1.

INTRODUCCIÓN
Los cambios en la dieta y el estilo de vida de las personas están causando un
aumento dramático en la incidencia de diabetes en todo el mundo. Los pacientes
con diabetes tipo I y tipo II usan insulina, sin embargo, los pacientes con diabetes
tipo II en etapa tardía requieren grandes dosis de esta hormona a medida que
desarrollan resistencia a la misma. El aumento dramático en el número de
pacientes diabéticos a nivel mundial y la exploración de métodos alternativos de
administración de insulina, como la inhalación o la vía oral, están destinados a
aumentar la demanda de insulina recombinante en un futuro próximo. En los
próximos 20 años, la OMS ha estimado que la venta de insulina crecería de 12 mil
millones USD a 54 mil millones USD a nivel mundial. [1]
La insulina humana está compuesta por 51 aminoácidos y tiene un peso molecular
de 5808 Da. Es producido por las células beta del páncreas y juega un papel clave
en la regulación del metabolismo de carbohidratos y grasas en el cuerpo. La
insulina se sintetiza como un polipéptido único conocido como preproinsulina en
las células beta pancreáticas. La preproinsulina alberga un péptido señal de 24
residuos, que dirige el polipéptido naciente al retículo endoplásmico. El péptido
señal se divide a medida que el polipéptido se transloca en el retículo
endoplásmico del ser humano, dando como resultado la formación de proinsulina.
En el retículo endoplásmico, la proinsulina se acomoda en la confirmación
adecuada con la formación de 3 enlaces disulfuro. Esta proinsulina se transporta a
la red del trans Golgi, donde se convierte en insulina activa mediante
endopeptidasas celulares llamadas convertasas de prohormona (PC1 y PC2) y
exoproteasa carboxipeptidasa E. Las endopeptidasas se separan en dos
posiciones, lo que resulta en la liberación de un fragmento denominado como
péptido C. La insulina madura, así formada, consiste en una cadena A con 21
aminoácidos y una cadena B que contiene 30 aminoácidos y ambos polipéptidos
unidos por dos enlaces disulfuro. Además, la cadena A tiene un enlace disulfuro
intracadena. [2,3]
Desde principios de la década de 1920, los pacientes diabéticos fueron tratados
con insulina, que se purificó del páncreas bovino o porcino. El desarrollo en el
campo de la ingeniería genética permitió la producción de insulina en E. coli y
levadura. [4,5]
La bacteria Escherichia coli es un bacilo Gram-negativo que pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, es habitante normal del tracto intestinal de animales y
también se encuentra habitualmente en el ser humano, se puede encontrar en el
medio ambiente ya que es capaz de sobrevivir durante cierto tiempo en el agua y
los alimentos, de manera que su aislamiento en los mismos es indicador de
contaminación fecal. Esta bacteria es el hospedero bacteriano más importante
para la producción de Proteínas recombinantes (PR). Aplicando el método de
obtención de proteínas recombinantes en la E. coli se insertan genes humanos en
el ADN de las bacterias para que estas elaboren el nuevo material, que para este
caso es la insulina humana; y así elaborar un proceso de reproducción de estas
células para lograr una producción en masa. [6,7]
2. MARCO TEÓRICO
2.1. DEMANDA DE INSULINA EN COLOMBIA
La diabetes es una enfermedad que ha afectado a muchos colombianos desde
siempre. La Asociación Colombiana de Diabetes estimó que el 7 % de los
colombianos padece esta enfermedad, es decir cuatro millones de personas y, de
éstos, la mitad no lo sabe.[8] Esto nos deja al menos 2 millones de colombianos
diagnosticados con la enfermedad. De estos dos millones de colombianos
aproximadamente 17% se les prescribe insulina como tratamiento. En promedio
estos pacientes que necesitan del medicamento consumen 63,6 UI de insulina
diariamente con rangos desde 33,33 hasta 1000 UI diarias.[9] Para este proyecto
se espera atender aproximadamente el 1,1% de la demanda total de insulina en
Colombia, esto al menos desde el principio ya que se entraría en un mercado a
competir con otras empresas. También hay que tener en cuenta que durante los
últimos años los diagnosticados con diabetes han aumentado, lo que crearía un
aumento de la demanda de insulina. Según datos de la Organización Mundial de
la Salud esta enfermedad afecta a 382 millones de personas y se calcula que para
el año 2030 padecerán 560 millones de seres humanos en el mundo.[10] Esto
demuestra la importancia de estar preparados para el aumento de la demanda de
insulina en Colombia y en el mundo. En base con los datos anteriormente
mencionados se hace un cálculo aproximado de cuanta insulina sería necesaria
producir para suplir la demanda en Colombia tal como lo muestra la siguiente
formula:
N° de pacientes con diabetes x Porcentaje de pacientes que se les transcribe
insulina x Consumo de insulina promedio por paciente = Unidades de insulina que
se necesitan diariamente en Colombia.
El resultado final queda en Unidades de Insulina por día necesarias, luego este
resultado se multiplicó por un factor de conversión, para calcular los mg de
Insulina pura y luego este resultado se multiplica por 1,1%, ya que el objetivo
planteado para este proyecto es cubrir al menos el 1,1% de la demanda en el país.
Este cálculo se muestra a continuación:

6 17 necesitan Insulina 6 3,6 UI promedio 1 mg Insulina pura

2 ×10 Pacientes × × × ×1,1 % ≅ 11 gramos de Insulina a
100 Pacientes dia 22 UI
De esta manera se puede concretar que el diseño de este proceso debe producir
al menos 11 gramos de insulina pura al día.
2.2. LEGISLACIÓN EN COLOMBIA
En Colombia todos los medicamentos se encuentran legislados por el ministerio
de salud y protección social en la resolución número (111166 DE 2015 26 AGO
2015) Por medio de la cual se define y se implementa el estándar de datos para
medicamentos de uso humano en Colombia, esta a su vez debe cumplir con las
normas farmacológicas decretadas por el instituto nacional de vigilancia de
medicamentos y alimentos (INVIMA). [11,12]
Basándose en las normas farmacológicas de 2019 publicadas por el INVIMA, la
insulina debe cumplir con la norma 9 de hormonas y reguladores hormonales,
específicamente el numeral 9.1.10. de insulinas, la cual te remite a la norma 8 de
medicamentos gastrointestinales y de metabolismo, específicamente el numeral
8.2.3.N10 de Antidiabéticos, hipoglicemiantes orales y parenterales e Insulinas,
por la cual se aceptan [12]:
 Figura 1. Concentración de insulinas permitidas en los medicamentos.[12]

2.3. MÉTODO RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCIÓN DE INSULINA

Siguiendo la metodología descrita por Rosabelhi (Et al. 2008) primeramente, se
clonan los genes con la β-galactosidasa en el plásmido pBR322. La recombinación
de los plásmidos es amplificada en E. coli. Se lleva a cabo una transformación de
la bacteria, en dos nucleótidos diferentes, luego la reacción entre la proteína β -gal
y el gen de la insulina con la metionina hace que el complejo proteico cambie,
expulsando de esta manera la molécula de la metionina y produciendo al final la
insulina con menos aminoácidos que al inicio del proceso por el método de la
recombinación.
El mecanismo de la separación de la insulina es a través del sistema RP-HPLC
(Reversed-Phase High Performance Liquid Cromatography) por sus siglas en
inglés, la cual es utilizada para separa la insulina de otras especies, basada en
una gran variedad de diferentes aminoácidos y gracias a la hidrofobicidad de la
insulina relacionada con otros componentes. La tendencia de las proteínas debe
ser generalmente con las proteínas mas grandes que se encuentren en una fase
estacionaria, en la cuela tiene una gran limitación del soporte de alcalinidad.[13]
 Figura 2. Producción de la insulina a través de la bacteria Escherichia coli.[13]

2.4. ESCHERECHIA COLI K12 W3110

La Escherichia coli W3110 y MG1655 son usadas para una cantidad substancial
de trabajos sistemáticos enfocados en la caracterización de la E. Coli K-12
Escherichia coli W3110 y MG1655 se utilizan para una cantidad sustancial de
trabajo sistemático destinado a caracterizar. Por ejemplo, se ha utilizado W3110
para crear una base de datos de los niveles de expresión de E. coli proteínas en
diferentes condiciones de crecimiento, para la construcción de un mapa físico del
cromosoma de E. coli, y para la secuenciación sistemática de cromosomas. De
todos modos, ha notado que la W3110 contiene varias mutaciones puntuales,
como, así como una inversión de un segmento cromosómico considerable así
también, la cepa MG1655 ha logrado el estado de representar el K-12
naturalmente. Por ejemplo, MG1655 se utilizó como fondo genético para
caracterizar los fenotipos de varias mutaciones de ARN polimerasa para estudios
sobre el control de la síntesis de ribosomas, sin embargo, W3110 y MG1655 están
estrechamente relacionados entre sí y son derivados de la cepa Lederberg
W1485, que surgió de la cepa original de E. coli K-12 después del tratamiento con
luz UV (Figura 2).

Figura 2. Origen de E. Coli K-12 a partir de cepas MG1655 y W3110.[14]

La Escherichia coli K12 (EcK12) se usa comúnmente con fines de tecnología

genética y se considera una cepa de seguridad debido a su incapacidad para
adherirse a las células epiteliales. La composición convencional de microbiota
intestinal es crítica para la resistencia a la colonización fisiológica contra la
mayoría de las especies bacterianas, incluidos los patógenos.

Después de su primera identificación en 1922 y su posterior caracterización, E.

coli K12 (EcK12) se ha utilizado ampliamente con fines de clonación genética y
debido a defectos genéticos, EcK12 se considera patógeno y es incapaz de
adherirse a las células epiteliales intestinales y, por lo tanto, de colonizar
vertebrados. EcK12 (W3110), que difiere de la cepa parental K12 por una gran
inversión cromosómica, y los derivados genéticamente modificados no pudieron
colonizar el tracto intestinal de los vertebrados en absoluto, y los cobayas que
albergan un microbiota intestinal convencional mostraron resistencia a la
colonización desafío peroral.[15]
La metodología de ADN recombinante requiere de una amplia variedad de
mutantes de Escherichia coli que son comunes en los laboratorios de Biología
Molecular. Muchas de estas cepas son derivadas de manipulaciones genéticas
realizadas a partir de la década del 40 del siglo XX.
El uso extendido de E. coli en este campo se debe a su fácil manipulación, su
rápido crecimiento, el bajo costo de los medios de cultivo empleados para su
propagación y el conocimiento acumulado de su bioquímica, fisiología, la dinámica
poblacional y adaptación de su genoma. Estas cepas también son ampliamente
utilizadas como hospederas para la expresión de proteínas recombinantes en los
procesos biotecnológicos.
Los experimentos de evolución adaptativa en el laboratorio con algunas de estas
cepas de E. coli han demostrado la versatilidad de este microorganismo
describiéndose un amplio número de mutaciones adaptativas. Este fenómeno
hace que la aplicación del concepto de sistema de siembra por lotes no sea
suficiente para garantizar los genotipos originales de los mutantes. La pérdida del
genotipo de interés se observa sobre todo en cepas donde es abolida la actividad
de la enzima RecA del sistema de reparación de ADN, con una marcada
disminución de la velocidad de crecimiento sobre medios sólidos agarizados. La
Colección Central de Microorganismos del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología de La Habana (CIGB) ha desarrollado estrategias para la
verificación de los bancos de mutantes de E. coli de importancia biotecnológica.
Las metodologías combinan métodos moleculares y crecimiento en medios de
cultivos selectivos.[16]
La producción de PR en bacterias es una tecnología que surgió hace cerca de 30
años y respondió a una necesidad de proveer proteína de uso terapéutico con un
abasto asegurado (que no dependiera de fuentes animales) y calidad constante.
La primera PR aprobada para su uso en humanos fue la insulina humana
producida en Escherichia coli por la empresa Genentech. Desde entonces, la
tecnología de producción de PR ha tenido un avance muy importante. Hasta el
año 2010, el número de productos biofarmacéuticos aprobados por la
administración de Alimentos y drogas de los EUA (FDA) era más de 200, de los
cuales la gran mayoría son PR La importancia económica de las PR de uso
terapéutico es innegable: las 10 PR de mayor venta durante 2009 sumaron más
de 50.000 millones de dólares en ventas.
Muchas de las PR terapéuticas requieren modificaciones postraduccionales que
no pueden ser llevadas a cabo por cepas bacterianas silvestres, por lo que son
preferentemente producidas por células eucariontes superiores. A pesar de ello, la
bacteria E. coli sigue siendo una plataforma ampliamente usada para la
producción de PR, ya que presenta una serie de ventajas importantes:
Su genoma es conocido desde hace varios años, lo que amplía
considerablemente las posibilidades de su manipulación genética, existe una gran
cantidad de conocimiento acumulado sobre su fisiología y metabolismo, se tienen
varios vectores bien establecidos para la producción de PR, puede crecer rápido
en medios muy simples, con altos niveles de producción de PR. Actualmente,
cerca del 30 % de las PR de uso terapéutico son producidas empleando k, las más
importantes pueden consultarse en la tabla 1. De un total de 58 productos
aprobados por la FDA en el periodo 2006-2010, 17 son producidos usando E. coli
y 32 empleando células de mamífero.[6]

Figura 3. Tabla de principales recombinantes de uso terapéutico producidas por E. coli. [6]

2.5. DISEÑO DE REACTORES FEDBACTH PARA LA PRODUCCIÓN DE

PROTEÍNAS RECOMBINANTES
En los sistemas de cultivo fed batch, una solución concentrada del sustrato
limitante es alimentada al sistema con el fin de aumentar el crecimiento celular
más allá del permisible en la fase batch (S-O Enfors 2011) [17]. El medio de
alimentación es comúnmente una solución concentrada de la fuente de
carbono/energía (en vez del medio completo utilizado para cultivos continuos),
comúnmente la concentración máxima posible, de modo de minimizar el aumento
del volumen del medio de cultivo. A su vez se suele complementar con elementos
trazas y vitaminas. La fermentación fed batch en general es la estrategia de
elección con fines productivos. Sin embargo, dicha técnica posee una serie de
desventajas, como la inhibición por sustrato, transferencia de oxígeno limitada,
formación de compuestos secundarios inhibitorios y limitaciones de disipación de
calor (Wang & Lee, 1998) [18].
La acción de control sigue una estrategia fija, que generalmente consiste en
controlar la tasa específica de crecimiento a un valor lo más grande posible
evitando el metabolismo de sobreflujo (ocasionado por una fermentación mixta).
En la fermentación mixta, posiblemente por una limitación río abajo del glicólisis, la
fuente carbonada no es completamente oxidada produciendo compuestos
secundarios, que a su vez son inhibidores del crecimiento celular. Al restringir su
formación es posible prolongar el crecimiento celular y aumentar los parámetros
productivos. En caso de existir restricciones físicas de transferencias de oxígeno,
el control debe considerar dicha restricción adicional mediante una estrategia de
control diferente.
El metabolismo celular global puede ser simplificado mediante una reacción
biológica global que define al sistema:

∑ k i . Si →v k X . X + ∑ k j . P j
i j

En donde, Si, X y Pj son la concentración molar instantánea del sustrato i, la

biomasa y el producto j. ki, kX y kj corresponden a los coeficientes estequiométricos
del sustrato i, la biomasa y el producto j. v corresponde a la velocidad a la que
ocurre la reacción global.
La derivada temporal de la concentración de sustratos y productos se conoce
como la tasa volumétrica de consumo (rS) y formación (rP), respectivamente. Las
tasas volumétricas de consumo y producción, normalizadas por la biomasa (r/X),
corresponde a las tasas específicas de formación (CS) y consumo (CP),
respectivamente. Particularmente, la tasa específica de formación de biomasa (CX)
tiene una nomenclatura diferente y se le identifica con la letra griega µ. En general,
se suele modelar la velocidad de la reacción global a través de la velocidad de
consumo del sustrato limitante mediante una cinética tipo Monod:
C Smáx . S
C S=
K S+ S

Para relacionar las tasas de consumo/formación se definen los rendimientos:

k X CX rX
Υ X= = =
P k P CP rP
Luego, conociendo los rendimientos y la velocidad a la cuál ocurre la reacción es
posible modelar el proceso de manera dinámica. Acoplando las reacciones
celulares con los balances de masa, se tiene:
d (C . V )
=F ¿ . C¿ −F out . C ( t )+ Cc . X . V
dt
En donde C, corresponde a la concentración instantánea del sustrato/producto; V
corresponde al volumen del medio de cultivo; Fin y Fout corresponden a los flujos de
entrada y salida al sistema; Cin es la concentración del sustrato/producto en la
alimentación; y Cc corresponde a la tasa específica de formación/consumo del
sustrato o producto c. [19]

REFERENCIAS
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[11] MINISTERIO DE SALUD. (2015). RESOLUCION NUMERO 00003166 DE
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[12] INVIMA. (2019). NORMAS FARMACOLÓGICAS. Recuperado 23 marzo,
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