IDENTIFICACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS Y LEY DE

BEER
Jesús David Bolaño Jiménez1, Marcos Fidel Jiménez Barros

1
, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del atlántico, Km 7 Via Puerto,
Barranquilla, Atlántico.
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Abstract.

El objetivo principal de esta práctica fue colocar a prueba todo el fundamento teórico recibido
en clases anteriormente, en esta primordialmente se analizó el equipo (sus partes, software,
amplificadores, etc…), luego se realizaron una serie de mediciones de la absorbancia en un
intervalo de longitudes de onda (visible), para fundamentar teóricamente lo que aprendido.

KEYWORDS O PALABRAS CLAVES

Espectrofotometría, Ley de Lambert-Beer, absortividad molar, Uv-Vis, Absorbancia,

Transmitancia, Transiciones electrónicas, Orbitales moleculares.

1. INTRODUCCION

Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias
químicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la
absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en
ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a
las mediciones a una determinada longitud de onda. La teoría ondulatoria de la luz propone la
idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta
longitud de onda está asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad
definida de energía.

La espectroscopia por absorción molecular en las regiones ultravioleta y visible del espectro se
usa ampliamente en la determinación cuantitativa de una gran cantidad de especies inorgánicas,
orgánicas y biológicas. La espectroscopia por absorción molecular, se basa en la medición de la
transmitancia T o de la absorbancia A de soluciones que están en celdas transparentes que
tienen una longitud de trayectoria de b cm. Normalmente, la concentración de un analito
absorbente se relaciona en forma lineal con la absorbancia según la ley de Beer-Lambert:

Po
A=−log T =log =εbc
P
El Principio de Lambert. Un cuerpo que radia obedece a la ley de Lambert, si su luminancia
espectral energética es la misma para un elemento cualquiera de su superficie, y no está en
función de la dirección de emisión.

El Principio de Beer. La absorbancia de una sustancia o especie, está directamente relacionada

a su concentración.

La ley de Lambert-Beer, establece que la absorbancia está directamente relacionada con las
propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del
haz de radiación al atravesar la muestra.

A=εbC

Donde:

A: absorbancia.
ε: coeficiente de absortividad molar .
b: longitud de la cubeta o del paso óptico.
C: concentración de la especie.

Las propiedades de ley de Beer-Lambert:

 Se cumple para cualquier longitud de paso óptico.

 Se cumple siempre que no se solape la superficie de captura del fotón, es decir, para
cambios de C en disoluciones diluidas.
 Siempre que se conserve la especie y la longitud de onda.
 Depende de la molécula, es decir, de ε (coeficiente de absortividad molar).
 Si varias especies interaccionan a esa longitud de onda es una magnitud aditiva.

Limitaciones de la ley de Lambert-Beer.

1. sólo se cumple para concentraciones bajas, a partir de una concentración 0,01M

empieza a haber desviaciones de la linealidad.

2. Si la concentración es mayor de 0.01M la distancia promedio entre las especies

disminuye hasta el punto en que cada una afecta la distribución de carga de sus vecinas,
alterando la capacidad de absorción a una longitud de onda.

3. En soluciones de baja concentración del absorbente, pero a altas concentraciones de

otras especies (como electrolitos), la gran proximidad de iones al absorbente altera la
absortividad molar. Este efecto se puede reducir al diluir.

4. Limitaciones debidas a desviaciones químicas: Tienen lugar cuando el analito se

disocia, asocia o reacciona con el disolvente para dar lugar a un producto con un
espectro de absorción, diferente al del analito. La ley de Beer no se cumple debido a los
cambios en los equilibrios que se producen.

2
 5. Desviaciones instrumentales con radiaciones policromáticas. Otra de las razones por
las que no obtenemos una linealidad se puede deber a desviaciones instrumentales, del
instrumento en sí. Si seleccionamos una longitud de onda única, lo ideal sería que el
monocromador dejase escapar esa longitud de onda que seleccionamos (Radiación
monocromática). Sin embargo la resolución del monocromador no está buena como
para dejar pasar una sola longitud de onda.

Desviaciones de la ley de Lambert-Beer.

Las desviaciones a la Ley de Beer caen en tres categorías: reales, instrumentales y químicas.
Dichas desviaciones pueden ser positivas (si la absorbancia medida es mayor que la real) o
negativas (si la absorbancia medida es menor que la real) y llevan a que no se obtengan
relaciones lineales entre la absorbancia y la concentración.

Las desviaciones reales provienen de los cambios en el índice de refracción del sistema
analítico, pues como depende del índice de refracción de la muestra, la ley de Beer sólo se
cumple para bajas concentraciones, en donde el índice de refracción es esencialmente constante,
ya que no es la absortividad la que es constante.

Las desviaciones instrumentales provienen, en primer lugar de la utilización de luz no

monocromática, ya que la pureza espectral del haz de radiación proveniente de la fuente,
depende del ancho de banda espectral del monocromador. La deducción de la ley de Beer
supone radiación monocromática y los monocromadores en realidad proporcionan una banda de
longitudes de onda.

Las desviaciones químicas a la ley de Beer también se llaman desviaciones aparentes porque
dependen de la naturaleza química del sistema en estudio y si se trabaja bajo ciertas condiciones
(pH, concentración de reactivos, etc.) es posible hacer que el sistema cumpla dicha ley. Las
desviaciones son causadas, generalmente, por equilibrios en solución que involucran a la
especie absorbente y alteran su concentración originando desviaciones positivas o negativas. Si
alguna reacción química que ocurra en el sistema origina un producto que absorba más
fuertemente que la sustancia ensayada, a la longitud de onda a la cual se hace la medida o
longitud de onda analítica, se producirá una desviación positiva. Si, al contrario, se origina un
producto que no absorbe a la longitud de onda analítica, la concentración de la sustancia se verá
disminuida y se originará una desviación negativa.

Cuando dos átomos forman un enlace químico, los orbitales atómicos de cada uno de ellos se
combinan para formar dos orbitales moleculares, uno de baja energía que es el orbital enlazaste
y otro de energía mayor, que es el orbital antienlazante (Figura 1). Los enlaces covalentes que se
originan entre los orbitales de dos átomos que se enlazan químicamente pueden ser de dos tipos
y se conocen como enlaces σ y enlaces π.

3
Figura 1. Formación de los orbitales σ y σ* por traslapamiento frontal de dos orbitales atómicos s y p,
así como enlaces π y π* por traslapamiento lateral de los orbitales p.

Al efectuarse dicho enlace covalente se forman simultáneamente orbitales antienlazantes: σ* en

el caso de un orbital molecular enlazante σ y π* en el caso de un orbital molecular enlazante π.
Los electrones que no participan en la formación de enlaces covalentes en la molécula, se
denominan electrones n o no enlazantes. En las moléculas orgánicas los electrones n están
localizados principalmente en los orbitales atómicos de átomos como: Nitrógeno, Oxígeno,
Azufre y del grupo de los halógenos. El diagrama de energía para los orbitales moleculares
enlazante, antienlazante y no enlazante así como las transiciones electrónicas posibles es el
mostrado en la Figura 2. La absorción de energía radiante en el Ultravioleta o Visible por los
electrones n, σ ó π resulta en la excitación de éstos, los cuales pasan a ocupar alguno de los
orbitales antienlazantes. La absorción de radiación Ultravioleta o Visible es capaz de efectuar
dichas transiciones.

Figura 2. Diagrama de niveles energéticos para diferentes orbitales moleculares y las

transiciones posibles en éstos.

4
En la Figura 2 se representan las transiciones posibles en una molécula. De acuerdo a este
diagrama el orden energético en estas transiciones el de mayor energía es σ→σ∗ y el de menor
energía n →π∗ Mientras mayor sea la energía requerida para una determinada transición, menor
es la longitud de onda de la radiación que debe suministrarse para conseguir tal fin; por ejemplo:
la transición σ→σ∗ para el propano requiere de radiación de 135 nm, la cual se encuentra en la
región del Ultravioleta lejano por lo que es necesario un equipo de alto vacío si se desea estudiar
dicha región del espectro. La transición n →π∗ es la que requiere de menor energía y mayor
longitud de onda. Las cetonas y aldehídos saturados efectúan esta transición a una longitud de
onda de aproximadamente 285 nm. Es necesario hacer notar que asociado a estas transiciones
electrónicas existen cambios rotacionales y vibracionales en la molécula lo cual origina que el
espectro obtenido se aun espectro de bandas y no un espectro de una o más líneas agudas, como
sí ocurre en un átomo.

Algunos términos utilizados muy frecuentemente en espectroscopia UV y Visible son:

cromóforo, auxocromo, efecto batocrómico y efecto hipsocrómico. La mayoría de las
aplicaciones de la espectroscopía de absorción a compuestos orgánicos se basa en transiciones
de electrones n ó π al estado excitado π∗, ya que las energías que se requieren para estos
procesos conducen a picos en una región espectral conveniente experimentalmente ( 200-700
nm ), ambas transiciones requieren la presencia de un grupo funcional que suministre los
orbitales π .Hablando estrictamente, es a estos centros absorbentes insaturados a los que se les
aplica el término CROMÓFORO.

AUXOCROMO. Es un grupo funcional que no absorbe por si solo en la región del ultravioleta
pero tiene en efecto de desplazar los picos de los cromóforos hacia longitudes de onda largas,
además de aumentar su intensidad. Los picos asociados a transiciones n→ π∗ se desplazan,
generalmente, hacia longitudes de onda más cortas (un desplazamiento hacia el azul) a medida
que aumenta la polaridad del disolvente. Este efecto se conoce como efecto hipsocrómico.

En los sistemas en que son posibles transiciones π→π∗, el estado excitado es más polar que el
estado basal; como resultado de esto, la transición π→π* ocurrirá a mayores longitudes de onda
en solventes polares que en solventes no polares. Este desplazamiento hacia el rojo del espectro
visible se conoce como efecto batocrómico.

DISOLVENTES. Las consideraciones que se tienen que hacer al elegir un disolvente no solo
con respecto a su transparencia, sino también respecto a sus posibles efectos sobre el sistema
absorbente. Normalmente, los disolventes polares tales como el agua, alcoholes, ésteres y
cetonas tienden a eliminar la estructura fina del espectro como resultado de los efectos
vibracionales. Se observan más fácilmente en disolventes no polares como los hidrocarburos.
Además, las posiciones de los máximos de absorbancia están afectados por la naturaleza del
disolvente.

Entre los disolventes comunes para espectroscopia UV se incluyen el agua, el etanol del 95%,
el ciclo hexano y el 1,4 dioxano. El disolvente no debe absorber radiación en las bandas de
estudio, de ahí la importancia de conocer las transiciones electrónicas de un disolvente.

5
2. EXPERIMENTAL

Espectro de absorción
del CoCl2 * 6H2O

Se tomó nota de los componentes y del

funcionamiento del espectrofotómetro, las
cubetas y el software de este.

Se agregó en 2 cubetas agua destilada

(blancos) y se midió su absorbancia.

En una cubeta se añadió CoCl 2 * 6H2O y

se midió su espectro de absorción
(muestra 1)

Se tomaron 10 mL de la muestra 1 y se
trasvaso a un matraz de 25 mL, este se
llevó hasta el aforo con agua destilada
(muestra 2), se midió espectro.

De la muestra 2 se tomó una alícuota de 5

mL y se pasaron a un matraz de 25 mL,
este se llevó hasta el aforo con agua
destilada (muestra 3). Se midió espectro.

A partir de los espectros obtenidos, se

escogió la longitud de onda máxima de
absorbancia y a dicha longitud se midió la
absorbancia de las muestra 1, 2, 3 y una
muestra problema.
6
3. RESULTS AND DISCUSSION

Los resultados obtenidos prácticamente fueron:

Tabla 1. Resultados de la práctica.

Concentración (M) Amax λmax (nm) V (mL)
Muestra 1 0,2 0,6953 510 10
Muestra 2 - 0,2191 510 10
Muestra 3 - 0,0112 510 5

Las concentraciones de las muestras 2 y 3 se hallaron mediante los siguientes cálculos, estos
empleando la ecuación de dilución y también la ecuación de la ley de Beer-Lambert.

Dilución.

Sln patrón = 0,2 M

[M2] = 0,08 M
[M3] = 0,016

C1V1 = C2V2 C2 = C1V1 ÷ V2

C2 = (0,2 M) (0,01 L) ÷ 0,025 L = 0,08 M
C2V2 = C3V3 C3 = C2V2 ÷ V3
C3 = (0,08 M) (0,005 L) ÷ 0,025 L = 0,016 M

Para poder usar la ley de Beer-Lambert, primordialmente debemos hallar el coeficiente de

absortividad molar a partir de la muestra 1.

A= 0,6953 A=ε∗b∗C
B= 1 cm ε =¿ A ÷ b*C
C= 0,2 mol* L-1 ε = 0,6953 ÷ (1) (0,2) = 3,4765 L*mol-1*cm-1
ε = 3,4765 L*mol-1 *cm-1

Lambert-Beer.

Muestra 2.
A= 0,2191 A=ε∗b∗C
B= 1 cm C= A ÷ b∗ε
C= 0,063 mol* L-1 C = 0,2191 ÷ (1) (3,4763) = 0,063 mol*L-1
ε = 3,4765 L*mol-1 *cm-1

Muestra 3.
A= 0,0112 A=ε∗b∗C
B= 1 cm C= A ÷ b∗ε
C= 0,00322 mol* L-1 C = 0,0112 ÷ (1) (3,4763) = 0,00322 mol*L-1
ε = 3,4765 L*mol-1 *cm-1

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Tabla 2. Comparación entre muestra 2 y muestra 3 a partir de diferentes métodos.
Concentración Dilución Ley de Beer-Lambert
Muestra 2 0,08 0,063
Muestra 3 0,016 0,00322

En la tabla 4 podemos observar la diferencias entre las concentraciones halladas, comenzando

por el método de dilución, encontramos que el margen de error es mayor debido a que hay cierto
error en los instrumentos utilizados para su medición, es decir, el error de la pipeta, del matraz,
etc. En cambio las concentraciones halladas por el método de la ley de Beer-Lambert (indica la
linealidad entre la absorbancia y la concentración) son mucho más exactas debido a que el
equipo utilizado fue un espectrofotómetro el cual se caracteriza por tener una gran precisión y
sensibilidad a la hora de tomar dichas medidas, por ende el resultado arrojado es más aceptable
que el del método anteriormente nombrado (dilución).

Continuando con nuestro estudio y utilizando los valores de absorbancia y longitud de onda
(400-800 nm) para cada muestra obtenidos por medio del equipo (espectrofotómetro) se hizo
una gráfica para así discutir el efecto de la concentración en la absorbancia.

Absorbancia vs lambda
0.8
0.7
0.6
0.5
Absorbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850
-0.2
Longitud de onda

M1 M2 M3

Figura 3. Grafica de Absorbancia vs lambda.

En esta práctica se utilizó una concentración (0,2 M) que afecto la linealidad de la ley.
Empezamos enfatizando que la ley de Beer solo se cumple en disoluciones diluidas, a
concentraciones del orden de 10 ^ -2 M, por encima de este valor la recta se curva debido a que
a medida que aumenta la concentración de especies absorbentes, estas se van aproximando entre
ellas hasta que se pone en marcha las interacciones electrostáticas, alterando la capacidad de las
especies a absorber a unas determinadas longitudes de onda. No vamos a obtener por lo tanto
una relación lineal entre A y c. Los niveles de energía en los que se mueven los electrones son
distintos. Lo mismo ocurre en disoluciones de baja concentración de especies absorbente,  pero
con concentraciones elevadas de otras especies (sales interferentes). Los iones de las sales
interaccionan con las especies absorbentes y se modifica la capacidad de absorción. De esta
manera el diagrama de energía y la capacidad de absorción de radiación variaran. Por lo tanto el
efecto salino también afecta.

8
 0.8
Curva Patron
0.7
f(x) = 3.75 x − 0.06
0.6 R² = 1

0.5
Absorbancias

A vs C
0.4
Linear (A vs C)
0.3 MP

0.2

0.1

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
Concentracion [M]

Figura 4. Curva de calibración.

Tabla 3. Hace Concentración Absorbanci

referencias de a
muestra
problemaXM
P
CoCl2*6H2O 0,04692 0,114 Tabla 4. Las muestras patrones
Concentración [M] Absorbancias

0,2 0,6953
0,08 0,2191
0,016 0,0112

Se calculó la concentración de la muestra problema (MP), por tendencias de la curva de patrón

de las sustancias conocidas a diferentes concentraciones, por su linealidad.

4. CONCLUSIONS.

Se concluye que se identifica las partes que integran un espectrofotómetro uv-vis y los
diferentes tipos de cubetas que se utilizan una la longitud de ondas trabajadas.

Por otro lado, se identificó la ley de Beer y las diferentes desviaciones que esta ley puede tener
(concentraciones, dispersiones, etc.), y como afecta su linealidad, se identificó una muestra
problema por diferentes concentraciones de una sustancia patrón (tipo curva calibración con las
absorbancias máxima de cada disolución).

Además, se realizaron cálculos para identificar la absorbitividad molar de la disolución patrón.

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INTERROGANTES.

1. Dibuje los componentes básicos (diagrama de bloques) de un espectrómetro de

barrido UV-Vis.

Figura 5. Componentes de un espectrofotómetro.

2. ¿Para qué tipo de moléculas es más útil la espectroscopia UV-Vis? ¿Para qué no lo es?
Como consecuencia, ¿cuáles son los mejores disolventes para la espectroscopia UV-
Vis?

La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de

soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados.

Soluciones de iones metálicos de transición

Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz
visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado
electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la
presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una
solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y
cambia la longitud de onda de absorción máxima.

Compuestos orgánicos.

10
Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación, también
absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta.

3. Compara los espectros de los diferentes disolventes. Indique cuál de estos disolventes
podría usarse en la espectroscopia de absorción UV-Vis.

Figura 6. Comparación de disolventes en el espectro.

Se nota en el espectro del acetaldehído que hay mayores picos en el espectro con el disolvente
heptano aumenta la longitud de ondas más cercano al infrarrojo que para UV no se puede usar
como si el alcohol que esta Uv-vis

4. Discuta en qué situaciones sería más importante una calibración precisa del UV-Vis.
Como en todo proceso y utilización de un equipo, antes de tomar las medidas deseadas
se debe de calibrar los instrumentos a usar, en este caso el espectrofotómetro. Antes de
utilizarlo es indispensable realizar rutinas básicas de calibración para asegurarnos que el
aparato proporcione datos y lecturas precisas y confiables. La calibración de este equipo
se basa fundamentalmente en los siguientes pasos:

-Se enciende el equipo y se deja que caliente por lo menos 15 minutos.

-Después se selecciona la longitud de onda deseada (esto depende de la muestra a ser
leída y del reactivo utilizado).
-Se selecciona la función absorbancia o transmitancia.
-Se ajusta el aparato a cero con agua destilada, aire o con un blanco de reactivo.

Luego de realizar los pasos anteriores, podemos realizar las medidas que en realidad
necesitamos, teniendo la certeza de que el resultado arrojado por el equipo será el
correcto.

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 5. Compara los diferentes materiales ópticos utilizados para hacer cubetas. ¿Para qué
rangos de longitud de onda es útil cada material?

También llamadas cubetas para espectrofotómetro, son recipientes hechos de diferentes

materiales tales como vidrio plástico o cuarzo utilizan para la lectura de soluciones o
líquidos una vez dentro del espectrofotómetro. Su función es contener las sustancias para
estudiar la capacidad de radiación electromagnética absorbida o emitida. Las cubetas
espectrofotométricas se fabrican en una variedad de materiales transparentes para soportar
diferentes rangos de longitud de onda. Pueden ser rectangulares, cilíndricas o sin refracción para
sostener varios volúmenes de muestra necesarias para ensayos espectroscópicos rápidos.

Tabla 5. Materiales, rangos y zona del espectro de las cubetas o celdas.

MATERIAL RANGO ZONA DEL ESPECTRO
Cristal óptico o vidrio De 380 a 780 nm Visible
borosilicatado.
Plástico De 380 a 780 nm Visible
Cuarzo fundido Menos de 380 nm Ultravioleta
Cuarzo UV 185 nm Ultravioleta
Cuarzo ES (Cuarzo De 190 a 2000 nm Ultravioleta
silicatado)

6. Menciona algunas aplicaciones industriales para la espectrofotometría de luz UV/Vis.

 Determinación de la estabilidad térmica de aceite vegetales

 Producción de nanoparticulas de ZnS utilizando cepas de hongos (BIORREDIACION)
 Medida de la luz de sustancias coloreadas e incoloras
 Determinación de ácidos nucleicos como ADN y ARN
 Industrias farmacéuticas
 Industrias de pinturas

REFERENCES

[1] Skoog D, Holler F, Crouch S. Principios de Análisis Instrumental. Cengage Learning

Editores,
6ta edición. México 2008.

[2]Kenneth A. Rubinson y Judith F. Rubinson. Análisis Instrumental Prentice Hall. Madrid

2001.

[3]Rouessac F, Rouessac A. Análisis químico: métodos y técnicas instrumentales modernas.

Mac
Graw Hill/ Interamericana de España, Madrid 2003

[4] Skoog, d.a.; leary j.j., holler f. james; principios de análisis instrumental, 5° ed.; ed. mcgraw-
hill (1998).

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