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BACHARELADO EM BIOMEDICINA
PARNAÍBA
2010
1
LUCAS BRITO; RAYARA MARQUES; SANSARA SANNY; TEREZA
CRISTINA E THIAGO LOPES.
PARNAÍBA
2010
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ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO_________________________________________ 4
2. OBJETIVOS___________________________________________ 6
3. MATERIAIS____________________________________________ 7
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS_______________________ 8
5. CONCLUSÃO__________________________________________10
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_________________________11
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1. INTRODUÇÃO
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coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a
migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.
A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é
comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos
percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de
peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e
eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do
processo.
A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de
densidade ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel,
membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida,
entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não
interferir na mobilidade das moléculas. No caso de eletroforese em géis, como
poliacrilamida e agarose, a migração das moléculas é profundamente
influenciada pelas malhas porosas. Em relação a géis de poliacrilamida ou
agarose, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas,
sendo este geralmente decorrente do grau de polimerização entre os
monômeros. Géis de poliacrilamida são freqüentemente usados para análises
de alta resolução (seqüenciamento de DNA/RNA) em análises protéicas e
isoenzimáticas que requeiram maior definição das bandas. Géis de agarose
também são amplamente usados na separação de DNA/RNA, especialmente
para fragmentos maiores.
A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para
separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A
técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser
separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de
gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel
pode ser determinada diretamente.
Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo
de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao
emitir fluorescência sob luz ultravioleta. Concentrações de até 1ng de DNA
podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.
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2. OBJETIVOS
2.1 . Geral
2.2. Específicos
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3. MATERIAIS
3.2 . Eletroforese:
Amostra de DNA;
Cuba de eletroforese;
Fonte de eletroforese;
Gel de agarose;
Marcador de alto peso molecular;
Tampão de carregamento (GelRed);
Pipeta automática;
Suporte com filme de PVC;
Transluminador.
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4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Foi coletado um volume de amostra de sangue (300 µl), este foi coletado
em EDTA (anticoagulante) para prevenir a coagulação. O tubo de sangue foi
agitado suavemente para que o mesmo ficasse bem homogeneizado e, depois
o sangue foi transferido para o tubo de microcentrífuga (Eppendorf) de 1,5 ml
contendo 900μl de Cell Lysis Solution. O tubo foi invertido algumas vezes para
que a solução ficasse homogênea. A solução foi incubada por 10 minutos em
temperatura ambiente (invertendo pelo menos três vezes durante o período de
incubação) para lisar os eritrócitos. Àquela foi centrifugada a 13.000-16.000 × g
por 20 segundos à temperatura ambiente de 25ºC. O sobrenadante foi
removido e descartado o máximo possível sem agitar o sedimento visível
branco. Alguns microlitros de líquido sobrenadante permaneceram sobre o
precipitado.
O tubo foi colocado sobre o agitador Vortex por alguns segundos para
que as células brancas do sangue fossem re-suspensas (alguns segundos). Foi
adicionado 300µl de Nuclei Lysis Solution no tubo que continha as células re-
suspensas. Pipetou-se de quatro a cinco vezes a solução para lisar as células
brancas do sangue. A solução então ficou bem visguenta e foi incubada a 37°
C até que os aglomerados fossem interrompidos. Foram adicionados 1,5µl de
RNase solution para o lisado nuclear e novamente a solução foi incubada a
37°C. Adicionou-se 100µl de Protein Precipitation Solution ao lisado nuclear, e
homogeneizou vigorosamente no agitador Vortex durante 10 a 20 segundos.
Pequenos pedaços de proteína puderam ser visíveis após a homogeneização.
Centrifugou-se a mistura a 13, 000 a 16, 000 × g por 3 minutos em
temperatura ambiente. Um pedaço de proteína marrom escuro pode então ser
visto. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga
(Eppendorf) de 1,5 ml contendo 300ul de isopropanol à temperatura ambiente.
A solução foi homogeneizada até que os fios brancos de DNA formaram uma
massa visível. Esta foi centrifugada a 13, 000-16, 000 × g durante 1 minuto à
temperatura ambiente. O DNA tornou-se visível como uma pequena massa
redonda branca no fundo do microtúbulo.
O sobrenadante foi descartado e foi adicionado etanol a 70% a 25º C
sobre o DNA. O tubo foi invertido devagar, várias vezes para lavar o precipitado
de DNA e os lados do tubo de microcentrífuga e depois centrifugou-se. O
etanol foi retirado usando uma pipeta. Como o precipitado de DNA fica muito
solto neste momento, deve-se ter cuidado para não retirar o precipitado.
Posteriormente o tubo foi invertido em papel absorvente e esperamos secar o
precipitado por volta de 10 a 15 minutos. Adicionou-se 100µl de DNA
Rehydration Solution no tubo com a solução para hidratar o DNA através da
incubação a 65 ° C durante 1 hora. Periodicamente, a solução foi misturada
batendo no tubo. Alternativamente, pode se hidratar o DNA através da
incubação da solução durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 °C. Por
fim, DNA foi guardado a uma temperatura de 2 a 8 ° C.
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4.2 . ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
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5. CONCLUSÃO
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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