ESCUELA MILITAR DE INGENIERÍA

TOXICOLOGIA AMBIENTAL – Lic. Lorena Rey Ortiz

ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE

ALFALFA (Medicago sativa L.)

Resumen

Este trabajo lo realizamos con el fin de adquirir conocimientos necesarios para

prácticas futuras y tener la capacidad de determinar la concentración de toxicidad en
las plantas, en este caso las semillas de Alfalfa de acuerdo con su morfología, dado al
tamaño de su Hipocotílo y la radícula, la coloración de su tallo y sus hojas, teniendo en
cuenta algunas variables (tiempo, mortalidad, la concentración del reactivo) que son
esenciales para el crecimiento de las semillas de Alfalfa.

I. Introducción.

El ensayo de toxicidad con semillas de Alfalfa es una prueba de la toxicidad aguda. En

el cual se evalúaran los efectos de crecimiento de las plantas de Alfalfa de acuerdo
con la concentración de toxicidad que se expongan las plántulas. Los ensayos de
toxicidad basados en la germinación de semillas y la elongación radical pueden
realizarse con diversas especies que incluyen plantas de importancia económica, que
son de fácil acceso y que, además, germinan y crecen rápidamente. [CITATION Fle85 \l
16394 ]

El bioensayo de toxicidad con semillas de Alfalfa (Medicago sativa L.) es una prueba

estática de toxicidad aguda (120 h de exposición), para evaluar los efectos fitotóxicos
de compuestos puros o de mezclas complejas de éstos, en el proceso de germinación
de semillas y en el desarrollo de plántulas durante los primeros días de crecimiento.
[ CITATION Bag11 \l 16394 ]

Es importante destacar que, durante el período de germinación y los primeros días de

desarrollo de la plántula, ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la
presencia de una sustancia tóxica puede interferir en la supervivencia y el desarrollo
normal de la planta. Por esta razón, la germinación es una etapa de gran sensibilidad
frente a factores externos adversos[ CITATION Raú08 \l 16394 ]

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Así, la inhibición en la elongación de la radícula y el epicotilo constituyen indicadores

subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en la germinación de
semillas Alfalfa.[ CITATION Raú08 \l 16394 ]

II. Antecedentes

La toxicidad o capacidad de una sustancia de generar un efecto nocivo en un organismo

vivo, estará condicionada a sus características fisicoquímicas, así como a la
concentración y frecuencia y tiempo de exposición (Exposición aguda y crónica). Los
efectos adversos en un individuo pueden ser tanto de inhibición como de magnificación,
generando desde la muerte del individuo (efecto letal) o produciendo una gran
diversidad de respuestas a distintos niveles de la organización biológica (efectos sub-
letales), que van desde alteraciones bioquímicas y celulares, incluyendo genotoxicidad y
disrupciones endócrinas, alteraciones a nivel morfológico y fisiológico, efectos en el
crecimiento y desarrollo, además de alteraciones en parámetros poblacionales.
[ CITATION Chr09 \l 16394 ]

La ecotoxicología aplicada tiene como objetivo el desarrollo de protocolos de ensayos

biológicos estandarizados (bioensayos de toxicidad) que puedan ser utilizados como
herramientas de diagnóstico y predicción temprana que permitan definir umbrales
permisibles, con niveles de incertidumbre aceptables, y sirvan de guía a las entidades
reguladores para la toma de decisiones, además de su aplicación en la evaluación de
riesgo ecológico de los efectos adversos de las actividades antrópicas en ambientes
naturales.[ CITATION Arm03 \l 16394 ]

En cada bioensayo de toxicidad se cuantifica uno o varios de estos efectos nocivos,

denominándose a cada uno de estos parámetros seleccionados como punto final de
evaluación de la toxicidad. Las substancias tóxicas pueden afectar el desarrollo normal
de las plantas, principalmente en sus etapas tempranas (germinación y desarrollo de las
raíces). Al observar y medir la longitud de raíces jóvenes, y comparar estas longitudes

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con un control normal, podemos determinar la posible presencia de productos químicos

tóxicos en el medio ambiente. [ CITATION Dan01 \l 16394 ]

III. Objetivos
 Observar analíticamente cual es el comportamiento de la germinación y
crecimiento de las plantas de Alfalfa, expuestas a distintos ambientes de
toxicidad. Incluyendo que algunos de estos microambientes tendrán los
diferentes elementos químicos que compone (ola aromatic cedron –
Desinfectante), identificando cual es el comportamiento de la planta germinada.
 Determinar la toxicidad de las muestras de germinación de semillas de
Alfalfa.
IV. Marco Teórico

Bioensayos

Son herramientas de diagnóstico adecuadas para determinar el efecto de agentes

físicos y químicos sobre organismos de prueba bajo condiciones experimentales
específicas y controladas. Se utilizan organismos vivos como un agente de prueba
para la presencia o concentración de un compuesto químico o un efecto ambiental.
[ CITATION Edu01 \l 16394 ]

La toxicidad de una sustancia depende:

 Concentración.
 Tiempo de exposición.
 Cantidad de especia que abarca.

Sus Efectos:

Inhibición, Magnificación, Evaluados por la reacción de los organismos, Muerte,

Crecimiento, Proliferación, Multiplicación, Cambios morfológicos, Fisiológicos o
históricos.

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Unos efectos nocivos evaluados por medio de ensayos biológicos normalizados

pueden indicar niveles de peligrosidad trasladables y asimilables a organismos que
forman parte de los sistemas naturales y la biocenosis.

La exposición a plaguicidas puede afectar la salud de diversas formas. Por razones de

tipo ético, el estudio de los efectos en los seres humanos se lleva a cabo con modelos
experimentales y la evidencia que hay en la población humana es limitada. Por esta
razón los datos toxicológicos que aquí se presentan de no especificarse lo contrario,
son experimentales.[ CITATION Edu01 \l 16394 ]

La Toxicidad

La toxicidad es la capacidad inherente de una sustancia química de producir efectos

adversos en los organismos vivos. Efectos de deterioro de tipo funcional, lesiones
patológicas que afectan el funcionamiento del organismo y reducen su capacidad de
respuesta a factores de riesgo o estrés. De acuerdo con el tiempo de exposición para
que se llegue a manifestar el efecto tóxico o de la duración del mismo, éstos se dividen
en dos grupos: agudos y crónicos. [ CITATION Ram99 \l 16394 ]

Clases de Intoxicaciones

La acción de un agente tóxico sobre un organismo se traduce en una alteración del

estado fisiológico o de salud. Según el grado de alteración del individuo, la intoxicación
se puede calificar como aguda, crónica o recidivante.

 Aguda: La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis
única y muy elevada de una sustancia. Así mismo consiste en la aparición de un
cuadro clínico patológico, a veces dramático, por la adsorción de una o varias
dosis o exposiciones a un agente durante un período de exposición inferior a 24
horas. En algunos casos como lo que ocurre con el fósforo, los efectos podrían
aparecer a la semana de su ingestión o exposición.
 Subaguda: significa un menor grado de aparatosidad de la intoxicación,
produciendo algunos trastornos a nivel biológico, pero sin manifestarse de

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forma aparente y clara. Generalmente como consecuencia de un tiempo de

exposición no demasiado grande al agente.

 Crónica: se produce como consecuencia de la repetida absorción de un tóxico,

siendo el tiempo de exposición especialmente alto (>90 días). A veces esta
intoxicación se produce por la absorción de cantidades pequeñas de agente
tóxico, pero, ante las sucesivas exposiciones, se produce acumulación en algún
órgano o tejido. No suele manifestarse (estado subclínico) hasta que llega el
momento en que, por un estado fisiológico más bajo o un posible movimiento
del agente tóxico, se manifiesta a largo plazo. Generalmente, esto suele ocurrir
en nuestros días con el uso de plaguicidas, ciertos compuestos químicos y por
efecto de la Contaminación Ambiental.
 Recidivante: conducen al individuo a un estado de carencia biológica cada vez
mayor que va mermando su capacidad de recuperación de manera que su
restitución es cada vez más deficiente.[ CITATION Ram99 \l 16394 ]

Efecto tóxico

El efecto tóxico producido por uno o varios agentes tóxicos sobre un organismo,
población o comunidad que se manifiesta por cambios biológicos. Su grado se evalúa
por una escala de intensidad o severidad y su magnitud está relacionada con la dosis
(cantidad de sustancia administrada, expresada generalmente por unidad de peso
corporal) o la concentración (sustancia aplicada en el medio) del agente tóxico.
[ CITATION Bag11 \l 16394 ]

El efecto puede ser:

 Cuantal: consistente en la presencia o ausencia de una característica (p. ej.

muerte o existencia de tumores).
 Letal: la muerte por acción directa como consecuencia de la exposición a una
determinada concentración de un agente tóxico.

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 Subletal: se produce por debajo del nivel que causa la muerte como resultado
directo de la exposición a una determinada concentración de un agente tóxico.
 Agudo: aquel causado por acción de sustancias químicas sobre organismos
vivos, que se manifiesta rápida y severamente (después de un corto período de
exposición: 0 - 96 h, típicamente.).
 Crónico: aquel que se produce, en general, después de un prolongado período
de exposición (normalmente se manifiesta después de días o años, según la
especie).
 Aditivo: la magnitud del efecto o respuesta simultánea de dos o más sustancias
es igual a la suma de los efectos o respuestas de cada una.
 Combinado: cuando dos o más sustancias aplicadas almismo tiempo producen
distintos efectos o tienen diferentes modos de acción.
 De potenciación o sinergismo: cuando la toxicidad de una mezcla de agentes
químicos es mayor a la esperada por la simple suma de las toxicidades de los
agentes individuales presentes en la mezcla.
 De inhibición o antagonismo: cuando la toxicidad de una mezcla de agentes
químicos es menor a la esperada por la simple suma de las toxicidades de los
agentes individuales presentes en la mezcla.[ CITATION Bag11 \l 16394 ]

Eco-toxicología

La eco toxicología estudia el destino y los efectos de los contaminantes en los

ecosistemas, intentando explicar las causas y prever los riesgos probables. La eco
toxicología prospectiva evalúa la toxicidad de las sustancias antes de su producción y
uso. La eco toxicología retrospectiva se ocupa de confirmar si la sustancia produce
daños en el ecosistema.

El efecto causado por un tóxico dependerá de su toxicidad inherente (capacidad de

causar algún efecto nocivo sobre un organismo vivo), del grado de exposición, que a
su vez dependerá de la cantidad que ingrese, de cuánto pase a los distintos
compartimientos del ecosistema y de su persistencia. [ CITATION Vil09 \l 16394 ]

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El principio de la eco toxicología es que los organismos vivos son herramientas

esenciales para la evaluación de la calidad ambiental, puesto que ellos son los que
están expuestos a los efectos combinados de la ecotoxicidad. El uso de los métodos
de

evaluación biológica para detectar compuestos potencialmente dañinos comenzó a

desarrollarse en los años ’70.[ CITATION Vil09 \l 16394 ]

En general, se testean las sustancias tóxicas para determinar qué tan perjudiciales son
y qué riesgo poseen para el ambiente. Los resultados de los ensayos se interpretan
para definir efectos letales, subletales y crónicos de tales sustancias, y su tendencia a
acumularse en tejidos vivos. El aumento de la resistencia a sustancias tóxicas por
parte de los organismos (por adaptación evolutiva, fisiológica o cambios en el
comportamiento) es uno de los factores que puede incidir en la dificultad para
extrapolar al ambiente los resultados obtenidos en ensayos de laboratorio. [ CITATION
Pui03 \l 16394 ]

Por otra parte, se estudian una variedad de propiedades ecológicas estructurales y

funcionales (bioindicadores) a distintos niveles de organización para caracterizar la
respuesta a la contaminación química. La complejidad de los sistemas biológicos y su
habilidad para compensar perturbaciones complica la interpretación de muchas
técnicas basadas en efectos biológicos. [ CITATION Vil09 \l 16394 ]

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V. Marco Practico

Metodología

Durante el ensayo de la toxicidad de las semillas de Alfalfa (Medicago sativa L), el

procedimiento experimental utilizado para la determinación de los efectos de (ola
aromatic - desinfectante) en las plantas de Alfalfa, primeramente, con poner a germinar
las semillas de alfalfa 3 réplicas con 15 semillas cada una, durante una semana. (120
h)

Materiales y Equipo

 Semillas de Alfalfa de la especie (Medicago sativa L.)

 Cajas Petri
 Pipetas volumétricas
 Matraces aforados de 50ml
 Pinzas
 Toallas de papel absorbente
 Regla

 Las semillas de Alfalfa deben ser semillas sin ningún tratamiento (sin fungicidas o
plaguicidas), con buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de
la radícula e hipocotilo.
 El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las
siguientes características: trama amplia y porosa que asegure una buena
capacidad de retención de líquido, resistencia de la fibra del papel para que las
radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la

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remoción de las plántulas sin dañarlas, la ausencia de residuos tóxicos (por

ejemplo, blanqueadores y que no promueva el desarrollo de hongos (no
asociados a las semillas).
 Las concentraciones que se utilizó fueron de 0,01, 0,05, 0,1 y 0,5 del
desinfectante (ola aromatic)

Procedimiento.

a) Colocar en 18 cajas Petri el papel absorbente, el cual debe estar muy

bien diseñado a la caja Petri.
b) Remojar el papel absorbente para que las semillas puedan adherirse bien.
c) A continuación, escogemos las semillas de Alfalfa para ponerlos en la caja
Petri y muy bien acomodadas dejando un espacio entre ellas, esto ara su
mejor desarrollo.
d) De esta manera quedan las semillas de Alfalfa sembradas en las cajas Petri
con papel absorbente, dependiendo de las sustancias.

VI. Resultados

Dia Agua agua ola aromatic cedrón (Desinfectante)

potable destilada
5 ml 10 ml 15 ml 25 ml
1 G= 0 G= 0 G= 0 G= 0 G= 0 G= 0
E= 1 E= 1 E= 2 E= 3 E= 3 E= 1
R= - R= - R= - R= - R= - R= -
h= h= - h= - h= - h= - h= -
p= - p= - p= - p= - p= - p= -
2 G= 14 G= 12 G= 3 G= 9 G= 7 G= 4
E= 1 E= 2 E= 1 E= 5 E= 7 E= 2
R= 14 R= 12 R= 2 R= 3 R= 3 R= 9
h= 6 h= - h= - h= - h= - h= -
p= p= 5 p= 5 p= 7 p= 0 p= 0

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3 G= 11 G= 10 G= 14 G= 10 G= 7 G= 6
E= 2 E= 4 E= 0 E= 3 E= 3 E= 7
R= - R= 11 R= 4 R= 1 R= 2 R= 2
h= 5 h= 3 h= 2 h= 1 h= 2 h= 1
p= 5 p= 4 p= 3 p= 5 p= 5 p= 4
4 G= 13 G= 14 G= 12 G= 12 G= 11 G= 10
E= 2 E= 1 E= 1 E= 1 E= 1 E= 4
R= - R= - R= 2 R= 1 R= 4 R= 2
r= 2,5 r= 3,5 r= 0,3 r= 0,3 r= 0,2 r= 0,1
h= 3 h= 3 h= 2 h= 7 h= 1 h= 2

p= 10 p= 14 p= 0 p= 0 p= 0 p= 0
5 G= 13 G= 14 G= 13 G= 12 G= 13 G= 5
E= 0 E= 0 E= 0 E= 0 E= 0 E= 0
R= 6 R= 1 R= 2 R= 3 R= 2 R= 9
r= 3,5 r= 4 r= 0,35 r= 0,25 r= 0,4 r= 0,4
h= 4 h= 3 h= 5 h= 4 h= 2 h= 3
p= 5 p= 2 p= 1 p= 0 p= 0 p= 0

Análisis de los Resultados

De acuerdo con los resultados obtenidos experimentalmente se analiza que la planta

de control negativo tiene mayor crecimiento y germinación, mientras que las de la
concentración alta tiene un porcentaje de menor crecimiento. Se compara que las
diferencias en la producción de la germinación de las plantas de Alfalfa y el
crecimiento de estas, fue que, a mayor concentración del desinfectante, cuando sus
microambientes estén expuestos estos se inhiben en su totalidad, su crecimiento se
detiene.

Se dedujo que las variables óptimas para el crecimiento en las plantas de alfalfa eran
tener suficiente agua en condiciones normales, temperatura, no tener ninguna
concentración del reactivo.

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Índice de germinación

El índice de germinación representa el producto de la germinación relativa de las

semillas por el crecimiento relativo de la radícula. Constituye un indicador de la
interacción de los factores que promueven o inhiben la germinación, así como de los
respectivos factores que favorecen o impiden el crecimiento de la radícula.
[ CITATION Vil05 \l 16394 ]

Este índice expresa tanto el porcentaje de semillas germinadas como el porcentaje de

crecimiento que alcanza la radícula durante el bioensayo. Los resultados obtenidos
muestran que en el primer grupo presentó el índice de germinación más bajo (47.95),
mientras que los demás grupos obtuvieron valores altos a 70. Al considerar este
promedio de los valores en el tercer grupo representa aproximadamente el 50 % de
dicho promedio.

Porcentaje de germinación relativa de semillas.

Representa el porcentaje de semillas germinadas en el agua. En su mayoría tanto del

agua destilada como del agua potable fueron de porcentajes altos. Lo cual quiere decir
que su germinación y la inhibición fue de manera positiva, ya que este disolvente no
contiene concentraciones químicas.

Crecimiento relativo de la radícula.

Representa el porcentaje de crecimiento de la radícula de las semillas expuestas al

componente (desinfectante). Debido a los resultados obtenidos tenemos un

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crecimiento significativo, lo cual quiere decir que no es toxico debido a las cantidades
utilizadas en este ensayo.

VII. Conclusiones y Recomendaciones.

Se concluye de acuerdo con los resultados que:

El comportamiento de la germinación y crecimiento de las plantas de alfalfa,

que fueron expuestas a distintas concentraciones fue que detuvieron su
crecimiento, en algunas concentraciones, identificando que la concentración
que más afectaba a las plantas era la 0,05.

La sensibilidad determinada para la semilla de alfalfa con la exposición del agente tóxico
(desinfectante ola aromatic), la sensibilidad identificada durante este ciclo de ensayo se
encuentra dentro de los rangos establecidos por otros investigadores con este tipo de
bioindicadores; las diferencias con los valores obtenidos y los teóricos se pueden asumir
por el manejo de los químicos en las pruebas realizadas.

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Se estableció por medio de las pruebas a partir de la sustancia pura que la

concentración de inhibición media (CE50) para este tipo de agente tóxico es 50 ml.
Dicha concentración no se encuentra en los límites de las normas con las que se rige el
uso y aprovechamiento del recurso agua como es el decreto 1594 de 1984, indicando la
normatividad para la protección y supervivencia de la flora y fauna. [ CITATION Riz06 \l
16394 ]

Se concluye que en todos los ensayos de toxicidad desarrollados durante la

investigación se desarrolló una relación directamente proporcional frente a los niveles de
concentración de los contaminantes y el porcentaje de germinación el cual se afectaba
con los cambios de concentraciones a niveles más altos se bajaban los niveles de
germinación de las semillas.

Anexos

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VIII. Bibliografía

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