Resolução de problemas de

Biologia Molecular

Sandra Morais Cardoso

Institute of Medical Biology Biologia Celular e Molecular II

 Descobrir RFLP

TaqI

IndoI
II
Uso dos RFLPs na averiguação de portadores de Doenças
genéticas e em DPN
-Escolha apropriada do marcador de RFLPs

-è necessário estabelecer em que cromossoma está o

allelo responsável pela doença genética:
Para se estabelecer o allelo é necessário estudar a criança
afectada, os pais, irmãos, tios, avós, etc.

-Finalmente usando os marcadores específicoc e o AND

fetal pode-se determinar se o feto é ou não afectado
 I
1 2

?
II
1 2 3

II1 I1 II2 I2 II3

A1
A2
I
1 2

II ?
? ? ?
1 2 3 4 5 6
Kb
5.0
4.0
3.0
1.0

II-6:
II-3:
II-4:
II-5:
 I
1 2

II
?
1 2 3
Taq I
A
B
PstI
A
B
Criação de AND recombinante
• Envolve a união de um fragmento de ADN a uma molécula maior,
utilizando-se uma endonuclease de restrição e a ADN ligase.

• A clivagem do ADN com a mesma enzima de restrição cria

extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da
ADN ligase

• Desta forma, um fragmento de ADN pode ser inserido numa

molécula maior, que passa a ser recombinante.

• Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido

no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou
mesmo transcrito várias vezes.

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Vectores
• Um vector é uma molécula de ADN à qual o fragmento de ADN a ser clonado está
ligado

• Os principais vectores utilizados são plasmídeos, e vírus de animais

• Os plasmídeos são os mais utilizados para a clonagem de pequenos fragmentos de

ADN; são geralmente obtidos a partir de células bacterianas, facilmente
reintroduzidos nestas células e possuem capacidade autónoma de replicação.

• Um exemplo amplamente utilizado de plasmídeo é o pBR322, que possui os genes

de resistència à tetraciclina e á ampicilina.

• Alguns tipos de vírus, como o bacteriófago l , são utilizados na clonagem de

fragmentos maiores de A DN

• Os Cosmídeos são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago

associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores
segmentos de ADN

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Plasmídeos
Elementos genéticos que se replicam independentemente do genoma do hospedeiro

Uma célula pode ter mais do que 1 cópia do mesmo plasmídeo

e mais do que 1 tipo de plasmídeo
Podem ter uma profunda influência no fenótipo celular, e codificar propriedades fundamentais para a célula,
dependendo dos genes que transportam
Podem transportar qualquer tipo de genes, desde que não interfiram com a sua replicação

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Recombinação Homóloga
Troca física de material genético (DNA) entre sequências homólogas.

Transducção Conjugação Transformação

Recombinação
Fragmentos de DNA com zonas homólogas são transferidos de um dador
para um receptor e recombinados com o genoma do receptor

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Transformação e recombinação

Há várias enzimas Ligação do DNA de dupla

envolvidas nos cadeia à membrana externa
processos que por uma DNA “binding
ocorrem desde a protein”
interiorização do
DNA até à sua
integração no
cromossoma do Entrada de uma das cadeias
hospedeiro e degradação da outra por
uma nuclease

A cadeia de DNA é ligada a

proteínas específicas, e
ocorre recombinação entre
regiões homólogas do
cromossoma, mediada pela
enzima RecA.

Célula transformada
Engenharia genética
Alguns microrganismos são naturalmente transformáveis, dizem-se competentes.
Frequência de transformação é de 10-3 para a maioria das espécies
Competência pode ser induzida artificialmente:

Ligação dum gene a um plasmídeo que

transporta resistência a ampicilina
Células resistentes a ampicilina

Tratamento das células com soluções

concentradas de CaCl2 que torna as membranas
mais “permeáveis” ao DNA de cadeia dupla –
plasmídeos

Na electroporação as células são sujeitas a um

campo eléctrico que induz a abertura de
pequenos poros nas membranas. As moléculas
de DNA que estão próximas desses poros são
captadas.
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 Clonagem
• É um método mais complexo de isolamento e DNA
amplificação de ADN que a PCR, mas muito útil ligase

em certas situações.
• Envolve a utilização de endonucleases de
restrição, a criação de mapas de restrição e a
utilização de vectores para a recombinação e
clonagem do gene em estudo.

ADN Ligase - cataliza a formação de um a ligação

fosfodiéster entre a hidroxila 3' na ponta de uma cadeia
de DNA e o fosfato 5'da ponta da outra, sendo essa
reação endergónica. A ligase repara quebras nas moléculas
bifilamentares do ADN. A ADN ligase é essencial para a
síntese normal de ADN, reparação de ADN danificado, e o
enxerto das cadeias de ADN na recombinação genética.

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 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Description:
1-Chromosomal DNA of organism A.
2-PCR.
3-Multiple copies of a single gene from organism
A.
4-Insertion of the gene into a plasmid.
5-Plasmid with gene from organism A.
6-Insertion of the plasmid in organism B.
7-Multiplication or expression of the gene, PCR product compared with
originally from organism A, occurring in organism DNA ladder in agarose gel.
B. DNA ladder (lane 1), the PCR
product in low concentration
(lane 2), and high
concentration (lane 3).
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 Modelos Animais de Doença

Sandra Morais Cardoso

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 Sumário
• Culturas Celulares como modelo– in vitro
– Culturas primárias
– Linhas Celulares
• Animais como modelo– in vivo
– Animais mais usados no laboratório e suas
características
• Biotério e suas características
• Modelos Biológicos na Doença de Alzheimer – um
exemplo prático.

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 Investigação Básica

Estudos de toxicidade e de actividade "in vitro" e "in

Ensaios Pré-clínicos vivo“ (animais).
Escolha da dose e da apresentação farmacêutica.

Ensaios Clínicos:
- Fase I
-conhecer a tolerância e o metabolismo do medicamento.
-voluntários saudáveis recebem doses crescentes da nova substância.
- Fase II
-grupo ainda pequeno de pacientes voluntários recebe uma dose determinada
-Objectivo: alcançar a dose óptima
- Fase III
-ensaio piloto
-medicamento administrado a um número grande de pacientes
-avaliar a eficácia e segurança do produto
-avaliação é comparativa, utilizando-se um placebo ou outro tratamento de referência
- Fase IV – Farmacovigilância
-posterior ao registo e lançamento do novo medicamento.
-objectivo: relação custo-benefício do tratamento e identificar reacções adversas raras

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1.Culturas Celulares como modelo
- Várias células animais e vegetais podem ser cultivadas em laboratório
sistemas in vitro

- Podem ser manipuladas geneticamente

- Meio experimental facilmente controlado

- Minoram o nº de animais usado para fins de experimentação

Principais Fontes de culturas celulares : Tipos de culturas:
- embriões ou tecido neo-natal - culturas primárias
- tumores - linhas celulares
Culturas primárias
2. Animais como modelo

Escherichia coli
- Célula procariota
- Simplicidade – cerca de 4000 genes (genoma humano cerca de 1000x maior)
- Facilidade de propagação no laboratório – Divide-se cada 20 min
- Requer um meio nutritivo muito simples
- Facilidade de isolar colónias (selecção de variantes genéticas)

Investigação de processos bioquímicos

Investigação dos mecanismos básicos da genética molecular
Replicação DNA, código genético, expressão génica, síntese de
proteínas
 Saccharomyces cervisie
- Seres eucariotas mais simples – leveduras - unicelular
– com membrana nuclear, 16 cromossomas, citoesqueleto e organelos
- Simplicidade – cerca de 6000 genes
- Facilidade de propagação no laboratório – Divide-se cada 2 h
- Requer um meio nutritivo muito simples
- Facilidade de isolar colónias (selecção de variantes genéticas)

Investigação dos mecanismos básicos biologia molecular

Replicação DNA, transcrição, processamento RNA, regulação do ciclo celular.
Caenorhabditis elegans

- Nemátoda – multicelular
- Cerca de 19000 genes
- Animal adulto com 959 células somáticas e 1000-2000 células germinativas
- Cresce facilmente em laboratório
- Facilidade de manipular geneticamente

C. elegans

Investigação desenvolvimento animal

Drosophila melanogaster
- Mosca da fruta
- Tamanho idêntico à C. elegans com 14000 genes
- Manutenção simples no laboratório
- Período de reprodução curto (cerca de 2 semanas)
Utilidade para experimentação genética

Investigação em biologia do desenvolvimento

Xenopus laevis - ovos

- Vertebrado
- Ovos muito grandes (1mm) que se desenvolvem exteriormente
- Manutenção simples no laboratório

Investigação em biologia do desenvolvimento (diferenciação, divisão celular

embriónica,…)
Zebrafish
- Vertebrado
- Reprodução rápida e fácil
- Manutenção simples no laboratório
- Embriões desenvolvem-se exteriormente e são transparentes

Investigação em biologia do desenvolvimento (diferenciação, divisão

celular embriónica,…)
Ratinho e Rato

- Mamíferos
- Elevada similaridade entre o genoma do ratinho e o do Homem
- Manutenção mais difícil
- Úteis para estudos de comportamento
- Mutações em genes homólogos resultam em defeitos do desenvolvimento
idênticos
ex. piebaldismo
 O que são animais geneticamente modificados?

Alteração do DNA da linha germinativa

Modificação/Mutação hereditária
Transgénicos – Introdução de gene exógeno
Há adição de DNA, muitas vezes sequências humanas

Gene Targeting – Modificação de um gene endógeno específico

“Knock-out” – perda de função de um gene
“Knock-in” – Introdução de uma mutação específica (Triple repeat,
mutação pontual)
Como se produzem animais geneticamente modificados ?
Recombinação Homóloga

Sequência do DNA que se quer modificar

Construção do DNA modificado e adição de marcadores

de selecção positiva (ex. resistência a antibioticos) ou
negativa (ex. timidina cinase)

Adição do DNA às células com DNA normal. Alinhamento

das sequências e recombinação homologa.

Produto final da recombinação homóloga

Possibilidade de recombinação não-homologa – presença

do marcador negativo - células morrem na presença de
ganciclovir
 Passo 1 - Isolar embrião em fase de blastocisto de ratinhos
pêlo cinzento

Passo 2 – Remover as células estaminais do blastocisto e

pô-las em cultura.

Passo 3 – Transfectar as células estaminais com a

construção por recombinaçao homologa.
Seleccionar a recombinação homologa fazendo crescer
as cel. na presença de neomicina e ganciclovir.
+ neomicina + ganciclovir
Passo 4 - Remoção da cultura das células estaminais
com a recombinação homóloga e injecção num
blastocisto de ratinhos com pêlo branco

Passo 5 - Introdução do embrião numa fêmea de pêlo

branco pseudo-grávida.

Passo 6 – Nascimento de diferentes tipos de

ratinhos.:
- Ratinhos normais de pêlo branco
- Ratinhos quiméricos
- Com muitas células do ratinho de pelo
branco e outras das células estaminas
recombinantes (com manchas cinzentas).
 Passo 7 - Acasalar os ratos quimericos com
ratos wild-type de pêlo branco. Se as gónadas
do rato quimérico forem derivadas das células
estaminais recombinantes, toda a descendência
vai ter pêlo cinzento. Todas as células no rato
cinzento são heterozigóticas para a
recombinação homóloga.

Passo 8 - Acasalar os ratos heterozigóticos

e fazer a genotipagem da descendência.
KnockOut
É necessário fazer a genotipagem da descendência
COMO?

Southern blotting

PCR
 3. Biotério
BIOTÉRIO - FMUC
Área manutenção animal

Área experimentação

Área administrativa

Principais objectivos
*Fornecer animais (ratos e ratinhos) aos utilizadores
*Respeitar normas da DGV

*Produção de anticorpos mono e policlonais

*Estudos in vivo – comportamentais e farmacológicos
Limpeza e esterilização Manutenção animal
Área Limpa

Corredor acesso
Limpeza e Esterilização
Sala de animais em Experiências
 Manutenção animal
Área Limpa

Sala Exp

Saída Animais
X X X X X X
X
Duche Coelhos Esterilização Acasalamentos Quarentena
Ratinhos Ratos
Knockouts Armazém Ratos Sala
Esterilização Adultos Controlo
Ninhadas
Ratos
4. Modelos Biológicos na Doença de Alzheimer
– um exemplo prático

DOENÇA DE ALZHEIMER
 Demência mais comum no idoso

Prevalência: >65 anos : 1300-11200 / 100000

Aumento exponencial com a idade

CARACTERÍSTICAS NEUROPATOLÓGICAS

 Perda neuronal selectiva

 Placas senis

 Tranças neurofibrilhares
FACTORES DE RISCO FACT. PROTECTORES
Idade ————
Menopausa Estrogénios
APOE4 APOE2/E3
Traumatismo Craniano ————
História Familiar ————
Analfabetismo Grau de Literacia
———— Anti-inflamatórios
———— Antioxidantes
MARCADORES GENÉTICOS

1
14

19

PS-
PS-1

PS-
PS-2 ApoE
21

APP
 APP - PROCESSAMENTO PROTEOLÍTICO
Secretases:   

N A C

Extracelular Intracelular

APP: 751-
751-770 a.a.
Como estudar a doença de Alzheimer ?

Qual o melhor modelo?

Culturas de Células – in vitro

Controlo Beta--amilóide
Beta

- Culturas primárias neuronais, gliais - Culturas organotípicas

- Linhas Celulares
- Culturas de Fibroblastos
Cíbridos de Alzheimer:

NT2 + Cell NT2 0 Cell

Mitocôndria DNA
DNA
+ Brometo de Etídio

Cíbridos de Alzheimer
+
DNA

Mitocôndrias de doentes
Ex vivo
Material recolhido de humanos:
- Plaquetas
- Linfócitos
 Animais – in vivo

- Drosophila -Zebrafish
- Coelho - ovos Xenopus
- C. elegans
- Ratinhos trangénicos
-Modificação da proteína APP
-Modificação das presinilinas
-Modificação da expressão de acetilcolinesterase
-....
Mas o melhor modelo ... É MESMO O HOMEM!!!
Resolução de Problemas de Biologia
Molecular

Sandra Morais Cardoso

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Uso dos RFLPs na averiguação de portadores de Doenças genéticas e
em DPN
-Escolha apropriada do marcador de RFLPs
-É necessário estabelecer em que cromossoma está o allelo responsável
pela doença genética:
Para se estabelecer o allelo é necessário estudar a criança afectada, os
pais, irmãos, tios, avós, etc.
-Finalmente usando os marcadores específicoc e o AND fetal pode-se
determinar se o feto é ou não afectado

Exemplo:

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 I
1 2

?
II
1 2 3

II1 I1 II2 I2 II3

A1
A2

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 I
1 2

II
?
1 2 3
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 I
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? ? ?
1 2 3 4 5 6
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4.0
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II-6:
II-3:
II-4:
II-5:
Institute of Medical Biology Biologia Celular e Molecular II
 I
1 2

II
?
1 2 3
Taq I
A
B
PstI
A
B

Institute of Medical Biology Biologia Celular e Molecular II