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CONOCIMIENTOS PREVIOS

COLORACIÓN GIEMSA

Principios de la técnica

Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento utilizar un contraste entre colorantes ácidos
y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar
existe una afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa.

El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B),
mientras que el colorante ácido es la eosina.

Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados
basófilos, entre otras, por tanto, serán teñidos con el azul de metileno.

En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la hemoglobina y algunos gránulos
como los contenidos en los segmentados eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la eosina.

Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azufre se caracterizan por ser colorantes
metacromáticos, estos pueden brindar una tonalidad variable a las distintas estructuras de acuerdo a la
carga de polianiones que posean.

Es así como la combinación estratégica de colorantes


básicos y ácidos logran desarrollar un amplio espectro de
colores, de acuerdo con las características bioquímicas de
cada estructura, paseándose por tonalidades azules
pálidas, azules oscuros, lila y púrpura en el caso de las
estructuras ácidas.

Mientras que la coloración que brinda la eosina es más


estable, generando colores entre rojizo- naranja y salmón.
Procedimiento

1.- Fijar la extensión de sangre con metanol duran.

2.- Cubrir la extensión de sangre con colorante Giemsa diluido:

– 1 mL de solución stock de Giemsa en 9 mL de agua destilada o buffer fosfato (PBS)

3.- Dejar actuar en reposo por 30 minutos.

4.- Lavar con agua corriente.

5.- Dejar caer el chorro de agua en forma suave,


empezando por el borde de la lámina inclinada.

6.- Dejar secar a temperatura ambiente.

7.- Observar en el microscopio con objetivo de


menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersión (l00x).

Utilidad principal
La técnica de tinción de Giemsa es utilizada en diversas áreas, entre ellas: en hematología, micología,
bacteriología, parasitología, citología y citogenética.

 Hematología

Es la utilidad más frecuente que se le da a esta tinción. Con ella se logran identificar todas y cada una
de las células presentes en muestras de médula ósea o sangre periférica. Así como estimar el número de
cada serie, pudiéndose detectar leucocitosis o leucopenia, trombocitopenia, etc. Debido a que es
sensible para identificar células inmaduras, es relevante en el diagnóstico de leucemias agudas o
crónicas. También es posible hacer el diagnóstico de anemias, como la anemia drepanocítica,
falciforme, entre otras.

 Micología

En esta área es común su utilización para la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfico


intracelular) en muestras de tejidos.

 Bacteriología

En frotis hematológicos teñidos con Giemsa es


posible detectar Borrelias sp en pacientes que
cursan con la enfermedad denominada fiebre
recurrentes. Las espiroquetas se observan
abundantes entre los eritrocitos, en muestras
tomadas en el pico febril.

También es posible visualizar bacterias


intracelulares como Rickettsias sp y Chlamydia
trachomatis en células infectadas.

 Parasitología

En el campo de la parasitología, la tinción de Giemsa ha permitido hacer el diagnóstico de


enfermedades parasitarias tales como la malaria, el mal de Chagas y la leishmaniasis.
En las dos primeras los parásitos Plasmodium sp y el Tripanosoma cruzi respectivamente pueden
visualizarse en sangre periférica de los pacientes infectados, los mismos pueden encontrarse en
diversos estadios según la fase en la que esté la enfermedad. Para mejorar la búsqueda de parásitos en
sangre se recomienda usar la tinción de Giemsa mezclado con el colorante de May-Grünwald. Así
mismo, la leishmaniasis cutánea puede diagnosticarse al evaluar muestras de biopsias de piel teñidas
con Giemsa, donde se encuentra el parásito.

COLORACIÓN WRIGHT

Principios de la técnica

La tinción de Wright nació de la tinción de Romanowsky, que consiste en una solución de alcohol


metílico de un colorante ácido (eosina Y) y otro básico (azul de metileno) y sus productos de
oxidación. La mezcla de colorantes usados en la tinción de Wright provoca el efecto conocido como
Romanowsky, es decir, proporciona una hermosa coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a
los gránulos neutrofílicos, mientras que los glóbulos rojos se tiñen de color rosado.

Los componentes responsables de dar la gama de colores típica de la tinción de Wright son el azul B y
la eosina Y. El efecto observado dependerá del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y a
las interacciones del azul B y la eosina Y. Las estructuras ácidas tales como los ácidos nucleicos, las
proteínas nucleares y el citoplasma inmaduro reactivo de algunos tipos de células, fijan el azul B
(colorante básico). Mientras que las estructuras básicas tales como la hemoglobina, los gránulos de los
segmentados eosinófilos, entre otras estructuras celulares, fijan la eosina Y (colorante ácido).
El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores, como el pH del colorante Wright, de
la solución amortiguadora y de lavado; así como el tiempo de tinción y de fijación. Por ello, cada paso
en la preparación de los reactivos es crucial y debe ser realizado cuidando cada detalle.

Procedimiento

1.- Cubrir la extensión de sangre con unas gotas de

colorante Wright. Contar las gotas.

2.- Dejar actuar en reposo durante 1 – 2 minutos.

3.- Agregar sobre el colorante el mismo número de


gotas de solución amortiguada tamponada y
mezclar rápidamente, que puede ser hecho soplando
suavemente (debe formarse una capa plateada).

4.- Dejar reposar la mezcla por 10 minutos

5.- Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de
la lámina inclinada.

6.- Dejar secar a temperatura ambiente.

7.-Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersión

(l00x).
Utilidad principal

 Hematología

Es ideal para la tinción de frotis de sangre periférica, para


el examen de gota gruesa de sangre y para el estudio de
células de muestras de médula ósea. Debido a las
propiedades químicas de esta combinación de colorantes
las estructuras celulares pueden ser fácilmente
reconocidas, pudiéndose distinguir los diferentes tipos de
células presentes.

 Secreción Nasal

Esta técnica es muy útil para identificar las células de la secreción nasal (células epiteliales,
segmentados eosinófilos, polimorfonucleares) en el diagnóstico de rinitis alérgicas.

 Parasitología

En este sentido, ha sido útil para el estudio de Leishmania sp dentro de los histiocitos del tejido celular
subcutáneo en úlceras de la piel. Así mismo, es empleada
para identificar leucocitos en muestra de heces (leucograma
fecal).

En este caso, es de interés para el médico saber si la


leucocitosis presente en las heces es por polimorfonucleares o
mononucleares. Este hallazgo en la leucograma fecal
orientará si se trata de una infección bacteriana o viral
respectivamente.

Por otra parte, los parásitos que circulan en la sangre pueden


hallarse dentro del eritrocito o libres en el plasma. Los
parásitos buscados son Plasmodium spp, Trypanosoma
cruzi y filarias, y en veterinaria es útil en la búsqueda de Theileria equi  y Babesia caballi, agentes
causales de la babesiosis, especialmente en equinos.

La coloración de Wright y también la de Giemsa permiten diferenciar los hemoparásitos de los


componentes celulares normales. Para ello se pueden utilizar dos tipos de extendidos:

 Gota gruesa

Esta metodología se usa para investigar la presencia de parásitos en una mayor cantidad de sangre. Para
ello se coloca sobre un portaobjetos una gota grande de sangre. Una vez allí se debe desfibrinar,
haciendo círculos cada vez más grandes desde el centro hacia afuera, utilizando para ello el borde de
otro portaobjeto. Finalmente, para poder observar los parásitos en el frotis grueso los eritrocitos deben
ser lisados con agua.

 Bacteriología

El uso de esta técnica en bacteriología es limitado, debido a que no es buena para teñir a las bacterias,
es por ello que para la tinción de las mismas se usan otras técnicas de coloración especializadas. Sin
embargo, se ha empleado para buscar células epiteliales con cuerpos de inclusión de Chlamydia
trachomatis en frotis de mucosa uretral o endocervical, aunque hay que reconocer que no es el mejor
método para ello. También es posible observar entre los glóbulos rojos bacterias tipo espiral como
la Borrelia  burgdorferi en pacientes infectados, así como mórulas o cuerpos de inclusión de Ehrlichia
sp en el citoplasma de linfocitos, monocitos o neutrófilos en un frotis sanguíneo.

 Micología

El Histoplasma capsulatum es un hongo patógeno frecuentemente diagnosticado por la observación


microscópica de diversas muestras de tejidos, teñidas con tinción de Wright.

¿Qué técnica de coloración se utilizó para la diferenciación de los parásitos en la sangre?


Sustente los principios de dicha técnica mediante referencias bibliográficas.
La técnica para identificar la especie de los parásitos es la de coloración Wright (colorante tipo
Romanowvsky) por la presencia de metanol en su composición, lo que permite ahorrarnos el paso
previo de fijación antes de teñir la muestra.

El colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes ácidas de las células)
y eosina (que tiñe las partes alcalinas), disueltos en metanol (que permite la fijación de las células) y
con esto la diferenciación de los parásitos.

¿Qué indica el reporte en base a cruces para el diagnóstico de la malaria?

La cuantificación de los parásitos (parasitemia) se mide en base a la cantidad de cruces, es decir la


densidad parasitaria luego del examen de 100 campos microscópicos será expresada en cruces de la
siguiente forma:

 Mas de 200 parásitos por campos en 100 campos observados indicaran ++++
 De 2 a 20 parásitos por campo en 100 campos observados indicaran ++
 1 parásito por campo en 100 campos observados indicara +
 De 40 a 60 parásitos en 100 campos observados indicaran ½+
 Menos de 40 parásitos en 100 campos observados se indicarán en números.

¿Qué diferencia existe entre las dos técnicas de coloración utilizadas? Sustente los principios
mediante referencias bibliográficas.

La tinción Giemsa, ideada por el alemán Gustav Giemsa, es un método habitual para el examen de
frotis sanguíneo, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Los poliorganismos que forman
parte de una muestra biológica adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de
la célula huésped. La técnica de Giemsa esta formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados
combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte acido lo que da una amplia gama
de colores y permite cuantificar los parásitos.

Eritrocitos Rosa asalmonado


Plaquetas Violeta

Tipo de leucocitos Núcleo Citoplasma Granulaciones


Neutrófilo Violeta a rojizo - Violeta
Eosinófilo Violeta a rojizo - Rojo ladrillo a pardo rojizo
Basófilo Violeta a rojizo - Violeta oscuro a negro
Monocito Violeta a rojizo Azul-grisáceo -
Linfocito Violeta Azul -

La tinción de Wright al igual que Giemsa es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la
diferenciación de los tipos de célula de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y
punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. Es una tinción de tipo Romanowcky en azul
de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B

PREGUNTAS DE REFLEXIÓN

Manifieste usted porque es importante conocer el fundamento de la coloración Giemsa y Wright.

Porque de esa forma nos permitirá inferir de manera lógica por qué las reacciones químicas colorean a
ciertas células y porque a otras no. Porque si no lo conocemos jamás llegaremos a entender como es
que la tinción Wrigth permite identificar la especie del parasito y como es que la coloración Giemsa
permite cuantificar la parasitemia; si no conocemos el fundamento de estas tinciones nos limitaríamos a
solo memorizar los resultados y no a deducirlos de manera razonable.

VOCABULARIO

 Anopheles: Es un género de mosquito de la familia Culicidae que habita en prácticamente todo


el mundo incluyendo Europa, África, Asia, América y Oceanía, con especial intensidad en las
zonas templadas, tropicales y subtropicales.

 Plasmodium:Esun género de protistas del filo Apicomplexa, clase Aconoidasida, orden Haemo
sporida y familia Plasmodiidae del que se conocen más de 175 especies. El parásito siempre
tiene dos huéspedes en su ciclo vital: un mosquito que actúa como vector y un
huésped vertebrado.
 Merozoito: Un merozoíto es una etapa del ciclo de vida de un parásito protozoario, resultado de
la reproducción asexual por división múltiple. Durante la merogonia, el núcleo se divide varias
veces y cada fragmento, al romperse la célula, adquiere una porción del citoplasma.

 Tincion Romanovscky: Es una técnica de tinción prototípica que fue predecesora de varios


métodos distintos, pero basados en principios similares entre los que se incluyen las tinciones
de Giemsa, Jenner, Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar
diferentes tipos de células en especímenes patológicos.

 Azul de metileno: Cuyo nombre científico es cloruro de metiltionina, es un colorante orgánico


que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia.

 Eosina: Es un colorante llamado así por su color rosa, semejante al de la aurora. Es un polvo


rojo insoluble en agua, benceno o cloroformo. Es soluble en alcohol, o soluciones alcalinas.
Tiene carácter ácido, por lo cual tiñe sustancias básicas, que a su vez son denominadas
eosinófilas por su afinidad por la eosina.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. 997939.pdf [Internet]. [citado 12 de mayo de 2019]. Disponible en:


http://www.cromakit.es/pdfs/inserts/997939.pdf

2. CEIVD10_es.pdf [Internet]. [citado 12 de mayo de 2019]. Disponible en:


https://www.itwreagents.com/download_file/ce_ivd_instructions/CEIVD10/es/CEIVD10_es.pdf

3. Acuña Zúñiga AM, Cabrera de los Santos F, Combol Martínez AM. Diagnóstico de
enteroparasitoris humanas. [Internet]. Montevideo: D - Universidad de la República; 2017 [citado 5
de mayo de 2019]. Disponible en: http://public.eblib.com/choice/publicfullrecord.aspx?p=5213801

4. López-Jácome LE, Hernández-Durán M, Colín-Castro CA, Ortega-Peña S, Cerón-González G,


Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. 2014;9.

5. Rodríguez por F. Tinción de Wright [Internet]. Blog de Laboratorio Clínico y Biomédico. 2017
[citado 12 de mayo de 2019]. Disponible en: https://www.franrzmn.com/tincion-de-wright/

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