PRACTICA No.

4 “EXTRACCION DE ADN BACTERIANO”

OBJETIVO: Conocer y aplicar un protocolo que permita la extracción del ADN de una cepa
bacteriana y estudiar las características moleculares de este importante ácido nucleico.
FUNDAMENTO: El ADN, ácido desoxirribonucleico, se define como un biopolímero (compuesto
químico formado por unidades estructurales que se repiten) que constituye el material genético
de las células. Está formado por unidades que están ordenadas según una secuencia y es ahí
donde se encuentra la información para la síntesis de proteínas. Es el responsable del código
genético, que determina en gran medida las características de los seres vivos al nacer (Alberts et
al., 2007). La molécula de ADN está formada por dos cadenas formada por compuestos
químicos llamados nucleótidos. Existen cuatro tipos de nucleótidos diferenciados por sus bases
nitrogenadas; adenina, timina, citosina y guanina. Las cadenas forman una especie de cadena
retorcida, lo que permite que el ADN se pueda desenrollar y hacer una lectura de éste. Cada
nucleótido posee una afinidad química con aquel que se encuentra en paralelo en la otra cadena.
Los nucleótidos están formados por un ácido fosfórico, una desoxirribosa y una base
nitrogenada (Nelson & Cox, 2005). La extracción o aislamiento del ADN permite el estudio,
análisis y caracterización de esta biomolecula. Los pasos necesarios para una correcta
extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. Lisis de las
células. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas
como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un
detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradación de
la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La
fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el
acetato sódico. 3. Purificación. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol frío o isopropanol y se puede recuperar mediante una centrifugación (Chen & Kuo,
1993). El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. De todas las
muestras biológicas que podemos someter a un proceso de extracción de ADN, las suspensiones
bacterianas, son quizás las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del
material. En particular, las suspensiones densas de bacterias gramnegativos pueden liberar
cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple
ebullición, congelación o una combinación de ambas.
 II. Protocolo de extracción de ADN bacteriano.
Para este fin se utilizará el kit de aislamiento de ADN marca Amershan Biosciences®: el cual
cuenta con los siguientes reactivos: a) Solución de lisis, b) RNasa, c) Solución para precipitar
proteínas y d) Solución de hidratación de ADN.
De acuerdo con el siguiente procedimiento:
Paso 1: Coloque en un tubo Eppendorff limpio y esterilizado, 200 µl de una suspensión
bacteriana. Centrifugar la muestra a 13,000 rpm durante 30 segundos.
Paso 2: Elimine cuidadosamente el sobrenadante con la ayuda de una micropipeta. Evite tocar el
“Pellet” durante la extracción del sobrenadante.
Paso 3: Adicione 120 µl de solución de lisis al “Pellet” que está depositado en el fondo del tubo
Eppendorff. Re suspenda la muestra (arriba-abajo) con la ayuda de una pipeta, esto para
mezclar y disolver correctamente el paquete celular. Incubar la mezcla a 80º C en un baño
maría durante 40 minutos.
Paso 4: Enfriar la muestra a temperatura ambiente y ahora adicione 0.5 µl de la enzima
RNasa(Ribonucleasa, abreviada comúnmente como RNasa, es una enzima (nucleasa) que cataliza
la hidrólisis de ARN en componentes más pequeños). Mezcle muestra invirtiendo los tubos
cuidadosamente por lo menos 25 veces.
Paso 5: A continuación adicionar 40 µl de la solución “para precipitar proteínas”. Vortexear
vigorosamente durante 20 segundos.
Paso 6: Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. Al concluir el tiempo centrifugar a
13000 rpm durante 8 minutos.
Paso 7. Cuidadosamente y con la ayuda de una micropipeta, extraiga el sobrenadante y coloque
en un tubo Eppendorff nuevo y limpio (etiquetar el tubo para evitar confusiones). Desechar el
precipitado (proteínas). Nota: cuide el sobrenadante, ya que ahí se encuentra el ADN.
Paso 8: Adicione al sobrenadante 200 µl de isopropanol al 100 % y agite cuidadosamente
invirtiendo la muestra 50 veces. Nota: El ADN es insoluble en este solvente y por lo tanto la
molécula de ADN precipita y se plegara formando una fina hebra.
Paso 9: Centrifugar esta nueva mezcla a 13000 rpm durante 10 minutos. Al terminar la
centrifugar, drenar el sobrenadante y cuidar de no perder el precipitado (ADN) que se
encuentra en el fondo del tubo. Adicionar 200 µl de etanol al 70 % (frio) por las paredes del
tubo lentamente para lavar el pellet (ADN). Invertir la muestra 25 veces para mezclar los
componentes químicos.
Paso 10: Centrifugar la muestra a 13000 rpm durante 5 minutos. Al terminar la centrifugación,
drenar el sobrenadante sobre un papel absorbente y dejar secar la muestra durante 30 minutos.
Paso 11: Después de este tiempo de secado, adicionar 25 µl de “solución de hidratación del
ADN” e incubar la muestra a 65º C por 30 minutos en el baño maría.
Paso 12: Finalmente, almacenar los tubos con el ADN a 2-8º C en el ultra-refrigerador.