CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA SÍNTESIS DE

GLUCÓGENO EN BACTERIAS DEL GÉNERO Bacillus

Autor: Carlos María Figueroa

Filiación: Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Cátedra de Bioquímica Básica de

Macromoléculas. Grupo de Enzimología Molecular. E-mail: carfigue@ful.unl.edu.ar.
Carácter: Becario (Beca de iniciación a la investigación UNL).

Director: Alberto Alvaro Iglesias

Otros integrantes del proyecto: Ana María Demonte, Corina Fusari, Esteban Erben, Mabel
Aleanzi, Cecila Esper, Silvia Garcilazo, Diego Arias.

INTRODUCCIÓN

El glucógeno es un polisacárido considerado como un compuesto de reserva que

se acumula en la fase estacionaria del crecimiento bacteriano, cuando existen
condiciones limitantes en el medio La acumulación de glucógeno en bacterias
sería útil para la provisión de carbono y energía en los períodos de escasez de
nutrientes.

La ruta biosintética del glucógeno en bacterias ocurre en tres etapas. En la

primera, la ADPGlc es sintetizada a partir de glucosa-1P y ATP en una reacción
catalizada por la ADPGlc pirofosforilasa (EC 2.7.7.27; abrev. ADPGlc PPasa).
Luego, se produce la transferencia del residuo de Glc desde la ADPGlc a un resto
-1,4glucano preformado, mediada por la enzima glucógeno sintasa (EC
2.4.1.21). Luego, una enzima ramificante (EC 2.4.1.18) cataliza la formación de las
uniones -1,6-glucosídicas.

Se ha establecido que en bacterias (así como en plantas) los niveles de actividad

y la regulación alostérica de la ADPGlc PPasa por metabolitos que son
intermediarios clave de la vía metabólica central de utilización del carbono en el
respectivo, son limitantes para la síntesis del polisacárido de reserva.
Se ha determinado que la ADPGlc PPasa de bacterias Gram-negativas y de
cianobacterias es una enzima homotetramérica de masa molecular de 200 kDa; mientras
que la proteína proveniente de organismos eucariotas (algas verdes y plantas superiores)
es heterotetramérica, compuesta por dos tipos de subunidades que dan lugar a una
estructura 22. La única excepción para lo anterior pareciera ocurrir en bacterias del
género Bacillus (B. subtilis y B. stearothermophillus) que ha sido informado tienen una
ADPGlc PPasa heterotetramérica, aunque estos estudios son preliminares y requieren de
mayores evidencias experimentales.

Una serie de publicaciones han informado sobre la relevancia de la acumulación de

polisacáridos de reserva del tipo glucógeno en bacterias Gram-positivas en los últimos
años. Así, la acumulación del polímero fue asociada con la capacidad de esporulación de
Bacillus subtilis, con la diferenciación celular (por ej. la formación de hifas, micelios y
esporas) en Streptomyces coelicolor y con la capacidad cariogénica (probablemente
derivada de la posibilidad de formar estructuras del tipo �biofilm�) en Streptococcus
mutants. En contraposición con esta importancia, es muy pobre el desarrollo de estudios
de caracterización de las enzimas involucradas en la biosíntesis de glucógeno en
bacterias Gram-positivas, en general y en las especies recién nombradas en particular.

En bacterias del género Bacillus se han aislado genes que codifican para
proteínas involucradas en la ruta biosintética del glucógeno y se ha informado que
la ADPGlc PPasa no estaría regulada alostéricamente y sería un caso particular
de enzima bacteriana heterotetramérica. Sin embargo, estos estudios fueron
realizados con técnicas de obtención de proteínas recombinantes en células
heterólogas y no fueron confirmados con enzima purificada, ni con muestra
obtenida directamente de células de Bacillus salvajes. La dilucidación de esto
último es el objetivo principal del presente plan de trabajo. Se propone purificar la
ADPGlc PPasa de Bacillus, tanto la enzima de la bacteria salvaje como la
resultante de la expresión de los genes que la codifican en células heterólogas [ya
se dispone de los genes (ej. los de B. stearothemophillus) y de un sistema de
expresión de los mismos]. La enzima purificada de ambas fuentes (la proteína de
células de Bacillus y la recombinante) se caracterizará en sus propiedades
cinéticas, regulatorias y estructurales. Los resultados se compararán respecto a
ambas enzimas purificadas; así como con la ADPGlc PPasa de otras fuentes
bacterianas y vegetales.

MATERIALES Y MÉTODOS

1.     Determinación de la actividad enzimática

La enzima cataliza la reacción:

Glc-1P + ATP <-----> ADP-Glc + PPi

Para la determinación de actividad por los métodos tradicionales, en el sentido de

la síntesis de ADP-glc, se parte de [14C]Glc-1P y se cuantifica la formación de
[14C]ADP-Glc, y para la reacción de pirofosforólisis, se parte de [ 32P]PPi y se
cuantifica la formación de [32P]ATP.

Como método alternativo, para la determinación de la reacción en el sentido de

síntesis hemos desarrollado una técnica colorimétrica, basada en la formación de
un complejo de fosfomolibdato con el colorante verde de Malaquita.

2.     Obtención y purificación de ADPGlcPPasas bacterianas nativas y

recombinantes

Las células fueron cosechadas en diferentes estadíos de acuerdo al objetivo de

estudio y si se trataba de enzimas nativas o recombinantes. La biomasa se
centrifugó, el precipitado fue resuspendido en solución extractante y sometido a
sonicación en frío. Se centrifugó y el sobrenadante se guardó a 80 ºC o fue
sometido a purificación. Las etapas de purificación fueron sucesivamente:
precipitación por tratamiento térmico seguida de centrifugación y cromatografía en
DEAE-Sepharose.

3.     Crecimiento de B. subtilis en diferentes condiciones

Los medios de cultivo utilizados fueron: A) medio de crecimiento vegetativo (LB) y

B) medio de esporulación (Caldo Nutritivo). Los cultivos se realizaron a 37 ºC y
180 RPM.

4.     Determinación del contenido proteico y análisis electroforético.

La concentración de proteínas de evaluó por el método de Lowry utilizando

albúmina bovina como estándar. El análisis electroforético se efectuó en geles de
poliacrilamida.

RESULTADOS

1-    Desarrollo de un ensayo colorimétrico para la medida de la actividad enzimática

Se desarrolló el siguiente microensayo para la cuantificación de la actividad en el sentido

de síntesis de ADPGlc: la enzima se incuba en el medio de reacción que contiene el
amortiguador de pH, sustratos (Glc-1P y ATP) y eventualmente activadores y pirofosfatasa
inorgánica en exceso para hidrolizar específicamente el PPi formado. La reacción se
detiene por calentamiento durante 45 s en baño de agua hirviente y luego se evalúa el Pi
formado por reacción con el reactivo molibdato-verde de Malaquita en medio ácido y
posterior lectura a 650 nm en lector de ELISA.

El ensayo presenta un comportamiento lineal en el rango de 1-10 nmoles de Pi (0,5-5 nmoles de

PPi). La evaluación en paralelo de la actividad en extractos enzimáticos crudos y purificados mostró
una correlación de resultados del 98 % entre ambos métodos.
2-    Expresión y purificación de ADPGlc PPasa recombinante de Escherichia coli

Las bacterias transformadas fueron crecidas en medio LB e inducidas con IPTG. El

extracto se purificó por tratamiento térmico seguido de cromatografía en DEAE-
Sepharose. La actividad específica del extracto luego del tratamiento térmico fue de 0,4
U/mg de proteína y la de la fracción purificada por cromatografía de intercambio iónico fue
de 1,5 U/mg. En la Figura 1 se muestra una imagen del análisis por PAGE-SDS de ambas
fracciones. Se puede observar que la banda correspondiente a 50 kDa es la predominante
en la fraccción purificada por cromatografía.

3-    Crecimiento de B. subtilis en distintos medios

La Figura 2 muestra las curvas de crecimiento de B. subtilis en medios líquidos vegetativo

o de esporulación, determinadas por medida de la DO a 600 nm.

Fig. 1. PAGE-SDS: marcadores de PM (A), extracto con tratamiento térmico (B) y

purificado por cromatografía (C), teñidos con coomasie.

 
Fig. 2. Curva de crecimiento de B. subtilis en medio de esporulación (verde; -^-) y
vegetativo (azul; --).

La actividad enzimática específica evaluada en extractos provenientes del cultivo

en medio de esporulación a distintos tiempos( t1, t2 y t3 indicados en la respectiva
curva de crecimiento), y en medio de crecimiento vegetativo en la fase
estacionaria, arrojó valores semejantes en todos los casos en el rango de 0,7-1,5
pmoles/minxµg de proteína. Estos resultado sugieren que la enzima se expresa en
este microorganismo en sus distintos estadíos.

 
CONCLUSIONES

- Se adquirió entrenamiento en la determinación de actividad de ADPGlc PPasa por los

métodos tradicionales radioactivos.

- Se desarrolló un método de medida de actividad colorimétrico con elevada sensibilidad y

reproducibilidad, con las ventajas de menor riesgo operativo, mayor rapidez y menor
costo.
- Se efectuaron las primeras evaluaciones de actividad de la ADPGlc PPasa en Bacillus,
en diferentes condiciones y tiempos de crecimiento.

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