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FICHA DE IDENTIFICACIÓN DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

Título ELISA RECOMBINANTE


Nombres y Apellidos Código de estudiante
Autor/es
Ramos Titirico Nelva 40987
Fecha 24/Mayo/2019

Carrera Bioquímica y Farmacia


Asignatura Micología y Virología
Grupo A-1
Docente Dr. José Antonio Santalla Vargas
Periodo I/2019
Académico
Subsede La Paz
Copyright © (2019) por (RAMOS). Todos los derechos reservados.
Título: ELISA RECOMBINANTE
Autor/es: Ramos

RESUMEN:

Durante los últimos años el avance tecnológico ha permitido desarrollar técnicas que ayudan
al diagnóstico de múltiples enfermedades. En el caso de las enfermedades autoinmunes, las
técnicas inmunológicas son de gran ayuda ya que permiten la detección de varios auto anticuerpos
simultáneamente a partir de volúmenes de muestra pequeños. Aunado al desarrollo de las nuevas
técnicas, la sensibilidad y especificidad en la detección de las especificidades de los anticuerpos
también han ido en aumento, de tal manera que el clínico puede contar con pruebas que le
permiten hacer los diagnósticos tempranos con mayor certeza y hacer también el seguimiento del
curso de la enfermedad en función de la variación de los anticuerpos presentes en las muestras
de los pacientes.
La técnica ELISA es un inmunoensayo y es una de las técnicas más utilizadas para identificar
o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con
enfermedades autoinmunes. Además, por su fácil estandarización, manejo y variedad de antígenos
disponibles.

Palabras clave: Técnica ELISA, Inmunoensayo

ABSTRACT:

During the last years the technological advance has allowed to develop techniques that help the
diagnosis of multiple diseases. In the case of autoimmune diseases, immunological techniques are
of great help since they allow the detection of several autoantibodies simultaneously from small
sample volumes. In addition to the development of new techniques, the sensitivity and specificity
in the detection of the specificities of antibodies have also been increasing, so that the clinician
can count on tests that allow him to make early diagnoses with greater certainty and also to do the
monitoring of the course of the disease based on the variation of the antibodies present in the
samples of the patients.

The ELISA technique is an immunoassay and is one of the most used techniques to identify or
confirm the specificity of the antibodies present in the samples of patients with autoimmune
diseases. In addition, for its easy standardization, management and variety of available antigens.

Key words: ELISA technique, Immunoassay

Asignatura: Micología y Virología


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Título: ELISA RECOMBINANTE
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Tabla De Contenidos

Lista De Tablas .......................................................................................................................... 4


Lista De Figuras ......................................................................................................................... 5
Introducción ............................................................................................................................... 6
Capítulo 1. Planteamiento del Problema .................................................................................... 7
1.1 Formulación del Problema ............................................................................................... 7
1.2 Objetivos .......................................................................................................................... 7
1.2.1 Objetivo general ............................................................................................................ 7
1.2.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 7
1.3 Justificación...................................................................................................................... 7
1.4 Planteamiento de hipótesis ............................................................................................... 7
Capítulo 2. Marco Teórico ......................................................................................................... 8
2.1 Área de estudio/campo de investigación ...................................................................... 8
2.2 Desarrollo del marco teórico ........................................................................................ 8
2.2.1 Prueba de ELISA .......................................................................................................... 8
2.2.2 Historia ......................................................................................................................... 9
2.2.3 Tipos de ELISA............................................................................................................. 9
2.2.4 Fundamento del método ELISA recombinante ........................................................... 11
2.2.4.1 Fases de un ensayo ELISA ....................................................................................... 11
2.2.5 Materiales y procedimiento ......................................................................................... 13
2.2.6 Interpretación de resultados ........................................................................................ 15
2.2.7 Utilidades de la prueba ................................................................................................ 15
2.2.8 Ventajas y desventajas de la prueba ............................................................................ 16
Capítulo 3. Método................................................................................................................... 17
3.1 Tipo de Investigación ................................................................................................. 17
3.2 Técnicas de Investigación ........................................................................................... 17
3.3 Cronograma de actividades por realizar ..................................................................... 17
Capítulo 5. Conclusiones ......................................................................................................... 18
Referencias ............................................................................................................................... 19
Apéndice .................................................................................................................................. 20

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Lista De Tablas

Tabla 1. Procedimiento del ensayo Elisa ................................................................................. 14


Tabla 2. Cronograma de actividades durante la investigación ................................................. 17

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Lista De Figuras

Figura 1. Combinación Antígeno-Anticuerpo............................................................................ 8


Figura 2. Fases de un ensayo ELISA ....................................................................................... 13
Figura 3. Combinación Antígeno-Anticuerpo.......................................................................... 20
Figura 4. Procedimiento de la técnica ELISA .......................................................................... 20
Figura 5. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo
unido al antígeno ...................................................................................................................... 21

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Introducción

Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como
reactivos enlazantes específicos. Tienen aplicación universal para la determinación o
cuantificación de fármacos terapéuticos y no terapéuticos, diversas sustancias biológicas,
sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped en el suero, en la orina, en el líquido
cefalorraquídeo en saliva y en cualquier liquido biológico donde se encuentre la sustancia a
investigar.
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una
enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Existen
diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso
molecular (>30 000 daltons), el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga
con un ligando, que puede ser un antígeno, un anticuerpos específico para el antígeno de interés o
un anticuerpo para el anticuerpo primario.
Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales se adsorbe un antígeno
o un anticuerpo sobre un soporte sólido. Algunos de los protocolos se basan en reacciones de
enlace competitivo y otras en reacciones de enlace no competitivo, pero en todas las pruebas
ELISA se requiere de un paso de separación para eliminar el conjugado enzimático libre antes de
proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimático enlazado. Para lo cual se añade sustrato
enzimático y se mide la reacción catalítica entre la enzima y el sustrato.
Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles. Una
sola proteína enzimática puede transformar en algunos minutos gran número de moléculas de
sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color
amplificado y que se detecta con facilidad.
En el método ELISA de inhibición el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimática
se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático

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Capítulo 1. Planteamiento del Problema

1.1 Formulación del Problema

¿Cuál es el principio inmunológico en virología de la prueba de ELISA para el diagnóstico


de enfermedades?

1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivo general

Comprender el principio inmunológico de la prueba de Elisa sus aplicaciones en virología y


limitaciones en el diagnóstico clínico de laboratorio

1.2.2 Objetivos específicos

 Conocer el fundamento de la prueba de Elisa


 Comparar los usos clínicos diagnósticos de los tipos de prueba Elisa en virología
 Clasificar las ventajas y desventajas de esta técnica en el área de virología
1.3 Justificación

ELISA son las siglas por las que se conoce al ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas,es
una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos
presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes.
Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios científicos en campos como la biología,
la bioquímica y la medicina. En el hospital se utiliza principalmente para identificar gérmenes
agresores que se encuentran en la sangre, orina, esputos, etc. La técnica pronto se generalizó con
el empleo de equipos simples y muy baratos que se utilizan todavía hoy en muchos centros
diagnósticos de todo el mundo.

1.4 Planteamiento de hipótesis

El ELISA es un inmunoensayo ampliamente utilizado tanto en investigación básica como con


fines diagnósticos. Sus aplicaciones van desde la detección de contaminantes en alimentos o
procesos industriales a la detección y validación de biomarcadores, cuantificación de analitos o
titulación de anticuerpos.

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Capítulo 2. Marco Teórico

2.1 Área de estudio/campo de investigación

Investigación en el área de Virología

2.2 Desarrollo del marco teórico

2.2.1 Prueba de ELISA

La prueba ELISA es un procedimiento de ensayo inmunoezimatico basado en la detección


antígeno o anticuerpo, inmovilizado sobre una fase solida mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reacción, la prueba recurre al empleo de inmunogenos, haptenos o
anticuerpos marcados con una enzima cuyo productos colorido, puede ser medido
espectrofotométricamente. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como
sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-
anticuerpo. (Figura 1)

Figura 1. Detección de Antígeno-Anticuerpo

Se denomina también Inmunoanalisis enzimático (IAE) o simplemente Inmunoanalisis (IA).


El acrónimo ELISA representa:

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2.2.2 Historia

El radioinmunoensayo desarrollada en 1959 por Yalow y Berson, es el precursor de los ensayos


enmunoenzimáticos que fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van
Wemen y Schuurs, sin embargo el uso de material radioactivo ha limitado el uso del
radioinmunoensayo, y a la vez a popularizado el empleo del inmunoensayo enzimático (EIA), del
que hay dos técnicas principales: el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y el ensayo
inmunológico multiplicado por enzimas (EMIT).
El ensayo ELISA fue introducida por Voller en 1.977. Es la prueba más empleada
comercialmente para el diagnóstico de diferentes enfermedades, dopin, tecnología de los alimentos
para buscar patógenas o subproductos. Puede llegar a utilizarse de rutina en laboratorios
especializados y aplicarla a gran escala.

2.2.3 Tipos de ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificación de un


antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de
anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase de un anticuerpo.

 ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución
analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo que
las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del
antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se
encuentra el antígeno buscado).

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 ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular,
como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es
un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un
eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el
anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener
en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida,
no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los
anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de
anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es
suficiente como para dar una señal detectable.).
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos
séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas
recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase
sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar
anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.3
 ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con
un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la
muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material
no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así,
pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un

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segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

2.2.4 Fundamento del método ELISA recombinante

Es una técnica cualitativa para la detección de anticuerpos, en muestras de suero o plasma


humano, la muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con
antígenos inmovilizados recombinantes específicos. Estos antígenos se obtienen por técnica de
ADN recombinante a partir de proteínas específicas correspondientes a zonas altamente
conservadas entre distintas cepas. La tecnología empleada permite asegurar una mezcla antigénica
de composición conocida y constante lote a lote, brindando resultados reproducibles, específicos
y con una elevada sensibilidad.
Si la muestra contiene los anticuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los
antígenos y permanecerán unidos al soporte (fase solida). La fracción no unida se elimina por
lavado luego se agregan anticuerpos anti-inmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa.
Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, se unirá el conjugado. El conjugado no
unido se elimina, luego de un nuevo lavado para posteriormente agregar el sustrato enzimático.
En los casos en que se haya unido el conjugado habrá aparición de color celeste. La reacción se
detiene con ácido sulfúrico, con lo que el color celeste vira al amarillo. (Figura 2)

2.2.4.1 Fases de un ensayo ELISA

1) Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un
determinado período de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser
valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a
una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se dé la
reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso
negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica.

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2) Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos
se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por
proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse
cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el
contrario, si se usa poco antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa.

3) Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la


placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti-primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse
unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del
anticuerpo unido a la placa, se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se
ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno
marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante
controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos
negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción
antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo.
Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo
antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es
muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen
su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.

4) Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las


moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato
enzimático, se incuba durante un tiempo estandarizado por cada casa comercial, en el cual
se producirá una reacción enzimática, luego se frena esta reacción mediante el uso de una
solución stop y se lee la densidad óptica mediante espectrofotometría.

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Figura 2. Fases de un ensayo ELISA

2.2.5 Materiales y procedimiento


Materiales Orgánicos
 Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)
 Antígenos
 Anticuerpos
 Enzimas (Figura 3)

Materiales No Orgánicos
 Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros,
pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
 Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA). (Figura 4)

Procedimiento
1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de Antígenos o Anticuerpos.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adición del Ac secundario marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac.

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7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.


8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10. Coloración.

Tabla 1. Procedimiento del ensayo Elisa

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2.2.6 Interpretación de resultados


 Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura
y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple
colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática
de microplacas.
 Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante
valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más
adecuada para la coloración final alcanzada.

2.2.7 Utilidades de la prueba


Aplicaciones clínicas
 Enfermedades producidas por parásitos
Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosoma.
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Diagnósticos de infecciones por microorganismos: al detectar la presencia de antígenos del
agente infeccioso.
 Confirmación de la presencia de anticuerpos: pueden ser anticuerpos contra cualquier
microorganismo, inclusive vacunas, autoanticuerpos, etc.
 Enfermedades producidas por bacterias
Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonela.
 Enfermedades producidas por virus
Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia felina.
 Otras aplicaciones
Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona)
Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmuno complejos circulantes)
(Acuña R.,)

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2.2.8 Ventajas y desventajas de la prueba


La técnica puede ser cualitativa si solo se requiere conocer si existen o no anticuerpos con
reactividad por determinado antígeno o cuantitativa si se requiere conocer la cantidad de
anticuerpos presentes en las muestras, para lo cual el ensayo debe incluir una curva patrón de
reactividad especifica.

Ventajas: ELISA tiene como ventaja que no se necesita un equipo sofisticado para su lectura.
 Muy sensible pueden usarse como pruebas screening
 Gran número de muestras procesadas simultáneamente
 Resultados rápidos
 Utilización de reactivos menos tóxicos
 Cuantificación de sustancias diversas: Hormonas, fármacos, citoquinas, metabolitos,
mediadores de la inflamación, toxinas, proteínas, agentes infecciosos, etc.
 Son automatizadas y se pueden usar para vigilancia seroepidemiológica.

Desventajas:
Su porcentaje de especificidad no es ideal, presentan reacciones cruzadas.
En cada prueba deben utilizarse suficientes controles.

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Capítulo 3. Método

3.1 Tipo de Investigación

Descriptiva.- Describir el fundamento de la técnica y todos sus componentes, características,


utilidades de la prueba ELISA.
Cualitativa.- Conocer su aplicaciones clínicas, ventajas y desventajas de la técnica.

3.2 Técnicas de Investigación

Investigación documental: Se apoya de la recopilación de antecedentes, información, en los


que se fundamenta y complementa la información

3.3 Cronograma de actividades por realizar

Tabla 2. Cronograma de actividades durante la investigación

Abril Mayo
Semanas S S S S S S S S
1 2 3 4 5 6 7 8
Selección del tema en
estudio, planteamiento del X
problema
Objetivos, justificación X X

Marco teórico X X X

Revisión del trabajo por el


docente de materia X
Análisis de resultados
Obtenidos, datos bibliográficos X
Conclusiones, elaboración final X X
del trabajo
Revisión final del trabajo X

Exposición del trabajo de X


investigación

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Capítulo 5. Conclusiones

Entre las técnicas inmunológicas que apoyan al diagnóstico de las enfermedades autoinmunes
se cuenta el ELISA. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es
versátil, robusto y simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil
entre la fracción retenida y la fracción libre.

El ELISA es una prueba confirmatoria de la reactividad de los anticuerpos presentes en las


muestras de pacientes. Su sensibilidad y especificidad son mayores comparadas con las pruebas
de tamizado inicial.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba
la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

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Referencias

 Guzman-Vasquez E., 2004 Las pruebas de Elisa


https://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf

 Chagatest ELISA recombinante v.4.0 Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la


detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi

 Armando Reyna. Fundamento, etapas, estandarización y tipos de la pruebas de ELISA.


Universidad Simón Rodríguez –IDECYT, Centro de Estudios Biomédicos
areyna@inmunobiologia.net.ve

 Dra. Bouchard Morella. Elisa, Instituto de inmunología clínica., Universidad Los


Andes https://www.yumpu.com/es/document/read/36283200/43bdmzrng/9

 Acuña R., Suarez T., Liñan J., 2015 Elisa. Universidad de Santander
https://es.slideshare.net/cristinupis/elisa-copia?next_slideshow=1

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Apéndice

Figura 3. Combinación Antígeno-Anticuerpo

Figura 4. Procedimiento de la técnica ELISA

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Figura 5. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo unido al


antígeno

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