REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DU COMMERCE
DENOMBREMENT DU CLOSTRIDRIUM PERFRINGENS
DANS LES ALIMENTS
1. APPLICATION
La présente méthode peut servir au dénombrement des
Clostridium perfringens viables dans les aliments
2. DESCRIPTION
Il a été démontré que cette méthode donne des résultats
satisfaisants avec des produits de viande et de volaille
contaminés naturellement (8.1-8.3).
3. PRINCIPE
La méthode permet d'évaluer le nombre de Clostridium
perfringens viables par g ou ml d'aliment. On mélange une
portion du produit et la fait incuber sur un milieu sélectif selon
la technique de numération sur boîte de Pétri.
On considère que les colonies noires caractéristiques sont des
colonies présomptives de Clostridium perfringens. On soumet
au moins cinq de ces colonies à des analyses de confirmation.
Le nombre de Clostridium perfringens confirmés est calculé
d'après le ratio du nombre de colonies présomptives
confirmées sur le nombre de colonies présomptives analysées.
4. DEFINITIONS
Voir l’annexe A du volume 2.
5. PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS
Voir l’annexe B du volume 2.
6. MATERIAUX ET MATERIEL SPECIAL
1) Gélose de sulfite de cyclosérine (SC)
2) Gélose de motilité au nitrate (NM)
3) Gélatine lactosée (LG)
4) Solution de D-cyclosérine
5) Réactif aux nitrites).
6) Diluant à l'eau peptonée
7) « Stomacher » Colworth 400, mélangeur ou l’équivalent.
8) Bocaux anaérobies .
9) Enveloppes génératrices de gaz
10) Indicateur aérobie).
11) Incubateurs capables de maintenir une température de 35 °
± 0,5 °C.
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7. MARCHE À SUIVRE
Il faut analyser chacune des unités d'échantillonnage
individuellement. Effectuer l'analyse en suivant les
instructions ci-dessous :
7.1 Manipulation des unités d'échantillonnage
7.1.1 Avant l'analyse au laboratoire, sauf dans le cas des
aliments de longue conservation, garder les unités
d'échantillonnage au réfrigérateur(0-5°C) ou au congélateur :
tout dépend de la nature du
produit.
Faire dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur
ou pendant une période et à une température qui empêchent la
croissance ou la mort des micro-organismes.
7.1.2 Analyser les unités d’échantillonnage le plus tôt possible
après leur arrivée au laboratoire.
7.2 Préparation pour l'analyse
7.2.1 Avoir à portée de la main de l'eau peptonée tamponnée
(9.4).
7.2.2 Nettoyer la surface de travail au moyen d’un
désinfectant approprié.
7.3 Préparation de l'échantillon
7.3.1 Pour que l’unité d'analyse soit vraiment représentative,
agiter les liquides ou les solides à écoulement libre jusqu'à ce
que le contenu soit homogène. Dans le cas d’un solide,
prélever des portions à différents endroits de l’unité
d’échantillonnage.
7.3.2 Préparer une dilution 1/10 de l'aliment en ajoutant de
façon aseptique 11(10) g ou ml (l’unité d'analyse) à 99(90) ml
de diluant (Tableau 1).
Agiter ou mélanger selon le genre d'aliment, de la façon
indiquée au tableau 1, ou utiliser un « stomacher » Colworth.
Note :
Le poids ou le volume entre parenthèses indique une autre façon
de préparer les dilutions.
7.3.3 Mélanger pendant le temps minimum requis pour
produire une suspension homogène. Pour éviter de surchauffer
le mélange, ne pas mélanger pendant plus de 2,5 min.
Dans le cas des aliments qui ont tendance à mousser, régler le
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mélangeur à basse vitesse et prélever ensuite une part aliquote
sous l'interface liquide/mousse.
7.3.4 S'il faut mélanger la dilution 1/10 en l'agitant, agiter la
bouteille de dilution 25 fois en suivant un arc de 30 cm
pendant 7 secondes environ.
7.3.5 Si l'on utilise le « stomacher », laisser macérer pendant 1
min.
7.3.6 Vérifier le pH de la suspension d'aliment. Si le pH ne se
situe pas entre 5,5 et 7,6, il faut l'ajuster à 7,0 en y ajoutant du
NaOH 1N ou du HCl 1N stériles.
7.3.7 Laisser l'homogénat (dilution 1/10) d'aliments secs
reposer à la température de la pièce pendant
15 min. Dans tous les autres cas, poursuivre l'analyse sans
tarder.
7.3.8 Préparer des dilutions décimales successives de la façon
requise en utilisant une pipette stérile distincte pour chaque
transfert.
7.3.9 Agiter toutes les dilutions immédiatement avant
d’effectuer les transferts afin d'assurer l’uniformité de la
distribution des micro-organismes présents.
7.4 Ensemencement dans des boîtes de Pétri et incubation
7.4.1 Pipetter 1 ml des dilutions requises dans des boîtes de
Pétri stériles préparées en double.
7.4.2 Verser dans chaque boîte environ 20 ml de gélose de
sulfite de cyclosérine (SC) (9.1) et mélanger
doucement par rotation.
7.4.3 Incuber les boîtes en position verticale, en anaérobiose, à
35°C pendant 20 h. Une incubation plus longue peut
provoquer un noircissement excessif le long des bords
inférieurs des boîtes.
Si les boîtes sont placées à l'envers, les gaz pourraient
déplacer la gélose.
On peut incuber un nombre limité de boîtes dans des bocaux
anaérobies et utiliser des enveloppes génératrices de gaz
H2/CO2 jetables ou un système d’échappement des gaz.
Si l'on utilise des enveloppes, il faut recouvrir le fond des
bocaux de CaSO4 anhydre ou d'un autre produit déshydratant
convenable. Pour incuber un grand nombre de boîtes, il est
préférable d'utiliser un incubateur anaérobie.
Il faut évacuer trois fois l'air des incubateurs et des bocaux
anaérobies et le remplacer par un mélange composé de 5% de
CO2 , de 10% de H2 et de 85% de N2 . Chaque bocal et
incubateur doit contenir un indicateur anaérobie.
7.5 Dénombrement des colonies présumées de Clostridium
perfringens
7.5.1 Après 20 h d'incubation, vérifier les indicateurs pour
s'assurer que le milieu est toujours anaérobie (sans quoi
l'analyse est interrompue).
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7.5.2 Choisir des boîtes qui contiennent de 20 à 200 colonies
noires d'un diamètre d'environ 1 à 2,5 mm.
Il ne faut pas compter les colonies noires trop petites.
7.5.3 Dénombrer les colonies présumées et établir la moyenne
de la deuxième série de boîtes.
Le dénombrement présumé N (nombre de colonies par g (ml))
est n=A x D, où A représente la moyenne du dénombrement
présumé pour les boîtes préparées en double et D, le facteur de
dilution.
Si le nombre le plus faible de colonies par boîte dépasse 150,
dénombrer ou estimer le nombre, consigner les résultats en y
ajoutant la lettre E, par exemple, 1,8 x 10 6 E, pour indiquer un
degré de précision plus faible.
Si le nombre des colonies est trop élevé pour qu'on puisse en
faire l'estimation, consigner le nombre minimal estimable en y
ajoutant un signe > : p. ex., >2,0 x 10 6
Si le nombre le plus élevé de colonies par boîte est inférieur à
15, consigner le résultat en y ajoutant la lettre E : p. ex., 1,2 x
103 E.
Si l'on ne trouve aucune colonie présumée, consigner le
dénombrement ainsi : <0,5 x D.
7.6 Epreuves de confirmation
7.6.1 Choisir au hasard au moins cinq colonies présumées
dans les boîtes appropriées (ou toutes les colonies présumées
s'il y en a moins de cinq).
Utiliser une aiguille ordinaire (ou une aiguille comportant une
anse minuscule) pour ensemencer chacune des colonies
choisies dans une gélose de motilité au nitrate (NM) (9.2).
En parallèle, ensemencer chacune de ces colonies
profondément dans une gélatine au lactose (LG) (9.3).
7.6.2 Boucher les éprouvettes hermétiquement et incuber à 35-
37 °C pendant 24 heures. Incuber deux éprouvettes NM et LG
non ensemencées comme témoins. Il n'est pas nécessaire de
les incuber en anaérobiose.
7.6.3 Ajouter de 0,2 à 0,4 ml de réactif aux nitrites (9.5) à
chaque éprouvette de gélose NM où l’on constate la présence
de bacilles non mobiles le long de la ligne d'ensemencement.
Une coloration rouge à la partie supérieure de l'éprouvette
indique qu'il y a eu réduction des nitrates en nitrites.
Une réaction faiblement colorée, un peu plus intense que celle
qui se produit dans les éprouvettes-témoins, est considérée
comme négative.
Si la croissance bactérienne est limitée à la partie inférieure de
l'éprouvette et si la coloration est faible ou nulle, aspirer et
jeter la couche supérieure du milieu sélectif de l'éprouvette et
ajouter de nouveau du réactif aux nitrites à ce qui reste.
7.6.4 Placer les éprouvettes contenant de la gélose LG dans de
l'eau glacée pendant 10 min, ou au réfrigérateur (4 °C)
pendant une heure.
S'il ne se produit aucune liquéfaction après 24 h d'incubation
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mais s'il y a indication de non-motilité, de réduction des 9.3 GÉLATINE LACTOSÉE (LG)
nitrates et de fermentation du lactose, incuber de nouveau Tryptose …………………………………….15,0 g
l'éprouvette LG pendant 24 h de plus. Les isolats qui sont Extrait de levure ……………………………10,0 g
immobiles, réduisent les nitrates et liquéfient la gélose Lactose ……………………………………..10,0 g
confirment la présence de Clostridium perfringens. Phosphate disodique (Na2 HPO4 ) …………..5,0 g
Rouge de phénol …………………….……...0,05 g
7.6.5 Calculer le nombre confirmé de Clostridium perfringens Gélatine (Difco) ……………………………..120 g
à partir du dénombrement présumé et du Eau distillée …………………………………1,0 litre
nombre relatif de colonies confirmées :
Note :
Dénombrement confirmé/g(ml) = Dénombrement Utiliser de la gélatine Difco si possible. On a constaté que
présumé/g(ml) x N bre de colonies confirmées N bre de certaines marques de gélatine ont donné des résultats
colonies analysées insatisfaisants.

Dissoudre les ingrédients, sauf la gélatine, dans de l'eau

Si aucune colonie n'est confirmée, inscrire le dénombrement
distillée chaude. Laisser refroidir et ajuster le pH à 7,5.
ainsi : <0,5 x D, où D représente le facteur de dilution.
Déposer le flacon dans l'eau bouillante et ajouter la gélatine en
9. PRÉPARATION DES MILIEUX
remuant constamment jusqu'à ce qu'elle se dissolve.
9.1 GÉLOSE DE SULFITE DE CYCLOSÉRINE (SC)
(Cette gélose était appelée à l'origine gélose TSC sans jaune
Transférer des volumes de 13 ml dans des éprouvettes de 16 x
d’oeuf.)
150 mm munies d'un bouchon
a. Base de gélose
qui visse. Stériliser à la vapeur.
Tryptose ………………………………………..15,0 g
Soytone…………………………………………..5,0 g
Entreposer et éliminer l'air de la même façon que pour la
Extrait de levure….………………………………5,0 g
gélose NM.
Citrate d'ammonium ferrique ………..…………..1,0 g
Métabisulfite de sodium (Na2 S2 O5 ) .…………..1,0 g
9.4 DILUANT À L'EAU PEPTONÉE (0,1 %)
Gélose ………………………………..…………20,0 g
Peptone ……………………………...1,0 g
Eau distillée …………………………...………1000ml
Eau distillée ………………………….1,0 litre
La base de gélose est disponible sur le marché (gélose Difco,
Dissoudre la peptone. Répartir dans des bouteilles à dilution
SFO ou Oxoid, base de gélose Perfringens)
pour obtenir 99 ml ou 90 ml après avoir fait stériliser à la
vapeur.
b. Solution de D-Cyclosérine (4 %)
D-cyclosérine (poudre blanche cristalline seulement)
9.5 RÉACTIF AUX NITRITES
………………………………………………….….4,0 g
a. Solution d'acide 5-amino-2-naphtalène sulfonique (5-2
Eau distillée ……………………………………...100 ml
ANSA)
Dissoudre les ingrédients de la base de gélose et ajuster le pH
5-2 ANSA …………………………………..0,1 g
à 7,6 (il n'est pas nécessaire d'ajuster le pH de la base de
Acide acétique (solution aqueuse A 15% d'acide acétique
gélose commerciale).
glacial) ……………………………………..100 ml.
Stériliser à la vapeur en suivant les instructions du fabricant de
b. Solution d'acide sulfanilique
l'autoclave et faire refroidir à 45-50 °C.
Acide sulfanilique ………………………….0,4 g
Acide acétique (solution aqueuse à 15 % d'acide acétique
Dissoudre la D-cyclosérine et stériliser par filtration. Ajouter
glacial) ……………………………………..100 ml
10 ml à la base de gélose refroidie à 45-50 °C.
Dissoudre le 5-2 ANSA et l'acide sulfanilique dans l'acide
9.2 GÉLOSE DE MOTILITÉ AU NITRATE (NM)
acétique à 15 %.
Peptone ………….………………………5,0 g
Extrait de bœuf ………………………….3,0 g
Filtrer les deux solutions au moyen d'un papier filtre Whatman
Nitrate de potassium (KNO3 ) ………….1,0 g
n°41 ou l'équivalent, mélanger à volumes égaux et verser le
Galactose ………….…………………….5,0 g
réactif dans une bouteille brune bouchée hermétiquement;
Glycérol ……………..…………………..5,0 g
garder à 4 °C.
Gélose ………………..………………….3,0 g
Eau distillée …………..……………….1000ml
Jeter la portion inutilisée de réactif après 6 mois.
Note :
Un mélange des 3 premiers ingrédients (peptone, extrait de
levure, KNO3 ) (Difco, bouillon de nitrate déshydraté Bacto). En
utiliser 9,0 g.
Dissoudre les ingrédients et en verser 13 ml dans des éprouvettes
de 16 x 150 mm munies d'un bouchon qui visse. Stériliser à la
vapeur et laisser refroidir à la température de la pièce.

On peut garder le milieu à 4 °C pendant un mois, mais il faut en

éliminer l'air (à 100 °C pendant 10 min) et le laisser refroidir à
45-50 °C avant de l'utiliser s'il a été entreposé pendant plus de
12 h.

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 TABLEAU 1
Préparation de la dilution initiale

Type de produit Préparation Traitement

alimentaire
Liquides :
lait, eau, etc. Pipetter directement dans Agiter
des boîtes de Pétri ou le
diluant à l'eau peptonée

Liquides Peser dans le diluant à Mélanger

visqueux et l'eau peptonée
non miscibles
Solides :
Solides Peser dans le diluant à Agiter
hydrosolubles l'eau peptonée

Poudres, viandes Peser dans le diluant à Mélanger

l'eau peptonée
Fromage Peser dans du citrate de Mélanger
sodium aqueux à 2%
(Na3C5O7 , 2H2 O) porté
au préalable à 45 °C

Epices Peser dans le diluant à Mélanger

l'eau peptonée agiter
Crustacés et
coquillages peser dans
le diluant à l'eau
peptonée

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