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Tinción de Gram

Guía de estudio para el


Laboratorio Microbiología

Elaborado por:
Adien A. Lugo Báez MD

Santiago, República Dominicana


2008
Introducción
Esta guía de estudio está ideada para facilitar al estudiante las herramientas teóricas
que permitirán comprender los protocolos prácticos para la sesión de laboratorio que
comprende la Tinción de Gram como componente fundamental para la identificación de
agentes bacterianos.

La importancia del estudio de los agentes patógenos al ser humano comprende un


gran espectro de disciplinas dentro de la medicina de forma tal que se busquen nuevas
alternativas para el abordaje tanto diagnostico (microbiológico) como de manejo
(farmacológico) de estas entidades para reducir al máximo el riesgo de infección y la
morbimortalidad asociada.

Es por eso que surge como componente básico de las ciencias medicas la
microbiología la cual trata de entender la organización, composición y características de los
principales agentes patógenos al ser humano. Dentro del estudio de los microbios, el
abordaje ocurre clasificándolos de acuerdo al reino biológico a que pertenezca. En esta
clasificación encontramos a las bacterias, hongos, protozoarios, anélidos (platihelmitos y
nematelmitos), virus y priones.

Los agentes bacterianos se pueden clasificar por múltiples formas de acuerdo a las
características morfológicas, medios de cultivos y tinciones. Las bacterias son descoloridas y
usualmente invisibles a la luz del microscopio por lo que colorearlas con tinciones ha
permitido visualizarlas.
Membrana Citoplasmática
El citoplasma bacteriano está rodeado por una membrana citoplasmática que se
encuentra inmediatamente por dentro de la capa de peptidoglicanos de la pared celular de las
bacterias Gram + y adyacente al espacio periplasmático en las bacterias Gram -.

La estructura básica de la membrana citoplasmática es una bicapa fosfolipídica(30-


60%) en las que están incluidas varias proteinas (50-70%). La mayoría de las membranas de
las celulas bacterianas contienen fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina y difosfatidilglicerol
(no contiene esteroles).

La membrana celular bacteriana contiene enzimas que actúan en la respiración celular


y en la fosforilación oxidativa, la biosíntesis de peptidoglicanos y en la biosíntesis de la
membrana externa de las bacterias Gram - . También actua en la síntesis y secreción de
enzimas y toxinas bacterianas. La membrana retiene metabolitos y excluye compuestos
externos.

Las proteinas membranales están involucradas en el transporte de electrones y la


fosforilación oxidativa. La biosíntesis de lípidos complejos, síntesis de los constituyentes de
la pared celular y la replicación del DNA. Involucradas en el transporte activo de materiales
hacia el citoplasma denominadas permeasas.

PARED CELULAR BACTERIANA

1) Brinda rigidez estructural : porque está constituida por peptidoglicanas que es un


esqueleto de residuos de carbohidratos formados por unidades alternas de N-
acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos por enlaces β -1,4

Tetrapéptidos cortos (unidos por aminoácidos D y L) se encuentran unidos a los


residuos de ácido N-acetilmurámico por medio de un enlace peptídico al grupo
lactilo de C3. Estos aminoácidos son: ácido glutámico y alanina (bacterias Gram +) y
ácido meso diaminopimélico (bacterias Gram -)

2) Confiere la forma a la célula

3) Crea una barrera física contra el medio ambiente externo

Pared Celular de las bacterias Gram +

1) Grosor de casi 80 nm

2) Constituida por varias capas peptidoglicanos (40-80% del peso seco de algunas paredes
celulares)

3) Dentro de la matriz de peptidoglicanos se encuentran una variedad de proteínas,


polisacáridos y moléculas únicas denominadas ácido teicoicos (son polímeros de unidades de
ribitol -5 carbonos- o glicerol -3 carbonos- unidos por enlaces fosfodiéster.

Los ácidos lipoteicoicos están unidos a la capa externa de la membrana


celular y se extiende dentro de la pared celular

Los ácidos teicoicos estabilizan la pared celular, mantienen la asociación de la


pared con la membrana celular, quelan pequeños iones para el funcionamiento y la
integridad de la pared celular y participan en la interacción celular y la adherencia a
mucosas u otras superficies. Pueden tener función en la síntesis de peptidoglicanos y
en la formación de septos durante el crecimiento y la reproducción.

En algunos microorganismo, los ácidos teicoicos son antígenos y forman la


base del agrupamiento antigénico.

Ejemplo:
*Antígeno grupo D de estreptococo y en los miembro del género
enterococos
*El polisacárido C del Streptococcus pneumoniae es un ácido
lipoteicoico complejo (compuesto por ribitol y fosfatos sustituidos
por N-acetil-D-galactosamina,D-glucosa,N-acetil-2,4diamino-2,4,6
tridesoxihexosa por medio de uniones O-glucosídica o con colina).

Esquema de representación de la
bacteria gram-positiva. Tienen un
gruesa capa de peptidoglicano (PGN),
así como ácidos teicoicos (TA) y ácidos
lipoteicoicos (LTA). Membrana
plasmática (Mb), Porinas (PO)
Pared Celular Bacterias Gram -

1) Más delgada que en las bacterias Gram + pero estructuralmente más compleja.

2) Por fuera de la membrana citoplasmática se encuentra el espacio periplasmático (contiene


enzimas

3) Una capa de peptidoglicanos de una sola unidad de espesor forma el borde externo del
espacio periplásmico. Esta capa es bastante laxa y entrecruzada con un grupo carboxilo
terminal de D-alanina en una cadena de aminoácidos libre del residuo de ácido
diaminopimélico en la cadena adyacente de peptidoglicano.

Fuera de la delgada capa de peptidoglicano se encuentra la membrana externa. Esta


membrana externa tiene una estructura básica que es similar a la de una bicapa fosfolipídica.
La membrana externa está fijada a la capa de péptidoglicano por una lipoproteina pequeña y
fuertemente lipofílica que se une al grupo amino del ácido diaminopimélico enel
peptidoglicano y se extiende del espacio periplasmático como una estructura alfa helicodial.
El otro extremo de esta lipoproteína está incluida en la estructura lipídica de la membrana
externa.

Un componente estructural que es único a la membrana externa de las bacterias


Gram - es el Lipopolisacárido (LPS). Los LPS son los determinantes antigénicos de
superficie más importante (llamados somáticos o antígeno 0) y son responsables de la
actividad de endotóxinas de las bacterias Gram - .

Los LPS son glucolípidos complejos compuestos por una porción lipídoca llamada
lípido A, la región del centro o Core polisacárido y cadenas laterales O-específicas (son
regiones de estructura bioquímica variable confieren una entidad serológica única a las
especies de bacterias Gram -).

¾ Lípido A está incluida en ala hoja externa de la membrane externa, con el


centro polisacárido y las cadenas O-específicas que se proyectan desde la
superficie de la membrana externa como si fueran escobillas o bigotes (Ej.:
Salmonella y Escherichia Coli)

El lípido A está constituido por disacáridos de glucosamina en el cual los


grupos hidrofilos están esterificados con ácidos grasos. La sustituciones
adicionales de ácidos grasos difieren entre los géneros de bacterias Gram -.
Este lípido parece ser el principal componente responsable de las
manifestaciones de la actividad de endotoxinas en pacientes con sepsis por
bacterias Gram -.

¾ El Centro polisacárido contiene 2 carbohidratos unicos (KDO y Heptosa).


Esta estructura es bastante conservada dentro de un género dado, pero puede
variar de una especie a otra.

¾ Las cadenas laterales de O-específicas estan unidas al core polisacárido y son


responsables de la especificidad antigénica de los aislados individuales.

La membrana externa de las bacterias Gram – contienen fosfolípidos


(fosfatidiletanolamina y fosfatidilglicerol) y proteinas presentes en alta concentración
llamadas proteinas mayores o principales de membrana. Estas proteinas pueden incluirse en
3 grupos fundamentales:
¾ Las porinas: proteinas que forman canales de transmembrana por el cual
las sustancias de bajo peso molecular son introducidas al espacio
periplasmático
¾ Las no porinas son proteinas de transmembrana que están asociadas con
la capa de peptidoglicanos de la pared celular, actúan en la producción y
secreción de exoenzimas, unen a superficies o agentes antimicrobianos a
las celulas blanco.
¾ Las lipoproteinas son las mas pequeñas de las proteinas membranal
externa y estabilizan la pared celular por uniones covalentes con el
peptidoglicano.

Esquema de representación de la
bacteria gram-negativa. Capa bien
delgada de peptidoglicano (PGN), así
como una membrane externa (OM),
constituida por lipopolisacáridos
(LPS), cápsula (Caps), lipoproteinas
(Lprot), membrana plasmática (Mb),
porinas (PO).
TINCIÓN DE GRAM

1. Introducción
Es un método empírico desarrollado en 1884 por el físico danés Hans
Christian Gram para diferenciar las especies de bacterias pneumococos y klebsiella
pneumoniae. Pero a la vez clasifica estos microbios en dos grandes grupos basado en las
propiedades físicas y químicas de la pared celular.

La coloración de Gram, descubierta hace más de 100 años, se usa principalmente


para el examen microscópica directo de muestras y subcultivos. Es una tinción diferencial
que se emplea para demostrar las propiedades de membrana de todo tipo de bacteria. La
tinción de Gram es una técnica muy útil para la diferenciación de las bacterias Gram
positivas y las Gram negativas, como primer paso para determinar la identidad de una
muestra bacteriana particular. Además permite al clínico clasificar las bacterias según su
morfología.
No es una herramienta infalible para el diagnóstico, identificación o filogénesis,
siendo sustituido por técnicas moleculares, debido a la variabilidad de algunas bacterias
(pueden teñirse de violeta o rojo; o no ser susceptibles a la tinción de Gram). Puede ser
realizada en fluidos corporales o biopsias cuando se sospecha de infección e incluso a
medios de cultivos bacterianos.

Las bacterias Gram + retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen


de color azul intenso. Las bacterias Gram- no son capaces de retener el cristal violeta
después de la decoloración, y son teñidas de rojo con el colorante de cntraste safranina. Las
características de la coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes, viejos,
muertos o degenerados.
El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, y se une a la
pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de yodo, que sirve
como mordiente para la unión del colorante. En medio acuoso el cristal violeta (CV) se
disocia en CV+ e iones de Cl-. Estos iones penetran a través de la pared celular y la
membrana citoplasmática a las bacterias tanto Gram + como -. El ión CV+ interactúa
negativamente con las cargas de los componentes de la célula bacteriana tiñéndolas de color
violeta. Luego el ión yodo (I- o I3- ) añadido en el segundo paso se une al ión CV+ formando
un complejo grande y queda atrapado por las capas celulares

Algunas especies de bacterias, debido a la naturaleza química de sus paredes


celulares, tienen la capacidad de retener el cristal violeta incluso luego del tratamiento con un
decolorante orgánico, como por ejemplo una mezcla en partes iguales de alcohol etílico al
95% y acetona. Las bacterias que retienen el colorante se ven negroazuladas cuando se
observan al microscopio, y se denominan entonces gram positivas (+).
Algunas bacterias pierden la coloración primaria con cristal violeta cuando son
tratadas con el decolorante, presumiblemente debido al alto contenido de lípidos de su pared
celular Cuando la solución alcohol-acetona se aplica este diluye parcialmente la capa de
lípidos de las Gram negativas, permitiendo que el complejo sea removido. Este paso de
descolocación es critico y su tiempo debe ser medido correctamente; es solo cuestión de
segundos para que tanto las Gram + y – se descoloren. Estas bacterias decoloradas toman el
colorante de contraste, la safranina, y se ven rojas cuando se observan al microscopio,
denominadas gram negativas (-).

La coloración de Gram también pueden ser utilizadas para identificar formas no


bacterianas, como las tricomonas, las larvas estrongiloides, los quistes de Pneumocysti carinii
y los trofozoítos de Toxoplasma gondii, si bien no es tan sensitiva como otras tinciones
específicas utilizadas para la vizualización de estos parásatos.

Morfología bacteriana
Según su forma se clasifican en:
*Cocos: esféricos
*Bacilos: bastones (algunos bacilos pequeños se denom cocobacilos)
*Espirales: coma, forma S o espiral
*Pleomórficas: adoptando diferentes formas (aspecto gelatinoso)
Existen 6 grupos de bacterias Gram positivas que causan enfermedades en el humano, 2 de
ellas son cocos y las 4 restantes son bacilos.

En el grupo de los cocos están:


* Estreptococos → cocos agrupados en forma de cadenas.
* Estafilococos → cocos agrupados en forma de racimos.
En el grupo de los bacilos 2 producen esporas:
* Bacillus
* Clostridium
y 2 no producen esporas:
* Corynebacterium
* Listeria (única Gram + formadora de endotóxinas)

En las bacterias Gram negativas existen:

Un grupo de cocos:
* Neisseria (eventualmente se agrupan en 2 → diplococos)

Un grupo de espirales:
* Espiroquetas (Treponemas, Borrelias y Leptospiras)

El gran grupo de los bacilos en su mayoría son entéricos:


* Eschericha coli * Proteus * Campylobacter
* Shigella * Enterobacter * Helicobacter
* Salmonella * Serratia * Pseudomonas
* Yersinia * Vibrio * Bacteroides
* Haemophilus * Bordetella * Brucella
* Legionella * Pasteurella * Gardnerella
* Francisella

Excepciones de bacterias a la tinción de Gram

* Micobacteria: bacteria débilmente Gram positiva. La mejor tinción para este grupo
especial es la tinción ácido-alcohol resistente.

* Espiroquetas: son Gram negativas por poseer pared celular fina,; pero son tan
pequeñas que no se pueden ver a la luz del microscopio, por lo que se visualizan mejor en
microscopía de campo oscuro.

* Micoplasma: grupo de bacterias con ausencia de pared celular, solo poseen su


membrana citoplasmática. No pueden ser Gram + o -.

*Clamidias y Ricketsias: bacterias pleomórficas intracelulares


2. Objetivos
2.1 Teóricos:
2.1.1 Estudiar la clasificación general de las bacterias.
2.1.2 Estudiar los principales medios de cultivo bacteriano.
2.1.3 Analizar las características de la membrana bacteriana.

2.2 Prácticos
2.2.1 Analizar los procesos de tinción bacteriana.
2.2.2 Realizar el proceso de tinción de Gram.
2.2.3 Interpretar los resultados de la tinción de Gram.

3. Materiales
3.1 Biológico:
a) Cultivos bacterianos

3.2 Equipos
a) Portaobjetos
b) Agua destilada estéril
c) Guantes
d) Asa bacteriológica estéril
e) Lámpara de alcohol
f) Rejilla de tinción
g) Microscopios
h) Aceite de inmersión para microscopio
i) Fósforos
j) Lentes de laboratorio

3.3 Reactivos
a) Set de tinción de Gram

4. Procedimiento
4.1 Procesamiento de la muestra

Se toma cuidadosamente el plato de cultivo bacteriano con las manos cubiertas con
guantes como forma de evitar contacto directo con el germen y utilizando lentes de
laboratorio. Se procede a abrir el cultivo cerca de la lámpara de alcohol.

Con el asa bacteriológica esterilizada (por flameo) hasta tomar color incandescente,
se dejándose enfriar posteriormente. Luego se toma una pequeña muestra del cultivo, de
aproximadamente 10 4 - 10 5 microorganismos/cc (cantidad necesaria para que sea visible),
depositándose sobre una gota de agua esterilizada en un portaobjeto limpio y rotulado donde
se distribuirá homogéneamente hasta realizar el frotis (2 cm diámetro aproximadamente).
Recuerde no dispersarlo mucho o dejarlo compacto para evitar artefactos o superposición de
bacterias.
Inmediatamente de distribuir el contenido con el asa bacteriológica la misma se
deberá esterilizar nuevamente por flameo, previo a su empaquetamiento y almacenaje.

Para fijar la muestra a la plaquita o portaobjeto se procederá al flameo, que consiste


en pasar el portaobjeto a unos 2 cm de distancia de la flama de la lámpara de alcohol
encendido de manera ondulante hasta que el contenido líquido esté casi seco, luego se dejará
secar con a temperatura ambiente y finalmente como factor de seguridad para la fijación se
volverá a pasar por el mechero por tres ocasiones sin dejar quemar el contenido en ningún
momento.

4.2 Tinción Gram

Se toma el portaobjeto fijado con


el frotis y se cubrirá completamente con
cristal (o genciana) violeta por 1 minuto,
luego se eliminará el CV no absorbido con
una suave corriente de agua, por 5
segundos máximo.

Con la plaquita escurrida se


aplicara solución de lugol sobre la muestra
fijada por 1 minuto y se lavará con una
suave corriente de agua, por 5 segundos
máximo.

En seguida se cubrirá el frotis con


solución alcohol-acetona por 10 segundos
y nuevamente se lava con una suave
corriente de agua, por 5 segundos máximo.
Este paso es el punto más crítico y
afectado por las variaciones en la técnica
aplicada alterando los resultados
posteriores.

Por último a la muestra en el


portaobjeto se añade el colorante safranina
por 1 minuto, lavándose con una suave
corriente de agua, por 5 segundos máximo.

4.3 Observación al microscopio

La plaquita teñida se dejará secar a temperatura ambiente para luego observarla al


microscopio. Examinar el extendido bajo un objeto de inmersión x100 (aceite). Las bacterias
grampositivas se tiñen de azul oscuro; las gram negativas aparecen rosa pálido.