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RESUMEN:
Durante los últimos años el avance tecnológico ha permitido desarrollar técnicas que ayudan
al diagnóstico de múltiples enfermedades. En el caso de las enfermedades autoinmunes, las
técnicas inmunológicas son de gran ayuda ya que permiten la detección de varios auto anticuerpos
simultáneamente a partir de volúmenes de muestra pequeños. Aunado al desarrollo de las nuevas
técnicas, la sensibilidad y especificidad en la detección de las especificidades de los anticuerpos
también han ido en aumento, de tal manera que el clínico puede contar con pruebas que le
permiten hacer los diagnósticos tempranos con mayor certeza y hacer también el seguimiento del
curso de la enfermedad en función de la variación de los anticuerpos presentes en las muestras
de los pacientes.
La técnica ELISA es un inmunoensayo y es una de las técnicas más utilizadas para identificar
o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con
enfermedades autoinmunes. Además, por su fácil estandarización, manejo y variedad de antígenos
disponibles.
ABSTRACT:
During the last years the technological advance has allowed to develop techniques that help the
diagnosis of multiple diseases. In the case of autoimmune diseases, immunological techniques are
of great help since they allow the detection of several autoantibodies simultaneously from small
sample volumes. In addition to the development of new techniques, the sensitivity and specificity
in the detection of the specificities of antibodies have also been increasing, so that the clinician
can count on tests that allow him to make early diagnoses with greater certainty and also to do the
monitoring of the course of the disease based on the variation of the antibodies present in the
samples of the patients.
The ELISA technique is an immunoassay and is one of the most used techniques to identify or
confirm the specificity of the antibodies present in the samples of patients with autoimmune
diseases. In addition, for its easy standardization, management and variety of available antigens.
Tabla De Contenidos
Lista De Tablas
Lista De Figuras
Introducción
Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como
reactivos enlazantes específicos. Tienen aplicación universal para la determinación o
cuantificación de fármacos terapéuticos y no terapéuticos, diversas sustancias biológicas,
sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped en el suero, en la orina, en el líquido
cefalorraquídeo en saliva y en cualquier liquido biológico donde se encuentre la sustancia a
investigar.
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una
enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Existen
diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso
molecular (>30 000 daltons), el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga
con un ligando, que puede ser un antígeno, un anticuerpos específico para el antígeno de interés o
un anticuerpo para el anticuerpo primario.
Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales se adsorbe un antígeno
o un anticuerpo sobre un soporte sólido. Algunos de los protocolos se basan en reacciones de
enlace competitivo y otras en reacciones de enlace no competitivo, pero en todas las pruebas
ELISA se requiere de un paso de separación para eliminar el conjugado enzimático libre antes de
proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimático enlazado. Para lo cual se añade sustrato
enzimático y se mide la reacción catalítica entre la enzima y el sustrato.
Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles. Una
sola proteína enzimática puede transformar en algunos minutos gran número de moléculas de
sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color
amplificado y que se detecta con facilidad.
En el método ELISA de inhibición el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimática
se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático
1.2 Objetivos
ELISA son las siglas por las que se conoce al ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas,es
una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos
presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes.
Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios científicos en campos como la biología,
la bioquímica y la medicina. En el hospital se utiliza principalmente para identificar gérmenes
agresores que se encuentran en la sangre, orina, esputos, etc. La técnica pronto se generalizó con
el empleo de equipos simples y muy baratos que se utilizan todavía hoy en muchos centros
diagnósticos de todo el mundo.
2.2.2 Historia
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución
analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo que
las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del
antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se
encuentra el antígeno buscado).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular,
como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es
un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un
eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el
anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener
en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida,
no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los
anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de
anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es
suficiente como para dar una señal detectable.).
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos
séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas
recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase
sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar
anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.3
ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con
un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la
muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material
no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así,
pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
1) Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un
determinado período de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser
valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a
una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se dé la
reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso
negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2) Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos
se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por
proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse
cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el
contrario, si se usa poco antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa.
Materiales No Orgánicos
Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros,
pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA). (Figura 4)
Procedimiento
1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de Antígenos o Anticuerpos.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adición del Ac secundario marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac.
Ventajas: ELISA tiene como ventaja que no se necesita un equipo sofisticado para su lectura.
Muy sensible pueden usarse como pruebas screening
Gran número de muestras procesadas simultáneamente
Resultados rápidos
Utilización de reactivos menos tóxicos
Cuantificación de sustancias diversas: Hormonas, fármacos, citoquinas, metabolitos,
mediadores de la inflamación, toxinas, proteínas, agentes infecciosos, etc.
Son automatizadas y se pueden usar para vigilancia seroepidemiológica.
Desventajas:
Su porcentaje de especificidad no es ideal, presentan reacciones cruzadas.
En cada prueba deben utilizarse suficientes controles.
Capítulo 3. Método
Abril Mayo
Semanas S S S S S S S S
1 2 3 4 5 6 7 8
Selección del tema en
estudio, planteamiento del X
problema
Objetivos, justificación X X
Marco teórico X X X
Capítulo 5. Conclusiones
Entre las técnicas inmunológicas que apoyan al diagnóstico de las enfermedades autoinmunes
se cuenta el ELISA. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es
versátil, robusto y simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil
entre la fracción retenida y la fracción libre.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba
la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Referencias
Acuña R., Suarez T., Liñan J., 2015 Elisa. Universidad de Santander
https://es.slideshare.net/cristinupis/elisa-copia?next_slideshow=1
Apéndice