–0,52 0,15–3,3 * % сухой массы
РНК** 5–25 2,5–15 0,7–28 ** из них 75–80% рРНК

Синтез нуклеотидов и нуклеозидов


Bacillus и другие 5'-Ксантин-
монофосфат
Bacillus subtilis
Bacillus megaterium
AICAR* 5'-ГМФ

Corynebacterium ammoniagenes,
Bacillus subtilis Нуклеаза Р1
Инозин из Penicillium
citrinum
Меласса, Corynebacterium ammoniagenes
гидролизат 5'-ИМФ
крахмала

Candida utilis
рРНК

Химический синтез Ферментация Использование ферментов


* AICAR: 5-амино-4-имидазолкарбоксамид-1-рибозид-5'-фосфат

Ферментация Выделение Химический синтез


Более 30 г/л
Штаммы-суперпродуценты Осаждение инозина Из 5'-ИМФ: PCl3
C. ammoniagenes; при рН 11; после 42 ч в триалкилфосфате,
гидролизат крахмала, перекристаллизация ферментации выход более 90%
неочищенная РНК; рН 6, 30 °С
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Биодетергенты и биокосметика

ВВЕДЕНИЕ. Некоторые микроорганизмы в присутствии органическими растворителями. Эмульзан проявляет


алканов, в частности в растительных маслах, или на са- поверхностно-активные свойства на границе раздела
харосодержащем субстрате способны синтезировать воды и нефти и поэтому используется в качестве
поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые на- эмульгатора для уменьшения вязкости нефти. Добав-
зываются биосурфактантами или биодетергентами. В ление небольших количеств эмульзана к нефти зна-
отличие от синтетических ПАВ, производство которых чительно увеличивает скорость транспорта нефти по
достигает нескольких миллионов тонн в год, весьма до- нефтепроводам, кроме того, эмульзан используют
рогостоящие биодетергенты пока находят ограниченное при очистке нефтедобывающего оборудования и тан-
применение, несмотря на то что эти ПАВ проявляют керов. Клетки Bacillus subtilis после добавления в сре-
очень высокую биологическую активность и легко раз- ду роста гидрофобных соединений-индукторов синте-
лагаются в природной среде. В настоящее время актив- зируют до 110 мг/л сурфактина – ацетилированного
но проводят исследования этих веществ с целью их гептапептида с низкой способностью к мицеллообра-
применения для очистки почв и воды; их можно, по-ви- зованию (большое значение критической концентра-
димому, добавлять также в косметические кремы (био- ции мицеллообразования, ККМ). Сурфактин не может
косметика). Все косметические средства, которые по- назначаться как медицинский препарат из-за своей
лучают (полностью или частично) из природных гематотоксичности. Ни один из биодетергентов не по-
источников, имеют общее название «биокосметика». лучен с таким высоким выходом, как для софороли-
Методами биотехнологии получают природный краси- пидов.
тель шиконин, а также теперь уже широко известный ШИКОНИН – производное нафтохинона, пигмент лепе-
компонент кремов гиалуроновую кислоту. стков редкого наземного растения воробейника крас-
БИОДЕТЕРГЕНТЫ (ПАВ) синтезируются многими мик- нокорневого (Lithospermum erythrorhizon). В медицине
роорганизмами – прокариотами и эукариотами в при- это вещество используют как противовоспалительное
сутствии насыщенных углеводородов и в раститель- средство, а также описаны случаи его успешного при-
ных маслах. Хорошо изучены сложные эфиры сахаров менения в противоопухолевой терапии. В промышлен-
и жирных кислот из бактерий: рамнолипиды и трега- ных масштабах шиконин получают из культур расти-
лолипиды, липопептид сурфактин и гетерополисаха- тельных клеток. В зависимости от того, соли какого
рид эмульзан. Из биодетергентов лучше всего изучен металла добавляют в среду роста, образуется пигмент
софоролипид из дрожжей. Этот гликолипид представ- шиконин с различными оттенками. Это свойство ак-
ляет собой смесь кислоты и лактона и образуется при тивно используется японскими косметическими фир-
культивировании клеток дрожжей Torulopsis bombicola мами, например, при производстве губной помады.
в присутствии триглицеринов с выходом более ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА. По химической природе
400 г/л. Переработку культуральной среды выгодно гиалуроновая кислота – глюкозоаминогликан с моле-
производить сразу по окончании ферментации. Высо- кулярной массой ~107 Да. Этот вязкоэластичный по-
коструктурированные синтетические неионные детер- лисахарид входит в состав стекловидного тела глаза,
генты могут давать коллоидные растворы (это свой- суставной жидкости и связок костей. В промышленно-
ство характеризуется специальным параметром – сти гиалуроновую кислоту получают из пуповины сель-
критической концентрацией мицеллобразования, скохозяйственных животных или из петушиных греб-
ККМ). В Японии софоролипиды в небольших количе- ней. Кроме того, это вещество можно производить
ствах добавляют в косметические средства по уходу ферментацией с генетически модифицированными
за кожей. Другим перспективным направлением при- штаммами Streptococcus equi или S. zooepidemicus.
менения биодетергентов является их использование Выход продукта достигает 6 г/л уже через 20 ч фер-
для очистки почв от продуктов нефтепереработки. Со- ментации. Молекулы гиалуроновой кислоты образуют
единения с поверхностно-активными свойствами об- в воде структуру, напоминающую сетку, поэтому этот
разуются микроорганизмами в присутствии алканов продукт иногда называют молекулярной губкой. Даже
или триглицеринов: например, головневый гриб Usti- 2%-й раствор гиалуроновой кислоты в воде желиру-
lago maydis синтезирует целлобиолипид, некоторые ется, так прочно взаимодействуют молекулы воды и
представители псевдомонад – рамнолипид, а Rhodo- гиалуроновой кислоты. Это свойство гиалуроновой ки-
coccus erythropolis – тетраэфир трегалозы. В некото- слоты находит применение в косметологии: раствор
рых случаях состав ацильной группы в молекулах гли- гиалуроновой кислоты хорошо ложится на кожу, обра-
колипидов зависит от природы алкана или зуя пленку, которая активно всасывает влагу из возду-
триглицерина в среде роста. Эмульзан – полианион- ха, препятствуя дегидратации кожи – основной причи-
ный гетерополисахарид (липополисахарид), который не возникновения морщин. В медицине гиалуроновая
синтезируют клетки Acinetobacter calcoaceticus в при- кислота используется прежде всего в пластической
64 сутствии триглицеринов, его выделяют экстракцией хирургии.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биодетергенты
Продуцент Структурные компоненты
Софорозолипиды Torulopsis bombicola Софороза, жирные гидроксикислоты
Целлобиозолипид Ustilago maydis Целлобиоза, жирные кислоты
Рамнозолипид Pseudomonas aeruginosa Рамноза, жирные кислоты
Трегалозолипид Corynebacterium, Arthrobacter Трегалоза, жирные кислоты
Кориномиколат Corynebacterium, Arthrobacter Эфир миколовой кислоты и моно-, ди- и трисахаридов
Эмульзан Acinetobacter calcoaceticus Полианионный гетерополисахарид, MR ~ 106 Да
Сурфактин Bacillus subtilis Ацилированный гептапептид

Софорозолипид Трегалозолипид

Инокулят Ферментация Очистка


Arthrobacter sp. Источники углерода, азота Солюбилизация, Выход продукта
и фосфора, морская вода; хроматография до 100 г/л
нефть для индукции синтеза

Биодетергенты и удаление нефтяных загрязнений


300 Загрязнение участка прибрежной
Остаточное содержание

отмели площадью 2 м2 нефтью


углеводородов, ppm
полициклических

10 × загрязнение 1 литром нефти


ароматических

200
10 × загрязнение 1 литром нефти;
с добавлением трегалозодикори-
номиколата в концентрации 1 г/л;
100
10 × загрязнение 1 литром нефти;
с добавлением неионных детергентов
0 в концентрации 100 мл/л (дисперги-
Май Июль Сентябрь Ноябрь рует лучше, но затрудняет деградацию)

Биокосметика

Шиконин
Гиалуроновая кислота
С16Н16O5
MR 288,30
Тпл 143 °С
Код CAS 517-89-5

Lithospermum Реактор Выход


erythrorhizon продукта Streptococcus Выход
Объем Ферментация 5–10 г/л
Иммобилизо- несколько Несколько equi
г/л после 10 ч
ванные клетки сотен литров
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Микробные полисахариды

ВВЕДЕНИЕ. Растительные полисахариды (крахмал, кулярную массу ~5 ⋅ 107 Да. У дрожжей и некоторых
целлюлоза, гуммиарабик, гуаровая смола, пектин, бактерий декстраны играют роль резервных полиса-
альгинаты, агар и др.) и их полусинтетические произ- харидов. В качестве примера продуцента декстрана
водные играют важную роль в современных техноло- можно назвать Streptococcus mutans, бактерию,
гиях, в том числе в качестве загустителей в пищевой которая обитает в кариозной полости зуба человека.
промышленности или при заводнении нефтяных Образование декстрана приводит к появлению бакте-
скважин. Производство полисахаридов растительно- риального налета («камней»). Для промышленного
го происхождения достигает нескольких десятков ты- получения декстрана используют Leuconostoc me-
сяч тонн в год. Внеклеточные микробные полисаха- senteroides: в течение 24 ч в клетках этого микроор-
риды также могли бы найти применение в самых ганизма из сахарозы образуется до 500 г/л декстра-
разнообразных отраслях промышленности, однако на. Декстран выделяют из культуральной жидкости
из-за значительных производственных затрат их ис- осаждением этанолом, затем гидролизуют кислотой
пользование пока ограничено. Наибольшее значение и еще раз осаждают этанолом. Декстран с молеку-
имеют ксантан и декстран. Гиалуроновая кислота уже лярной массой 75 000 Да используют как замени-
применяется в биокосметике. тель плазмы крови, а с молекулярной массой
КСАНТАН представляет собой разветвленный гетеро- 40 000 Да – в качестве антитромболитика при поло-
полисахарид, состоит из пяти остатков гексоз (глю- стных операциях.
козы, маннозы и глюкуроновой кислоты). Молеку- ДРУГИЕ МИКРОБНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ. Pseudomo-
лярная масса ксантанов – от 2 до 12 тыс. кДа. nas aeruginosa и Azotobacter vinelandii синтезируют
Ксантановые смолы имеют высокую вязкость (в за- альгинаты, по строению аналогичные альгинатам из
висимости от числа групп пирувата в полимере) и по водорослей. Альгинаты часто используют в качестве
ряду свойств сходны с пластмассой. Эти вещества носителей для иммобилизации клеток при проведе-
безвредны для человека, поэтому их добавляют в ка- нии различных биокаталитических реакций. Некото-
честве стабилизаторов и загустителей во многие пи- рые базидиомицеты синтезируют полимер склеро-
щевые продукты. Кроме того, благодаря устойчиво- глюкан, главная цепь которого образована остатками
сти в растворах электролитов ксантаны добавляют к глюкозы, соединенными β-1,3-связями, а в местах
буровому шламу при бурении нефтяных скважин. разветвления остатки глюкозы присоединены β-1,6-
Ксантаны образуются в клетках Xanthomonas campe- связями. Склероглюкан, как и геллан, образующийся
stris при аэробном росте на среде с глюкозой. Полу- в клетках Auromonas elodea, используется как пище-
чение ксантанов осуществляют, как правило, в про- вая добавка. Пуллулан – глюкан с разветвленной це-
цессе периодической ферментации, используя в пью, в которой остатки глюкозы соединены α-1,4-
качестве источника углерода глюкозу, а в качестве (90%) и α-1,6- (10%) связями. Из пуллулана изго-
источника азота – пептон, нитрат аммония и мочеви- товляются тонкие пленки, не пропускающие кисло-
ну. Клонирование генов β-галактозидазы (lacZ) и ла- род, которые используются для защиты пищевых и
ктопермеазы (lacY) из Escherichia coli в геном X. сam- других продуктов от окисления. Промышленное полу-
pestris позволило получить штамм, использующий в чение микробных полисахаридов пока является очень
качестве источника углерода молочную сыворотку дорогостоящим и экономически невыгодным процес-
(отходы молочной промышленности). Из-за образо- сом, поэтому такие полимеры еще не нашли широко-
вания ксантанов культуральная жидкость становится го применения в современных технологиях.
очень вязкой (до 10 000 сантипуаз). Для сохранения
аэробных условий роста в этом случае особое значе-
ние имеют мешалки специальной конструкции. Как
правило, ксантаны из среды осаждают растворите-
лем – изопропанолом. В современной промышленно-
сти производство ксантанов достигает 30 000 т/год.
ДЕКСТРАНЫ – очень важные вещества, которые мо-
гут служить заменителями плазмы крови. Благодаря
тому, что полимерные цепи в этих веществах имеют
поперечные сшивки, образуются сетчатые структуры,
которые очень эффектны при очистке белков разно-
го размера. Декстраны также применяются в пище-
вой промышленности. Разветвленные цепи декстра-
нов, состоящие только из остатков глюкозы,
66 связанных между собой α-1,6-связями, имеют моле-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ксантан
Степень Псевдопластические свойства
полимеризации 10 000
~ 10 000

Кажущаяся вязкость,
1000

мПа ⋅ с
100

10

1
1 10 100 1000
log скорости сдвига, с–1

0,05–1%-я суспензия
Код CAS 11138-66-2 ксантана в воде, 25 °C

Ферментация и очистка
Предферментация Биореактор Выделение Выход
Xanthomonas campestris*; Объем более 120 м3, Пастеризация, продукта
глюкоза или декстран, 40–80 ч, 28 °С, рН 7,0, осаждение этанолом до 30 г/л
источник азота специальные мешалки или 2-пропанолом после 60 ч
(из-за высокой вязкости) ферментации

* X. campestris – растительный патоген, вторая степень биологической опасности

Декстран
1,6-α-D-глюкоза; Биосинтез
степень полимеризации (1,6-α-D-глюкозил)n + сахароза
~ 28 000;
1,2-, 1,3-
и 1,4-гликозидные связи Декстран-сахараза

Код CAS 9004-54-0 (1,6-α-D-глюкозил)n+1 + фруктоза

Ферментация и очистка
Биореактор Выделение Гидролиз
и фракционирование Выход продукта
Leuconostoc mesenteroides Осаждение
1) Инокуляция. этанолом, Декстраны 100 г/л через 24 ч
2) Фаза синтеза; сахароза ацетоном разного размера (утилизируется
в качестве источника или метанолом ~ 45% сахарозы)
углерода, 23 °С

Производство и использование полисахаридов


Полисахарид Объем Цена, Микроорганизм- Применение
производства, долл./кг продуцент
т/год
Ксантан 40 000 10 Xanthomonas Пищевая добавка, при заводнении
campestris нефтяных скважин
Декстран, 2000 35–390 Leuconostoc Заменитель плазмы крови, пищевая
производные 600 400–2800 mesenteroides добавка, биохимический реактив
декстрана
Гиалуроновая 500 2000–100 000 Streptococcus equi Хирургия, косметология
кислота

Микробные полисахариды, производимые в небольших объемах:


альгинат (Azotobacter), курдлан (Agrobacterium, Rhizobium), геллан (Auromonas),
пуллулан (Pullularia), целлюлоза (Acetobacter)
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Биоматериалы

ВВЕДЕНИЕ. Материалы на основе поли-3-гидрокси- ными белками, гены которых удалось клонировать и мо-
масляной кислоты все чаще находят применение в со- дифицировать для экспрессии в клетках E. coli и Pichia
временной промышленности. Необычными свойства- pastoris. Выход рекомбинантных белков фиброина и
ми, чрезвычайно интересными для технологического спидроина составляет около 1 г/л.
применения, обладают природные белки натурального БЕЛКИ С АДГЕЗИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ. Мидии Myti-
шелка (фиброин и спидроин) или белок мидий, поэто- lus edulis обладают способностью прикрепляться к рако-
му в настоящее время ведутся активные исследования винам ракообразных или поверхности обшивки кораблей
возможностей получения этих веществ методами ге- и таким образом перемещаться на большие расстояния.
нетической инженерии. Производные бактериородоп- Эти моллюски синтезируют специфический белок, про-
сина, синтезируемого Halobacterium salinarum, воз- являющий адгезионные свойства. Белок-предшествен-
можно, найдут применение в качестве оптического ник имеет молекулярную массу 130 кДа и состоит пре-
носителя информации. имущественно из полярных аминокислот – тирозина,
ПОЛИМЕРЫ, СПОСОБНЫЕ К БИОРАЗЛОЖЕНИЮ. В про- серина, треонина, лизина и пролина. В ходе посттранс-
мышленности уже получают из L-молочной кислоты ляционных модификаций остатки тирозина и пролина
полилактид (Nature WorksTM). Производится также сопо- преобразуются в о-гидрокситирозин или 3- или 4-гидро-
лимер получаемого биотехнологическим путем 1,3-про- кси-L-пролин соответственно. На воздухе полипептипти-
пандиола и терефталевой кислоты (SoronaTM). При полу- дные цепи полимеризуются, и образуются дихиноны.
чении 1,3-пропандиола используются рекомбинантные Методами генетической инженерии удалось осущест-
штаммы E. coli, метаболизм которых изменен внедрени- вить гетерологичную экспрессию фрагмента белка адге-
ем гена глицерин-дегидратазы методами метаболиче- зии размером 25 кДа в клетках E. coli с достаточно вы-
ской инженерии. Многие микроорганизмы, например соким выходом. Однако в этих клетках-хозяевах не
Ralstonia eutropha, в определенных условиях способны происходит посттрансляционных модификаций белков,
запасать в клетке полигидроксимасляную кислоту, со- поэтому выделенный рекомбинантный продукт обраба-
держание которой может достигать 90% сухой клеточ- тывают ферментом тирозиназой, который гидролизует
ной массы. Состав запасных полимеров зависит от со- остатки тирозина до о-гидрокситирозина, что обеспечи-
става питательной среды, поэтому, добавляя в среду вает образование поперечных сшивок между полипеп-
роста различные вещества-предшественники, можно уп- тидными цепями. Полученный белок используют в ме-
равлять процессом образования продукта. Для техноло- дицинских целях, в том числе в стоматологии для
гического применения наиболее интересен сополимер заполнения полостей в зубе.
3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, БАКТЕРИОРОДОПСИН. Галобактерия Halobacterium sali-
который проявляет свойства полипропилена, однако в от- narum обитает в средах с повышенным содержанием по-
личие от последнего может разлагаться биологическим варенной соли: концентрация NaCl 3–5 М является нор-
путем. Получение этого сополимера ферментацией пока мальной для ее роста. При фототрофном росте
очень дорогой процесс, поэтому это вещество находит бактериородопсин служит в качестве протонного насоса
лишь ограниченное применение – в медицине (препарат и таким образом снабжает клетку энергией. Молекулы
Biopol®). Оперон синтеза поли-3-гидроксимасляной кис- бактериородопсина формируют в клеточной мембране
лоты содержит 3 гена, которые уже клонированы. Транс- агрегаты (бляшки), которые легко выделяются в составе
формация растений и клеток Escherichia coli плазмидами, так называемой «пурпурной мембраны», на 75% по мас-
содержащими эти гены, позволила получать поли-3-гид- се состоящей из белков и на 25% из липидов. Препара-
роксимасляную кислоту с выходом до 95% сухой клеточ- ты «пурпурных мембран» очень стабильны. Кофактор
ной массы. Для выделения образующегося в клетках по- бактериородопсина ретиналь и процесс его цис-транс-
лимера используют экстракцию органическими изомеризации связан с необычной функцией: бактерио-
растворителями или энзиматическое расщепление. родопсин действует как светозависимый протонный
ФИБРОИН И СПИДРОИН. Белки образуются в специаль- насос, число оборотов которого может достигать
ных железах гусеницы тутового шелкопряда (Bombyx 100 в секунду. В восстановленной форме бактериоро-
mori) для создания кокона при окукливании, а также в допсин имеет пурпурный цвет (λmax = 570 нм), а при
паутинных железах многих паукообразных (например, протонировании ретиналя и остатка лизина в положе-
паука крестовика Nephila claviceps). Натуральное волок- нии 216 становится желтым (λmax = 410нм). Замена
но имеет очень хорошие технические перспективы, в ча- определенных аминокислотных остатков путем напра-
стности для создания парашютной ткани, так как многие вленного мутагенеза дает возможность регулировать
их свойства уникальны. Волокна каркасной нити паути- скорость циклического светозависимого изменения
ны, состоящие из белка спидроина, при равной толщине цвета бактериородопсина. Чрезвычайно перспектив-
волокна в несколько раз прочнее стали и при этом спо- ным представляется использование бактериородопси-
собны растягиваться на 30% своей длины без разрыва на и его производных в качестве оптического носите-
68 (BioSteelTM). Фиброин и спидроин являются фибрилляр- ля информации (фотоэлемента).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферментация и очистка
Организм Продукт Фирма-производитель
Ralstonia eutropha Сополимер 3-гидроксимасляной Metabolix (коммерческий продукт)
и 3-гидроксивалериановой кислот
Escherichia coli Поли(3-гидроксимасляная кислота), ATO-DLO
клонирован оперон из Alcaligenes latus
Lactobacillus Хирально чистый L-полилактид Cargill (производство)
из L-молочной кислоты
E. coli Сополимер пропан-1,3-диола DuPont, Geneva (производство)
с генами Klebsiella и терефталевой кислоты

Ralstonia eutropha Биореактор Выделение


Гетеротрофный Непрерывная Ферментативные Выход продукта
штамм-продуцент ферментация, глюкоза, методы более 80 г/л
пропионовая кислота, (более 2 г/л в ч)
30 °С, ~ 40 ч

Структура оперона синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) из Ralstonia eutropha


Промотор РНК-Синтаза 3-Кетотиолаза Ацетил-КоА-редуктаза

Волокна каркасной нити паутины паука-крестовика (Nephila claviceps)


Основной компонент 6

Прочность на разрыв,
Аморфные белка каркасной нити
нити 5
(gly–pro–gly–gly–x)3–63 –

⋅ 109 Н/м2
4 Энергия,
β-слои (gly–gly–x)12-спейсер
3 выделяющаяся
Сшивки в виде тепла
2
Прочность 4 ⋅ 109 Н/м2
Эластичность 35% 1
Водородные
мостики Прочность 0
на разрыв 105 Дж/кг 0 5 10 15
Растяжимость, %

Белок с адгезионными свойствами из мидий Mytilus edulis


или или hyp = 4-гидроксипролин
DOPA = 3,4-дигидрокси-
фенилаланин

Тирозиназа Аскорбиновая кислота Окисление,


из шампиньонов образование
сшивок
и связывание
Кислород воздуха с поверхностью

Генно-инженерный Активирован в виде преполимера,


белок-предшественник стабилизирован аскорбиновой кислотой

Бактериородопсин как протонный насос


Цитоплазма Донор Поток
протонов протонов
Бактериородопсин
(по рентгено-
структурным данным
Мембрана

Мембрана

с разрешением 0,23 нм);


красным Ретиналь-CH = NH
обозначен ретиналь,
зеленым –
Asp85, Asp96, Lys216
Акцептор Протонирование
протонов ретиналя
69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Биотрансформация

ВВЕДЕНИЕ. Биотрансформация – основная функция ные из крови при диализе, в результате биотрансфор-
организма, необходимая для осуществления нор- мации осаждаются на молекулах альбумина.
мального обмена веществ и обезвреживания токсич- РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ. Наиболее известный
ных веществ, в том числе ксенобиотиков. В биотех- пример использования растительных клеток для био-
нологии под термином биотрансформация принято трансформации – реакции специфического гидрокси-
понимать биокатализ, то есть процесс ферментатив- лирования. Так, в культуре Digitalis lanata в результа-
ного превращения природного или синтетического те гидроксилирования дигитоксина по положению 12
вещества-предшественника в продукт с необходимы- образуется дигоксин. Биореакторы для культивирова-
ми свойствами. Этот процесс может осуществляться ния растительных клеток по техническим причинам
в биореакторах микроорганизмами, целыми клетка- пригодны лишь для ограниченного числа процессов,
ми животных или растений, их отдельными органел- например для синтеза таксола (PaclitaxelTM) Taxus
лами, а также иммобилизованными на носителях brevifolia.
ферментами или клетками. В последние годы сильно ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ целесообразно применять,
выросла роль генетической инженерии для усовер- если реакция биотрансформации проходит всего в
шенствования ферментов и получения рекомбинант- одну стадию и может протекать в системе in vitro.
ных организмов. Термины «биокатализ», «фермента- В большинстве случаев в промышленности использу-
ция» и «биотрансформация» в определенном смысле ются не требующие кофакторов ферменты, напри-
можно считать синонимами. Процесс биотрансфор- мер, для реакций субстрат-специфичного гидролиза
мации включает одну или несколько стадий – каждую или этерификации. В последнее время изолирован-
стадию катализирует отдельный фермент. Примене- ные ферменты также стали применяться для осу-
ние выделенных ферментов имеет ряд преимуществ: ществления реакций присоединения по двойной свя-
можно оптимизировать температурный режим прове- зи, например в карбонильных группах.
дения реакции, так как белок менее чувствителен к «РЕКОМБИНАНТНЫЕ» ПУТИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. Наи-
условиям среды, чем более сложные биологические более яркими примерами использования этого подхо-
системы (органеллы или клетки); отсутствует необ- да в промышленности является производство аскор-
ходимость поддерживать стерильные условия реак- биновой кислоты в Erwinia herbicola (см. ранее)
ции; фермент взаимодействует с субстратом более и получение индиго в рекомбинантных клетках Esche-
эффективно. Использование органелл или целых richia coli. Методами генетической инженерии в клет-
клеток более целесообразно в тех случаях, когда вы- ках E. coli была дополнительно усилена активность
деление фермента является сложной процедурой, триптофаназы, катализирующей реакцию превра-
если очищенный фермент нестабилен или процесс щения триптофана в индол, а затем с помощью
трансформации включает несколько стадий и все не- TOL-плазмиды в клетки был введен ген нафталинди-
обходимые ферменты находятся в клетке. оксигеназы из Pseudomonas sp. Полученный рекомби-
МИКРООРГАНИЗМЫ используются как для полу- нантный штамм обладает способностью синтезиро-
чения природных метаболитов (например, глу-тами- вать индиго – один из самых распространенных кра-
новой кислоты), так и для превращения веществ, ко- сителей для тканей. Для получения L- или
торые не являются их природными субстратами (к D-аминокислоты из синтетических гидантоинов ис-
примеру, гидроксилирование стероидов по 11β-по- пользуют хозяйские клетки E. coli с векторными кас-
ложению). Как правило, ферменты катализируют ре- сетами, содержащими рекомбинантные гидантоиназы
акции нормального метаболизма с высокой суб- и карбамилазы («синтетическая биология»).
стратной специфичностью. Экспрессия генов или
целых генных кластеров, клонированных из другого
организма, позволяет расширить круг веществ, под-
вергающихся биотрансформации, как, к примеру, в
случае получения индиго. Метаболическая инжене-
рия и белковый дизайн позволяют находить новые
метаболические пути на основе анализа генома и иг-
рают важную роль при разработке методов промыш-
ленной биотрансформации.
ЖИВОТНЫЕ КЛЕТКИ широко используются для синте-
за фармацевтических препаратов и антител в биореа-
кторах. В настоящее время проводятся работы по со-
зданию искусственной печени для очищения крови от
70 некоторых токсических веществ. Токсины, выделен-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биотрансформация
Биотрансформация/биокатализ
Синтез необходимых продуктов

Ферментация «Покоящиеся» или иммобилизованные клетки Ферментативный катализ


Живые клетки Kлетки в виде суспензии Один или несколько
в биореакторах или иммобилизованные на носителе изолированных ферментов

Примеры реакции биотрансформации


Реакция Организм/Фермент Процесс Фирма-разработчик
D-сорбит → L-сорбоза Acetobacter suboxydans Ф Roche
Фенил-D-лактат → 4-гидроксифенил- Beauveria gossypii Ф BASF
D-лактат
Фумаровая кислота → Escherichia coli ИмК Tanabe, DSM
L-аспарагиновая кислота
D-глюкоза → D-фруктоза Глюкозоизомераза ИмК, ИмФ Novo, Clinton
из Streptomyces sp.
D,L-ацетоксиметоксифенилэтиламин → Липаза из Pseudomonas ИмФ BASF
L-фенилэтиламин cepacia
Триптофан → индиго Pекомбинантный штамм E. coli ИмРК Genencor
Ф – ферментация;
ИмК – иммобилизованные клетки;
ИмФ – иммобилизованные ферменты;
ИмРК – иммобилизованные рекомбинантные клетки

Производство индиго в рекомбинантных штаммах E. coli

Мутантный штамм E. coli –


суперпродуцент индола

Клонирование генов
Триптофаназа из Pseudomonas sp.:
а нафталиндиоксигеназа
б ксиленоксидаза
Триптофан Индол

а б Ксиленоксидаза
Нафталин-
диоксигеназа

Спонтанная дегидратация

цис-Индол-2,3-дигидродиол Индоксил Индиго

Некоторые способы иммобилизации клеток и ферментов

Адсорбция Ковалентное Образование Включения Микрокапсулирование


на носителе связывание поперечных в нерастворимый
с носителем сшивок гель
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Специальные продукты Биотрансформация стероидов

ВВЕДЕНИЕ. Одним из примеров экономически выгод- мышленного использования такой реакции является
ной биотрансформации является получение стерои- гидроксилирование одного из промежуточных проду-
дов из стеролов. ктов синтеза гидрокортизона – соединения Рейх-
СТЕРОИДЫ. К группе стероидов относятся более штейна «S» (вещество названо по имени Тадеуша
10 000 природных и синтетических соединений, Рейхштейна – швейцарского химика, лауреата Нобе-
многие из которых имеют важное фармацевтическое левской премии 1950 г., который впервые выделил
значение. В качестве примеров можно привести кортизон и установил его структуру). Реакция проте-
витамин D2 (кальциферол), кортикостероиды (проти- кает в клетках плесневого гриба Curvularia lunata.
вовоспалительные средства), эстрогены и гестагены Чтобы предотвратить гидроксилирование по 7α-
(женские половые гормоны), спиронолактон (моче- и 14α-атомам, «S»-вещество предварительно ацети-
гонное средство). В промышленном синтезе сте- лируют по 17-гидроксигруппе. В процессе фермента-
роидов используются различные типы биотранс- ции реакция биотрансформации идет с высокой сте-
формации: например, отщепление боковой цепи реоспецифичностью.
β-ситостерола с образованием андроста-4-ен- БИОСИНТЕЗ ПРЕГНЕНОЛОНА ИЗ САХАРОВ. При созда-
3,17-диона (АД) или андроста-1,4-диен-3,17-диона нии рекомбинантного дрожжевого штамма, синтези-
(АДД) и гидроксилирование 11-β-атома кортексоло- рующего прегненолон из сахаров, был использован
на (также называемого соединением Рейхштей- новый экспериментальный подход. В процессе обра-
на «S»). Аналогично получению индиго в клетках зования микостерола в дрожжах синтезируется эрго-
E. coli, возможно осуществить процесс синтеза пре- стерол. В рекомбинантных штаммах были произведе-
гненолона из сахаров в клетках дрожжей, и хотя эти ны следующие перестройки генома: во-первых,
методы пока не используются в промышленности, выключен ген фермента, ответственного за окисли-
очевидно, что в будущем биотрансформация станет тельное отщепление боковой цепи в Δ-22-ненасы-
очень важным технологическим приемом. щенных продуктах; во-вторых, в геном встроены три
ОТЩЕПЛЕНИЕ БОКОВЫХ ЦЕПЕЙ. Традиционно основ- гена ферментов, участвующих в синтезе стеролов
ным сырьем для производства стероидов служит крупного рогатого скота, и ген Arabidopsis thaliana
диосгенин – природный стерол растительного проис- (резуховидка, двудольное травянистое растение), ко-
хождения, главный поставщик – Мексика. Другие дирующий Δ-7-редуктазу. Полученные рекомбинант-
источники – желчные кислоты, которые поставляет ные штаммы, в которых экспрессируются все эти
мясоперерабатывающая промышленность, и стигма- ферменты, обладают способностью синтезировать
стерол – побочный продукт производства витамина Е прегненолон при росте на D-глюкозе. Кроме того,
из соевого масла. Процессы превращения этих ве- если в клетках осуществлять коэкспрессию
ществ в важные фармацевтические продукты (корти- 3β-гидроксистероид-дегидрогеназы человека, из пре-
костероиды, половые гормоны или спиронолактон) г-ненолона образуется прогестерон. Клонирование
состоят из множества стадий. Поэтому для отщепле- гена монооксигеназы P450, которая осуществляет
ния боковых цепей, в частности от β-ситостерола из избирательное гидроксилирование, приводит к гидро-
соевого или рапсового масла, представляется пер- ксилированию молекулы прогестерона по положе-
спективным использование таких микроорганизмов, ниям 11β-, 17α- и 21. Таким образом рекомбинант-
как Mycobacterium, Nocardia, Arthrobacter или Cory- ный штамм дрожжей синтезирует гидрокортизон из
nebacterium. В результате ферментативной реакции сахаров. Научные достижения, основанные на фунда-
образуется андроста-4-ен-3,17-дион и андроста-1,4- ментальных исследованиях в области молекулярной
диен-3,17-дион – предшественники эстрогенов и ге- биологии, используются в разработках компании
стагенов, а также кортикостероидных гормонов. Дру- Sanofi-Aventis при оптимизации штаммов дрожжей
гие источники сырья для производства стероидов, методами метаболической инженерии. Это приводит
такие как холестерол или желчные кислоты, также к появлению конкурентоспособной технологии.
могут быть использованы для биотрансформации,
однако пока эти методы экономически невыгодны.
ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ 11β-АТОМА. Гидроксилирова-
ние – одна из важнейших стадий синтеза стероидов с
заданной структурой. В настоящее время получены
обширные коллекции микроорганизмов, в каждом из
которых гидроксилирование протекает по определен-
ному положению, что позволяет осуществлять гидро-
ксилирование предшественников стероидов по всем
72 возможным положениям. Важным примером про-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Биосинтез стеролов

Дезоксихолевая кислота Диосгенин Стигмастерол


26 стадий 5 стадий
4 стадии

Кортизон Прогестерон β-Ситостерол

7 стадий

Реакции гидроксилирования,
осуществляемые различными
микроорганизмами

11-α-Гидроксипрогестерон Андроста-4-ен-3,17-дион (АД)

Половые гормоны
Химические реакции
Ферментация Доступное промышленное сырье
Гидроксилирование соединения Рейхштейна «S»
в положении 11β в клетках Culvularia lunata

17-Ацетат соединения 17-Ацетат гидроксикортизона Гидрокортизон


Рейхштейна «S»
Ацетилирование субстрата по 17-гидроксигруппе препятствует
гидроксилированию в положениях 7α и 14α.

Синтез стероидов в рекомбинантных штаммах дрожжей


Сахар
21

11 17

3β-Гидроксистероид-
дегидрогеназа,
P450 моноокси-
Эргостерол Прегненолон геназы CYP17A1, Био-гидрокортизон
CYP21A1, CYP11B1
Обмен веществ дрожжей
Клонированные гены крупного рогатого скота, человека и растений
Клонированный ген млекопитающих
73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты Ферменты

ВВЕДЕНИЕ. Применение ферментов животного, рас- эти посторонние активности часто не влияют на про-
тительного и микробного происхождения в промыш- изводственный процесс. Для диагностических, анали-
ленном производстве или в аналитических целях тических и терапевтических целей чаще используют
началось около 100 лет назад. В 1970 г. иммобили- внутриклеточные ферменты, и в этом случае необхо-
зованые ферменты были впервые использованы как димы препараты ферментов с высокой степенью очи-
биокатализаторы для химического превращения ве- стки. После разрушения клеток клеточный дебрис
щества (ферментативная трансформация). Развитие удаляют центрифугированием, а внутриклеточное со-
методов генетической инженерии и возможность по- держимое концентрируют. Затем для удаления посто-
лучения рекомбинантных белков с измененными ронних белков последовательно проводят несколько
свойствами открывает новые перспективы фермен- стадий хроматографического разделения компонен-
тации. тов полученного раствора. Степень очистки фермента
КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ. В соответствии с ме- определяют по следующим критериям: 1) удельная
ждународной классификацией ферменты разделены активность фермента; 2) активность других компо-
на 6 классов, согласно типам реакций, которые они нентов препарата; 3) электрофоретическая картина
катализируют. К настоящему времени описаны тыся- разделения компонентов препарата. Многие фермен-
чи разнообразных ферментов с различными функция- ты, использующиеся в промышленности, получены
ми. Как правило, ферменты с аналогичными функци- путем ферментации в рекомбинантных штаммах мик-
ями, выделенные из разных организмов, несколько роорганизмов. Методы генетической инженерии поз-
отличаются по структуре. При оценке возможностей воляют получать продукт с меньшим числом побоч-
использования фермента в биотехнологии необходи- ных активностей, следовательно, его очистка требует
мо располагать данными о его биологических свойст- значительно меньших затрат.
вах. Так, около трети всех описанных ферментов яв- РАЗРЕШЕНИЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ. Ферменты явля-
ляются мембраносвязанными, они нестабильны в ются природными белками, поэтому их использова-
очищенном виде. Для осуществления ферментатив- ние во всех областях, за исключением пищевой про-
ной реакции многим оксидоредуктазам, трансфера- мышленности или медицины, не требует специальных
зам, лигазам и синтазам необходимы кофакторы, на- разрешений. Компоненты пищевых продуктов, полу-
пример NADH, ATФ или кофермент А, поэтому ченные из природного сырья с помощью ферментов
использование таких ферментов в биотехнологиче- (например, изоглюкоза), относятся к «природным» и
ских целях не всегда экономически выгодно из-за вы- применяются наравне с естественными. В соответст-
соких цен на кофакторы. Гидролазам и изомеразам вии с постановлениями Международной ассоциации
кофакторы не требуются, поэтому эти ферменты ши- производителей ферментов для пищевой промыш-
роко используются в промышленности. Для большин- ленности (AMFEP), при производстве продуктов пита-
ства аналитических и диагностических исследований ния разрешено использование ферментов животного
особенно важна высокая специфичность ферментов и растительного происхождения, а также продуктов
по отношению к субстрату. так называемых «безопасных» микробных штаммов.
ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ. Способ выделения и очист- Применение ферментов, выделенных из других мик-
ки фермента зависит от источника (животные, расти- роорганизмов, разрешается лишь после прохождения
тельные или микробные клетки), конкретной задачи, многочисленных и весьма дорогостоящих процедур
необходимого количества, а также биологических тестирования и утверждения, поэтому использование
свойств фермента (растворимый или мембраносвя- таких ферментов в промышленных масштабах оказы-
занный белок). Ферменты, секретируемые во внекле- вается экономически невыгодным.
точное пространство, удается получать в больших ко-
личествах (например, протеазы для производства
стиральных порошков). В этом случае процедура очи-
стки фермента значительно упрощена: после отделе-
ния клеток следует стадия концентрирования культу-
ральной жидкости методом ультрацентрифугирования
или осаждения. Затем – высушивание распылением
или в псевдоожиженном слое, после чего препарат
фермента готов к промышленному использованию.
Полученные таким способом препараты часто содер-
жат значительные примеси посторонних белков,
поэтому при их применении могут иметь место побоч-
74 ные ферментативные реакции. В промышленности
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Классификация ферментов и примеры

ЕС-номер Название, функция Кофактор Примеры


1.x.y.z Оксидоредуктазы
1.1.y.z Действуют на СН–ОН-группу NAD+, NADP+, PQQ Алкогольдегидрогеназа
1.1.3.z Действуют на СН–ОН-группу FAD+ Глюкозооксидаза
1.3.y.z Действуют на С–Н-группу Гем, Fe2+ Стероид-11β-гидроксилаза
2.x.y.z Трансферазы
2.4.y.z Переносят гликозильные группы Гликозилтрансфераза
2.6.1.z Переносят NH2-группы на С=О Пиридоксальфосфат Трансаминаза
3.x.y.z Гидролазы
3.1.y.z Гидролизуют эфирные связи Липазы, эстеразы
3.2.y.z Гидролизуют гликозидные связи α-Амилаза
3.4.y.z Гидролизуют пептидные связи Субтилизин, трипсин
4.x.y.z Лиазы
Катализируют реакции присоединения по двойным связям
4.x.y.z Добавление (удаление) NH2-группы к (от) двойной связи Аспартаза
5.x.y.z Изомеразы
5.1.y.z Рацемизация D- и L-аминокислот Аланинрацемаза
5.3.y.z Внутримолекулярные оксидоредуктазы Ксилозо(глюкозо)-изомераза
6.x.y.z Лигазы
6.2.y.z Образование C–S связей ATФ, КоА-SH Ацетил-КоА-синтетаза

Получение ферментов
Микро- Ферментация
организмы
Высушивание Техни-
в псевдо- ческие
ожиженном слое фер-
гранулирование менты
Выделение
Клонирование Растительный из клеток Концент-
и экспрессия материал отделение рирование
твердых частиц Аналити-
ческие
Животный Тонкая очистка фер-
материал менты

Применение
Источник Примеры Применение
Животные ткани Панкреатические ферменты, в соответствии с GMP*
сычужный фермент, пепсин
Растительные ткани Папаин, бромелаин в соответствии с GMP*
Микроорганизмы:
а) традиционно исполь- Bacillus subtilis, Aspergillus niger и A. oryzae, GRAS (generally recognized as safe) –
зуемые для получения Mucor javanicus, Rhizopus sp., Saccharomyces признаны безопасными в соответствии
продуктов питания cerevisiae, Kluyveromyces fragilis и K. lactis, с положениями AMFEP (Международная
Leuconostoc oenus ассоциация производителей ферментов
для пищевой промышленности)
б) ферменты Bacillus stearothermophilus, B. licheniformis, Специальная процедура
хорошо изученных B. coagulans, B. megaterium и B. circulans, согласования
микроорганизмов Klebsiella aerogenes
* GMP (good manufacturing practice) – «Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств»,
принятые Всемирной организацией здравоохранения. — Прим. перев.
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты Ферментативный катализ

ВВЕДЕНИЕ. Преимущества использования ферментов вой кислоты. Липаза из Pseudomonas cepacia служит
в реакциях химического синтеза связаны с для промышленного производства аминов из пред-
в их высокой субстратной специфичностью. В про- шественников-амидов, липаза из Serratia marces-
мышленности, как правило, применяют ферменты, cens используется для энантиоселективного гидроли-
которые не требуют дополнительных кофакторов: за оксирана – предшественника дилтиазема,
гидролазы, лиазы, изомеразы и некоторые оксидоре- применяемого для снижения кровяного давления.
дуктазы. К настоящему времени гены многих фер- С помощью липазы из клеток Rhizomucor miehei про-
ментов клонированы, поэтому появилась возмож- изводят синтетическое масло какао, а ацилазу ами-
ность получать эти ферменты без побочных нокислот из Aspergillus oryzae применяют для энанти-
активностей и с некоторыми улучшенными в резуль- оселективного гидролиза N-ациламинокислот.
тате генно-инженерных манипуляций свойствами. ЛИАЗЫ. К лиазам относятся ферменты, которые
ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ. На сегодняшний день охаракте- разрывают связи С–С, С–О, С–N и др., при этом не
ризованно около 850 оксидоредуктаз. Эти ферменты требуется наличия кофакторов. К настоящему време-
катализируют окислительно-восстановительные ре- ни описано более 300 лиаз. Аспартазу из E. coli ис-
акции в присутствии кофермента. В случае оксидаз пользуют для промышленного производства L-аспа-
коферментом является молекула ФАД, ковалентно рагиновой кислоты из фумаровой. Процедура
связанная с ферментом. Оксидоредуктазы широко очистки фермента требует дополнительных затрат,
применяются в аналитических методах. Дегидрогена- поэтому в промышленности используют целые клет-
зы используются для аналитических, а также препа- ки E. coli, а не выделенный фермент. Акрилонитрил-
ративных целей в качестве восстановителей карбок- гидратаза из Pseudomonas chloraphis катализирует
сильных или окислителей гидроксильных групп. присоединение молекулы воды к акрилонитрилу.
Процедура очистки кофакторов, например NAD(P)+ В результате этой реакции образуется акриламид –
или NAD(P)H, требует значительных затрат, поэтому важнейший продукт для получения полимера полиак-
использование этих веществ в очищенном виде явля- риламида. Оксинитрилазы обеспечивают стерео-
ется экономически невыгодным. Часто в технологи- селективное присоединение HCN к альдегиду; при
ческий процесс включают дополнительную реакцию с гидролизе нитрила образуются D- или L-аминокисло-
недорогими субстратами, в результате которой обра- ты. Альдолазы, выделенные, к примеру, из печени
зуются необходимые кофакторы. Значительными кролика, используются при стереоселективном син-
преимуществами обладает мембранный фермента- тезе гексоз из С3-компонентов.
тивный реактор, в котором для синтеза кофактора ИЗОМЕРАЗЫ. Известно около 140 ферментов, отно-
используется производное NAD(P)H и формиатде- сящихся к классу изомераз. Ферментам этого типа
гидрогеназа. В последнее время ведутся активные не требуется кофактор. Изомеризация D-глюкозы и
исследования возможностей применения перокси- D-фруктозы, катализируемая глюкозоизомеразой,
даз, диоксигеназ и Р450-монооксигеназ, катализи- является важнейшим процессом в производстве ис-
рующих определенные реакции гидроксилирования. кусственных подсластителей. Этот фермент внутри-
Эти ферменты содержат железо-серный кластер или клеточный, и для этой реакции, как правило, исполь-
гемовую группу, играющие роль кофактора. зуют дезактивированные иммобилизованные клетки
ТРАНСФЕРАЗЫ. К настоящему времени известно Streptomyces.
около 950 ферментов, относящихся к классу транс- ЛИГАЗЫ. К классу лигаз, их известно 117, относят-
фераз. В промышленности эти ферменты не находят ся ферменты, катализирующие соединение двух мо-
применения. лекул, сопряженное с гидролизом АТФ. Теоретиче-
ГИДРОЛАЗЫ. К классу гидролаз относится более ски использование лигаз в технологическом
1000 ферментов, в том числе протеазы, липазы и процессе весьма перспективно, однако необходимо
эстеразы, имеющие большое значение в современ- найти дешевые пути синтеза кофактора – АТФ. Такие
ной биотехнологии. По сути эти ферменты можно системы разрабатываются в лабораторных условиях,
рассматривать как трансферазы, переносящие ту или но пока не находят применения в технологических
иную группу на молекулу воды. Гидролазы катализи- процессах.
руют гидролиз связей С–О, C–N, C–C и др. и могут
применяться для синтеза или гидролиза сложных
эфиров и амидов. Так, термолизин, выделенный из
Bacillus stearothermophilus, используют для синтеза
аспартама из L-аспарагиновой кислоты и L-фенил-
аланина, пенициллинамидазу из клеток E. coli – для
76 гидролиза пенициллина G до 6-аминопенициллано-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты в химическом синтезе


4 Преимущества ферментов в реакциях химического синтеза
1
1 Стерео- и субстрат-специфичное окисление
неактивированных С–Н групп
2 Стереоселективные реакции присоединения
2 по активированным двойным связям
3 Стереоселективное восстановление
3 карбонильных групп
4 Стереоселективное восстановление
5 6 7 гидроксильных групп
5 Субстрат-специфичное замещение
в ароматических соединениях
6 Субстрат-специфичная изомеризация
7 Субстрат-специфичные и стереоселективные реакции
гидролиза и этерификации

Ферменты в биокатализе
Пероксидазы 2 4 5 Лиазы, 1 Оксидо-
и оксигеназы 1 трансферазы, редуктазы
В том числе: изомеразы
Oчищенные 1 2 Трансферазы
ферменты 3 Гидролазы
3 Липазы
Оксидоредуктазы 1 4 Лиазы
(целые клетки)
5 Изомеразы
Другие гидролазы 3 3 Эстеразы
6 Лигазы

Нитрилазы 3 3 Протеазы

Примеры использования ферментов в технологических процессах

Реакция Фермент Ежегодное Фирма-


потребление, т производитель

3 Расщепление пенициллина G Пенициллинамидаза* 40 000 North China


с образованием из E. coli Pharmaceuticals
6-аминопенициллановой кислоты
3 Расщепление рацемата N-ацил- Ацилаза* 5 000 Tanabe Sejyaku,
DL-аминокислот с образованием из Aspergillus sp. Degussa, DSM
L-аминокислот
4 Обработка NH3 Аспартаза* из E.coli 10 000 Tanabe Sejyaku
фумаровой кислоты с образованием
L-аспарагиновой кислоты

3 Гидролиз крахмала до D-мальтозы α-Амилаза, 100 000 Различные фирмы


и D-глюкозы глюкоамилаза
5 Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу Глюкозоизомераза* 100 000 Clinton Corn
из Streptomyces sp. Products
3 Синтез акриламида из акрилонитрила Нитрилгидратаза* 30 000 Nitto Chemicals
из Pseudomonas
chloraphis
3 Расщепление рацемата Липаза* из 10 000 BASF
фенилэтиламинов Pseudomonas cepacia

3 Трансэтерификация пальмового масла Липаза* из 1000 Unilever


и метилового эфира стеариновой Rhizomucor miehei
кислоты с образованием масла какао
3 Дегалогенирование Дегалогеназа* из Технология Dow Chemicals
1-хлорпропандиола термофильных разрабатывается
организмов

* Иммобилизованный фермент.
77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты Ферменты в клинических анализах

ВВЕДЕНИЕ. При клинической диагностике важную метод определения глюкозы – кинетический. При
роль играют лабораторные анализы, где широко при- этом анализируют не конечные продукты реакции, а
меняются ферменты различных классов. При этом измеряют начальную скорость реакции (метод на-
используется свойство фермента специфически ка- чальных скоростей). Когда концентрация субстрата
тализировать реакцию, в которой участвует лишь значительно ниже Km (менее 1/10), скорость реак-
один компонент сложной среды. Чтобы получить пра- ции линейно зависит от концентрации субстрата. При
вильный результат анализа, в ферментном препара- таком методе анализа особенно важно соблюдать по-
те должны отсутствовать другие активности; поэтому стоянные условия реакции, поэтому этот метод ле-
к степени очистки ферментов, применяемых при про- жит в основе действия автоматических анализато-
ведении клинических анализов, предъявляются ров. Каталитический метод анализа основан на том,
очень жесткие требования. Анализы большого числа что количество анализируемого вещества является
проб проводят с помощью лабораторных автомати- лимитирующим фактором в циклическом каталити-
ческих анализаторов, тест-полосок или биосенсоров. ческом процессе, в котором оно разлагается в ходе
Ферменты также применяются в качестве репортер- одной ферментативной реакции и образуется в ходе
ных соединений (маркеров) в реакциях специфиче- другой. Количество анализируемого вещества опреде-
ского связывания антител или нуклеиновых кислот ляют по изменению количества одного из участников
(иммунный или ДНК-анализ): в присутствии избытка циклического процесса. Так определяют, например,
субстрата ферменты значительно увеличивают ин- концентрацию КоА в сопряженных реакциях, катали-
тенсивность сигнала. Объем рынка ферментов, ис- зируемых фосфотрансацетилазой, цитратсинтазой и
пользуемых в целях медицинской диагностики, со- малатдегидрогеназой.
ставляет около 6 млрд долл. США в год. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА. Объемы производства
МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ. В ферментативном ана- ферментов, используемых в медицине при проведе-
лизе чаще всего используются фотометрические, нии лабораторных анализов, невелики, однако эти
флуорометрические или люминометрические мето- препараты ферментов должны иметь очень высокую
ды регистрации продукта реакции. Если продукт реак- чистоту. Обычно это внутриклеточные белки, кото-
ции нельзя определять непосредственно, используют рые образуются в клетке в малых количествах, поэ-
дополнительные ферменты, так называемую сопря- тому для их выделения и очистки используют специ-
женную систему ферментативных реакций, продукты альные методы. К настоящему времени получено
которых можно зрегистрировать. Например, в гидро- много рекомбинантных штаммов-суперпродуцентов.
ксилазной реакции за восстановлением NAD(P)H Методами генетической инженерии в ген фермента
можно наблюдать на длинах волн 334, 340 или могут быть внесены изменения, и такой белок будет
366 нм. Современные спектрофотометры позволяют обладать свойствами, оптимальными для своего вы-
проводить измерения в очень малых объемах образ- деления и применения. Наряду с чистотой и высокой
ца (несколько микролитров). специфичностью фермент должен оставаться актив-
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕН- ным в течение достаточно продолжительного вре-
ТРАЦИИ. Ферментативные методы делятся на сле- мени, поэтому в препарат добавляют различные ста-
дующие: билизаторы, благодаря чему при хранении при тем-
а) метод конечной точки титрования; пературе до +40 °С ферменты теряют менее 20%
б) кинетический метод; активности в год.
в) метод ферментативного катализа.
Конечная точка титрования дает возможность опре-
деления количества субстрата или косубстрата,
которое полностью превратилось в продукт. Так с по-
мощью алкогольдегидрогеназной реакции опреде-
ляют содержание спирта, а с помощью лактатгидро-
геназной – лактата. Такой анализ выполняется всего
за несколько минут. Окончание реакции (конечная
точка) достигается тем быстрее, чем меньше Km или
чем больше Vmax, т. е. пока концентрация субстрата
самая высокая. Примером определения концентра-
ции субстрата по продукту сопряженной реакции
является ферментативное определение глюкозы
с помощью гексокиназы и глюкозо-6-фосфат-
78 дегидрогеназы. Другой, значительно более быстрый
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты, применяемые при проведении лабораторных клинических анализов


Фермент ЕС-номер Анализируемое вещество Детектируемое
вещество
Алкогольдегидрогеназа 1.1.1.1. Этанол, другие спирты, альдегиды NADH
Глюкозооксидаза 1.1.3.4. Глюкоза Окраска
Пируваткиназа 2.7.1.40 Фосфоенолпируват, АДФ
Креатинкиназа 3.5.3.3. Креатинин
Цитратлиаза 4.1.2.6. Лимонная кислота NAD+
Маннозо-6-фосфатизомераза 5.3.1.8. Манноза
Сукцинил-КоА-синтетаза 6.2.1.4. Сукцинат

Методы детектирования
Определение концентрации NADH
Метод Чувствительность
метода, ммоль/л 1,2
Фотометрический 1,0

Поглощение
– по продукту реакции 10–6–10–5 0,8
– кинетический 10–7–10–6
– каталитический 10–9–10–8 0,6
Флуорометрический 0,4
0,315
– по продукту реакции 10–9–10–8 0,2
– каталитический 10–15–10–14
Люминометрический 10–13–10–8 0
260 300 340 400
Длина волны, нм

Определение концентрации субстрата по количеству продукта реакции


а Алкоголь-
дегидрогеназа Прямое определение
Этанол + NAD+ Ацетальдегид + NADH + H+
продукта
Лактат-
дегидрогеназа или NADH
Лактат + NAD+ Пируват + NADH + H+

б Гексокиназа
Глюкоза + ATФ Глюкозо-6-фосфат + AДФ Определение количества
Глюкозо-6-фосфат- продукта реакции
дегидрогеназа в сопряженных реакциях:
Глюкозо-6-фосфат + NADP+ + H2O с высокоспецифичной
Определяемое глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой
соединение (аналит) и с менее специфичной
6-Фосфоглюконат + NADPH + H+ гексокиназой
Вещество, концентрацию
которого можно измерить

Кинетический метод
Кинетический метод определения глюкозы с использованием Количество фермента и Km
гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы NADPH
через 10 с после добавления фермента в анализатор Аналит Фермент Km, v/Km,
моль/л МЕ/л*
0,6
ΔA340 /10 с

0,4 АДФ Аденилаткиназа 1,6 ∙ 10–3 1600


Глюкоза Гексокиназа 1,0 ∙ 10–4 100
0,2
Глицерин Глицеринкиназа 5,0 ∙ 10–5 50
0,0 Мочевая Уратоксидаза 1,7 ∙ 10–5 17
0 20 40 60 кислота
Глюкоза, ммоль/л
Фумаровая Фумараза 1,7 ∙ 10–6 1,7
Уравнение Михаэлиса–Ментен: кислота
v = vmax × [S]/(Km + [S])
При концентрации субстрата [S], когда [S]<< Кm Чем выше Km, тем больше фермента необходимо
(Кm – константа Михаэлиса, характеризует сродство добавить к пробе, для того чтобы за несколько
фермента к субстрату), скорость v ферментативной минут в продукт превратилось 99% субстрата.
реакции прямо пропорциональна концентрации
субстрата [S].
79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Ферменты Тесты с помощью ферментов

ВВЕДЕНИЕ. Развитие методов ферментативного деление активности ферментов-«индикаторов» про-


анализа, иммуноанализа, а в последние годы и ана- водится, как правило, кинетическим методом со
лиза ДНК значительно расширило возможности специфическими субстратами.
клинической диагностики. Лабораторные исследо- АВТОМАТИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ АНАЛИЗАТОРЫ.
вания плазмы крови с помощью ферментов позво- Ранее анализы на ферментативную активность про-
ляют определить в ней концентрацию низкомолеку- водили на фотометрах, управляемых вручную. Со-
лярных метаболитов, например глюкозы или временная лаборатория анализирует огромное чис-
молочной кислоты. При выявлении различных пато- ло проб, и хотя пробоподготовка производится
логий для определения концентрации ферментов в по-прежнему вручную (например, получение сыво-
сыворотке крови применяют также высокоспецифи- ротки крови), благодаря внедрению автоматических
чные индикаторы. Так же стремительно развивают- анализиторов, оснащенных автоматическими пипет-
ся ферментативные методы анализа пищевых про- ками и компьютеризованной системой обработки
дуктов и экологического состояния окружающей данных, анализы выполняются очень оперативно.
среды. Первые методы определения концентрации Производительность таких анализаторов может
низкомолекулярных соединений были основаны на превышать 1000 проб в час.
реакциях, катализируемых гидрогеназами: NAD(P)+ ТЕСТ-ПОЛОСКИ позволяют провести ферментативный
и NAD(P)H имеют разные спектры поглощения, ко- анализ биологического материала прямо на месте
торые регистрируются спектрофотометрически (оп- (у постели больного) и, если это необходимо, оказать
тические тесты). Таким способом можно напрямую неотложную помощь. Исследуемую жидкость (напри-
оценивать концентрацию глюкозы и этанола в рас- мер, кровь) наносят на многослойную полоску, на
творе, а для определения количества жирных кис- которую нанесены компоненты ферментативной
лот и глицерина используют сопряженные реакции. реакции, подготовленные таким образом, чтобы ре-
Из соображений практического характера при про- зультат можно было наблюдать по изменению цвета
ведении многофакторного ферментативного анали- в определенной зоне полоски. Часто в качестве фер-
за, как правило, стараются использовать макси- мента на тест-полосках используют оксидазу: про-
мальное количество реакций, за ходом которых дукт этой реакции – пероксид водорода – окисляет
можно наблюдать спектрофотометрически. При вещество, изменяющее цвет при окислении. Вспомо-
анализе пищевых продуктов ферменты служат для гательным ферментом, который катализирует реак-
определения концентраций различных сахаров цию окисления, служит пероксидаза. Результаты те-
(глюкозы, галактозы, мальтозы) и кислот (лимон- ста можно увидеть невооруженным глазом или
ной, пропионовой). Непрерывное определение кон- измерить на фотометре.
центрации глюкозы при микробной ферментации
или содержания лактата при культивирован