“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA

CORRUPCION E IMPUNIDAD”
SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO
INFORME N° 03- MV/ JLRA.

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

VETERINARIA-CANCHIS

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

Frotis y tinción de Muestras de Sangre

DOCENTE :
MVZ. MARGOT BLANCA LIRA APAZA

ESTUDIANTE :
JOANA LISSET RODRIGUEZ ARROYO

CODIGO:
051774

2019
 I. INTRODUCCIÓN

La sangre es un tipo especial de tejido conectivo constituido por elementos

formes en una matriz fluida. El plasma es la porción fluida y cuando está
desprovisto de fibrinógeno recibe el nombre de suero. Los elementos formes
son los eritrocitos (glóbulos rojos), los leucocitos (glóbulos blancos) y las
plaquetas.

Las tinciones hematológicas son el conjunto de técnicas necesarias para teñir

y diferenciar los componentes celulares de la sangre. Estos componentes
conforman la fracción forme de la sangre, y gracias a las tinciones se pueden
diferenciar en un microscopio óptico.
Las técnicas en que se basan las tinciones hematológicas hacen uso de
colorantes. Éstos interactúan con los componentes celulares dispuestos a
modo de frotis sanguíneo sobre un portaobjetos. Los colorantes son sustancias
capaces de fijarse selectivamente según su afinidad química.

El colorante de Giemsa es una solución en metanol de un colorante ácido

(eosina) y dos colorantes básicos (azur y azul de metileno). Estos colorantes
teñirán las estructuras celulares dependiendo de su carácter ácido o básico.
II. OBJETIVOS:

II.1. OBJETIVO GENERAL:

Diferenciar los distintos componentes celulares de una muestra

sanguínea.

II.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

o Conocer y utilizar el método de tinción de Giemsa para la

identificación de las partes de las células sanguíneas.
o Diferenciar las partes de una célula sanguínea de un ave.
o Diferenciar las partes de una célula sanguínea de un perro.
o Diferenciar las partes de una célula sanguínea de un humano.
o Establecer las diferencias entre las muestras de sangre de un
ave, un perro y un humano.
III. REVISION BIBLIOGRAFICA:

III.1. Métodos utilizados para el estudio de la sangre periférica

El método habitual consiste en hacer un frotis sobre un portaobjetos

de vidrio. Tras su fijación, se usa una tinción policromática (en este
caso tinción Giemsa), que pueden ser Giemsa, Wright o Leishman
para su observación con el microscopio. Generalmente, un extremo
del frotis es mucho más delgado que el otro. En la capa delgada se
pueden apreciar mejor los detalles morfológicos de la célula, ya que
las células son más aplanadas y menos densas. El frotis y tinción de
sangre periférica provoca importantes alteraciones artefactuales en
relación con la imagen in vivo, sobre todo en lo que se refiere al
tamaño y a la forma de las células, lo que ha de tenerse en cuenta en
la interpretación. Dependiendo de la afinidad de las distintas
organelas celulares para los diversos colorantes utilizados en estos
métodos, pueden identificarse cuatro características específicas de
tinción:
- Basofilia (azul oscuro) = afinidad por el colorante básico azul de
metileno; es característica del ADN nuclear y del ARN del citoplasma,
por ejemplo, de los ribosomas.
- Azurofilia (violeta) = afinidad por los colorantes azures; es típica de
los lisosomas, un tipo de gránulos presente en los leucocitos.
- Eosinofilia (rosa) = afinidad por el colorante ácido eosina (también
se denomina acidofilia); es una característica particular de la
hemoglobina que ocupa el citoplasma de los hematíes.
- Neutrofilia (rosa asalmonado/lila) = afinidad por un colorante que se
creía erróneamente tenía un pH neutro; es característica de los
gránulos citoplasmáticos específicos de los leucocitos neutrófilos.

3.2. Tipos de células sanguíneas

3.2.1. Hematíes (eritrocitos, células rojas)

Los eritrocitos maduros son células pequeñas y anucleadas altamente
adaptadas para el transporte de oxígeno y anhídrido carbónico hacia y
desde los tejidos. Son acidófilos o eosinófilos y adquieren una coloración de
naranja a rojo con la coloración de Romanovsky debido a su alto contenido
en un pigmento respiratorio que contiene hierro, la hemoglobina, que es una
proteína básica.
El diámetro promedio de los eritrocitos en un frotis seco varía con la
especie. Los eritrocitos del perro son los más grandes (7 um). La palidez
central que refleja la forma bicóncava de los eritrocitos está mejor definida
en el perro, pero puede observarse en otros mamíferos domésticos.

La apariencia de los glóbulos rojos (y también de los blancos) depende de

varios factores. Estos incluyen el tiempo transcurrido desde la extracción de
la sangre hasta la confección del frotis, el empleo de anticoagulantes, con
qué rapidez se secó el frotis y el grosor del extendido. La presencia de la
palidez central, la formación de pilas de monedas y la crenación no sólo
varían con la especie animal, sino también con cada frotis y entre diferentes
zonas del mismo frotis.

En las AVES los eritrocitos maduros son muy diferentes de los de los
mamíferos domésticos. Son grandes, elongados y aplanados con un núcleo
ovalado. Miden 9-12 um de largo por 6-8 um de ancho. El tamaño varía con
la raza y el sexo del ave. El núcleo contiene grumos de cromatina pequeños
y uniformemente distribuidos. El citoplasma se tiñe de color naranja pálido a
rosado.

3.2.2. Leucocitos (células blancas)

Los leucocitos son componentes celulares básicos del sistema inmune. Son
células nucleadas, mayores que los eritrocitos pero menos numerosos. Los
leucocitos tienden a acumularse en el borde del extendido sanguíneo, por lo
tanto es la zona de elección para buscarlos, aun cuando a menudo
aparecen con distorsión.
 Dependiendo de la presencia o ausencia de gránulos específicos en su
citoplasma, se clasifican como granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y
basófilos) o agranulocitos (linfocitos y monocitos).

Debido a la variabilidad en la forma del núcleo de los granulocitos, también se

denominan leucocitos polimorfo-nucleares (polimorfos, PMN). Sin embargo,
este término suele usarse de manera específica como sinónimo de neutrófilos.
Los linfocitos son los leucocitos predominantes en los rumiantes y en el cerdo.
Su tamaño oscila entre 6 y 15 micras y suele clasificárselos como linfocitos
pequeños, medianos y grandes.
En las AVES los linfocitos son los leucocitos más numerosos. Su tamaño
variable también permite clasificarlos en pequeños y grandes como en el caso
de los mamíferos. El citoplasma es levemente basófilo y puede ser granular u
homogéneo. El núcleo es redondo, a veces ligeramente indentado y central.
Contiene gruesos grumos de cromatina excepto en los grandes linfocitos,
donde son más delicados.

Los monocitos constituyen los leucocitos de mayor tamaño (15-20 um de

diámetro). La cromatina nuclear tiende a ser difusa y se observa en forma de
parches o semejantes al encaje. La forma
del núcleo es muy variable; puede ser
ovalado, irregular, arriñonado o tener forma
de hoz. En las AVES los monocitos son
usualmente más grandes que los linfocitos.
La cromatina del núcleo tiende a ser más
difusa, mientras que el citoplasma presenta
a menudo vacuolas.
Los neutrófilos son los leucocitos predominantes en el perro, el gato y el
caballo. El núcleo oscuro de la célula madura contiene cromatina densamente
aglutinada, es largo y angosto y puede ser monolobulado o segmentado.
Los gránulos son más pequeños en el perro, de tal manera que el citoplasma
parece muy tenue y sin gránulos.
En las AVES los neutrófilos se denominan “heterófilos” y son los granulocitos
más abundantes. Presentan un núcleo polimórfico y al igual que los eosinófilos,
presentan gránulos específicos acidófilos. Los gránulos del heterófilo tienen
forma de bastón o huso. Su centro contiene un granulo distintivo, específico, de
color rojo rubí. Durante la tinción los bastones pueden disolverse por completo
o en parte, quedando sólo el granulo central más estable.

El núcleo del eosinófílo es similar al del neutrófilo

pero tiende a tener menos lóbulos y es menos
denso.
El citoplasma del eosinófílo se tiñe de azul pálido
o gris. Los gránulos específicos se tiñen de
diversos tonos de naranja, rojo o rosado con la
eosina. Los gránulos del eosinófílo del perro
tienen tamaños variables y no llenan en general
completamente el citoplasma, como ocurre en
otros mamíferos domésticos. En ocasiones,
también se observan pequeñas vacuolas claras en
el citoplasma.

En las AVES los gránulos de los eosinófilos son redondos y de color rosado. El
citoplasma se tiñe de azul pálido en
comparación con el citoplasma claro del
heterófilo. Poseen un núcleo polimórfico con
menos lóbulos que el del heterófilo y su
cromatina se presenta en forma de densos
bloques bien separados por áreas más claras.
Esto contrasta con la cromatina con menos
grumos del núcleo del heterófilo. Sólo un
pequeño porcentaje (0,5-3%) de los leucocitos
de los animales domésticos son basófilos y por
lo tanto a menudo pueden no verse en los frotis.

El núcleo del basófilo puede ser irregular, bilobulado o muy segmentado. Los

gránulos de los basófilos varían en tamaño, número e intensidad del color. A
menudo son grandes, redondos u ovalados y se tiñen de púrpura rojizo a
púrpura oscuro. En las AVES los basófilos son mucho más numerosos que en
los mamíferos. Los gránulos específicos son profundamente basófilos y el
núcleo es unilobular y pálido.

3.2.3. PLAQUETAS (TROMBOCITOS)

Las plaquetas juegan un papel muy importante en la hemostasia. Aunque
también se las conoce como trombocitos, no
son células sino fragmentos citoplasmáticos
rodeados por membrana que derivan de
grandes células denominadas megacariocitos,
que se encuentran en la médula ósea y a
veces en los ganglios linfáticos y el bazo. Las
plaquetas son pequeñas, de color azul pálido
y presentan gránulos púrpuras en el centro en
las muestras coloreadas. En los frotis de
sangre periférica aparecen como elementos individuales o en grupos.
En las AVES los trombocitos son células nucleadas con funciones similares a
las de las plaquetas de los mamíferos. Son más pequeños y menos
elongados que los eritrocitos y presentan un núcleo más grande y
redondeado. El citoplasma, pálido y azulado, se caracteriza por presentar
pequeños gránulos de color magenta y vacuolas.

3.3. TINCIÓN DE GIEMSA

3.3.1. ¿QUÉ ES?
La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada
en la mezcla de colorantes ácidos y básicos. Su creación estuvo inspirada por
el trabajo realizado por Romanowsky, donde Gustav Giemsa, químico y
bacteriólogo originario de Alemania, la perfeccionó agregando glicerol para
estabilizar los compuestos.
La técnica de tinción de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que
permite la observación de estructuras específicas de las células. Esta técnica
tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y gránulos de las células,
pudiéndose distinguir incluso finas trazas de cromatina.
Además, se pueden detectar cambios significativos en el tamaño, forma o
coloración del núcleo, donde es posible visualizar la pérdida de la relación
núcleo – citoplasma.
Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento utilizar un
contraste entre colorantes ácidos y básicos, para lograr teñir las estructuras
básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar existe una
afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa.
El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados
(Azure A y Azure B), mientras que el colorante ácido es la eosina.
Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos
de los segmentados basófilos, entre otras, por tanto serán teñidos con el azul
de metileno.
En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la
hemoglobina y algunos gránulos como los contenidos en los segmentados
eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la eosina.
Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azure se caracterizan por
ser colorantes metacromáticos, estos pueden brindar una tonalidad variable a
las distintas estructuras de acuerdo a la carga de polianiones que posean.
Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos logran
desarrollar una amplio espectro de colores, de acuerdo con las características
bioquímicas de cada estructura, paseándose por tonalidades azules pálidas,
azules oscuras, lila y púrpura en el caso de las estructuras ácidas.
Mientras que la coloración que brinda la eosina es más estable, generando
colores entre rojizo- naranja y salmón.

3.3.2. Preparación de la solución madre

Requiere pesar 600 mg de colorante Giemsa en polvo, medir 500 cc de
alcohol metílico libre de acetona y 50 cc de glicerina neutra. Colocar el polvo
de Giemsa pesado en un mortero. Si existen grumos se deben pulverizar.
Posteriormente agregar una cantidad apreciable de la glicerina medida y
mezclar muy bien. La mezcla obtenida se vierte a un frasco color ámbar muy
limpio. El resto de la glicerina se coloca en el mortero. Volver a mezclar para
limpiar el resto de colorante que haya quedado pegado a las paredes del
mortero y echar al mismo frasco.
El frasco se tapa y se lleva durante 2 horas en baño maría a 55 ºC.  Mientras
se encuentre en baño de maría, realizar ligeras agitaciones de la mezcla cada
media hora aproximadamente. Posteriormente, se deja enfriar la mezcla para
colocar el alcohol. Previamente, una parte del alcohol medido se coloca en el
mortero para terminar de lavar lo que quede de colorante y seguidamente se
adiciona a la mezcla junto al resto del alcohol. Esta preparación se debe dejar
madurar durante al menos 2 semanas. La porción que se vaya utilizando de
la solución madre debe ser filtrada. Para evitar la contaminación del
preparado, se recomienda pasar la porción que va a estar en constante uso a
un frasco ámbar pequeño con gotero. Recargar cada vez que se agote el
reactivo.
3.3.3. Preparación de la solución Buffer
Se pesan 6,77 gr de fosfato de sodio (anhidro) (NaHPO 4), 2,59 gr de fosfato
dihidrógeno de potasio (KH2PO4) y agua destilada hasta 1000 cc. Esta
solución debe tener un pH de 7,2.

3.3.4. Preparación final del colorante

Se miden 1cc de la solución madre filtrada y se mezclan con 9 cc de la
solución buffer. Se agita la mezcla. Un dato relevante que hay que tener en
cuenta, es que las técnicas de preparación del colorante pueden cambiar
según la casa comercial.
IV. MATERIALES Y MÉTODOLOGÍA

IV.1. MATERIALES:

o Muestra de sangre o Solución Giemsa

de ave (pavo) o Porta objetos
o Muestra de sangre o Alcohol
de perro o Agua destilada
o Muestra de sangre o Gotero
de humano o Papel toalla

IV.2. METODOLOGÍA:

Para los 3 tipos de muestra de

sangre realizaremos el mismo
procedimiento, que detallaré a
continuación:

IV.2.1. Preparamos 2 portaobjetos limpios

IV.2.2. Extraemos 1 gota de muestra de sangre y lo colocamos en un
extremo del portaobjetos.
IV.2.3. Con el otro portaobjetos (en un ángulo de 45°) lo distribuimos de
manera homogénea y con un solo movimiento constante hasta antes
de llegar al otro extremo.
IV.2.4. Dejamos secar un par de minutos.

IV.2.5. Para la fijación sumergimos las muestras en alcohol de 70°, durante

3 minutos.

IV.2.6. Enjuagamos las muestras con agua destilada.

IV.2.7. Colocamos la solución Giemsa sobre cada muestra de sangre,
dejándolo actuar durante 10 minutos.
IV.2.8. Pasado este tiempo volvemos a enjuagar con agua destilada, y
secamos el excedente de agua.

IV.2.9. A continuación observamos al microscopio cada muestra de sangre y

hacemos reconocimientos de los tipos de células, al mismo tiempo
establecemos las diferencias entre cada especie.

Vista a 10X . Células sanguíneas del Pavo

 Vista a 10X . Células sanguíneas de un perro

Fotografía de células sanguíneas de un humano

Fuente: Wikipedia
V. RESULTADOS

Podemos apreciar lo siguiente:

V.1. En la muestra de sangre de ave, observamos eritrocitos maduros,

grandes, elongados y aplanados con un núcleo ovalado. El núcleo
contiene grumos de cromatina pequeños y uniformemente
distribuidos, también se logran ver monocitos (2 und) y 1 neutrófilo.

V.2. En la muestra de sangre de perro observamos los eritrocitos un poco

más grandes aunque con cierta palidez central que refleja su forma
bicóncava, en este caso la muestra no se aprecia bien por la
hemostasia debido a los errores que se cometieron en la recolección
de muestra. También observamos monocitos (4 und) y neutrófilos (1).

V.3. En la muestra de sangre de una persona, no pudimos observar nada,

debido a los errores que se cometieron en la forma de recolección,
pero al ver la fotografía referencial observamos la forma circular y
definida de los eritrocitos con un núcleo grande y esférico.

VI. RECOMENDACIONES

VI.1. La forma de recolección de cada muestra deberá hacerse de manera

segura, utilizando un tubo morado que contenga anticoagulante
(heparina), evitando sacudirlo bruscamente ya que esto produce
muerte de las células sanguíneas.

VI.2. La nitidez con la que podamos observar en el microscopio

dependerá de cuan bien hicimos el frotis y el método de tinción,
respetando los intervalos de tiempo y la forma correcta en las que se
utilizan.
 VII. BIBLIOGRAFIA

https://www.franrzmn.com/realizacion-de-un-frotis-sanguineo/

https://www.franrzmn.com/tincion-de-giemsa/

https://ateuves.es/estudio-morfologico-de-las-celulas-sanguineas/

https://es.slideshare.net/adnestelamartin/31-0315-celulas-sanguineas-en-aves

https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_sangu%C3%ADneas