TP : Mise en évidence de l’activité amylase chez

les végétaux

INTRODUCTION

Manipulation 1 : Hydrolyse de l'amidon

1. Hydrolyse acide de l'amidon

2. Hydrolyse enzymatique de L’amidon ; action de l’amylase.

Manipulation 2 : Mise en évidence d'une activité amylasique

1. Mise en évidence d'une activité amylasique dans la salive

2. Mise en évidence d'une activité amylasique chez végétaux

Manipulation 3 : Extraction d'une activité amylasique des

végétaux et le test de son activité

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 TP : Mise en évidence de l’activité amylase chez
les végétaux
INTRODUCTION

L’amidon
L’amidon est un polyglucane (polymère de glucose) composé d’amylose et d’amylopectine.
C’est un polymère de réserve (formule (C6H10O5)n) accumulé sous forme transitoire dans les
chloroplastes des tissus chlorophylliens ou sous forme plus durable dans des organes de
réserve comme les grains de céréales (blé, riz, maïs,…), les tubercules ( pommes de terre,…).
Il sert de réserve glucidique pour la plante et fait l’objet de différentes utilisations alimentaires
et non alimentaires. L’amidon ne se trouve que dans les végétaux et leurs dérivés. On ne le
trouve jamais chez les animaux et dans les matières d’origine animale. C’est un solide blanc
et insipide. Il est principalement utilisé dans l’alimentation, en pharmacie, en papeterie et pour
empeser le linge.
L'amidon est la forme de réserve glucidique des plantes : la cellule végétale est donc capable
d’effectuer la synthèse de l’amidon à partir du glucose et l’hydrolyse de l’amidon en glucose.
Chacune de ces 2 réactions est catalysée par une enzyme protéique : l’amylase pour
l’hydrolyse de l’amidon et l’amylo-synthétase pour sa synthèse.

L’amylase
L’amylase est un complexe enzymatique (α-amylase, β-amylase, phosphorylase) qui catalyse
la dégradation de l’amidon en maltose, destiné à alimenter le métabolisme végétal en sucres
ou à servir de substrat glucidique au cours de procédés agroalimentaires comme la
fermentation. Les processus fermentaires peuvent être induits en anaérobiose par les levures
par exemple.
L'α-amylase (EC 3.2.1.1) est une enzyme digestive classée comme glycosidase
(enzyme qui hydrolyse les polysaccharides) d’origine animale. C'est un constituant du suc
pancréatique et de la salive, requis pour le catabolisme des glucides à longue chaîne (comme
l'amidon) en unités plus petites. Elle est également synthétisée dans les fruits de beaucoup
de plantes durant leur maturation (c'est ce qui rend leur goût si doux et sucré), et aussi pendant
la germination des graines. L'amylase est entre autres responsable de la production de malt.
La bêta-amylase (EC 3.2.1.2) est une enzyme qui agit sur l’amidon, le glycogène et
le glycogène et oligosaccharides, produisant le bêta- maltose. La bêta-amylase se trouve dans
les bactéries, les champignons et les plantes. En opérant à partir de l'extrémité non réductrice,
la β-amylase catalyse l'hydrolyse de la seconde liaison glycosidique α-1,4, en séparant deux
unités de glucose (maltose) à la fois. Au cours de la maturation des fruits, la β-amylase éclate
l'amidon en maltose, ce qui entraîne une saveur douce des fruits mûrs. La β-amylase est
présente sous une forme inactive avant la germination des semences.
De nombreux microbes produisent également de l'amylase pour dégrader les amidons
extracellulaires. Les tissus animaux ne contiennent pas de β-amylase, bien qu'il puisse être
présent dans les microorganismes contenus dans leur tube digestif.

L'objectif :
L'objectif de la manipulation est de mettre en évidence la présence d’amidon dans des grains
de maïs. Il s’agit également de démontrer la présence d’amylase dans du malt (graines germé :
orge ou blé) en étudiant la capacité d’un extrait à hydrolyser un empois d’amidon et en
suivant l’apparition séquentielle de produits de dégradation réactifs au lugol (solution iodo-
iodurée).

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Principe

L’amidon est une macromolécule polymère du glucose utilisée comme molécule de

réserve chez les végétaux, il permet après hydrolyse, l’approvisionnement des cellules en
glucose. Cette hydrolyse est progressive et libère des molécules de plus en plus courtes pour
aboutir à du maltose et un peu de glucose.
Réaction à l’iode :
Le lugol ou l’eau iodée (I3-) se fixe sur les chaînes polysaccharidiques pour donner
des complexes colorés. La réaction du lugol avec le glycogène donne une coloration
brune alors qu’on obtient une coloration bleue-noir avec l’amidon.
La coloration au lugol (eau iodée) est caractéristique des polymères du glucose (coloration
bleu nuit en présence d’amidon, coloration jaune en son absence).

Réduction de la liqueur de Fehling

Principe :
La réaction à la liqueur de Fehling permet la mise en évidence de certains petits
glucides solubles (maltose et glucose par exemple) par la formation d’un précipité rouge
brique (orange) à chaud.
En milieu alcalin et à chaud, les oses et dans certaines conditions les polyholosides
peuvent s’oxyder et en même temps réduire des substances telles que les sels métalliques. On
parle alors de pouvoir réducteur des sucres. Cette propriété, qui est due à la présence de
fonction hémi-acétalique libre, peut être mise en évidence par exemple grâce au réactif de
Fehling qui est une solution alcaline d’ions cuivreux de coloration bleue (les ions Cu+2 sont
maintenus en solutions grâce au double tartrate de Na+ et K+).
Si la réaction est positive, on obtient un précipité rouge brique dont la
quantité est proportionnelle a celle du sucre réducteur présent.

Glucides réducteurs produits d’oxydation + ne-

2 Cu+2 + 2OH- + 2e- Cu2O + H2O

Précipité rouge brique
Si le sucre n’est pas réducteur, la coloration reste bleue.

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 Manipulation 1 : Hydrolyse de l'amidon
L’hydrolyse de l’amidon (C6H10O5)n peut être obtenue in vitro soit avec un catalyseur minéral
(HCl), soit avec une enzyme, l’amylase. Cette hydrolyse libère un sucre réducteur : le glucose
(C6H12O6) avec HCl et le maltose (C12H22O11) avec l’amylase.

L'α amylase présente chez les végétaux est également une enzyme digestive contenue dans la
salive et, le suc pancréatique. C’est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de la liaison
glycosidique α 1-4 à l'intérieur (endoglucosidase) des chaînes poly-saccharidiques, mais elle
n'a pas d'action sur les liaisons α 1-6. La β amylase présente dans les graines, les tubercules
catalyse aussi l'hydrolyse de la même liaison, mais en bout de chaîne (exoglucosidase).
L'action de ces α glucosidases ne permet pas l'hydrolyse complète des chaînes
polyglucosidiques, car les liaisons α 1-6 résistent, mais elle conduit à la libération d'oligo-
saccharides et de maltose.

1. Hydrolyse acide de l'amidon

PRINCIPE
L'amidon est un ensemble de polysaccharides de hautes masses moléculaires. Une hydrolyse
acide permet de détruire les liaisons osidiques et de libérer les monomères sans détruire ces
derniers.

MATÉRIEL
- Fécule de pomme de terre ou amidon soluble.
- Bain-marie à 100°.
- Lugol.
- Liqueur de Fehling.
- Acide chlorhydrique normal (HCL 1N) et soude normale (NaOH 1N).
- Papier indicateur de pH.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

1) Préparer 100 ml d'empois d'amidon à 1 % (à partir de fécule) ou 100 ml de solution

d'amidon à 1 % (à partir d'amidon soluble).

2) Préparer dans un panier deux séries de 8 tubes à essais avec:

- 5 ml de solution d'amidon,
- 2 ml d'acide chlorhydrique.

3) Placer le panier au bain-marie bouillant.

4) Toutes les 5 min, prélever un tube de chaque série:

- faites refroidir le premier tube (sous le robinet) puis ajouter quelques gouttes de lugol ;
- neutraliser le deuxième tube avec de la soude (environ 2 ml de soude, progressivement,
en vérifiant au papier pH). Noter le volume de soude qui sera nécessaire pour neutraliser les
tubes suivants. Ajouter 2 ml de liqueur de Fehling. Replacer au bain-marie.

5) Témoins initiaux : faire ces deux réactions sur 2 tubes non placés au bain-marie (T0).

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2. Hydrolyse enzymatique de L’amidon

PRINCIPE
Comme un acide, l'amylase dégrade l'amidon en ses monomères. Cette hydrolyse plus douce
se réalise à une température compatible avec la vie et ne libère pas exactement les mêmes
produits.

MATÉRIEL
- Fécule de pomme de terre ou amidon soluble.
- Bain-marie à 37°C.
- Lugol, Liqueur de Fehling.
- Solution d'amylase de commerce à 1 ‰.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

1) Préparer 100 ml de solution d'amidon à 1 %.

2) Préparer dans un panier deux séries de 8 tubes à essais avec:
- 5 ml de solution,
- 2 ml de solution d'amylase.
3) Placer le panier au bain marie à 37°C.
4) Toutes les 5 min, prélever un tube de chaque série et faire:
- un test au lugol,
- un test à la liqueur de Fehling.
5) Témoins initiaux : faire ces deux réactions sur deux tubes non placés au
bain-marie (T0).

Manipulation 2 : Mise en évidence d'une activité amylasique

1. Mise en évidence d'une activité amylasique dans la salive

PRINCIPE
L’ amylase est une enzyme qui permet la digestion partielle de l’amidon et du
glycogène, en hydrolysant les liaisons  1-4 glucosidiques. Elle est sécrétée par les
glandes salivaires mais aussi par les cellules acineuses du pancréas. L’ amylase
pancréatique est donc une enzyme présente dans le suc pancréatique pour permettre la
digestion des aliments. En présence d'une amylase, l'amidon est hydrolysé et sa disparition
peut être visualisée par la réaction au lugol.

MATÉRIEL
- Amidon soluble, Gélose ou agar-agar.
- Lugol dilué (1/10).
- Boîtes de Pétri.
- Solution d'amylase de commerce ( à partir de Bacillus subtilis).
- Bain-marie.

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PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL (fig.3)

1) Préparer une solution contenant 1 g de gélose, 1 g d'amidon soluble et 100 ml d'eau.

2) Chauffer au bain-marie bouillant, en remuant avec un agitateur, jusqu'à ce que la solution
devienne limpide.
3) Verser la solution dans les boîtes de Pétri et laisser refroidir.
4) Préparer des morceaux de papier filtre humectés avec :
- de l'eau (témoin),
- la solution d'amylase,
- de la salive.
5) Placer les papiers sur la gélose solidifiée, refermer les boîtes et attendre 10 min.
6) Enlever les papiers, recouvrir la boîte avec du lugol dilué et observer.

RÉSULTAT
La trace des papiers contenant une amylase apparaît en clair sur fond bleu-noir. Une légère
trace apparaît à l'endroit du papier imbibé d'eau: elle est due à une plus faible dilution de
l'amidon soluble.

Figure 3 : Montage expérimental.

(a : temps 0) (b : après révélation par le lugol)
1 : eau ; 2 : amylase ; 3 : salive

2. Mise en évidence d'une activité amylasique chez les végétaux

PRINCIPE
En présence d'une amylase, l'amidon est hydrolysé et sa disparition peut être
visualisée par la réaction au lugol.

MATÉRIEL
- Grains de maïs imbibés depuis quelques heures ou mis à germer.
- Boîtes de Pétri, gélose et amidon soluble.
- Lugol dilué au 1/10e.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

1) Préparer les boîtes de Pétri, avec 1 % de gélose et 1 % d'amidon soluble.

2) Sectionner des grains de maïs longitudinalement (coupe sagittale), la section devant être la
plus nette possible.

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3) Humecter légèrement la section et placer les demi-grains sur la gélose, en prenant soin que
la surface de section adhère bien à la surface de la gélose.
4) Réaliser des témoins (papier humide, papier imbibé de salive, demi-grain de Maïs bouilli
pendant 2 min, etc.).
5) Attendre 15 à 30 min.
6) Enlever délicatement les échantillons sans les faire glisser sur la gélose.
7) Recouvrir complètement la gélose avec du lugol dilué.
8) Observer (fig. 4).

Remarque : On aura soin de conserver les demi-grains afin de comparer leur morphologie
avec celle de l'empreinte.

RÉSULTAT

Figure 4
Observation de la boîte au début de l'expérience (a)
Observation de la boîte après addition du lugol (b). .

1 : papier + salive ; 2 : papier + eau ; 3 : demi-caryopse ; 4 : demi-caryopse bouilli.

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 Manipulation 3 : Extraction d'une activité amylasique

PRINCIPE

Extraire par l'eau l'ensemble des substances solubles contenues dans des semences. Mettre en
évidence in vitro l'activité amylasique.

MATÉRIEL

- Grains d'orge (ou de blé) germés (3 j) ; les grains de maïs ne conviennent pas parce qu'ils
sont trop durs pour un broyage correct.
- Agitateur magnétique.
- Empois d'amidon à 1 %
- Lugol, Liqueur de Fehling (LF).
- Tampon phosphate pH 5,2.
- Bain-marie à 40 et à 100°C.

PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL
1) Extraction de l'amylase:
- broyer 20 caryopses d'orge (ou blé dur) germés dans 25 ml de tampon phosphate pH 5,2 ;
-laisser reposer 5 min (en agitant si possible)
- filtrer et compléter le filtrat à 50 ml avec le tampon.

2) Préparer deux séries de 10 tubes avec 5 ml d'empois d'amidon à 1 % et 1 ml d'extrait.

3) Première série:
- dans le premier tube, ajouter une goutte de lugol (témoin T0) ;
- placer les autres tubes au bain-marie à 40°C;
- toutes les 5 min, prélever un tube, le refroidir sous le robinet et ajouter une goutte de lugol.

4) Deuxième série :
- dans le premier tube, ajouter 5 ml de liqueur de Fehling et placer au bain-marie bouillant;
- placer les autres tubes au bain-marie à 40°C;
- toutes les 5 min, prélever un tube, ajouter 5 ml de liqueur de Fehling et placer au bain-marie
bouillant.

5) Notez la coloration obtenus dans les tubes

RAPPEL DE TP SUR LES GLUCIDES

Lugol + amidon = coloration bleue, violet

Lugol + oses = coloration jaune orangé

Liqueur de Fehling + amidon = coloration bleue,

Liqueur de Fehling + sucre réducteur = coloration rouge brique

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ANNEXES I

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 ANNEXES II : Préparation des solutions

Liqueur de Fehling :
La liqueur de Fehling est obtenu en mélangeant V:V deux solutions A et B dont la
composition est la suivante :

o Solution A : dissoudre 40 g de sulfate de cuivre (CuSO4.5H2O) dans 900 mL d’eau

distillée et chauffer pour dissoudre le sel. Compléter à 1 L.

• Solution B : : dissoudre 200 g de sel de Seignette ( tartrate de K et Na ) et 150 g de

soude dans 1 L d’eau distillée.

Amylase de la salive

Récupérer de la salive dans un petit verre et ajouter un grain de sel. On pourra activer la
sécrétion par des mouvements masticatoires "à vide" ou en mâchant un morceau de bougie.
Laisser se séparer la mousse de la partie liquide et récupérer cette dernière avec un compte-
gouttes ou une seringue.

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