Вы находитесь на странице: 1из 92

СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра микробиологии

Методические указания
к практическим занятиям по микробиологии
с иммунологией и вирусологией
для студентов

Под редакцией профессора Е.А.Федосова

Часть 1.

В составлении пособия принимали участие преподаватели кафедры:


.Д Гусева, В.С.Дукова, Г.Г.Захарава, С.В.Кирюшенкова,
Р.С.Козлов, А.Федосов, Н.А.Фролова.

СМОЛЕНСК. 2005 год.


2

ПРЕДИСЛОВИЕ

Методические указания к практическим занятиям по микробиологии для студентов 2-го курса


лечебного и педиатрического факультетов являются пособием, позволяющим студентам самостоятельно
выполнять практическую работу.
Все занятия строятся по единому плану из расчета 3-х академических часов на каждое занятие.
Указываются темы, цель обучения (перечень знаний, умений, навыков, которые студент должен
получить в итоге занятий), затем преподаватель даѐт пояснения к проведению практической работы, во-
влекая при этом студентов в беседу и выясняя подготовленность группы к выполнению практического
занятия.
На практических занятиях студент, естественно, может встретиться с аппаратурой, оборудованием,
материалами, которых он никогда не видел, поэтому самостоятельной работе должна предшествовать
демонстрация.
Контроль знаний осуществляется путем текущего опроса студентов во время занятий, а также на
итоговых занятиях по результатам собеседования и компьютерного тестирования. Для этой цели на
кафедре разработаны тесты, вопросы, ситуационные задачи, с которыми студенты имеют возможность
предварительно ознакомиться.
3

ЗАНЯТИЕ №1
Темы:
 Предмет и задачи микробиологии.
 Правила работы в микробиологической лаборатории.
 Морфология бактерий.

План занятия:
1. Правила организации и оборудования микробиологической лаборатории.
2. Правила работы в микробиологической лаборатории
3. Современные методы микроскопических исследований
4. Основные формы бактерий.
5. Приготовление бактериального мазка и простой метод окраски.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Медицинская микробиология занимается:
 изучением биологических свойств микробов и процессов их взаимодействия с организмом человека и
окружающей средой;
 микробиологической диагностикой инфекционных заболеваний;
 разработкой методов индикации микробов во внешней среде;
 разработкой методов специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний;
 организацией производства бактерийных препаратов, антибиотиков,
применяемых для диагностических, лечебных и профилактических целей.

Студенты, работающие на кафедре микробиологии, обязаны выполнять правила, принятые в


микробиологических лабораториях, где производится работа с заразным материалом.
Одним из этапов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний является изучение морфологических
и тинкториальных свойств микроорганизмов. Для этого используются микроскопические методы исследования.
Цель занятия:
1. Ознакомление с принципами организации и оборудованием
микробиологической лаборатории, с правилами работы в ней и основными методами микроскопии.
2. Освоить технику приготовления бактериального микропрепарата с последующей его окраской простым
методом и научиться работать с иммерсионным объективом.
3. Изучить основные формы бактерий.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1.Принципы организации и назначение микробиологической лаборатории.
2.Правила работы в микробиологической лаборатории.
3.Типы современных микроскопов. Принципы работы электронного, люминесцентного, фазово-контрастного
микроскопов, темнопольного конденсора. Основные характеристики ветового микроскопа.
4.Основные формы бактерий.
Уметь:
1. Обеззараживать отработанный инфицированный материал и инфицированные объекты внешней среды.
1. Приготовить бактериальный мазок и производить простую окраску.
2. Проводить бактериоскопическое исследование с иммерсионной системой.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Структура и оборудование лаборатории
В структуру любой микробиологической лаборатории входят:
1. Лабораторные комнаты и боксы для работы в асептических условиях;
2. Специально оборудованное помещение для стерилизации питательных сред, посуды, обеззараживания
отработанного инфицированного материала;
3. Моечная, оборудованная для мытья посуды;
4.Помещение для приготовления питательных сред;
4
5.Виварий - помещение, предназначенное для содержания лабораторных животных.
Стены должны быть окрашены масляной краской или покрыты кафельной плиткой, пол - линолеумом .

Оснащение микробиологической лаборатории


Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами
необходимых красителей.
2. Набором инструментов: бактериологическими петлями, микробиологическими шпателями, пинцетами,
спиртовками и др.
3. Лабораторной посудой: пробирками, чашками Петри, флаконами, пипетками и др.
4. Приборами для стерилизации посуды, питательных сред и реактивов, рН-метрами, дистилляторами,
центрифугами, техническими и аналитическими весами, аппаратурой для фильтрования и др.
5. Необходимыми средствами пожарной и химической безопасности (огнетушителями, дезинфицирующими
растворами и т. д.).

Оборудование рабочего места студента


На рабочем столе должно быть все необходимое для работы:
Микроскоп.
Иммерсионное масло.
Бактериологические петли.
Спиртовка.
Набор красок.
Ванна и вода для промывки препаратов.
Предметные стекла и салфетки для их протирания.
Штатив для пробирок с культурами.
Пинцет для извлечения стекол.
Фильтровальная бумага для высушивания препаратов.
Банка для отработанных стекол.
Из личных вещей студента на рабочем месте допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой
делаются записи и зарисовки. Ничего лишнего (в том числе учебников и других книг) на рабочем столе не
должно быть.
Правила работы в микробиологической лаборатории
Работа на кафедре микробиологии и в бактериологической лаборатории требует строгого соблюдения
специальных правил, так как исследования проводятся с использованием культур патогенных микроорганизмов и
заразного материала от больных и экспериментальных животных.
Соблюдение этих правил необходимо для обеспечения не только личной безопасности, но и безопасности
окружающих.
1. В лабораторию на практические занятия студенты должны являться в халатах и колпаках.
2. На лабораторные столы не разрешается класть портфели и другие личные вещи. На столах можно оставлять
только записные тетради и руководства.
3. В лаборатории запрещается принимать пищу.
4. Отработанные препараты, пипетки и т.п. не класть на стол, а опускать в банку с дезинфицирующим раствором.
5. В случае попадания заразного материала на стол; руки, одежду и прочее, сообщить преподавателю и
обработать зараженный объект дезинфицирующим раствором.
6. Содержать в чистоте свое рабочее место и производить уборку стола после занятий.
7. Бережно относиться к инвентарю (особенно к микроскопу), мебели лаборатории. Экономно расходовать
краски, реактивы, фильтровальную бумагу.
8. Точно и аккуратно выполнять задания по практическим занятиям.
По окончании работы необходимо:
1. Привести в порядок рабочее место.
2. Все использованные предметные стекла положить в банку с дезинфицирующим раствором.
3. Все засеянные пробирки и чашки сдать дежурному студенту для помещения в термостат.
4. Отработанный материал, загрязненный микробами, культуры бактерий, трупы зараженных животных
сдать дежурному лаборанту для стерилизации.
5. Привести в порядок микроскоп.
5

6. Обработать руки дезинфицирующим раствором и тщательно вымыть их с мылом.


Методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных патогенными микробами
объектов внешней среды
Перед сбрасыванием патологического материала его подвергают дезинфекции.
Использованные в работе предметные стекла, пипетки, стеклянные шпателя и металлические инструменты
сразу же после работы опускают в стеклянные банки с дезинфицирующим раствором (1-2 % р-р хлорамина),
которые должны находиться на рабочем столе. Посуда, в которой выращивались микроорганизмы (чашки,
пробирки, флаконы), складываются в биксы или металлические бачки для обеззараживания путем кипячения или
автоклавирования.
Рабочее место по окончании работы подлежит уборке с применением дезинфицирующих средств.
Используют более концентрированные растворы, чем для обработки рук - 5% р-р хлорамина или 5% р-р
карболовой кислоты.
Пинцетом берут кусочек ваты, смоченной дезраствором, и протирают поверхность стола на рабочем месте.
Если разбилась пробирка с культурой, пролилась жидкость с заразным материалом или материал попал на
одежду, обработку проводят немедленно, заливая это место дез. раствором или помещают ватный тампон,
смоченный дезраствором. О случившемся сообщают преподавателю или заведующему лабораторией.
Методы антисептической обработки рук лабораторных работников, контаминированных исследуемым
материалом, культурами патогенных микробов
По окончании работы руки обрабатывают дезинфицирующим раствором. Используют ватные тампоны или
марлевые салфетки, смоченные в 700 спирте этиловом (1% хлорамин, 3% р-р лизола).
Последовательность обработки: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства и ногтевые
ложа, т. е. с учетом первоначальной обработки менее, а потом наиболее загрязненных мест. Вначале
обрабатывают левую, а потом правую кисть руки.
При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материалом сразу же
обрабатывают данный участок кожи, покрывая его на 3-5 мин. ватой, смоченной в дезрастворе. После обработки
рук дезраствором их моют теплой водой с мылом.
Микроорганизмы по степени опасности заражения работающих с ними лиц подразделяют на 4 группы

I. Возбудитель чумы.
II. Возбудители холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, сапа, Ку-
лихорадки, бластомикоза, кокцидиоидоза, гистоплазмоза, ВИЧ, гепатиты В, С, Д, клещевой энцефалит.
III. Возбудители коклюша, возвратного тифа, столбняка, ботулизма дифтерии, лепры, брюшного тифа,
дизентерии, некоторых микозов, грипп, полиомиелит, гепатиты А, Е.
IV. Возбудители пневмонии, пищевых токсикоинфекций, газовой гангрены, септицемий, кандидозов;
микробы - показатели санитарного состояния объектов окружающей среды.

Работу с культурами возбудителей 1 и 2 групп можно проводить только в специальных лабораториях строгого
режима с разрешения органов здравоохранения России. Работа с возбудителями 3 и 4 групп проводится в
соответствии с правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии в лабораториях СЭС и
других бактериологических лабораториях.
6

Рис.1. Клеточные и неклеточные возбудители инфекционных заболеваний.


Возбудителями инфекционных заболеваний могут быть представители клеточных неклеточных форм (рис.1).
Неклеточные формы – это вирусы (царство Vira), вироиды, прионы. О вирусах подробнее будет сказано ниже.
Вироиды открыты Т. О. Дайнером в 1972 г. Это сравнительно небольшие по размерам молекулы кольцевой
суперспирализованной РНК, состоящие из немногих, 300—400 нуклеотидов. Они вызывают заболевания неко-
торых растений, способны передаваться у них как обычные инфекционные вирусы. У человека и животных они
не обнаружены.
Прионы (от англ. proteinaceous infectious particle), что означает «белковоподобная инфекционная
частица» - особый класс инфекционных агентов. Они представлены белковыми структурами, лишенными
нуклеиновых кислот (например, Р г -s c , т . е . с к р е п п и ) . В их состав входит идентифицированный белок Рг – c
(cells), кодируемый в геноме теплокровных. Прионы («нормальные») резистентны к действию нуклеаз, но
инактивируются протеазами. Считают, что при мутации гена Рг-с начинает вырабатывться «ненормальный»
прионовый белок с измененной пространственной конфигурацией, устойчивый к действию протеаз. Более того,
измененные прионовые белки, контактируя с нормальными, в дальнейшем начинают их также менять с
лавинообразной скоростью. Это способствует возникновению метаболических нарушений в клетках различных
тканей, в частности, в центральной нервной системе. Прионовые белки выделены, как инфекционное начало
скрэпи. куру, болезни Кройтцфельда-Якоба, спонгиоформной энцефалопатии крупного рогатого скота
(коровье бешенство) и амиотрофического лейкоспонгиоза. Высказывается предположение, что прионовый
белок является одновременно и индуктором и продуктом какого-то клеточного гена, ставшего автономным и
ускользнувшего от регуляции, называя такой ген «взбесившимся».
Что касается клеточных форм микроорганизмов, то различают три домена: ―Bacteria‖ (эубактерии),
―Archaea‖ (архебактерии) и ―Eucarya‖ (эукариоты).
В домене «Bacteria» можно выделить следующие бактерии:
- бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные;
- бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные;
- бактерии без клеточной стенки (класс Mollecutes — микоплазмы)
Большинство грамотрицательных бактерий объединены в тип протеобактерии, основанный на сходстве по
7
рибосомной РНК («Proteobacteria» — от греческого бога Протеуса, принимавшего разнообразные формы). Они
появились от общего фотосинтетического предка.
Грамположительные бактерии, согласно изученным последовательностям рибосомной РНК, являются от-
дельной филогенетической группой с двумя большими подотделами. Как и протеобактерии, эта группа
метаболически разнообразная.
Архебактерии отличаются от эубактерий прежде всего тем, что не содержат пептидогликан в клеточной стенке.
Имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК). Термин «архебактерии» появился в 1977 г. Это одна из
древних форм жизни, что и означает приставка «архе». Среди них нет возбудителей инфекционных болезней.
Домен эукариот включает: 1) царство грибов (Fungi), 2) царство животных (Animalia) с подцарством
простейших (Protozoo), 3) царство растений Plantae).

Морфология бактерий и микроскопические методы исследований в микробиологии


Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки
большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая
группа мицелийобразующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим
все бактерии по форме разделяются на следующие группы.
Кокки (сферические) клетки могут быть одиночными (микрококки), парными (диплококки, например,
нейссерия); тетракокки, располагающиеся по 4 в форме квадратов; пакетообразные кокки, располагающиеся
«этажами» (сарцины); располагающиеся цепочками (стрептококки); образующие бесформенные скопления в виде
виноградных гроздьев (стафилококки). Диаметр клеток – 1 – 2 мкм.
Палочковидные бактерии – наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические
структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 – 10 мкм. Такие бактерии
часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными
(например, энтеробактерии).
Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы – бактерии,
изогнутые в виде запятой (холерный вибрион, кампилобактер); спириллы имеют несколько крупных завитков
(возбудитель возвратного сыпного тифа); спирохеты имеют вид тонких спиралевидных клеток со множеством
завитков и петель (возбудитель сифилиса).
Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток.
Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Beggiatoa, Thiotrix).
К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно
разветвленный мицелий. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных
стадиях роста. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры
наблюдается плейоморфизм клеток.
К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это
выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не
отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий выросты служат для размножения, у других – для
прикрепления к субстрату или друг к другу.
Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют клеточной стенки – микоплазмы. В
культуре одного вида можно одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные,
дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы.

Основными задачами микроскопии являются следующие:


1. Выявление микроорганизмов в различных материалах.
2. Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце.
3. Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул,
жгутиков и т. д.).
4. Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.
Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный
вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения,
структурной организации клеток и других особенностей. Максимальная разрешающая способность светового
микроскопа составляет 0,2 мкм (минимальное расстояние, при котором различимы два объекта). Общее
увеличение складывается из произведения увеличений объектива и окуляра. Разрешение микроскопа можно
увеличить за счет увеличения коэффициента преломления (иммерсии). В микроскопии применяют несколько
иммерсионных систем: масляную, глицериновую, водную.
При работе с микроскопом производят следующие действия:
8
С помощью зеркала и суховоздушного объектива малого увеличения (×8) добиваются наиболее
интенсивного и равномерного освещения поля зрения. В центральной части столика микроскопа устанавливают
препарат.
Если дальнейшие исследования проводят с суховоздушным объективом (×40), то следует прикрыть диафрагму
конденсора, перевести револьвер микроскопа на данное увеличение и опустить вниз тубус микроскопа с
помощью микровинта до появления в поле зрения микроскопа исследуемых объектов.
Если исследования проводятся с помощью иммерсионной системы (увеличение ×90), то в центр препарата
следует нанести каплю иммерсионного масла, осторожно перевести объектив микроскопа вниз таким образом,
чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, поднять объектив вверх с помощью макровинта
до появления в поле зрения микроорганизмов. С помощью микровинта добиваются максимальной четкости
изображения.
После просмотра всех препаратов следует снять масло с иммерсионного объектива, перевести микроскоп на
малое увеличение, снять осветитель, опустить конденсор и тубус микроскопа вниз до упора. Хранить микроскоп
следует в условиях, предотвращающих попадание пыли на линзы.
Фазово-контрастная микроскопия представляет ценность в том, что с ее помощью можно наблюдать живые
объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. С точки
зрения увеличения никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в
проходящем свете обычного светлопольного микроскопа. При отсутствии специального микроскопа обычный
световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые
изменения световых волн, которые проходят через объект, в амплитудные. В результате этого живые прозрачные
объекты становятся контрастными и видными в поле зрения.
С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их
подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д.
Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля). При
таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если в исследуемом
препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от
своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие
объекты. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора,
которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа.
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми
долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного
микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не
дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или
некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие
хлорофилл, витамин В12, алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией. Клетки
микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными
красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных
водных растворов: 1:500 – 1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать
неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава клеточные структуры в разной степени
адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково
адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для
цитологических и иммунологических исследований, определения жизнедеятельности клеток, изучения
микроорганизмов в почве, воде и т. д. Проведение люминесцентной микроскопии предполагает использование
специальных микроскопов (например, МЛ-2).
Разработанные на основе люминесцентной микроскопии иммунофлюоресцентные методы используются для
визуализации иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии антигена изучаемого
объекта и меченых флюоресцентными красителями антител.
Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании
световых или ультрафиолетовых лучей. Короткая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой
зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет различить объекты размером 0,5 – 1,0 нм (или
большие чем 0,0002 мкм). В современных электронных микроскопах достигается увеличение на экране или
пленке 5000 – 15000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей
бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и
проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки
электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования.
9
Детали внутреннего строения выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал.
Предварительно бактерии фиксируют и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого
контраста. Часть электронов проходит через образец, а другие рассеиваются компонентами структуры, в
результате чего формируется изображение на экране или пленке. Электронный микроскоп, в котором
изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют
просвечивающим (или трансмиссионным).
В сканирующем (растровом) микроскопе, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует
поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Сканирующий
микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать сразу трехмерное изображение.
При методе сколов (замораживании–оттаивании) проводят изучение внутреннего строения клеточных
мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота ( – 196 °С) в присутствии криопротектора и
используют для получения сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя
липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной. Полученные реплики изучают в
сканирующем электронном микроскопе.
Помимо вышеуказанных разработаны также и другие методы визуализации:
1. Компъютерная интерференционная микроскопия позволяет получить
высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур;
2. Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить четкое
изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. При сочетании
с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция
изучаемого объекта.
3. Рентгеновская микроскопия, позитронная эмиссионная томография позволяют наблюдать объекты не в
вакууме, а в обычных условиях.
В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий используют окрашенные
(зафиксированные) или неокрашенные (нативный материал) препараты (мазки), приготовленные из естественных
образцов либо из колоний выросших микроорганизмов.
Процесс приготовления мазка состоит из трех этапов:
а) собственно приготовление мазка: на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды. Затем на
пламени горелки прокаливают петлю до красного каления, мизинцем правой руки открывают у огня пробирку с
культурой, после остывания петли (она не должна плавить агар), берут ею небольшое количество культуры.
После этого закрывают пробирку пробкой (через огонь) и эмульгируют бактерии в капле воды так, чтобы она
помутнела. Затем прожигают петлю с избытком культуры, охлаждают ее и быстрыми круговыми движениями
равномерно распределяют каплю на площади диаметром 15-25 мм и снова прожигают петлю.
Для приготовления мазка методом отпечатка вырезают блок агара с выросшей колонией и помещают на
покровное стекло бактериями вниз, резко прижимают блок к стеклу, после этого препарат сразу же фиксируют.
б) высушивание препарата: препарат после высыхания должен быть равномерно тонким. Высушивание
можно ускорить, держа препарат высоко над пламенем спиртовки.
в) фиксация мазка: чаще всего осуществляется термически (фламбирование), т. е. над пламенем горелки.
Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к
красителям. Препарат проносят 2 – 4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до
такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение).
Фиксация мазка преследует следующие цели: а) инактивировать микроорганизмы; б) закрепить их на
поверхности стекла и предотвратить их смывание при последующем окрашивании; в) повысить восприимчивость
клеток к красителям.
Для более детального изучения структуры клеток используют фиксирующие растворы,
предовращающие ферментативный автолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их
сшивания. Наиболее часто применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др. Мазки фиксируют,
помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок.
Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на:
позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители,
окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными –
красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся
видимыми в виде силуэтов на фоне красителя; кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин,
толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию
(например, цитоплазматическими белками). Щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами
клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).
10
Основные цвета окрашивания могут быть следующими:
а) красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго красный);
б) фиолетовый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый);
в) синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий);
г) зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).
Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные свойства. Это
определяется структурой и составом клеточной стенки.
Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окраски.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще
всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае использования
негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате
клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне.
Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко
выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в
вегетативной клетке.
Техника приготовления препарата заключается в следующем:
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На
мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 – 2 мин. Следят за тем, чтобы во время
окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех
пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной
бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсионной
системой.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории.
2. Современные методы работы с иммерсионным объективом.
3. Устройство фазово-контрастного, электронного и люминесцентного микроскопов.
4. Микроскопия в темном поле.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент микроскопирует с сухим и иммерсионным объективом готовые окрашенные мазки дрожжей,
антракоида. стафилококка, стафилококка в крови.
2. Каждый студент готовит 3 мазка препарата из бактериальных культу ( сарцина, стафилококк, антракоид,
кишечная палочка, вибрион) окрашивает фуксином Пфейффера, метиленовой синькой; микроскопирует с
иммерсионным объективом, зарисовывает.
3. Освоить и записать в тетрадь:
а) методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных микробами объектов внешней
среды;
б) методы антисептической обработки рук, контаминированных исследуемым материалом, культурами
патогенных микробов.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие задачи выполняет медицинская микробиология?
2. Какова структура и оснащение микробиологической лаборатории?
3. Почему необходимо выполнять правила работы в микробиологической лаборатории? В чем они
заключаются?
4. Как определить увеличение микроскопа?
5. Что такое разрешающая способность микроскопа и от каких факторов она зависит?
6. Каковы преимущества иммерсионного объектива?
7. Изложите правила работы с иммерсионным объективом.
8. Из каких двух основных систем состоит электронный микроскоп?
9. Каковы основные отличия электронного микроскопа от светового?
10. Как готовят препараты для электронной микроскопии?
11. Основные принципы работы фазово-контрастного микроскопа.
12. Основные принципы работы люминесцентного микроскопа.
13. Принцип микроскопии в тѐмном поле.
11

14. Что лежит в основе выбора метода микроскопического исследования микропрепаратов?


15. Назовите основные формы шаровидных, палочковидных и извитых бактерий.
16. Из каких этапов состоит процесс приготовления мазка?
17. Для чего осуществляют фиксацию бактериального микропрепарата и как она проводится?
18. Что такое тинкториальные свойства бактерий?
19. Назовите основные краски, применяемые для окраски микропрепаратов
20. Для чего изучают тинкториальные свойства бактерий?
21. Что такое простая окраска?

ЗАНЯТИЕ №2
Тема:
 Структура бактериальной клетки, сложные методы окраски (метод Грамма), подвижность бактерий.
План занятия:
1. Строение бактериальной клетки.
2. Сложные методы окраски. Окраска по Граму.
3. Исследование микроорганизмов в живом остоянии, подвижность бактерий.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
По классификации Берджи бактерии относятся к прокариотам. Клетки прокариот имеют более простое
строение, чем у эукариот. Они имеют: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму,
рибосомы, мезосомы и ядерную субстанцию (нуклеоид), состоящую из ДНК. Бактериальная клетка по своим
размерам (1-10 мкм) меньше эукариотов, величина последних колеблется от 10 до 100 мкм. У прокариотов в
отличие от эукариотов отсутствует ядерная мембрана, гистоны, аппарат Гольджи, митохондрии и
хлоропласты, в клеточной стенке отсутствуют стероиды и отсутствует тканевая дифференцировка. У бактерий
всего одна хромосома, а эукариоты имеют диплоидный набор хромосом. У бактерий бинарный способ
размножения, а эукариот – митотический. У бактерий часто встречается анаэробный тип дыхания, у
эукариотов он обычно отсутствует.
Бактериальная клетка также может иметь необязательные (дополнительные) компоненты, такие как капсула,
споры, жгутики, включения (например, зерна волютина). Они выявляются с помощью сложных методов окраски
или специальных методов исследования (например, микроскопия препаратов, приготовленных из живых
бактерий).
Рис. 2. Схема строения оболочек грамотрицательных и грамположительных бактерий.
12
Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится
небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих
бактерий является многослойный (до 40 слоев) пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 %
массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно
связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная
посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана (не более 2-х слоев). На ультратонких
срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней
мембраной, которую называют цитоплазматической (рис.2). Основным компонентом этих мембран является
бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен
фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Липополисахарид наружной
мембраны состоит из 3 фрагментов: липида А — структуры, практически одинаковой у всех
грамотрицательных бактерий; ядра, или стержневой, части и высоковариабельной О-специфической цепи
полисахарида (0-антиген). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы
белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гид-
рофильные молекулы. Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое
пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, бета -
лактамазы) и компоненты транспортных систем.
При резком нарушении синтеза клеточной стенки бактерии чаще всего погибают. Например, это может
происходить под воздействием антибиотиков-ингибиторов синтеза пептидогликанов (пенициллин и др.) В ряде
случаев под влияние лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма могут образоваться клетки с
измененной (часто шаровидной) формой: протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки;
сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного
типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и
способные размножаться, называются L-формами. Они способны поддерживать развитие хронического
инфекционного процесса. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к
изменениям бактерий, могут реверсировать, «возвращаясь» в исходную бактериальную клетку.
Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие
нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина
жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального
тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков — у грамположительных и 2 пары
дисков — у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране
и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик.
Жгутики состоят из белка — флагеллина (от flagellum — жгутик), являющегося Н-антигеном. Субъединицы
флагеллина закручены в виде спирали. Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного
(монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии
(перитрих) у кишечной палочки, протея и др.
Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или
пучку жгутиков на противоположных концах клетки.
Пили (фимбрии, ворсинки) — нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм х 0,3 мкм), чем
жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной
активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, т. е. за прикрепление бактерий к поражаемой
клетке, а также пили, ответственные за питание, водно-солевой обмен и половые (F-пили), или
конъюгационные, пили. Пили многочисленны — несколько сотен на клетку. Однако половых пилей обычно
бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми «мужскими» клетками-донорами, содержащими
трансмиссивные плазмиды (F-, R-, CoL-плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является
взаимодействие с особыми «мужскими» сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются
на половых пилях.

Цель занятия:
1. Ознакомиться со структурными (дифференциальными) особенностями прокариот и овладеть некоторыми
методами их изучения (окраска по Граму и изучение подвижности).
Учебно-целевые задачи:
Знать:
13

1. Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки, их функции.


2. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий.
3. Методы изучения структурных особенностей микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии:
а) технику приготовления и особенности микроскопии нативных препаратов;
б) сложный метод окраски по Граму.
Уметь:
1. Окрасить методом Грама.
2. Приготовить и микроскопировать препараты из живых бактерий

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
1. При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими
веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются
различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др., которые играют роль дифференциаторов.
С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов
(клеточные структуры, запасные вещества, включения и т. д.).
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска
положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри
клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода, либо терять его после обработки спиртом. В
характеристике микроба каждого вида обязательно указывают на отношение к окраске по Граму. Все бактерии по
отношению к этому методу окраски делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные: (Bacillus,
Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia,
Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в
процессе окраски комплекс генцианвиолета и йода. У грамположительных бактерий основным веществом
клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды - муреин (пептидогликан) в соединении с тейхоевой кислотой
и рибонуклеатом магния. У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располоагается в глубине клетки,
значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные
слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того,
проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это
объясняется также меньшим диаметром пор у грамположительных бактерий, что способствует удержанию
образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Техника окраски по Граму (модификация Синева)
1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом. и смачивают
несколькими каплями воды.
2. Через полторы-две минуты бумажку снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту.
3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд до прекращения
отхождения красителя от мазка.
4. Тщательно промывают препарат водой.
5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты.
6.Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой.
Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного.
2. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий иногда используют неокрашенные
препараты (нативные), приготовленные из естественный образцов, либо из колоний выросших микроорганизмов.
Нативные препараты чаще всего готовят для исследования живых неокрашенных бактерий с целью установления
их подвижности. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах,
применяя светлопольный микроскоп с приопущенным конденсором, но лучше всего исследовать в темноном
поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют
методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами.
Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее
стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и
накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют
бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с
использованием объективов х40 или х90.
14
Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием
микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью
бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают
на предметное стекло с лункой. Капля должна свободно свисать в лунку, не затрагивая ее краев и дна. Для
создания влажной камеры и предохранения от высыхания, края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют
также, как и препарат «раздавленная капля».
Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем
питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной
области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в
закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.
Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их
расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для
окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание
препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2 ) и последующая окраска (чаще карболовым раствором
фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно
достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности.
Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом
культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в
термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей
толще агара, вызывая диффузное помутнение среды.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Методика окраски по Граму
2. Приготовление препарата «висячая капля» из живых подвижных бактерий (вибрион), микроскопирование в
фазово-контрастном микроскопе.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Приготовить препараты из грамположительных и грамотрицательных культур (стафилококк, антракоид,
кишечная палочка, вибрион), окрасить по Граму, микроскопировать, зарисовать.
2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из зубного налета и чистой культуры водного вибриона,
микроскопировать в темном поле, записать результат.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. В чем заключаются различия в анатомии эукариот и прокариот?
2. Какие свойства бактерий можно изучить в результате окраски простыми и сложными методами?
3. Какие методы окраски называют дифференциальными? Назовите их.
4. Какие свойства бактерий влияют на их способность воспринимать разные красители?
5. Какой метод окраски позволяет разделить все бактерии на две альтернативные группы?
6. Каково строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?
7. Объясните последовательность и механизм окраски по Граму.
8. В какой цвет при этом могут окрашиваться бактерии и почему?
9. Назовите морфологические разновидности грамположительных и грамотрицательных бактерий.
10. Какое значение имеют жгутики в биологии бактерий?
11. Как определяют подвижность бактерий микроскопическим методом?
12. Как определяют подвижность бактерий методом посевов?
11. Какое практическое значение имеет изучение подвижности бактерий?
12. Как готовятся висячая и раздавленная капли и каковы особенности их микроскопии?
13. Какие существуют варианты расположения жгутиков у бактерий? Как обнаружить жгутики?

ЗАНЯТИЕ №3
Тема:
 Структура бактериальной клетки (продолжение.) Сложные методы окраски.
План занятия:
1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена.
2. Выявление спор у бактерий. Окраска по Ожешко.
3. Выявление капсул у бактерий. Окраска по Бурри-Гинсу.
15
4. Выявление включений по методу Нейссера.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой
трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм разделены светлым — промежуточным). По
структуре она похожа на плазмалемму клеток животных и состоит из двойного слоя фосфолипидов с
внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь
структуру мембраны. При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки)
цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных
структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются
внутрицитоплазматическими мембранами.
Цитоплазма состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных
мелких гранул — рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер
около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 80S-ри6ocoм, характерных для эукариотических
клеток. Рибосомные РНК (рРНК) — консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции).
16S рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S рРНК — в состав большой субъединицы рибосом.
Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.
В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как
липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигметные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в
цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по
наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и
дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями,
изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-
красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены
полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул
волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно
биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина
уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется
из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно
фиксировавшие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки желтого.
Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой
ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не
имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится
одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК, содержащая до 4000 отдельных генов.
Ядерные структуры можно наблюдать в фазово-контрастный микроскоп. Для их выявления в фиксированных
мазках применяют реакцию Фѐльгена. Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной
клетке имеются внехромосомные факторы наследственности в виде ковалентно замкнутых колец ДНК, так
называемые плазмиды. Они не являются жизненно необходимыми, т.к. не кодируют информацию о синтезе
ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме.
Плазмиды (другое названия — эписомы) представляют двунитчатые кольцевые ДНК с молекулярной массой
в несколько миллионов дальтон, реплицируемые клеткой и несущие от 40 до 50 генов. Они вначале были
обнаружены у прокариотов, и с их существованием связаны разные свойства бактерий, например устойчивость
к антибиотикам. Поскольку плазмиды обычно не связаны с бактериальной хромосомой (хотя многие из них
способны к интеграции), их считают экстрахромосомными факторами наследственности.
Плазмиды были обнаружены и у эукариотов (дрожжей и других грибов), более того, обычные вирусы высших
животных также могут существовать в виде плазмид, т.е. кольцевых ДНК, лишенных собственных белков и
реплицируемых клеточными ферментами синтеза ДНК. В частности, в виде плазмид могут существовать вирусы
У бактерий известны плазмиды, выполняющие регуляторные и кодирующие функции. Например, R-плазмида
обусловливает устойчивость бактерий к лекарственным препаратам, плазмида бактериоцирогении кодирует синтез
бактериоцинов, т.е. особых белковых продуктов, вызывающих гибель близкородственных бактерий.
Капсула, микрокапсула, слизь. Капсула — слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с
клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-
отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она
выявляется при специальных методах окраски мазка (например, по Бурри—Гинсу), создающих негативное
контрастирование веществ капсулы: тушь образует темный фон вокруг капсулы.
16

Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда — из полипептидов; например, у


сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна,
препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение
(реакция набухания капсулы).
Многие бактерии образуют микрокапсулу — слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое
лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слизь — мукоидные экзополисахариды,
не имеющие четких границ. Слизь растворима в воде. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии
(прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом. Кроме синтеза экзополисахаридов бактериями,
существует и другой механизм их образования: путем действия внеклеточных ферментов бактерий на
дисахариды. В результате этого образуются декстраны и леваны.
Кислотоустойчивые бактерии обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, щелочам и
спиртам, что связано с наличием в теле микроба нейтральных жиров, воска и оксикислот, в частности миколовой
кислоты. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для выявления
кислотоустойчивых бактерий применяют концентрированные красители, приготовленные в растворе карболовой
кислоты, и подогревание. Карболовая кислота при подогревании разрыхляет клеточную стенку и тем самым
повышает ее тинкториальные свойства. При последующем воздействии серной или азотной кислотой тело
микробной клетки не обесцвечивается, что дает возможность отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от
бактерий, не обладающих этим свойством. К патогенным кислотоустойчивым бактериям относятся палочки
туберкулеза и проказы. К непатогенным - палочка смегмы, нередко находящаяся в моче человека. а также
микробы, встречающиеся в организме холоднокровных, на различных злаках, почве, навозе, в молоке, масле. В
отличие от туберкулезных бактерий они обесцвечиваюся спиртом. Окраска кислотоустойчивых микробов
производится по методу Циля-Нильсена.
Споры у бактерий образуются при неблагоприятных условиях существования микроба. По расположению
споры могут находиться в центре микробной клетки, например, у сибиреязвенной палочки, ближе к концу -
субтерминально - у Bac.perfringes, и на конце (терминально) - у палочки столбняка. Спорообразование
наблюдается среди некоторых палочковидных бактерий и актиномицет. Образование спор происходит в
присутствии кислорода и при температуре не ниже 15° и не выше 43°. Споры очень устойчивы к температуре,
погибают при кипячении в течение 2-6 часов, при стерилизации в автоклаве, при температуре 120°, погибают в
течение 15-30 минут. Споры у бактерий служат для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней
среды.
Бактериальные споры могут быть выявлены с использованием как простых, так и сложных методов окраски.
Простой, например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина микроорганизм окрашивается в зеленый
цвет, споры – бесцветные, а фон – черный. Наиболее часто применяют сложные методы окрашивания эндоспор
по Ожешко и по Шеферу – Фултону.
Капсула располагается поверх клеточной стенки и представляет ослизненную клеточную оболочку.
Патогенные бактерии образуют капсулу только находясь в организме животных или человека, а при
культивировании может появляться при добавлении к питательной среде нативного белка. Капсула защищает их
от действия фагоцитов и антител. "Капсульные" бактерии образуют капсулу и в организме, и на питательных
средах, где они дают характерный слизистый рост. Для обнаружения капсул у бактерий применяют специальные
методы окраски. Чаще всего используется метод Гинса.
В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные
тельца, гликоген, гранулеза, пигметные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме
встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по наименованию
которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии.
Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет
последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое
явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся
веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при
лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен.
Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера.
При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая
принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировавшие метиленовую синьку, остаются
темно-синего (почти черного) цвета, а палочки желтого.
17
Цель занятия:
1. Освоить методы микроскопического выявления структурных элементов клетки (споры, капсулы,
включения, оболочка кислотоустойчивых бактерий).
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Структурные элементы бактериальной клетки, их назначение и роль в распознавании микробов.
2. Методы микроскопического изучения структурных элементов бактериальной клетки:
- оболочка кислотоустойчивых бактерий (окраска по Цилю-Нильсену);
- споры (окраска по Ожешко);
- зерна волютина (окраска по Нейссеру)
- капсулы (окраска по Бурри и по Бурри-Гинсу)
Уметь:
1. Окрашивать препараты сложными методами с целью выявления кислотоустойчивых бактерий, спор, зерен
волютина у дифтерийной палочки, капсул у бактерий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Для выявления туберкулезных бактерий обычно исследуют мокроту. Пинцетом или препаровальными иглами
наносят комочек мокроты на середину предметного стекла, затем его покрывают вторым пролетным стеклом так,
чтобы одна треть нижнего и одна треть верхнего стекла были свободными. Затем берут за свободные концы
стекла и растирают комочек между ними, после чего раздвигают оба стекла. Таким образом, получаются два
мазка, которые затем высушивают на воздухе и фиксируют на пламени.
На фиксированный мазок мокроты, для окраски туберкулезных бактерий по Цилю-Нильсену, кладут листок
фильтровальной бумаги размером меньше предметного стекла и наливают на него карболовый фуксин Циля.
Окрашиваемый мазок подогревают на пламени до появления пара, который хорошо заметен, если смотреть на
препарат сбоку, так подогревают его 2-3 раза.
Препарату дают остыть, сбрасывают бумажку с краской и наносят 5% серную или 25% азотную кислоту.
Докрашивают препарат метиленовой синькой в течение 4-6 мин, после чего промывают водой, высушивают и
рассматривают под иммерсионной системой.
Туберкулезные палочки окрашиваются в рубиново - красный цвет, а форменные элементы,
некислотоустойчивые бактерии в синий цвет.
Для окрашивания спор по методу Ожешко готовят густой мазок на одном конце предметного стекла и
высушивают на воздухе, после чего на него наносят 1% раствор соляной кислоты и нагревают на пламени до
появления паров в течение 1-2 минут. Препарат промывают водой, высушивают, фиксируют на пламени и
окрашивают по методу Циля-Нильсена. При иммерсионной микроскопии обнаруживают красного цвета споры и
синего цвета вегетативные тела.
Метод Шефера – Фултона: фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который
наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления
паров. Сняв фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором
сафранина и вновь промывают водой.темой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный.
Для выявления капсул по методу Гинса на предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в
которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. Рядом с первой каплей помещают
каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок, как мазок крови,
ребром одного стекла проводят по поверхности другого. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют,
пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов,
окруженные бесцветной капсулой.
Для выявления зерен волютина н а фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску
фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин. Снять бумагу, промыть мазок водой.
Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для
обесцвечивания. Промыть водой, докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.,
вновь промыть водой, высушить и микроскопировать.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Приготовление препаратов из нативной мокроты и их окраска по Цилю-Нильсену.
2.Окрашенные препараты, приготовленные из мокроты туберкулезных больных и из чистой культуры
дифтерийной палочки.
3.Споры антракоида, окрашенные по методу Шефера-Фултона.
18
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА
1. Приготовить препарат из мокроты, окрасить по Цилю-Нильсену, микроскопировать и зарисовывать.
2. Приготовить препарат из Kl. Pneumoniae или Kl. ozaenae методом Бурри-Гинса, микроскопировать и
зарисовать их.
3. Микроскопировать окрашенные по Ожешко препараты спор антракоида и зарисовать их.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие палочковидные формы принято называть бациллами?
2. В каких условиях образуется капсула у бактерий?
3. В каких условиях образуется спора у бактерий?
4. Каково назначение капсулы у бактерий?
5. Каково назначение споры у бактерий?
6. Какие химические вещества входят в состав капсулы?
7. Как обнаружить капсулу у бактерий?
8. Каким преимущественно формам бактерий присуще спорообразование?
9. Как можно убить спору?
10. Чем обусловлена кислотоустойчивость спор?
11. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии по методу Циля- Нильсена?
12. Чем обусловлена кислотоустойчивость бактерий?
13. Каково назначение зерен волютина?
14. Как можно выявить зерна волютина?
15. Что такое метахромазия?
16. Какое значение имеет обнаружение зерен волютина у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №4
План занятия:
 Морфология спирохет, грибов, риккетсий, хламидий, простейших, вирусов (бактериофагов).
План занятия:
1. Изучение морфологии нитчатых и дрожжеподобных грибов.
2. Изучение морфологии простейших.
3. Морфология вирусов. Бактериофаги: строение бактериофагов, получение бактериофагов, титрование.
Применение в медицине.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Спирохеты — тонкие, длинные, извитые (спиралевидной формы) бактерии, отличающиеся от спирилл
подвижностью, обусловленной сгибательными изменениями клеток. Спирохеты имеют наружную мембрану
клеточной стенки, окружающую протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной. Под
наружной мембраной клеточной стенки (в периплазме) расположены периплазматические фибриллы (жгутики),
которые, как бы закручиваясь вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, придают ей винтообразную
форму (первичные завитки спирохет). Фибриллы прикреплены к концам клетки и направлены навстречу друг
другу. Другой конец фибрилл свободен. Число и расположение фибрилл варьируют у разных видов. Фибриллы
участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам вращательное, сгибательное и поступательное движение.
При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые названы вторичными завитками.
Спирохеты плохо воспринимают красители. Их окрашивают по методу Романовского—Гимзы или серебрением,
а в живом виде исследуют с помощью фазово-контрастной или темнополь-ной микроскопии. Спирохеты
представлены 3 родами, патогенными для человека: Treponema, Borrelia, Leptospira.
Трепонемы имеют вид тонких штопорообразно закрученных нитей с 8-12 равномерными мелкими завитками.
Вокруг протопласта трепонем расположены фибриллы. Патогенными представителями являются Т.pallidum —
возбудитель сифилиса, T.pertenue — возбудитель тропической болезни — фрамбезии.
Боррелии более длинные, имеют по 3-8 крупных завитков и 8-20 фибрилл. К ним относится возбудитель
возвратного тифа (B.recurrentis) и возбудители болезни Лайма (В. burgdorferi и др.).
Лептоспиры имеют завитки неглубокие и частые — в виде закрученной веревки. Концы этих спирохет
изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах. Образуя вторичные завитки, они приобретают вид букв
«S» или «С»; имеют 2 осевые нити. Патогенный представитель L inter-rogans вызывает лептоспироз.
19
Микоплазмы — мелкие бактерии (0,3-0,8 мкм), не имеющие клеточной стенки, окруженные
цитоплазматической мембраной, содержащие стеролы Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмо-
тически чувствительны. Имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную, похожи
на L-формы. Самые мелкие из них – элементарные тельца. Эти формы видны при фазово-контрастной
микроскопии чистых культур микоплазм. Микоплазмы – внеклеточные патогенны, прикрепляются к
эпителию посредством специальных белков – адгезинов. Отсутствие клеточной стенки определяет
устойчивость микоплазм к пенициллинам, цефалоспоринам и др. антибиотикам, ингибирующим синтез
клеточной стенки. Патогенные микоплазмы вызывают хронические инфекции — микоплазмозы, некоторые
из них входят в состав нормальной микрофлоры (полости рта).
Актиномицеты — ветвящиеся, нитевидные или палочковидные грамположительные бактерии. Свое
название (от греч. actis — луч, mykes — гриб) они получили в связи с образованием в пораженных тканях друз
— гранул из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся
колбовидными утолщениями. Актиномицеты могут делиться путем фрагментации мицелия на клетки, похожие
на палочковидные и кокковидные бактерии. На воздушных гифах актиномицетов могут образовываться
споры, служащие для размножения. Споры актиномицетов обычно нетермостойки.
Общую филогенетическую ветвь с актиномицетами образуют так называемые нокардиоподобные
(нокардиоформные) актиномицеты — собирательная группа палочковидных, неправильной формы бактерий. Их отдельные
представители образуют ветвящиеся формы. К ним относят бактерии родов Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др.
Нокардиоподобные актиномицеты отличаются наличием в клеточной стенке сахаров арабинозы, галактозы, а также миколовых
кислот и больших количеств жирных кислот. Миколовые кислоты и липиды клеточных стенок обусловливают
кислотоустойчивость бактерий, в частности, микобактерий туберкулеза и лепры (при окраске по Цилю—Нильсену они имеют
красный цвет, а некислотоустойчивые бактерии и элементы ткани, мокроты — синий цвет).
Грибы представляют собой растительные организмы, лишенные хлорофилла. В отличие от бактерий, клетки
грибов имеют дифференцированное ядро и размножаются бесполым и половым способом. По особенности
строения мицелия и образования половых спор грибы делят на несколько классов.
Представители класса фикомицетов имеют несептированный мицелий и относятся к низшим грибам (мукоровая
плесень). Мукоровые грибы представляют собой сильно разветвленную клетку, от которой отходят плодо-
носящие гифы - спорангеносцы с шароподобными образованиями наверху спорангиями, наполненными
эндоспорами. К классу аскомицет относится аспергиллус и пенициллиум. Аспергилус имеет расчлененный
мицелий, одноклеточный конидиеносец, на головке которого веерообразно расположены короткие стеригмы, от
которых отшнуровываются экзоспоры (при микроскопии напоминают струйки вытекающей из лейки воды). У
пенициллиума или кистевика мицелий и конидиеносец многоклеточные, плодоносящее тело имеет вид кисточки.
Представители этих двух классов грибов широко распространены в природе и, как правило, ведут,
сапрофитический образ жизни. В отдельных случаях могут вызывать поражение дыхательных путей, среднего
уха, глаз.
Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует
в пределах 2-15 микронов. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют
цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой
размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная. Наружных спор, типа конидий, и
внутренних, типа аскоспор, дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей,
аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды Candida образуют хламидоспоры, диаметр их
достигает 10-20 микронов, форма округлая, оболочка толстая, двуконтурная. Хламидоспоры возникают на концах
псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.
Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за
счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называют псевдомицелием и
отличаются они от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных
клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования. В патологии человека
определенную роль играют дрожжеподобные грибки из рода Candida, поражающие чаще всего слизистую
желудочно-кишечного тракта.
Лучистые грибки - актиномицеты - по строению совмещают свойства бактерий и грибов. В патологии человека
встречаются актиномицеты, вызывающие актиномикоз - заболевание, характеризующееся образованием
лучистых друз в гнойно - восполительных инфильтратах различных тканей.
Представители семейства Streptomycetaceae служат источником для получения антибиотиков.
Риккетсии - занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Это мельчайшие
грамотрицательные микроорганизмы кокковидной или палочковидной формы, не способные расти на
искусственных питательных средах. Они могут развиваться только в живой клетке с пониженным
20
метаболизмом. Их культивируют также в желточном мешке куриного эмбриона. Клетка содержит клеточную
стенку, ЦПМ, цитоплазму, нуклеоид и рибосомы, что сближает их с бактериями. Внутриклеточное размножение
и абсолютный паразитизм сближает их с вирусами. По величине они крупнее вирусов, не проходят через
фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе.
По П. Ф. Здродовскому, наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсий): 1)
кокковидные (0,5мкм), 2) палочковидные (короткие - 1-1,5мкм), 3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3-4мкм),
4) нитевидные (20-40мкм). Все формы полиморфны.
Риккетсии окрашивают по Граму (грамотрицательны), по Романовскому-Гимзы и по Здродовскому. У
человека риккетсии вызывают сыпной тиф и другие риккетсиозы.
Хламидии - грамотрицательные, мелкие кокковидные бактерии, размножаются только в живых клетках и не
растут на искусственных питательных средах, т.е., как и риккетсии, они относятся к числу облигатных
внутриклеточных бактерий. Попавшие в чувствительную клетку элементарные тельца хламидий превращаются в
ретикулярные тельца, которые делятся пополам. После нескольких делений образуются промежуточные формы,
превращающиеся затем в элементарные тела. У человека хламидии вызывают поражение глаз, урогенитального
тракта, легких и др.
Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями
располагаются группами по 4-6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагромождения
чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии
располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее
плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам,
макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.
Хламидии окрашивают по Романовскому-Гимзе, они хорошо видны в нативных препаратах при фазово-
контрастной микроскопии. Чаще всего для их выявления в соскобах клеток применяют метод иммунной
люминесцентной микроскопии.
Простейшие имеют более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами.
Снаружи тело простейших покрывает элактичная и ригидная мембрана – пелликула, образованная внешним
слоем цитоплазмы. У некоторых видов кдеточная мембрана может включать опорные фибриллы и даже
минеральный скелет. Клеточная структура и набор органоидов идентичен клеткам многоклеточных животных
организмов. Многие простейшие активно двигаются за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек.
Простейшие включены в царство Protozoa, подцарство Animalia, разделенное на 7 типов. Виды, патогенные
для человека, например, малярийные плазмодии, лямблии, трихомонады, токсоплазмы, саркоцисты, изоспоры,
пнемоцисты, криптоспоридии, трипаносомы и др. входят в сотав 3-х типов – Apicomplexa, Sarcomastigophora и
Ciliophora. Всего насчитывается около 7 000 видов, патогенных для растений, животных и человека. Жизненый
цикл паразитических простейших нередко включает образовавние промежуточных форм в различных хозяевах,
что дает им возможность более эффективно инфицировать восприимчивые организмы.
Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей
возбудителя и значительно зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации.
Морфология простейших изучается как в живом их состоянии, так и в окрашенном виде. Простая окраска
(фуксином или метиленовой синей) непригодна, так как она не позволяет выявить сложную структуру этих
микроорганизмов. Наиболее простым способом, дифференцирующим отдельные элементы клетки, является
метод окраски по Романовскому-Гимзе. При этом фиксация мазков должна производиться не на пламени, а в
каком-либо фиксаторе (например, смесью спирта с эфиром по Никифорову). При выявлении подвижности
лучшие результаты достигаются, применяя подогрев предметного столика и исследуя в первые 30 минут после
взятия материала.
Вирусы - автономные, проходящие через бактериальные фильтры генетические структуры, способные
функционировать и репродуцироваться в восприимчивых клетках животных, растений, бактерий, простейших,
грибов.
Вирусная частица - вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой -
капсидом. У некоторых вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой. Капсид состоит из субъединиц -
капсомеров, имеющих чаще всего симметричное строение. Особенностями вирусов являются: фильтруемость,
неспособность размножаться на искусственных питательных средах, отсутствие собственных
белоксинтезирующих систем, наличие только одной какой либо нуклеиновой кислоты, дисъюнктивный
(разобщенный) способ размножения.
Вирусы культивируют в организме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц и культурах
клеток (тканей). Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: цитопатогенного действия
21
(ЦПД) вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции
гемагглютинации, гемадсорбции, реакции иммунофлюоресценции.
Вирусы, поражающие бактерии (бактериофаги) состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту
и отростка. Некоторые фаги не имеют отростка, или он очень короткий. Проникновение фага в бактериальную
клетку может закончиться гибелью клетки и выходом фага (продуктивная инфекция - вирулентный фаг). В
других случаях геном фага интегрирует с геномом клетки. Клетка не погибает, а геном фага репродуцируется с
геномом клетки. Такая культура бактерий называется лизогенной. ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии,
называется профагом, сам процесс – лизогенией. Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующих
агентов (УФ-лучи, митомицин С и др.) Лишь в отдельных клетках лизогенных бактерий фаг размножается и
вызывает гибель клеток (умеренный фаг). Профаг может придавать бактерии новые свойства, что получило
название фаговой конверсии. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает еѐ способность
продуцировать дифтерийный экзотоксин.
Бактериофаги получают путем фильтрации материала через бактериальные фильтры. Количество бактериофагов
можно определить путем серийных разведений с последующим добавлением их к индикаторным бактериям,
выращиваемым на жидкой питательной среде (метод Аппельмана), или выращиваемым на плотной среде в
чашках (метод Грациа).
Бактериофаги применяют для профилактики, лечения инфекций, в генной инженерии, а также для диагностики.
Цель занятия:
1. Изучить особенности строения спирохет, хламидий, риккетсий, нитчатых и дрожжеподобных грибов,
простейших, вирусов, в том числе бактериофагов.
2. Познакомиться с лечебно-профилактическими и диагностическими препаратами из бактериофагов.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Морфологию спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир).
2. Морфологию нитчатых и дрожжеподобных грибов.
3. Морфологию простейших (лямблий, трихомонад, токсоплазм, дизентерийной амебы, малярийного
плазмодия).
4. Морфологию хламидий, риккетсий и вирусов, в том числе бактериофагов.
5. Получение бактериофагов, титрование, применение в медицине.
Уметь:
1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов в готовых препаратах.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ:
Методика окраски спирохет по методу Романовского-Гимзы.
Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.
На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.
Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет,
боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются
в синий цвет.
Для изучения морфологии грибов необходимо на предметное стекло нанести каплю воды, в которую
препаровальными иглами вносится и расправляется мицелий грибков; препарат прикрывается покровным стек-
лом и рассматривается под сухой системой микроскопа. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у
аспергилла и пеницилла - многоклеточный. У мукора оганы плодоношения представлены в виде большого
спорангиеносца с эндоспорами, у аспергилла конидиеносцы несептированные в виде лейки, у пеницилла -
септированные в виде кисти рук.

Микроскопические методы исследования вирусов.


1. Этапы репродукции многих вирусов можно наблюдать с помощью электронного микроскопа. Однако
крупные вирионы (300-400 нм) видны в виде скоплений (элементарные тельца Пашена - при натуральной оспе)
даже в обычном световом микроскопе после обработки соответствующих препаратов методом серебрения по
Морозову.
2. На отдельных этапах внутритканевого размножения о наличии вирусных особей можно судить по
образованию довольно крупных внутриклеточных включений. В этих случаях применяются гистохимические
методики, метод электронной и непрямой люминесцентной микроскопии. Так, например, при заболевании
бешенством в цитоплазме ганглиозных клеток аммонова рога, мозжечка и продолговатого мозга после окраски
(по Манну, Муромцеву или по Туревичу) обнаруживаются цитоплазматические включений – тельца Бабеша-
22
Негри. При натуральной оспе можно выявить внутриклеточные включения, состоящие из больших
скоплений белковых компонентов вируса, локализующихся в цитоплазме эпителиальных клеток - тельца
Гварниери.
Выявление вирусов по цитопатическому эффекту.
Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре
ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии
клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной
деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной
дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Приготовление препарата из нитчатых грибов.
2. Препарат-мазок из дрожжеподобных грибов Candida albicans.
3. Схемы морфологии и строения риккетсий и хламидий.
4. Токсоплазмы, малярийный плазмодий в готовых препаратах.
5. Схема строения вирусных частиц.
6. Тельца Бабеша- Негри в мозговой ткани животного, погибшего от бешенства.
7. Схема строения бактериофагов.
8. Титрование бактериофага по Аппельману и по Грациа.
9. Биопрепараты бактериофагов.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Каждый студент готовит по 1 препарату нитчатых грибов, микроскопирует, зарисовывает в альбом.
2. Каждый студент готовит препарат из культуры дрожжевых клеток, окрашивает по Нейссеру,
микроскопирует, зарисовывает.
3. Приготовление мазка из риккетсиозного диагностикума.
4. Каждый студент готовит препарат из культуры грибка Candida albicans, окрашивает по Граму (или
метиленовой синькой), микроскопирует и зарисовывает.
5. Студенты изучают бакпрепараты из бактериофагов.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Каковы морфологические отличия аскомицет от фикомицет?
2. Чем грибы по морфологии отличаются от бактерий?
3. Какое место в системе микроорганизмов занимают спирохеты?
4. Какие роды спирохет имеют медицинское значение?
6. Какие бактерии относятся к числу облигатных внутриклеточных?
7. Какие свойства указывают на принадлежность риккетсий к бактериям?
8. Какое главное биологическое свойство сближает риккетсий с вирусами?
9. Какова форма риккетсий?
10. Какой механизм обеспечивает внутриклеточное выживание риккетсий?
11. Какие свойства указывают на принадлежность хламидий к бактериям?
12. В чем особенность жизненного цикла хламидий?
13. В чем особенность функциональной организации простейших по сравнению с бактериями?
14. Назовите типы простейших, в которые входят виды, патогенные для человека.
15. Что лежит в основе диагностики протозойных инфекций?
16. Каковы структурные элементы вирионов?
17. Какие биологические свойства отличают вирусы от других микроорганизмов?
18. Какие свойства лежат в основе классификации вирусов?
19. Каким способом размножаются вирусы?
20. Какие изменения могут возникать в клетке в результате заражения ее вирусом?
21. Что такое элементарные вирусные частицы? Как их можно определить?
22. Какие структурные элементы имеет фаговая частица?
23. Чем отличается вирулентный бактериофаг от умеренного?
24. Какие фазы взаимодействия вирулентного фага и бактериальной клетки Вам известны?
25. Что такое явление лизогении?
26. Как измерить количество фаговых частиц в материале?
23

27. Для каких целей используются бактериофаги в медицине?

ЗАНЯТИЕ №5
Тема:
 Физиология бактерий. Питание и выращивание бактерий и вирусов.

План занятия:
1. Питание и выращивание бактерий. Классификация питательных сред.
2. Культивирование риккетсий, хламидий и вирусов.
3. Методы посевов и пересевов бактериальных культур, методы выделения чистых культур: по Дригальскому,
Гольду, Коху и биобактериологический.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Физиология микробов изучает вопросы питания, ферменты, рост и размножение микробов, их
конструктивный и энергетический метаболизм.
Для роста и размножения микробной клетке необходима энергия. Она высвобождается в процессе
окислительно-восстановительных реакций. Поступление питательных веществ в бактериальную клетку
происходит в основном за счет осмоса и диффузии, а также обменной адсорбции. Для культивирования бактерий
используются питательные среды. Их применяют для получения чистых культур микроорганизмов, изучения
особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в
лабораторных и производственных условиях. Любая питательная среда должна соответствовать следующим
требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь
оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по
возможности, прозрачной. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно
просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Гетеротрофные бактерии получают
энергию в результате окисления восстановленных углеродных (органических) соединений. Некоторые из них,
такие как E.coli, способны к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Другие,
например, молочнокислые бактерии - растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд
органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать
самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их
добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа
организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор
основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе
встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1
мг/л в день. Они получили название олиготрорфных, противоположную группу для них составляют бактерии
копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах.
По составу среды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические. Естественные
питательные среды - это натуральный продукт животного или растительного происхождения - молоко, яйца,
овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из
различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических
солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в
точно указанных концентрациях. Например, минимальная среда Ледерберга часто используется для получения
ауксотрофных мутантов. На таких средах культивируются прототрофы, использующие углерод глюкозы как
единственный источник углерода, и аммонийные соединения как единственный источник азота.
По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие. Жидкие среды чаще
применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и
продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные - для выделения
микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения
антагонистических свойств и др.
Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в
микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок,
пропитанный питательным раствором. В качестве уплотнителей в настоящее время используют агар, реже
желатин и силикагель. Агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде
24
гели, плавящиеся при 1000С и уплотняющиеся при 450С и ниже, не используемые микроорганизмами в
качестве питательного субстрата. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара
образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Агар к средам добавляют в
количестве 1,5-2% - для плотной среды или 0,4-0,7% - для полужидкой среды, которая может применяться для
длительного хранения культуры без пересевов.
В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в
промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы,
мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного
времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав.
Микротест - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых
содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-
облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в
практических лабораториях.
По назначению среды подразделяются на обычные (простые), специальные, элективные,
дифференциально-диагностические. Обычные среды используют для культивирования большинства
микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), сусло жидкое, сусло-агар.
Специальные среды используют для выделения, культивирования и идентификации определенных групп или
видов микроорганизмов.
Элективные среды используют при выделении определенного вида микроорганизмов из мест его
естественного обитания и содержат компоненты с учетом биологических особенностей выделяемых микробов.
Например, дифтерийные бактерии в силу их высокого паразитизма лучше всего растут на сывороточных средах
или кровяных средах (Ру, Леффлера, Тинсдаля, Клауберга). В последних двух случаях в состав сред входит
теллурит калия или натрия, в результате чего рост сопутствующих бактерий сильно задерживается. В
противоположность этому холерный вибрион можно выращивать даже на «голодной» водной среде, содержащей
всего 1% пептона, но при этом рН среды должна быть более 8.0.
Дифференциально-диагностические среды (например, среды Гисса, Симонса, Кларка, бульон Штерна)
предназначены для изучения и индикации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы
применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон
Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их
расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону.
Соответственно выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения
индолообразования, среды для определения протеолитической активности и политропные, или
комбинированные, среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый
синий, индикатор Андреде, бромкрезоловый пурпурный, крезоловый красный), помогающие визуально
определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону
вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым
синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Все
дифференциально-диагностические среды разделяют на 4 основные группы.
А. Содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь,
желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее
распространенными средами являются МПЖ, свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).
Б. Содержащие индикаторы, углеводы или многоатомные спирты; ферментативное расщепление приводит
к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами
(например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР) и лакмусовое молоко (среда Минкевича). Также широко
распространены среды Хисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные
углеводы с образованием кислоты либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют
пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андраде и поплавками, облегчающими
обнаружение газообразования; иначе такой набор называют «пестрый», или цветной, ряд. Из углеводов наиболее
часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды
(лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит,
сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин). Например, для выделения патогенных
бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы
от постоянных обитателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда
Эндо, в состав которой входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и
основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый
цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и окрашивает колонии
25

в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде
образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не
сбраживают лактозу.
В. Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красками,
обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный - агар
Ротберга, индигокармин - агар Омилянского), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей
активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).
Г. Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Наиболее
распространенными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ


Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и
химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели
каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют
методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных
и микроаэрофильных условиях.
Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, т. е.
торможению процессов обмена веществ. Хранение микроорганизмов осуществляется в специальных коллекциях
типовых культур. В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов может поддерживается следующими
методами: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием;
4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур.
Выделение чистой культуры аэробных бактерий.
В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не
менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена
при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур
различных видов бактерий, существующих в естественных условиях. Для выделения чистых культур
большинства бактерий обычно затрачивается не более 2 – 3 суток, однако для некоторых (например, бактерии
туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4 – 6 недель. Чистой культурой микроорганизмов называют
популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки.
Для выделения чистой культуры применяют методы, основанные на:
1) принципе механического разделения микроорганизмов:
а) механическое разобщение бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по
Дригальскому), рассев штрихами калиброванной петлей (по Гольду) или тампоном после забора им
исследуемого материала;
б) метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с
определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод
применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в
фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).
2) получении серийных разведений в жидкой среде с последующим высевом на чашки с агаром (метод
пластинчатых разводок по Коху).
3) на биологических свойствах микроорганизмов:
а) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре для
получения культур психрофильных бактерий.
б) метод Шукевича. Клетки бактерии (протея), характеризующиеся скользящим типом движения,
засеянные в конденсационную жидкость свжеприготовленного косого агара, поднимаются («всползают») по
поверхности среды и разрастаются далеко за зону внесения посевного материала.
в) метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают
исследуемый материал на водяной бане при 800С 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры
сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.
г) бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на различном действии некоторых химических
веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и
не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост
грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина
26

позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро
убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.
д) метод заражения лабораторных животных или растений. Основан на способности
некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных
(биопроба). Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от
сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю
инфекции виды животных или сорта растений. После появления у зараженных организмов признаков болезни их
убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных
паразитов этот метод является основным и единственным.
Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов.
Для культивирования вирусов (так же как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий)
используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.
Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов с целью получения вирусов и для
приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные
зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца
над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично
протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры,
в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок,
аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость отверстие
заливают парафином; если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным
покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в
термостат при 370С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-
аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют
специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).
Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые
используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок)
длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и
злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона,
образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток
применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие
аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки.
Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.
Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД),
которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых
случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД
зависит от вида вируса.
Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных
животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида
животного и его возраста.
Культивирование риккетсий
Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях.
Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона. Патогенные риккетсии вызывают сыпной тиф,
Ку-лихорадку и другие риккетсиозы.
Культивирование хламидий.
Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных.
Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33-410С и даже более широких, но
чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.
Цель занятия:
1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на
различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования.
2. Освоить технику посевов бактерий на плотных и жидких питательных средах.
3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
27
1. Метаболизм микроорганизмов.
2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и
гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы.
3. Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку.
4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных
видов бактерий.
5. Принципы культивирования различных групп микроорганизмов. Культуральные свойства бактерий.
6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой
питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов,
аминокислот, полисахаридов и других веществ.
7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов.
8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и
вирусов.
Уметь:
1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.
2. Описать культуральные свойства микроорганизмов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Техника посева бактерий на питательные среды, выделение, идентификация чистых культур бактерий.
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации,
которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков
микроорганизмов.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании
мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста
бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и
особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов,
присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение
имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на
дифференциально-диагностических средах.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и
культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens,
золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseudomonas
aeruginosa (синегнойная палочка).
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по
выявлению соответствующего маркера - определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.
Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или
выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. При посеве уколом
в столбик желатины наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом.
Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур.
При посеве уколом пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают
пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают обожженной на пламени
платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки
Посев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора (рис.
3), проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в
первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм.
Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах
чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в
виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.
28
Б

Рис. 3. Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний

Выделение чистых культур бактерий по методу Дригальского. Берут 3 чашки Петри с питательной средой.
В одну из чашек на питательный агар пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю исследуемого
материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во 2-ю
чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в
3-ю чашку и аналогичным образом производят посев, после чего чашки помещаются в термостат. В
последующем, в извлеченных из термостата чашках в зависимости от содержания микробных клеток в
исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии различных бактерий, отличающиеся
между собой по форме, цвету, величине, консистенции пригодные для выделения чистой культуры
микроорганизма. Отдельную "подозрительную", интересующую исследователя колонию снимают и засевают на
косой агар. Из остатка колонии готовят микропрепарат и изучают при окраске по Граму. У выросших на косом
агаре бактерий (как правило, одного вида) определяют биохимические, тинкториальные. антигенные свойства и
делают заключение о выделенной культуре бактерий.
При выделении чистой культуры бактерий по Гольду, внесенной на один из 4-х секторов пластинчатого
агара в чашке Петри, материал равномерно штрихами засевается по всему сектору и петля прожигается. Ох-
лажденной петлей материал снимается с одного из штрихов первого сектора и переносится во второй, где
производится равномерный штриховой посев, аналогичный первому. В третий и четвертый сектор посев делается
соответственно из второго и третьего секторов аналогично засеву второго сектора.
После инкубации в термостате наиболее густой рост бактерий выявляется в области первых штрихов первого
сектора. В каждом последующем секторе выявляется менее густой рост бактерий, чем в предыдущем, или рост
отдельных колоний. Отдельную колонию отвивают на косой агар и идентифицируют по тинкториальным,
биохимическим, серологическим свойствам.
Данный метод применяется в тех случаях, когда одновременно с выделением чистой культуры необходимо
определить количество бактерий в исследуемом материале. Определение количества бактерий всех видов в 1 г (1
мл) материала производят по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного
материала и степени его разведения. Количество микроорганизмов в 1,0 г = n'a'b, где n - число колоний,
выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (при посеве 0.1 мл а=10, при посеве 0,05 мл
а=20); b - степень разведения посевного материала.
Метод серийных разведений (пластинчатых разводок) по Коху также применяет для определения
количества микробов в исследуемом материале, чаще всего в жидких средах.
Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара.
При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы
«вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара
и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.
29
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Агар-агар, пептон в порошке, МПБ, МПА. сывороточные среды, желчный бульон, сахарный бульон,
кровяной агар, среды Гисса. Эндо, Левина, Клиглера, Левенштейна-Йенсена, среды обогащения
(магниевая, селенитовая), среда 199.
2. Демонстрация всех вариантов посевов и пересевов бактерий: с косого агара на косой, с косого агара на
бульон, с бульона на бульон с помощью петли и пастеровской пипетки.
3. Демонстрация методов посева для выделения чистых культур по Дригальскому иГольду.
4. Клеточные культуры, чистые и зараженные вирусами.
5. Схемы строения куриного эмбриона.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент производит пересев с косого агара на косой.
2. Пересев с косого агара на бульон петлей и пастеровской пипеткой (два студента в бригаде).
3. Две бригады студентов из 3-4 человек производят посев взвеси испражнений шпателем по Дригальскому
на чашки со средами Эндо и Левина. Две бригады студентов сеют слизь из зева в чашки Петри со средой
ЖСА.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Каковы основные фазы роста бактериальной популяции в жидкой питательной среде?
2. Какие механизмы поступления питательных элементов в бактериальную клетку?
3. Каким требованиям должны отвечать питательные среды?
4. Какие среды называются элективными, дифференциально-диагностическими, универсальными? Примеры.
5. Что такое чистая культура бактерий?
6. В чем сущность бактериологического метода выделения чистой культуры?
7. В чем сущность биолого-бактериологического метода выделения чистой культуры?
8. Что представляет собой колония бактерий на питательной среде?
9. В чем заключаются культуральные различия разных видов бактерий?
10. В чем заключаются особенности культивирования облигатных внутриклеточных бактерий и вирусов?
11. Назовите методы культивирования хламидий, риккетсий и вирусов?
12. Как проводится индикация роста хламидий, риккетсий и вирусов при их культивировании?
13. Для каких целей применяется метод посева исследуемого материала по Гольду?

ЗАНЯТИЕ №6
Темы:
 Методы выделения чистых культур аэробных бактерий (продолжение).
 Основные типы биологического окисления субстрата (аэробный и анаэробный).
 Действие физико-химических факторов на микроорганизмы. Асептика и антисептика
План занятия:
1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (2-день). Идентификация: культуральные, морфологические и
тинкториальные свойства.
2. Методы культивирования анаэробных бактерий.
3. Методы выделения и идентификации чистых культур анаэробных бактерий
4. Методы стерилизации. Дезинфекция.

Вводные замечания.
Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внимание на характер роста микроба, т.е. на
культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорга-
низма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде:
а) диффузного помутнения;
б) придонный и пристеночный рост в прозрачной среде;
в) образование поверхностной пленки;
г) рост в виде «комочка ваты».

В полужидких средах можно наблюдать:


а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижные бактерии);
30
б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии);
в) разрыв среды или образование пузырьков газа.
На плотных средах:
а) рост отдельными колониями;
б) рост сплошным налетом.

Определение чистоты выделенной культуры


Изолированные колонии, выросшие на плотной среде, отсевают бактериологической петлей на поверхность
скошенной агаризованной среды в пробирке. Поскольку изолированные колонии иногда могут формироваться не
только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их
однородности. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим и высевом на
соответствующие питательные среды. При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на
поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и
требуется ее дополнительная расчистка.
При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму (точечная,
круглая, волокнистая, неправильная, ризоидная), высоту, профиль (плоский, высокий, выпуклый), вид края. Край
колонии может быть гладким, волнистым, лопастным, зубчатым, волокнистым, складчатым и т. д. Для
рассмотрения краев используют микроскоп с малым увеличением. Следует описать также и поверхность колоний,
которая бывает гладкой, блестящей, шероховатой, тусклой, неровной, гранулированной матовой, мукоидной,
слизистой. Отмечают степень прозрачности колоний (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные) и их
консистенцию при проверке иглой: маслянистую, вязкую, сухую. На характеристики колоний могут влиять среда,
возраст культуры, условия культивирования.
Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать путем микроскопии клеток. Для
этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируют с иммерсионной системой.
Клетки чистых культур микроорганизмов, как правило, однородны по размеру и окраске по Граму. Однако,
следует помнить, что колонии, вырастающие из чистой культуры могут быть гладкие (S) и шероховатые ®. Кроме
того, в чистых культурах многих бактерий могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры. Наконец, многие
микроорганизмы проявляют грамвариабельность.
Чистоту культуры клеток проверяют также и путем повторного рассева на селективные среды,
обеспечивающие избирательный рост тех или иных микроорганизмов. Критерием чистоты в этом случае является
однородность формирующихся при этом колоний.
Особенности физиологии анаэробных бактерий
Анаэробные микроорганизмы в отличие от аэробов не только не нуждаются для своей жизнедеятельности в
кислороде воздуха, но последний, в ряде случаев, для них является даже губительным. Окисление субстрата в
бактериальной клетке может осуществляться прямым окислением вещества кислородом воздуха (аэробный путь)
или же путем дегидрирования (отнятия от субстрата водорода), что происходит как в аэробных условиях
(аэробное дегидрирование), так и в анаэробных (анаэробное дегидрирование).
Аэробное дегидрирование при широком доступе кислорода заканчивается окислением субстрата до конечных
продуктов, при этом выделяется вся заключенная в субстрате энергия. Но оно может быть неполным, и
образующиеся продукты окисления могут содержать еще большее количество энергии.
Анаэробное дегидрирование протекает в бескислородной среде. Конечными акцепторами водорода при этом
могут быть углерод, азот, сера восстанавливающиеся до СН^, .NH^ , H^S. Высвобождающаяся при этом энергия
невелика, но образовавшиеся промежуточные продукты содержат еще значительное количество заключенной в
них энергии. И аэробный и анаэробный типы окисления не могут идти без участия определенных ферментов,
причем анаэробный путь окисления у микроорганизмов превалирует. Некоторые микроорганизмы способны
менять аэробный тип дыхания на анаэробный и обратно - факультативные анаэробы. Другие микроорганизмы
способны жить только в отсутствии свободного кислорода - облигатные, т.е. обязательные, анаэробы.
Методы создания анаэробных условий.
Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом.
31
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или
растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный
в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее
перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством
стерильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и
муравьинокислый натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая
используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания
роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по методам Вейнберга и Веньяль-Вейона.
Культивировать анаэробы Вейнберг предложил на сахарном агаре столбиком. Агар с глюкозой наливают в
пробирку высоким столбиком до 2/3 их объема, охлаждают до 42-450С. Исследуемый материал добавляют в агар,
тщательно перемешивают. Пробирку ставят в штатив, питательная среда застывает и внутри нее (особенно в
нижней части пробирки) создаются надежные анаэробные условия.
Метод Веньяль-Вейона состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут
стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один коней трубки вытягивают в капилляр в виде
пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют
ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 500С агаром засевают исследуемый материал.
Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в
пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых
строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила
асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с
питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания их специальных приборов -
анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой
толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный
отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата
удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, СО2 ) можно производить в тех же
анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде
(анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S2O4.
Биологические методы (метод Фортнера). Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими
аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем
полоску агара шириной около 1 см. Получается 2 агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой
пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону
засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии
подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки
будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства
в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания
анаэробиоза.
Влияние физических факторов на микроорганизмы.
Температура является наиболее значительным фактором, оказывающим влияние на жизнедеятельность
микробов. Температура, необходимая для роста и размножения бактерий одного и того же вида варьирует в
широких пределах. Различают температурный оптимум, минимум и максимум.
Температурный оптимум соответствует физиологической норме данного вида микробов, при которой
размножение происходит быстро и интенсивно. Для большинства патогенных и условно-патогенных микробов
температурный оптимум соответствует 370С.
Температурный минимум соответствует температуре, при которой данный вид микроба не проявляет
жизнедеятельность.
Температурный максимум - температура, при которой рост и размножение микробов прекращается, все
процессы метаболизма снижаются и может наступить гибель.
В зависимости от температуры, оптимальной для жизнедеятельности, различают 3 группы
микроорганизмов:
32
1) психрофильные, холодолюбивые, размножающиеся при температуре ниже 200С
(иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонады, вызывающие заболевания человека. Размножаясь
в пищевых продуктах, они более вирулентны при низких температурах);
2) термофильные, оптимум развития которых лежит в пределах 550С (в организме теплокровных не
размножаются и медицинского значения не имеют);
3) мезофильные, активно размножаются при температуре 20-400С, оптимум температуры развития для них
370С (патогенные для человека бактерии).
Микроорганизмы хорошо выдерживают низкие температуры. На этом основано длительное сохранение
бактерий в замороженном состоянии. Однако ниже температурного минимума проявляется повреждающее
действие низких температур, обусловленное разрывом клеточной мембраны кристаллами льда и приостановкой
метаболических процессов.
Низкая температура не оказывает бактерицидного действия на микроорганизмы, но приостанавливает
вызываемые ими гнилостные и бродильные процессы. Это лежит в основе консервации субстратов (в частности,
пищевых продуктов) холодом. Однако нужно учесть, что некоторые возбудители инфекционных заболеваний
(листерии, иерсении, легионеллы и др.) будучи психрофилами при низкой температуре получают селективное
преимущество над другими бактериями. В этих условиях они начинают усиленно размножаться и достигают
критической массы, достаточной для возникновения заболевания при попадании в организм человека.

Губительное действие высокой температуры (выше температурного максимума для каждой группы)
используется при стерилизации. Стерилизация - обеспложивание - это процесс умерщвления на изделиях или в
изделиях или удаление из объекта микроорганизмов всех видов, находящихся на всех стадиях развития, включая
споры (термические и химические методы и средства). Для гибели вегетативных форм бактерий достаточно
действия температуры 600С в течение 20-30 мин; споры погибают при 1700С или при температуре 1200С пара под
давлением (в автоклаве).
Асептика - условия и комплекс мероприятий, направленных против возможности попадания
микроорганизмов в рану, ткани, органы, полости тела больного при хирургических операциях, перевязках,
инструментальных исследованиях, а также на предотвращение микробного и другого загрязнения при получении
стерильной продукции на всех этапах технологического процесса. Составной частью противоэпидемических и
противоинфекционных мероприятий является также дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на
уничтожение конкретных патогенных микробов

Рост и размножение микробов происходит при наличии воды, необходимой для пассивного и активного
транспорта питательных веществ в цитоплазму клетки. Снижение влажности (высушивание) приводит к переходу
клетки в стадию покоя, а затем к гибели. Наименее устойчивыми к высушиванию являются патогенные
микроорганизмы - менингококки, гонококки, трепонемы, бактерии коклюша, ортомиксо-, парамиксо- и герпес-
вирусы. Микобактерии туберкулеза, вирус натуральной оспы, сальмонеллы, актиномицеты, грибы устойчивы к
высушиванию. Особой устойчивостью к высушиванию обладают споры бактерий. Устойчивость к высушиванию
повышается, если микробы предварительно замораживают. Для сохранения жизнеспособности и стабильности
свойств микроорганизмов в производственных целях используется метод лиофильной сушки - высушивание из
замороженного состояния под глубоким вакуумом.
В процессе лиофилизации производят: 1) предварительное замораживание материала при t -40-450С в
спиртовых ваннах в течение 30-40 мин; 2) осуществляют сушку из замороженного состояния в вакууме в
сублимационных аппаратах в течение 24-28 часов.
Процесс высушивания имеет 2 фазы: сублимация льда при t ниже 00С и десорбцию - удаление части
свободной и связанной воды при t выше 00С.
Лиофилизацию используют для получения сухих препаратов, когда не происходит денатурации белков и не
изменяется структура материала (антисыворотки, вакцины, сухая бактериальная масса). В лабораторных условиях
лиофилизированные культуры микробов сохраняются в течение 10-20 лет, причем культура остается чистой и не
подвергается мутациям.
Действие лучистой энергии на микроорганизмы. Солнечный свет, особенно его ультрафиолетовый и
инфракрасный спектры, губительно действуют на вегетативные формы микробов в течение нескольких минут.
Инфракрасное излучение используется для стерилизации объектов, которая достигается за счет теплового
воздействия температурой 3000С в течение 30 мин. Инфракрасные лучи оказывают воздействие на
свободнорадикальные процессы, в результате чего нарушаются химические связи в молекулах микробной клетки.
Для дезинфекции воздуха помещений лечебно-профилактических учреждений и аптек широко
используются ртутно-кварцевые и ртутно-увиолевые лампы, являющиеся источником ультрафиолетовых лучей.
33
При действии УФЛ с длиной волны 254 нм в дозе 1,5-5 мк Вт т/с на 1 см2 при 30-ти минутной экспозиции
погибают все вегетативные формы бактерий. Повреждающее действие УФ излучения вызвано повреждением
ДНК микробных клеток, приводящим к мутациям и гибели.
Ионизирующая радиация обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном микробов
действием. Для стерилизации инструментов одноразового использования (игл, шприцев) используют гамма-
излучение, источником которого являются радиоактивные изотопы 60Со и 137Сs в дозе1,5-2 MN.рад. Этим
методом стерилизуют также системы переливания крови и шовный материал. Действие ультразвука в
определенных частотах на микроорганизмы вызывает деполимеризацию органелл клетки, денатурацию входящих
в их состав молекул в результате локального нагревания или повышения давления. Стерилизация объектов
ультразвуком осуществляется на промышленных предприятиях, так как источником УЗ являются мощные
генераторы. Стерилизации подвергаются жидкие среды, в которых убиваются не только вегетативные формы, но
и споры.
Стерилизацию в ионизированной плазме, так же как и газовую стерилизацию, следует считать
комбинированным физико-химическим воздействием.
Пастеризация - стерилизация при 65-700С в течение 1 часа для уничтожения бесспоровых
микроорганизмов (молоко освобождается от бруцелл, микобактерий туберкулеза, шигелл, сальмонелл,
стафилококков). Хранят на холоде.
Тиндализация - дробная стерилизация материалов при 56-580С в течение 1 часа 5-6 дней подряд.
Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови,
витамины и др.).
Стерилизация фильтрованием - освобождение от микробов материала, который не может быть
подвергнут нагреванию (сыворотка крови, ряд лекарств). Используются фильтры с очень мелкими порами, не
пропускающими микробы: из фарфора (фильтр Шамберлана), каолина, асбестовых пластинок (фильтр Зейтца).
Фильтрование происходит под повышенным давлением, жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник
или создается разрежение воздуха в приемнике и жидкость всасывается в него через фильтр. К фильтрующему
прибору присоединяется нагнетающий или разрежающий насос. Прибор стерилизуют в автоклаве.
Стерилизацию сухим жаром осуществляют в сухожаровых шкафах (печь Пастера). Сухим жаром
стерилизуют лабораторную посуду. Режим стерилизации: 1600С - 60 мин, 1800С - 15 мин, 2000С - 5 мин.
Жидкости, питательные среды, предметы из резины и синтетических материалов нельзя стерилизовать сухим
жаром.
Стерилизации паром.
Существует 2 режима стерилизации:
1. Текучим паром в автоклаве или аппарате Коха при не завинченной крышке и открытым выпускном кране,
когда антибактериальное действие пара проявляется в отношении вегетативных форм. Так стерилизуют среды с
витаминами и углеводами, мочевиной, молоком, картофелем и желатиной. Для полного обеспложивания
применяют дробную стерилизацию (при 1000С) 20-30 мин 3 дня.
2. Стерилизация паром под давлением в автоклаве - наиболее эффективный метод обеспложивания. При
однократной обработке при 1-2 атм в течение 15-25 мин. погибают как вегетативные, так и споровые формы
бактерий. Этим методом стерилизуют перевязочный материал, операционное белье, хирургические
инструменты, лабораторную посуду, инфицированный материал, инъекционные растворы. Материал помещают в
емкости (биксы). На дно бикса помещают прокладки из ткани, впитывающие влагу после стерилизации.
Стерильность материала сохраняется 3 суток.
Паром под давлением стерилизуют также и питательные среды, кроме сред, содержащих нативные белки,
жидкости, приборы, имеющие резиновые части. Простые среды (МПА, МПБ) стерилизуют 20 мин при 1200С (1
атм). Среды, содержащие нативные белки и углеводы, при этой температуре нельзя стерилизовать, т. к. это легко
изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 1000С или при 1120С (0,5
атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и
фильтры стерилизуют при 1200С (1 атм) в течение 20 мин.
При дезинфекции химическим методом применяют следующие дезинфицирующие вещества:
хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин Б), окислители (перекись водорода, перманганат
калия), фенолы, йод и йодофоры, соли тяжелых металлов, четвертичные аммониевые соединения, спирты,
альдегиды, красители, кислоты.
Контроль стерилизации.
Для контроля используют различные тесты, представляющие чаще всего порошкообразные вещества, меняющие
консистенцию или цвет при достижении определенной температуры стерилизуемого материала (бензойная
кислота 1210С, антипирин - 1130С, резорцин - 1100С). В настоящее время используются бумажные индикаторы
34
стерилизации одноразового применения для контроля параметров режимов работы паровых и воздушных
стерилизаторов. Бумажные полоски закладываются в разных местах со стерилизуемым материалом и после
окончания цикла сверяют изменение окраски индикатора с эталоном. Если индикатор светлее эталона –
стерилизуемые объекты подлежат повторной стерилизации.
Для экспресс-контроля концентраций рабочих растворов для дезинфекции также используются индикаторные
полоски (Дезаконт-ПВ-01).
Цели занятия:

1. Изучить сущность дыхания бактерий, классифицировать микробы по типу дыхания.


2. Освоить методику посевов и выделения чистых культур аэробов и анаэробов.
3. Изучить характер влияния на микроорганизмы физических и химических факторов.
4. Освоить методы стерилизации и принцип работы автоклава и сухожарового шкафа.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Сущность дыхания бактерий. Классификация микробов по типу дыхания.
2. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления.
3. Принципы культивирования анаэробных бактерий.
4. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация.
5. Действие на микроорганизмы физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция.
Асептика и антисептика.

Уметь:
1. Готовить посуду к стерилизации в сухожаровом шкафу и автоклаве.
2. Описать культуральные свойства бактерий.
3. Освоить методику создания анаэробных условий.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Просматривая извлеченные из термостата чашки с пластинчатым агаром, засеянные в первый день
исследования, обращают внимание на наличие колоний разных типов по форме, цвету, величине, консистенции.
Каждому виду микроба свойственен определенный характер колоний. Это помогает выбрать колонию искомого
микроба и поставить диагноз заболевания. Снимают изолированную колонию петлей и пересевают на косой агар,
а из остатка пересеянной колонии готовят микропрепарат и исследуют его, окрасив по Граму. После инкубации
посева в термостате, на косом агаре вырастает чистая культура микроба.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Бригада студентов учитывают пересевы бактериальных культур
2. Каждый студент изучает и подробно описывает различные типы колоний,
выросшие на чашках. Отсевает одну из колоний на косой агар а из остатка
бактерий на. петле делает мазок, окрашивает по Граму и микроскопирует.
Результаты записывают в протокол.

ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Колонии на пластинчатом агаре в чашках Петри. Отсев одной колонии на косой агар.
2. Рассмотрение различных методов культивирования анаэробов: анаэростат, посев во Фортнеру, посев на
среду Китт-Тароцци, столбик среды Вильсона-Блера, кровяной агар Виньяль-Вейона, использование
щелочного раствора пирогалола.
3. Демонстрация аппаратуры для стерилизации: автоклавы, сухожаровые печи, электрический стерилизатор,
фарфоровые свечи и фильтры Зейтца. Термостат и терморегуляторы, свертыватель Коха. Тесты контроля
стерилизации.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Что называется стерилизацией?
2. Что такое дезинфекция?
3. Что такое асептика и антисептика?
4. Что такое пастеризация?
35
5. Какие условия стерилизации в автоклаве?
6. Какие условия стерилизации в сухожаровых печах Пастера?
7. Какие тесты контроля стерилизации вы знаете?
8. Что такое дробная стерилизация и в каких случаях к ней прибегают?
9. Почему в отдельных случаях при пересеве одной колонии получаем рост смеси бактерий?
10. Какие свойства необходимо учитывать при изучении колоний?
11. Как характеризуется рост бактерий на жидких и полужидких питательных средах?
12. В чем сущность аэробного типа окисления?
13. В чем сущность анаэробного типа окисления?
14. Какие среды применяют для культивирования анаэробов?
15. Какие существуют методы культивирования анаэробов?
16. Какой способ чаще всего применяется для стерилизации стеклянной лабораторной посуды?
17. Как стерилизуются дифференциално-диагностические среды, содержащие углеводы?
18. Как стерилизуют сывороточные питательные среды?
19. Как стерилизуют простые питательные среды?
20. Какие существуют методы выращивания облигатных анаэробов?
21. Какие бактерии называют микроаэрофилами?
22. Какие бактерии называют психрофилами, мезофилами, термофилами?

ЗАНЯТИЕ №7
Темы:
 Методы выделения и идентификация чистых культур аэробных бактерий
(продолжение): биохимическая активность бактерий.
 Антибиотики.

План занятия:
1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам.
2. Антагонизм микроорганизмов.
3. Классификации антибиотиков.
4. Механизмы антимикробного действия важнейших групп антибиотиков.
5. Методы определения антибиотиков в жидкостях организма.
6. Количественное и качественное определение чувствительности бактерий к антибиотикам.
7. Механизмы развития антибиотикорезистенности бактерий и пути ее преодоления.
8. Осложнения при лечении антибиотиками.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
А. Идентификация выделенной на скошенном агаре культуры бактерий проводится после установления
чистоты (однородности) культуры по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам.
Определяют ферментативные (биохимические) свойства микробов, фаго- и батерициночувствительность,
токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую принадлежность. В некоторых случаях у
выделенных бактерий определяют также эпидемиологические маркеры (серовар, фаготип, хемовар,
колициновар), с помощью которых можно установить очаги инфекции и пути ее распространения.
Б. В естественных условиях микроорганизмы существуют в сложных ассоциациях, внутри которых
складываются разнообразные взаимоотношения, определяющиеся, в первую очередь, физиолого-
биохимическими особенностями членов ассоциаций, а также различного рода экологическими факторами.
Взаимоотношения между микроорганизмами могут быть симбиотические (симбиоз, метабиоз, сателлитизм,
синергизм) и конкурентные (антагонизм, паразитизм, хищничество).
Симбиоз - взаимоотношения микроорганизмов, при которых два или более вида микроорганизмов при
совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичный пример таких взаимоотношений –
совместное развитие аэробных и анаэробных бактерий. В кефирных зернах одновременно развиваются
молочнокислые бактерии и дрожжи, при этом молочнокислые бактерии, испытывающие потребность в
витаминах, получают их в результате развития дрожжей, последние получают благоприятные условия для
развития за счет подкисления среды. При метабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма,
содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве
питательного материала. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется
36
одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания
человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена,
например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clоstridium в ассоциации с различными
аэробными бактериями, главным образом, стафилококками и стрептококками.
Разновидностью метабиоза является сателлитизм, для которого характерно, что одни микроорганизмы
выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого
микроорганизма или макроорганизма-хозяина, как, например, нормальная микрофлора у человека. При
синергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения
продуктов, стимулирующих их развитие.
Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один
вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е между ними при их
развитии наблюдается антагонизм. Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны:
1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов,
нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того
микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на
питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут
развиваться быстрее.
2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических
кислот, спиртов, или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для
развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как
молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения
молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях
наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий.
3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду
антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.).
Процесс хищничества состоит в том, что некоторые микроорганизмы разрушают клетки других видов
микроорганизмов и используют их в качестве питательного субстрата. К числу микроорганизмов-хищников
относят, главным образом, миксоформы (миксобактерии, миксомицеты).
Паразитизм характеризуется тем, что один вид микроорганизмов (паразит) поселяется в клетках другого
(хозяина) и питается за его счет. Облигатные паразиты не могут развиваться в отсутствие хозяина. К типичным
паразитам относятся бактериофаги.
Наиболее существенной формой конкурентных взаимоотношений, имеющей важное практическое
использование, является образование микробами-продуцентами специфических продуктов обмена, угнетающих
или полностью подавляющих развитие микроорганизмов других видов.
Практическое значение антагонизма для медицины: 1) применение бактериальных препаратов, содержащих
живые антагонистические действующие микроорганизмы, для угнетьения па огенных и условно-патогенных
микробов и лечения нарушений нормального микробиоценоза кишечника (дисбактериоза) – колибактерин.
Бифидумбактерин, лактобактерин и др.; 2) использование микробов антагонистов для производства
антибиотиков.
Антибиотики – вещества, образуемые различными живыми клеточными структурами, способные подавлять
рост и вызывать гибель определенных микроорганизмов. По происхождения антибиотики подразделяют на
следующие группы:
 Антибиотики, образуемые бактериями (грамицидин, полимиксин и др.);
 Актиномицетами (линкомицин и др.);
 Грибами (пенициллин, цефалоспорины и др.);
 Растениями (фитонциды: аллицин, рафанин и др.);
 Животными клетками (экмолин, эритрин);
 Синтетические и полусинтетические.

По химическому составу антибиотики относятся к следующим основным группам:


 Азотсодержащие гетероциклические соединения, имеющие в своем составе бэта-лактамовое кольцо
(пенициллины);
 Ароматические соединения (левомецитин);
 Тетрациклины, содержащие четыре конденсированных шестичленных цикла (тетрациклины и др.);
 Аминогликозидные соединения, в составе которых имеются аминосахара (стрептомицин и др.);
37

 Макролиды: содержат макроциклическое кольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин и др.);


 Ациклические (полиеновые) соединения с несколькими двойными связями - /СН=СН/ (нистатин и др.);
 (Фтор)хинолоны.

По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия.
Антибиотики узкого спектра действуют на определенные группы бактерий (например, пенициллин,
оказывающий губительное действие только на шаровидные бактерии, спирохеты и некоторые
грамположительные бактерии). Антибиотиками широкого спектра действия являются аминогликозиды,
подавляющие рост кислотоустойчивых, многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших,
риккетсий, хламидий.
Антибактериальное действие антибиотиков измеряют в единицах действия (Е.Д.), содержащихся в 1 мл
раствора препарата или в 1 мг химически чистого вещества. За единицу активности принимается то минимальное
количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма определенного вида микроорганизма в
строго определенных условиях.
Механизм антибактериального действия антибиотиков различен. У одних он связан с нарушением или
блокированием синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины). У других - с адсорбцией на ЦПМ и
взаимодействием с ее стерольным компонентом, что приводит к быстрой потере клеткой низкомолекулярных
водорастворимых веществ цитоплазмы или нарушением жизненно важных функций ЦПМ (нистатин.
полимиксины). У третьих - в блокировании синтеза белка рибосомами бактерий и нарушении считывания
генетического кода, что нарушает репликацию бактерий (стрептомицин). Антибиотики, обладающие
противоопухолевым действием, избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках злокачественных
опухолей, для которых характерен дефект репарационных механизмов, в связи с чем они не в состоянии
восстанавливать поврежденную ДНК.
Цель занятия
1. Изучить сущность и механизм действия различных ферментных систем у бактерий;
освоить методику их изучения и применения для идентификации чистых культур.
2. Изучить особенности взаимоотношений между микроорганизмами как основу учения о антибиотизме и
антибиотиках.
3. Освоить методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Классификация ферментов бактерий, механизмы их действия, методы изучения.
2. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация по биохимическим свойствам
3. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Принципы атимикробной химиотерапии.
4. Симбиотические и конкурентные взаимоотношения между микроорганизмами.
5. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы – продуценты антибиотиков.
6. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру
антимикробного действия, способам получения.
7. Методы определения антибиотикочувствительности бактерий.
8. Побочное действие антибиотиков на организм человека.

Уметь:
1. Интерпретировать результаты изучения ферментативной активности бактерий и их
антибиотикограммы.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Устойчивость ферментных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в
сочетании с их морфологическими, культуральными и другими признаками для идентификации бактерий и
установления микробиологического диагноза. Для обнаружения исследуемую культуру микробов засевают на
специальные дифференциально-диагностические среды, которые в зависимости от состава и своего назначения
можно разделить на 4 группы:
 среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и
т.д.) для выявления протеолитических ферментов;
38
 среды с сахарами или многоатомными спиртами для определения сахоролитической
активности;
 среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных
ферментов, продуцируемых микробами;
 среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних
видов и не ассимилируемые другими видами микробов.
В состав дифференциально-диагностической среды обычно входит индикатор, указывающий на наличие или
отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента
Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием
кислоты или кислоты и газа изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. При
ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты и альдегидов, цвет среды меняется за счет
находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты - «пестрый ряд». В зависимости от изучаемого
рода и вида бактерий, подбирают среды с соответствующими моно- и ди-сахаридами (глюкоза, лактоза и др.),
полисахаридами (крахмал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации
которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные продукты /СО². Н². СН²/, последние накапливаются в
«поплавке».
Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы,
сбраживая до кислоты находящийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кислота
изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.
Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается. При росте микроорганизмов,
образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают,
прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя (цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал
дает с этим раствором синее окрашивание.
Среда Вильсона-Блера. Готовят из мясо-петонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na²SO³, хлористое
железо FeCl². На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. При этом в
анаэробных условиях осуществляется восстановление сернисто-кислого натрия до сернистого, последний же
вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет.
Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой и пептоном.
При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и
др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причем различные виды микробов дают
характерную для него форму разжижения (послойно в виде гвоздя, елочки и т.д.). При посеве на свернутую сыво-
ротку вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина
с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватыи цвет.
Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для
обнаружения индола по способу Мореля, узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим
насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой
пробирки с МПА и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает
розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод позволяет концентрировать индол на поверхности среды
ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) дает образование
красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.
Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата
свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и
ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.
Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и
пробкой засеянной пробирки.
Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды -
желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в
щелочную сторону и изменяет цвет индикатора в красный.
Определение образования ацетона проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре
40% КОН и 5% альфа-нафтола дает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-
нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.
Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода
проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия,
индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и
окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой.
39
Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий.
Бумажки пропитаны индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. ве-
ществами. Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изменению цвета индикатора. Имеются
наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Посев испытуемой культуры производится в
стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6).
Наличие каталазы у аэробов и факультативных анаэробов выявляется внесением петли культуры бактерий в
каплю 3% перекиси водорода. При этом выделяются пузырьки 0². У облигатных анаэробов каталаза отсутствует и
перекись водорода оказывает на них губительное действие.
Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на
индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола.
Бумажка синеет.
Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент
восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты
окисляют иодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, дает синее окрашивание среды. Тип окисления
глюкозы в аэробных или анаэробных условиях устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится
агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Дяя создания анаэробных условий среда
заливается слоем вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет
зеленый цвет среды в желтый. Утилизация глюкозы в аэробных и анаэробных условиях свидетельствует о
преобладании бродильных процессов. Аэробы (Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в
аэробных условиях, анаэробы - только в анаэробных. Факультативные анаэробы (Escherichia coli) утилизирует
глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.
Гемолитические свойства микроорганизмов изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при
разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная
зона.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация
антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта.
При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала
лечения нтибиотиками. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением
стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных средах.
Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии
антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы
диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам.
В 2004 году Госсанэпиднадзором России утверждена новая инструкция определения чувствительности к
антибиотикам, учитывающая общепринятые международные стандарты в этой области. Согласно этим
рекомендациям для исследования берут 3-5 колоний выделенной чистой культуры, из которых затем готовится
клеточная взвесь на физиологическом растворе или бульоне (Мюллер-Хинтона). С помощью оптического
стандарта мутности на 0,5 ед. (по Mс Farland, что соответствует 1,5 х 108 КОЕ/мл) клеточная взвесь
стандартизируется. Затем стерильным ватным тампоном, смоченным в приготовленной взвеси, исследуемые
бактерии засевают в чашке Петри со специальной средой (чаще всего агар Мюллер-Хинтона). Заштриховав всю
поверхность агара вначале один раз, еѐ заштриховывают еще дважды, предварительно вращая чашку каждый
раз на 60º. Стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от
краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков.
Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий.
Если бактерии чувствительны к данному соединению, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр
зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному
антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам.
Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо
диффундируемым в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти
антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом
серийных разведений. Жидкую среду (пригодную для роста данного микроба) разливают по 2 мл в 10 пробирок.
Готовят раствор антибиотика. содержащий 100 ед. в 1 мл и добавляют 2 мл раствора в 1-ую пробирку. После
тщательного перемешивания 2 мл переносят в следующую пробирку и т.д. Из 9-ой пробирки 2 мл удаляют.
Десятая пробирка не содержит антибиотика и служит контролем. Суточную культуру микроба разводят с
использованием стандарта мутности до густоты 10000 микробов в 1 мл. После чего в каждую пробирку вносят по
40
0.2 мл взвеси. После 20 ч инкубации в термостате учитывают результат. Среда в пробирках, в которых
антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается
прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не
происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей
концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как
бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения
бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (это значит,
концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из
пробирок, содержимое которых не помутнело, на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие
роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком.
Метод Е-тестов (от англ. еllipse – эллипс, т.к. при наличии чувствительности образуется зона задержки роста
эллиптической формы) – сочетает в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков. Вместо
дисков используются полоски фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика.
Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии
чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие
концентрации, возникает эллипсовидная зона.
Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде удобен тем, что позволяет в одном опыте
проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика
готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора
антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно
чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с
помощью бактериологической петли на отдельный сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика.
Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий и
инкубируют в течение 40 – 72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в
сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой
его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Демонстрация ферментативной активности бактерий с использованием СИБ для межродовой
дифференциации бактерий.
2. Ферментативная активность представителей семейства кишечных бактерий на средах Гисса (E.coli).
3. Обнаружение выделения сероводорода и индола.
4. Действие летучих и нелетучих фракций фитонцидов чеснока у бактерии.
5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методами: а) диффузии в агаре с помощью
бумажных дисков и градуированных полосок (Е- тест); б) серийных разведении.
6. Определение концентрации антибиотика в сыворотке крови
7. Флаконы и ампулы с различными антибиотиками и дисками для определения
антибиотикочувствительности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Каждый студент учитывает рост культуры на косом агаре, приготавливает мазок,
окрашивает по Граму.
2. Бригада студентов производит пересев культуры с косого агара на «Пестрый ряд»
(изучение биохимических свойств).
3. Бригада студентов определяет чувствительность выделенной культуры к
антибиотикам методом бумажных дисков.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Какую роль выполняют ферменты у бактерий?
2. Какова классификация ферментов у бактерий?
3. Каков принцип идентификации бактерий по биохимическим свойствам?
4. Как изучаются сахаролитические свойства бактерий, и какие питательные среды для этого применяются?
5. Как и на каких питательных средах изучаются протеолитические свойства бактерий?
6. Что такое «пестрый ряд»?
7. Что собой представляет СИБ и ее назначение?
41

8. Какие газообразные продукты образуются при расщеплении бактериями белков и как их определяют?
9. Назовите ферменты биологического окисления и как их выявляют?
10. Назовите формы симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами.
11. Каковы формы конкурентных взаимоотношений между микроорганизмами?
Что такое микробный антагонизм и каковы практические аспекты его применения?
12. Что такое химиотерапия, каковы ее принципы?
13. Какие существуют химиотерапевтические препараты?
14. Что такое химиотерапевтический индекс?
15. Что такое антибиотики?
16. Какова классификация антибиотиков по способам получения, по химическому строению, происхождению,
механизму и спектру антимикробного действия?
17. Каков механизм действия противоопухолевых антибиотиков?
18. Какие Вы знаете осложнения антибиотикотерапии?
19. Как предупредить развитие дисбактериоза при антибиотикотерапии?
20. Как предупредить или снизить выраженность побочного действия антибиотиков на организм больного?
21. Каковы механизмы формирования антибиотикорезистентных культур?
22. Что способствует формированию антибиотикорезистентности у бактерий?
23. Какие мероприятия могут способствовать предупреждению формирования антибиотикорезистенности у
бактерий?
24. Какие существуют методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам?
25. В чем заключается проблема получения и применения противовирусных химиопрепаратов?
26. Что такое аномальные нуклеозиды и каков механизм их действия при лечении вирусных инфекций?
27. Каков механизм действия азидотимидина и других веществ, ему подобных, применяемых для лечения
СПИДа?

ЗАНЯТИЕ № 8

Темы:
 Методы выделения и идентификации чистых культур аэробных бактерий, определение
чувствительности к антибиотикам (окончание).
 Медицинская экология микроорганизмов. Санитарно-бактериологическая оценка объектов
окружающей среды, пищевых продуктов.

План занятий.
1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам, учет чувствительности к
антибиотикам.
2. Природные микробиоценозы. Экологические среды микробов.
3. Санитарно-показательные бактерии, их характеристика.
4. Определение микробного числа воздуха по методу Коха и с помощью аппарата Кротова.
5. Методы санитарно-бактериологической оценки воды: определение коли-титра, коли-индекса бродильным
методом и с помощью мембранных фильтров. Определение микробного числа и коли-фагов.
6. Определение микробной обсемененности кожи рук и предметов обихода методом смывов.
7. Определение микробного числа и коли титра пастеризованного молока (для педиатров).

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ.
Микроорганизмы распространены повсюду. Большинство их в естественных условиях находятся в
определенных взаимоотношениях друг с другом. В окружающую среду патогенные бактерии попадают от
больных, бактерионосителей и находятся здесь в течение определенного времени. В связи с этим санитарно-
бактериологические исследования направлены на изучение и оценку различных объектов с целью определения их
эпидемической безопасности. Методы проведения санитарно-микробиологических исследований
предусматривают определение общей микробной обсемененности (ОМЧ), определение и титрование санитарно-
показательных микроорганизмов, выявление в исследуемых объектах патогенных микробов и их метаболитов.
42
Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их
малого количества, в связи с чем используются косвенные методы выявления микробной обсемененности
постоянно сопутствующими патогенным бактериям санитарно-показательными микробами. ОМЧ расценивается
как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.
Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном
присутствии патогенов в окружающей среде. Облигатные микробы кишечника и дыхательных путей являются
санитарно-показательными; обнаружение на объектах окружающей среды E.coli, Е. faecalis свидетельствует об их
фекальном загрязнении. Одновременное выделение St.aureus, Str hemolyticus из воздуха свидетельствует о его
орально-капельном загрязнении. Содержание санитарно-показательных бактерий оценивается по титру и
индексу.

Цель занятия:
1. Изучить методы и показатели, необходимые для санитарно-бактериологической оценки объектов
окружающей среды.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Природные микробиоценозы. Экологические связи в микробиоценозах.
2. Экологические среды микробов: микрофлора почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов, бытовых и
производственных объектов и ее роль в распространении инфекционных болезней.
3. Принципы санитарно-микробиологических исследований. Индикация патогенных микробов в объектах
окружающей среды, косвенные методы: определение ОМЧ и санитарно-показательных
микроорганизмов: бактерий группы кишечной палочки, клостридий, стрептококков и стафилококков.
Уметь:
1. Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы, пищевых
продуктов и смывов по микробиологическим тестам.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды
Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества
термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы, с преобладанием санитарно-
показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненными фекалиями человека
или животных. Присутствие в почве E. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее, бактерий родов
Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, а Clostridium perfringens - на давнее фекальное загрязнение. Более точная
оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки
(БГКП или, так называемые, колиформные бактерии), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра - масса
почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общей численности сапрофитных,
термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.
Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по:
1) микробному числу - количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2) коли-титру -
наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживается БГКП и 3) коли-индексу - количеству БГКП в 1 л
воды. 4) Кроме того, в воде определяют наличие спор сульфитредуцирующих бактерий и цист лямблий.
Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по микробному
числу - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий -
представителей микрофлоры дыхательных путей - гемолитические стрептококки, золотистый стафилококк.
Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение микробного числа
и санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП), а также патогенных возбудителей.
Микрофлора воздуха. Нормативы: чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков -
до 35; грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков - более 70.

Нормативные показатели микробной обсемененности воздуха в помещениях больницы


Операционные ОМЧ Золотистый стафилококк
(в 250 л)
до начала работы не более 500 не допускается
во время работы не более 1000 не допускается
родильные комнаты не более 1000 не допускается
43
палаты для недоношенных не более 750 не допускается
детей

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводится седиментационным и аспирационным


методами. Седиментационный метод по Коху заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют
открытыми на 5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на обсемененность кокковой
микрофлорой. Засеянные чашки инкубируют 24 часа в термостате и столько же при комнатной температуре.
Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха. На площадь 100 кв. см. в течение
5 минут оседает столько бактерий, сколько их содержится в 10 л. воздуха.
Аспирационный метод более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев
воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова. Он устроен таким образом, что воздух с заданной
скоростью просасывается через узкую щель пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При
этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей
поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

Микрофлора воды
Микробиологические и паразитологические показатели для питьевой воды.
Показатели Единицы измерения Нормативы
Термотолерантные Число бактерий в 100 мл Отсутствие
колиформные бактерии
(44º С)
Общие колиформные Число бактерий в 100 мл Отсутствие
бактерии (37ºС)
Общее микробное число Число образующих колоний Не более 50
бактерий в 1 мл
Коли – фаги Число бляшкообразующих Отсутствие
единиц (БОЕ)
Споры В 100 мл число спор в 20 мл Отсутствие
сульфитредуцирующих
клостридий
Цисты лямблий Число цист в 50 мл Отсутствие

Метод мембранных фильтров


Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая
присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объеме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на
поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 370С в течение суток подсчитывают количество
выросших колоний, типичных для БГКП.
Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест,
позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных
бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого
фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок
фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает
колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с
0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 370С. При наличии газообразования
подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Метод бродильной пробы


1-й день. Воду в объме 100 мл берут 3 пробы, 10 мл (3 пробы) засевают соответственно на 10 мл и 1 мл
концентрированной среды ГПС (глюкозопептонная среда) или ЛПС (лактозопептонная среда). 1 мл воды (3
пробы) засевают на 10 мл разведенной среды ГПС с «поплавками». Посевы инкубируют при 37°С 24 часа.
2-й день. Из всех объемов воды. независимо от результатов (кислота- газ) делают пересев на две чашки со средой
Эндо (одна - с добавлением раствора основного фуксина или раствора разоловой кислоты, другая - с добавлением
молока или желатина - для обнаружения протеолиза). Посевы инкубируют при 37°С 18 часов.
44

3-й день. С чашек из каждого засеянного объема отбирают 2-3 лактозоположительные, протеолизоотрицательные.
оксидазоотрицательные, грам-отрицательные палочки и отвивают на полужидкий агар с глюкозой и индикатором
Андреде или бромтимоловым синим (укол в столбик). Посевы инкубируют 20 часов при 37°С.
4-й день. Производят учет результатов. Определяют, какой объем воды на полужидком агаре с глюкозой дает
образование кислоты и газа, и делают расчет коли-титра и индекса по таблице ГОСТа 48963-73.
Микробное число определяют при посеве 1мл исследуемой, воды. Оксидазный тест позволяет отбросить
оксидазоположительные колонии (псевдомонады, аэромонады, вибрионы и др.). Микроскопия мазков из колоний
позволяет исключить грамположитель-ную споровую флору и шаровидные бактерии. Окисление глюкозы, лак-
тозы до кислоты и газа при 37°С подтверждает принадлежность бактерий к кишечной группе.
Микрофлора пищевых продуктов
Нормативы: молоко и напитки - ОМЧ не более 75000 в 1 мл, коли-титр - не менее 3;
мясо, колбасные изделия и мясные продукты - БГКП не должны содержаться в 1 г, сальмонеллы не должны
содержаться в 25 г, протей - в 0,1 г, коагулазоположительные стафилококки - в 0,1 г, сульфитредуцирующие
клостридии - в 0,1 г, ботулотоксин и клостридиум ботулинус в консервах не должен присутствовать.
Ход исследования.
Для определения ОМЧ пастеризованное молоко разводят стерильным изотоническим раствором NaCl 1:10,
1:100, 1:1000 и по 1 мл разливают на дно стерильных чашек, заливают расплавленным, остуженным агаром.
Инкубируют в термостате при 370С в течение 24 часов. Подсчитывают количество выросших колоний.
Для определения коли-титра цельное пастеризованное молоко забирают в 6 пробирок со средой Кесслера: в
3 пробирки вносят по 1 мл, в остальные по 0,1 мл (разводят в 10 раз стерильной водой). Инкубируют при 43 0С 24
часа. Из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и идентифицируют БГКП. При обнаружении Гр-
палочек ставят пробу на оксидазу и производят посев на среду с глюкозой и среду Козера. При наличии кислоты
и газа на среде с глюкозой и отсутствие роста на среде Козера (1 л дистиллированной воды, 10 г фосфата
однозамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 2,5-3,0 г цитрата натрия, 10 мл 0,5% спиртового раствора
бромтимолового синего). Согласно ГОСТу 9225-68 учитывают только цитратонегативные разновидности
кишечной палочки. Коли-титр вычисляют по таблице (Л. Б. Борисов и др. 1993. С. 69).
При исследовании напитков определяют ОМЧ и коли-титр по методикам исследования питьевой воды.
Лимонад нейтрализуют 10% раствором гидрокарбоната натрия (проверка рН лакмусовым индикатором). Коли-
титр определяют методом мембранных фильтров.
При микроскопии мяса - определяют количество бактерий в мазках-отпечатках из кусочков 2х1,5х2,5 см.
Окраска по Граму. Мясо свежее - если в поле зрения не более 10 бактериальных клеток.
Для определения ОМЧ, БГКП, сальмонелл, бактерий рода Протеус, коагулазоположительных
стафилококков и клостридий из глубинных участков стерильно берут навески мяса 20 г и добавляют 80 мл
стерильного физ. р-ра, гомогенизируют в электрическом смесителе. 0,1 и 0,01 г продукта засевают на МПА,
инкубируют 48 часов и подсчитывают число колоний.
Определение БГКП в 1 г продукта. 5 мл взвеси засевают на среду Кода (питательный бульон, сульфанол, лактоза,
бромтимоловый синий), инкубируют 18 часов. Лак+ БГКП меняют синий цвет среды на темно-зеленый или ярко-
желтый.
Определение сальмонелл проводят посевом на среды Мюллера, Кауфмана или селенитовый бульон с
последующим выделением чистой культуры.
Протей выделяют по методу Шукевича, клостридии - на среде Вильсон-Блера, коагулазоположительные
стафилококки на желточно-солевом агаре.
Для выявления ботулинического токсина пробы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию
нейтрализации токсина антитоксической противоботулинической сывороткой типов А,В,С,Е и F на белых
мышах.
Микрофлора рук и предметов окружающей среды
Осуществляется взятием смывов с рук обследуемых лиц, с посуды, поверхности столов, досок и т. д. При
взятии смыва с рук пользуются стерильными ватными тампонами, которые перед употреблением смачивают в
среде Кесслера. Смывы делают с обеих рук, тщательно протирая ладони, межпальцевые промежутки и
подногтевые пространства сначала левой руки, а затем правой. Смывы с поверхности предметов делают с
помощью трафаретов из проволоки, имеющих площадь 25 см2. Тампоны помещают в пробирки со средой
Кесслера и посевы выдерживают в термостате при температуре 430С в течение суток. При наличии брожения в
45
среде Кесслера делают высев на среду Эндо. Колонии, подозрительные на кишечную палочку, подвергают
дальнейшей идентификации.

ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Определение микробного числа воздуха по методу Коха и с помощью аппарата Кротова. Определение
микробного числа водопроводной воды.
2. Определение числа общих колиформных бактерий методом мембранных фильтров.
3. Определение фекального загрязнения предметов обихода и рук персонала.
4. Снитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов (для студентов
педагогического факультета).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Бригады студентов учитывает результаты изучения биохимических свойств чувствительности к
антибиотикам ранее выделенной культуры.
2. Бригады студентов учитывает посевы воздуха по методу Коха: определяет микробное число воздуха,
изучает культуральные, морфологические и тинкториальные свойства выросших колоний.
3. Каждый студент производит посев отпечатков пальцев на чашку с МПА.
4. Один студент в бригаде производит посев смыва с рук на среду Кода.
5. Две бригады студентов производят посев слизи из зева сахарный бульон, ЖСА и кровяной агар.
6. Две бригады студентов засевают слизь из носа на солевой бульон, ЖСА и кровяной агар.
7. Каждый студент производит оценку санитарно-бактериологических показателей молока и молочных
продуктов по результатам проведенных исследований (только для студентов педиатрического
факультета).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Что такое популяция, биотоп и микробиоценоз?
2. Что такое экосистема?
3. Что такое микробиоценоз?
4. Какие существуют экологические среды микробов, и какие из них являются антропогенными?
5. Какова роль экологических сред в распространении инфекционных заболеваний?
6. По каким критериям производится оценка санитарно-бактериологического состояния экологических
сред: почвы, воды, воздуха и др.?
7. Какие микроорганизмы относятся к санитарно-показательным для воды, воздуха, почвы?
8. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние почвы?
9. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние воздуха?
10. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние воды?
11. На основании каких показателей оценивается санитарно-микробиологическое состояние пищевых
продуктов?
12. Что такое коли-титр и коли-индекс воды?
13. Что такое микробное число воды?
14. Какие методы применяются для определения фекального загрязнения воды?
15. Как определяется микробное число воды?
16. Чему равняются микробиологические и паразитологические показатели питьевой воды?
17. Как проводится определение фекального загрязнение персонала и предметов обихода?

ЗАНЯТИЕ №9

Тема:
 Медицинская экология микроорганизмов (продолжение): нормальная микрофлора тела человека.
План занятия:
1. Качественный и количественный состав микрофлоры организма человека.
2. Методы определения состава микрофлоры тела человека. Дисбактериоз.
46
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ:
Сочетание микробных ассоциаций, встречающихся в организме человека, составляют его микрофлору.
Нормальная микрофлора – это качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов
отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие
макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека. Микробные биоценозы, сформировавшиеся в
различных полостях тела человека, в процессе эволюции в результате селекции наиболее приспособленных к
условиям существования характеризуются относительным постоянством. Но на качественный и количественный
состав микроорганизмов влияют многие факторы: возраст, пол, особенности питания, микробы окружающей
среды, и в особенности, антибиотики и другие химико-терапевтические и иммунологические препараты,
применяемые в лечебно-профилактических целях.
Формирование состава микрофлоры регулируются антагонистическими и синергетическими отношениями
между отдельными ее представителями в составе биоценозов, а также контролируется физиологическими
факторами макроорганизма.
Микрофлора тела человека представлена постоянно находящимися микроорганизмами в той или иной полости
(автохтонная или индигенная микрофлора) и случайной или факультативной (аллохтонной) флорой. К первой
группе - облигатной или резидентной - относятся микробы, максимально приспособленные к существованию в
организме человека - это сапрофиты и условно-патогенные виды. Основу нормальной микрофлоры человека
составляют облигатно-анаэробные бактерии. Факультативная и транзиторная микрофлора является временной и
необязательной. В ее состав входят также сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы. Иногда в
организме здоровых людей могут встречаться патогенные микробы и вирусы.
Естественной формой существования в природе любых микроорганизмов является иммобилизованное
состояние, т.е.99,9% бактерий обитает в виде фиксированных к различным поверхностям микроколоний,
заключенных в полисахаридный гликокаликс бактериального происхождения, который защищает
микроорганизмы от других микробов, бактериофагов и прочих неблагоприятных факторов. Представители
автохтонной микрофлоры в животном организме способны фиксироваться лишь к строго определенным
рецепторам кожи и слизистых, образуя при этом биопленку, защищающую слизистые от колонизации другими
микроорганизмами. Элементами, ответственными за специфическую адгезию, являются поверхностные
структуры бактерий, содержащие лектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам,
расположенным на мембранах эпителиальных клеток.
Несмотря на определенную стабильность, состав автохтонной бактериальной популяции в биопленке может
изменяться под влиянием разнообразных факторов (фармакологические препараты, промышленные яды,
пестициды, радиация, стрессы, гормоны и т.п.). В тех случаях, когда воздействующие факторы по своей
интенсивности превышают компенсаторные возможности микробной экосистемы, возникающие дисбиотические
нарушения, могут стать пусковым механизмом развития и поддержания различных патологических состояний.
В настоящее время существенно расширился спектр клинических синдромов и патологических состояний,
патогенез которых может быть связан с изменением состава и функций нормальной микрофлоры (диарея,
запоры, колиты, гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, коагулопатии, гипо-и гипертензия, острая
мезентериальная ишемия, гипо- и гиперхолинестеринемия, кариес, моче- и желчекаменная болезнь,
злокачественные новообразования и др.).
Некоторые представители нормальной микрофлоры человека относятся к условно-патогенным
(стафилококки, эшерихии, бактероиды и др.). А поэтому при определенных условиях (снижение
колонизационной резистентности, смена среды обитания, ослабление защитных сил организма и др.) становятся
причиной эндогенных инфекций различной локализации.
Микрофлора кожи. Кожа, особенно еѐ открытые части, обсеменены различными микробами. Микрофлора
кожи складывается не только из микробов, находящихся на поверхности, но и в глубине кожи (волосяные
мешочки, протоки сальных и потовых желѐз). На грязной коже многие микробы способны не только сохранять
жизнеспособность, но и размножаться. На поверхности чистой кожи микроорганизмы быстро гибнут.
Неповреждѐнные кожные покровы для большинства микроорганизмов, в том числе и патогенных,
непроходимы. При нарушении же целостности кожных покровов, а также при снижении общей резистентности
микроорганизма на коже могут возникать различные заболевания: гнойничковые элементы, инфицированные
мацерации, вызванные бактериями, грибками, вирусами.
Микрофлору кожи составляют микроорганизмы как постоянно живущие на ней, так и разнообразная
заносная микрофлора, попадающая из внешней среды - из воды, воздуха, почвы, при соприкосновении с
загрязнѐнными объектами внешней среды или полостями организма (рот, кишечник, полость носа и др.).
47
Преобладающим представителем кожной микрофлоры являются анаэробные пропионобактерии
(преимущественно P. аcnes). Здесь же в значительных количествах присутствуют стафилококки, дифтероиды,
грибы рода Candida. Микрофлора коньюктивы, как правило, по составу схожа с таковой кожи.
Микрофлора полости рта разнообразна и многочисленна, поскольку в ротовой полости создаются
благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов. Это щелочная реакция слюны, пищевые
остатки, «термостатная» температура и влажность. Особенно много их локализуется в зубном налѐте, между
зубами, в криптах и лакунах миндалин. В ротовой полости встречается более 300 видов микроорганизмов. Их
можно разделить на постоянную (резидентную) и факультативную микрофлору. Более многочисленны анаэробы
(бактероиды, пептококки, лептотрихии, фузобактерии, вейлонеллы).
Резидентную группу составляют стрептококки (Str. salivarius, Str. mutans, Str. sanguis), непатогенные
стафилококки, диплококки, коринебактерии, лактобациллы, вейлонеллы, трепонемы (Tr. Buccalis),
дрожжеподобные грибы (Candida albicans), актиномицеты, микоплазмы, простейшие.
Среди факультативных микроорганизмов встречаются энтеробактерии (роды Eseherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Proteus), синегнойная палочка, спорообразующие - бациллы, клостридии, а также -
пептострептококки и пептококки. Некоторое время в ротовой полости могут персистировать вибрионы,
спирохеты, дифтерийная палочка, менингококки и др.
В поддержании количественного и качественного постоянства нормальной микрофлоры полости рта
главную роль играет слюна, обладающая антибактериальной активностью за счѐт содержания в ней ферментов
(лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза) и секреторных иммуноглобулинов. Индивидуальные колебания в
составе микрофлоры полости рта зависят от возраста, гигиенических навыков, диеты, общей резистентности
организма и резистентности слизистых оболочек, наличия дефектов зубов.
Нормальная микрофлора полости рта обеспечивает еѐ защиту за счѐт конкуренции, антагонизма по
отношению к патогенным микроорганизмам, таким как дифтерийный возбудитель, патогенные стафилококки и
стрептококки, менингококки, условно-патогенные и патогенные грибы. В случае же нарушения микрофлоры, то
есть возникновения дисбактериоза, патогенные и условно-патогенные микробы могут вызывать заболевания
органов полости рта (кариес, парадонтоз, гингивит) или обеспечивать, так называемую, «нисходящую инфекцию»
из полости рта в глотку, гортань, желудок, трахею, бронхи, лѐгкие.
Микрофлора желудка бедна, поскольку большинство попадающих сюда микроорганизмов погибают под
действием соляной кислоты желудочного сока. Однако при нарушении общего и местного гомеостаза в желудке
могут появляться условно-патогенные микроорганизмы, которые способствуют возникновению гастритов и
язвенной болезни (Helicobacter pyloris).
В тонком кишечнике в норме микроорганизмы либо отсутствуют, либо их количество невелико. Из выяв-
ляемых бактерий чаще обнаруживаются энтерококки, лактобактерии. Иногда высеваются сарцины, грибы.
В толстом кишечнике регистрируется самая разнообразная по составу микрофлора. Биомасса
микроорганизмов, заселяющих кишечник взрослого человека, составляет 2,5-3 кг и включает в себя до 450 видов.
Нормальная микрофлора кишечника на 92-95% состоит из строго анаэробных видов, остальная часть - аэробы.
В толстом кишечнике обнаруживаются следующие микроорганизмы:
Анаэробные бактерии Аэробные
Грамотрицательные бактерии В. fundiliformis Грамотрицательные бактерии E.coli,
В. fragilis B.putidum и др. группа Veillonella Enterobacter, Citrobacter, klebsiella, Proteus,
Грамположительные бактерии providentia, Pseudomonas
Грамположительные бактерии

Групп молочнокислых бактерий. Спороносные бактерии Вас. Subtillis, Вас. Вrevis,


Лактобактерии: L. fermentum, L. acidopnilis L. молочнокислые бактерии, дифтероиды,
plantarum. Бифидобактерии: B.bifidum, энтерококки.
B.longum, B.infantis, B.adolescentis,
B.fermentum.

Группа спороносных бактерий Cl. perfringens, Стафилококки и микрококки


Cl. tetani Cl. botulinum Cl. sporogenes Candida
Группа шаровидных Peptostreptococcus Sp. Плесневые грибки
Peptococcus Sp. Группа актиномицетов A. Israelii и др.
48
Кишечную микрофлору делят на облигатную и факультативную. К облигатным микробам относят
буфидумбактерии, лактобактерии, бактероиды, кишечные палочки, энтерококки. К факультативным бактериям
толстого кишечника относят сапрофитные, условно-патогенные, патогенные виды микробов.
Представители нормальной микрофлоры, обладая высоким сродством к рецепторам энтероцитов и адгезируя с
ними, формируют на поверхности слизистых защитный биослой, обеспечивающий колонизационную
резистентность. Вместе с тем нормальная микрофлора способствует созреванию, особенного у детей раннего
возраста, общего и местного иммунитета. Благодаря этому возрастает синтез иммуноглобулинов, комплемента,
лизоцима.
В процессе жизнедеятельности нормальной кишечной флоры выделяются органические кислоты и
антибиотические вещества (колицины, лактолин, низин, стрептоцин), что препятствует размножению
болезнетворных и гнилостных бактерий, а вместе с тем способствует снижению синтеза аммиака, токсических
аминов, фенола, сероводорода, крезола и других токсических продуктов.
Нормальная кишечная аутофлора принимает активное участие в процессах пищеварения, расщепляя
поступившие из тонкого кишечника нерасщепленные белки, жиры и углеводы, а образующиеся при этом
продукты, стимулируют перистальтику. Кишечная аутофлора принимает участие в биохимических процессах
жирового и пигментного обмена, в частности, обмена холина, желчных и жирных кислот с образованием
дезоксихолевой кислоты, копростерина, уробилина. Кишечная микрофлора благоприятно влияет на процессы
всасывания и обмена веществ, утилизации кальция, железа, витамина Д. Она тормозит процессы
декарбоксилирования пищевого гистидина, уменьшая тем самым синтез гистамина, а, следовательно, снижает
аллергический потенциал энтерального питания для организма.
Благодаря нормальной кишечной аутофлоре происходит эндогенный синтез многих витаминов (В1, В2, В5,
В6, В, РР, К, С, Н) и незаменимых аминокислот, а также улучшается всасывание витаминов Д и Е, поступивших в
организм с пищей.
Микрофлора урогенитальной системы Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре в норме стерильны. На
наружных половых органах мужчин и женщин обнаруживаются микобактерии смегмы (Mycobacterium
smegmalis), непатогенные, иногда патогенные стафилококки, монококки, коринебактерии, микоплазмы, но
пейзаж микроорганизмов однообразен, включает 2-3-4 вида. Уретра женщин обычно стерильна. Уретра мужчин
имеет немногочисленную микрофлору: непатогенные кокки, сапрофиты, дрожжи. Микрофлора влагалища
разнообразна, но непостоянна, зависит от многих причин, в том числе и от функции яичников, от возраста и
общей резистентности организма, а также от уровня гликогена в клетках эпителия влагалища и pH влагалищного
секрета. Сразу после рождения женщины происходит заселение влагалища лактобактериями, затем появляется
кокковая флора. В зрелом возрасте, кроме лактобактерий и непатогенных кокков, появляются непатогенные
стрептококки, клебсиеллы, бактероиды, анаэробы, микоплазмы, дрожжевые грибки, грибы Candida. Но основным
и важнейшим представителем нормальной микрофлоры влагалища является Bac. vaginalis (палочка Додерлейна -
лактобактерии). В некоторых случаях, в микрофлоре влагалища появляются и вызывают заболевания такие
микробы как патогенные или условно-патогенные стафилококки, стрептококки, синегнойные палочки,
клебсиеллы, хламидии, а также микробные ассоциации. Хламидии, вызывающие распространѐнное в настоящее
время заболевание хламидиоз, не являются представителем нормальной микрофлоры влагалища.
Поражения органов урогенитального аппарата, вызванные микоплазмами и хламидиями, сложны как в
диагностике, так и в лечении. Трудности в диагностике вызваны особенностями строения и культивирования
микроорганизмов
Педиатрические аспекты
Кишечник родившегося ребенка стерилен. Первым и основным источником микробной флоры для
новорожденного ребенка является мать. Первичная микробная контаминация ребенка начинается за счет флоры
влагалища уже во время родового акта при прохождении родовых путей матери. В дальнейшем в результате
постоянного контакта с матерью аутофлора новорожденного начинает формироваться в основном за счет
микрофлоры кишечника матери.
Существует мнение, что основа для формирования микробной аутофлоры будущего ребенка
закладывается еще во время беременности под влиянием иммунной системы матери. Считают, что в основе этого
явления лежит механизм иммунологической толерантности, формирующийся у плода в результате
проникновения через плаценту антигенов, характерных для микробного пейзажа матери.
При грудном вскармливании к 4-6-7 дню появляются бифидобактерии, энтерококки, лактобактерии, но при
искусственном вскармливании в кишечнике новорожденных быстро появляются стафилококки, стрептококки,
сарцины, анаэробные бактерии, дрожжи, а также возникают изменения в составе нормальной микрофлоры
кишечника. Например, бактероиды у детей с искусственным вскармливанием высеваются в большем количестве
(1010) и от 5 до 10% диарей вызываются этими микробами. Вейлонеллы у детей, находящихся на искусственном
49
вскармливании, также регистрируются чаще и в большем количестве (108), чем у взрослых (105) и
иногда вызывают у них диспептические явления. Среди бифидобактерий у них чаще всего присутствуют виды
В.adolescentis и B.longus, что характерно чаще всего для взрослых, а не B.biphidus и B.inphantis, как это бывает
при грудном вскармливании.
Следовательно, профилактика нарушений микробиоценоза новорожденного должна начинаться еще
задолго до его рождения путем коррекции дисбактериоза родовых путей и кишечника, если таковые имеются у
будущей матери.
Цель занятия
1. Изучить нормальную микрофлору кожи, слизистых, различных полостей организма человека (рта, желудочно-
кишечного тракта, мочеполовой системы), функции и механизмы действия микрофлоры на макроорганизм.
2. Изучить причины и условия формирования дисбактериозов, усвоить принципы получения эубиотиков
(пробиотиков), показания к их применению.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Понятие о нормальной микрофлоре тела человека.
2. Характеристика нормальной микрофлоры кожи, слизистых, различных полостей организма человека.
3. Особенности взаимоотношений между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры организма
человека (синергизм, антагонизм и др.).
4. Роль нормальной микрофлоры человека для его здоровья.
5. Факторы, оказывающие влияние на количественный и качественный состав микрофлоры организма человека.
6. Методы исследования нормальной микрофлоры организма человека, критерии оценки.
7. Причины и условия возникновения дисбактериозов.
8. Методы микробиологического изучения дисбактериозов, практическая значимость исследований.
9. Препараты для восстановления нормальной микрофлоры организма человека (эубиотики или пробиотики),
принципы их получения, показания к применению.

Уметь:
1. Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека;
2. Освоить методику взятия материала для микробиологического исследования со слизистой рото-носоглотки и
зева стерильным ватным тампоном;
3. проводить оценку качественного и количественного состава микрофлоры кожи, рото-носоглотки

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ:
Для изучения состава микрофлоры организма используют бактериоскопический и бактериологический
методы. В частности, для изучения микрофлоры полости рта готовят мазки из зубного налета и окрашивают по
Граму и Бурри. Кроме этого, делают посевы на элективные среды для выделения и последующей идентификации
чистой культуры бактерий.
Микробиологическое исследование фекалий производится с целью определения состояния нормальной
микрофлоры или для исключения дисбактериоза кишечника. Показания для него разнообразны -
предоперационное обследование больных, кишечные инфекции неясной этиологии, дисфункции кишечника
после антибиотикотерапии, уточнение диагноза и др.
Забор свежих фекалий производят в стерильную взвешенную посуду и доставляют в лабораторию не
позднее чем через 2 часа. Исследуемые фекалии помещают в тиогликолиевый буфер (способствующий
сохранению как аэробной, так и анаэробной микрофлоры), затем готовят десятикратные разведения надосадочной
жидкости в физиологическом растворе и высевают на элективные и дифференциально-диагностические среды,
соответственно группам выделяемых микроорганизмов.

Схема посева разведений на питательные среды.


Разведение Посевная Среды Конечное
материала Доза Разведение

10 –1 1,0 Селенитовый бульон -


0,1 Плоскирева, Левина 10-2
10 –3 0,1 Желточно-солевой агар, Сабуро 10-4
50
0,5 Среда для клостридий (4,5 мл) 10-4
–5
10 0,1 Кровяной агар, Эндо 10-6
0,5 Среда для лактобактерий (4,5мл) 10-6
0,5 Среда для клостридий (4,5 мл) 10-6
10 –7 0,1 Кровяной агар, Эндо 10-8
0,1 Анаэробный агар 10-8
0,5 Среда для лактобактерий (4,5мл) 10-8
1.0 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10-8
0,1 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10-9
10 –9 0,1 Анаэробный агар 10-10
1,0 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10-10
0,1 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10-11
10-11 1,0 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10-12
(дети до 1 0,1 Среда для бифидобактерий (9-10 мл) 10 –13
года)

Посевы на факультативные анаэробы инкубируют в обычном термостате при 370С, на дрожжеподобные


грибы при 28-300С, на бактероиды и лактобактерии в анаэростате при 370С. Из выросших подозрительных
колоний выделяют чистые культуры микроорганизмов, с целью их идентификации проводят изучение
культуральных, морфологических, биохимических, патогенных и др. свойств. Идентификацию проводят как для
выделенных патогенных и условно-патогенных возбудителей, так и для представителей нормальной микрофлоры
кишечника.
Количество обнаруженных микроорганизмов выражают в десятичных логарифмах, учитывая посевную
дозу и разведения, из которых сделан высев.
Для восстановления микроэкологического статуса больных с явлениями дисбиоза применяются
биологические бактерийные препараты (пробиотики или эубиотики), приготовленные из штаммов живых
бактерий аутохтонной флоры и/или продуктов их жизнедеятельности. Монокомпонентные сухие препараты
бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин готовятся из одноименных бактерий, бактисубтил – из Bacillus
cereus, бактиспорин – из B.subtilis. Поликомпонентные: бифилонг содержит два вида бифидумбактерий
(В.bifidum, B.longum), ацилакт – три штамма лактобактерий, аципол – L.acidophilus и полисахарид кефирных
грибков, линекс – B. acidophilus, B.infantis, Enterococcus faecalis, биоспорин - B.subtilis, B. lichiniformis, бификол –
бифидобактерии и кишечная палочка, бифилакт – бифидобактерии и лактобактерии.
Кроме лиофилизированных препаратов из бифидо- и лактобактерий в последние годы стали производить жидкие
(закваски), а на их основе – лечебно-профилактические кисломолочные продукты. Считают, что эффективность
таких препаратов выше по сравнению с сухими, поскольку содержат уже готовые биологически активные
вещества и сами бактерии в них более активны.
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Таблицы с перечнем облигатной и факультативной микрофлоры полости рта и кишечника.
2. Рисунки микрофлоры зубного налета, окрашенных по Граму и Бурри.
3. Рост бифидумбактерий на среде Блоурокка
4. Препараты, применяемые для коррекции нормальной микрофлоры человека при дисбактериозах (сухие и
жидкие эубиотики, кисломолочный бифидумбактерин и др.)

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Каждый студент готовит препарат из зубного налета. В бригаде из двух человек один окрашивает препарат
по Граму, второй - по методу Бурри.
2. Каждый студент готовит препарат из чистой культуры бифидумбактерий, окрашивает по Граму и
микроскопирует.
3. Бригада студентов из 3-4 человек производит посев «отпечатков» пальцев на пластинчатый агар в
соответствующем секторе чашки Петри.
4. Бригада студентов из 3-4 человек производит посев материала из зева и носа на МПА и ЖСА в чашки Петри.
5. Студенты учитывают результаты посева воздуха по Коху и с помощью аппарата Кротова делают заключение о
загрязненности исследованного воздуха.
6. Студенты учитывают результаты посева смывов с рук на среду Кес-слера и делают заключение о возможном
загрязнении рук.
51
7. Студенты учитывают результат по определению микробного числа воды.
8. Студенты засевают Pr. vulgarus на обычный и карболовый агар.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Какие микроорганизмы встречаются на коже, конъюнктиве?
2. Какие микроорганизмы выявляются в верхних дыхательных путях?
3. Перечислите шаровидных и извитых бактерий, встречающихся в полости рта?
4. Перечислите палочковидных микробов, встречающихся в полости рта.
5. Какие микроорганизмы встречаются в толстом кишечнике?
6. Какие микроорганизмы встречаются в тонком кишечнике?
7. Какую роль играют микроорганизмы толстого кишечника в физиологии человека?
8. Какие микроорганизмы из числа нормальной микрофлоры человека являются облигатными
анаэробами?
9. Какие микроорганизмы из числа постоянных обитателей полости рта принимают участие в развитии
кариеса, парадонтита и гингивита? 10.Какие причины могут приводить к возникновению
дисбактериоза?
10. Какие микроорганизмы могут преобладать в случае развития дисбактериоза?
11. К каким последствиям может приводить дисфункция нормальной
микрофлоры?
12. Какие вопросы изучает гнотобиология?
13. Какую функцию выполняет биопленка кишечника?
14. Какими методами изучается нормальная микрофлора человеческого организма
15. В каких случаях проводится обследование на дисбактериоз?
16. Какой материал берется для исследования при дисбактериозе кишечника?
17. Как проводится микробиологическое обследование при дисбактериозе?
18. Какие питательные среды применяются при обследовании на дисбактериоз?
19. Какие биопрепараты применяются для восстановления нормальной микрофлоры.
20. Каков принцип получения эубиотиков и пробиотиков?
21. Как получаются жидкие эубиотики, в чем их преимущество перед сухими?
22. Как получают кисло-молочный бифидумбактерин и лактобактерин , в каких случаях их следует
применять?
23. Какие факторы влияют на количественный и качественный состав нормальной
микрофлоры тела человека?
24. Какие взаимоотношения существуют между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры
организма человека?
25. Какая взаимосвязь существует между нормальной микрофлорой организма человека и
функционированием его иммунной системы?

ЗАНЯТИЕ 10
Тема:
 Генетика микроорганизмов.
План занятия:
1. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов. Генотип и фенотип.
2. Рекомбинации у бактерий: трансформация, трансдукция, конъюгация.
3. Модификации у бактерий и вирусов.
4. Мутации у бактерий и вирусов. Диссоциации.
5. Идентификация нуклеиновых кислот. Полимеразная цепная реакция (ПЦР),
молекулярная гибридизация.
6. Генная инженерия.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ:
Исследования в области генетики микроорганизмов ознаменовались выдающимися открытиями. Установлены
генетическая роль дезоксирибонуклеиновой кислоты, структура гена, расшифрован генетический код, выявлены
многие закономерности процессов мутагенеза, создано новое направление в изучении генетики - генная
52
инженерия, с помощью которой можно производить пересадку генов из одной клетки в другую, что позво-
ляет управлять наследственностью микроорганизмов.
У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов,
необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка
гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. Обычная бактериальная хромосома имеет
молекулярную массу около 1010 Д (5х106 пар оснований; размер генома человека составляет 2,9х109 пар
оснований). Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии, впервые установленная методом
радиоавтографии, для клеток E.coli составляет около 1 мм.
В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами. Они
не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в
энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное
состояние), либо встроены в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). В автономном состоянии
они самостоятельно реплицируются. Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106 - 108 Д, несущие от
40 до 50 генов, несут 2 функции - регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений
метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного
бактериального генома, не способного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного
репликона. Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о
которой судят по приобретенному признаку, например образованию пилей (F-плазмиды), резистентности к а/б (R-
плазмиды), выделению бактериоцинов (col-плазмида).
Конъюгативные плазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или
близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды
(чаще выявляются у Гр- палочек).
Неконъюгативные плазмиды - обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр -
микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку. Неконъюгативные плазмиды
тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и
неконъюгативных плазмид.
R-плазмиды обуславливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам,
стрептомицину, пенициллину, тетрациклину, либо устойчивость к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий,
кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в
агар из бумажных дисков.
F-плазмиды - удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т. е. увеличивает их
«плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ.
High frequency of recombitions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых
ворсинок (sex или F pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными
клетками при конъюгации.
Col-плазмиды - контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы -
бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины
обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины),
стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов.
Роль этих продуктов связана с формированием микробных сообществ (напрмер, в кишечнике человека
бактериоцины E. coli вызывают гибель патогенных энтеробактерий). Бактериоциногения более выражена у Гр-
микроорганизмов, но распространена и у Гр+ бактерий.
Способность к синтезу бактериоцинов используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип
колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование), либо тип плазмиды
(колициногенотипирование).
Плазмиды патогенности - контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий.
В частности F-,R-,Col-плазмиды в интегрированном состоянии включают tox+ транспозоны, кодирующие
токсинообразование. Нередко tox+ транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например,
дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых
контролируют гены бактериальных хромосом.
Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков называют модификациями, они
не находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре, после
действия фактора и его прекращения, утрачиваются. Модификации проявляются в мире бактерий довольно часто,
они могут возникать в популяции любого вида.
У бактерий чаще наблюдаются морфологические модификации, приводящие к обратимым изменениям
формы бактерий. Так, например, в старых культурах палочковидные бактерии изменяются до кокковидных,
53
подвижные бактерии теряют подвижность на средах с формалином, пигментообразующие бактерии временно
утрачивают синтез пигмента (Serratia marcescens). Биохимические модификации - основу составляют
индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных
генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы
синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина
синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик.
К модификациям относят включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов
в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного заболевания.
Модификации могут возникать под непосредственным действием а/б, например пенициллина.
Образующиеся при этом L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже
размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия
пенициллина (бледная трепонема, микобактерии туберкулеза, гонококки).
Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменение окружающей среды,
что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне.
Своеобразной формой изменчивости является R-S диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно
вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру
образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (rough - неровный) -
характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью; второй тип - S-колонии (smooth - гладкий) -
имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток,
формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через
промежуточные стадии образования слизистых (М) или карликовых (Д) колоний. Обратный переход R- в S-
форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний.
Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые
другие, которые в R-форме являются вирулентными.
В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические,
антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней
среды.
Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают
после встраивания внехромосомных факторов наследственности - умеренных фагов, либо неконъюгативных
крупных плазмид, которые кодируют образование детерминантных полисахаридных звеньев липополисахарида у
Гр- бактерий (имеющих значение для инвазивности у шигелл Зонне, и пенетрации шигелл Флекснера в
эпителиальные клетки кишечника). Утеря этих плазмид приводит к образованию R-мутантов. Они формируют
шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных
бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У
других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-
последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате
рекомбинаций.
Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных
преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится
более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-
формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время
сохраняются в воде, молоке. S-R-диссоциация усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных
заболеваний, например, дизентерия Зонне, эшерихиоза, вызванного E.coli О124 и др.
Мутации и индукция новых мутаций мутагенами представляют собой ценный инструмент в генетических и
биохимических исследованиях. Во-первых, изменения, которые вызывает мутация в определенном гене,
позволяют не только его идентифицировать, но и точно указать его место в хромосоме с помощью методов
генетического картирования. Во-вторых, анализ мутантных штаммов, у которых нарушены различные этапы
сложной цепи биохимических процессов, может вскрыть детали организации генетического и биохимического
аппаратов. В-третьих, знание механизмов действия различных мутагенов может помочь в установлении
корреляции между мутагенным и канцерогенным действием множества факторов окружающей среды
(химические агенты, радиоактивное излучение и др.).
Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинации у них осуществляются в результате
проникновения в клетку реципиента не всей хромосомы донора, а только еѐ части, определенного фрагмента, что
приводит к формированию мерозиготы и образованию одного рекомбинанта. Генотип такого рекомбинанта
представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом донорской ДНК. Передача
генетического материала от одних бактерий другим может осуществляться путѐм передачи чистой ДНК, что
54
может быть осуществлено в экспериментальных условиях (трансформация), либо фрагмент донорской
ДНК переносится клетке-реципиенту с генетическим материалом умеренного фага (трансдукция), либо
фрагменты ДНК донора передаются клетке реципиенту при непосредственном контакте клеток с участием по-
ловых ворсинок (конъюгация).
Способы генетического обмена, наряду с процессами мутирования генов, играют важную роль и
обусловливают генетическую изменчивость, поставляющую материал для эволюции. Эти процессы также важны
и для понимания биохимических и генетических механизмов функционирования бактерий, установления
принципов строения и регуляции генов, а также расшифровки сложных процессов синтеза макромолекул, роста и
деления клеток.
Современная генетика интенсивно изучает молекулярно-генетические основы патогенности и
иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и
условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиотикорезистентных штаммов на фоне
расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Большое внимание уделяется получению
микроорганизмов со сниженной вирулентностью и сохраненной иммуногенностью - вакцинных штаммов.
Название «вакцина» было дано Луи Пастером всем прививочным препаратам, полученным из
микроорагнизмов и их продуктов. Э. Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус
коровьей оспы (vaccinus - коровий), идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но
маловирулентной человеку, т. е. данная вакцина была заимствована из природы. В России применяется другая
вакцина, заимствованная у природы - сибиреязвенная вакцина СТИ, названная в честь сотрудников санитарно-
технологического института г. Ленинграда, выделивших из почвы бескапсульный вариант сибирской язвы.
Заслугой Луи Пастера была разработка принципов направленного получения аттенуированных вакцинных
штаммов - селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохраненными иммуногенными
свойствами путем культивирования их в определенных условиях, пассирования через организм устойчивых к
данной инфекции животных, через куриный эмбрион, через культуру клеток, после длительного действия
бактериофага, воздействия ультрафиолетовых, рентгеновских лучей.
Антирабическая вакцина получена Л. Пастером в результате 133 пассажей уличного вируса бешенства
через мозг кроликов.
Чумная вакцина EV получена Г. Жераром и Ж. Робиком при культивировании чумных бактерий при
температуре 16ОС в течение 5 лет.
Вакцина БЦЖ получена А. Кальметтом и Ш. Гереном при длительном культивировании микобактерий
туберкулеза бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью. Желчь явилась фактором, неблагоприятным для
микобактерий, что привело к ослаблению вирулентности этого штамма.
Бруцеллезная, туляремийная вакцины были получены при культивировании на картофельной среде в
течение 5 лет.
Вакцина против вируса желтой лихорадки была получена 238 пассажами на белых мышах.
Вакцины против гриппа, кори, краснухи, полиомиелита также получены под воздействием различных
факторов - азотистая кислота, гидроксиламин, бромзамещенные основания, повышение температуры, понижение
рН среды, ультразвук, ультрафиолетовые лучи, нуклеазы и др.
Современная биотехнология приготовления вакцин включает ряд этапов: накопление значительных
количеств микробной массы или токсина на специальных питательных средах при оптимальных температурных и
других условиях при постоянной аэрации, а для анаэробов при отсутствии кислорода. Большинство вакцин
высушивают из замороженного состояния в глубоком вакууме - лиофильная сушка. Это обеспечивает их
длительное хранение.
Достижение генной инженерии: получена рекомбинантная гриппозная вакцина, вакцина против гепатита В.
Благодаря переносам генов человека, кодирующих синтез инсулина, интерферона в геном E.coli налажено
производство генно-инженерного инсулина, интерферона.
Цель занятия:
1. Ознакомиться с особенностями генома бактериальной клетки, его отличия от генома эукариотической клетки;
видами и формами изменчивости микроорганизмов; основными механизмами изменчивости
микроорганизмов.
2. Изучить методы генетической диагностики инфекционных заболеваний. Ознакомиться с практическим
применением достижений генной инженерии.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Особенности генома бактериальной клетки.
55

2. Отличия генома бактериальной клетки от генома эукариотов и вирусов.


3. Внехромосомные детерминанты наследственности - плазмиды, их функции.
4. Механизмы передачи генетического материала у бактерий (конъюгация, трансформация, трансдукция).
5. Достижения генной инженерии в получении новых лекарственных препаратов.
6. Механизмы, обусловливающие изменчивость микроорганизмов (адаптации, мутации, рекомбинации).
7. Методы генетической диагностики инфекционных заболеваний (ПЦР, молеклярная гибридизация).

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Идентификация нуклеиновых кислот.


Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях, когда в исследуемом матенриале ДНК или РНК мало или
недостаточно для того, чтобы установить ее точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной
цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий
определенного участка ДНК.
Вначале проводят термическое (t 95°) разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. После
охлаждения в пробирку вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклиотидным
последовательностямобеих цепочек, содержащие не менее 20-30 нуклеотидов. Затем в среду вносят
термостабильную tag-полимеразу (по названию микроба Thermus aquaticus), что запускает образование
вторичных копий цепей РНК. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз, что позволяет получить около миллиона
копий ДНК. Полученную нуклеиновую кислоту идентифицируют с помощью электрофореза в 1% геле с окраской
фракций ДНК бромидом этидия, яркосветящимся в ултрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы
анализируются. При проведении ПЦР используются специальные термостаты-циклеры, позволяющие быстро
проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК
специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК
искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Постановка опыта конъюгации. Бригада студентов из трех-четырех человек используют культуру-донор Е.


Coli Hfr pro+, urac +. Str S и культуру реципиент - Е coli F- pro¯, urac¯, his¯, str R В стерильной пробирке смешать
1 мл культуры донора и 1 мл культуры реципиента и инкубировать в термостате 40 мин., после чего высевают
1мл смеси на минимальную среду в чашке Петри. Минимальная среда для данного опыта содержит стрептомицин
в концентрации, задерживающий рост культуры донора. На ней могут вырасти лишь рекомбинанты родительских
культур в случае их образования при конъюгации. Контроли: посев культур донора и реципиента на
минимальную среду с антибиотиком. В обоих случаях роста не будет.
2. Постановка опыта трансдукции. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру Е coli Lac+ в
качестве реципиента и трансдуцирующий фаг, полученный путѐм индукции из лизогенной культуры Е coli Lac+.
В стерильную пробирку вносят 1 мл культуры реципиента и 1 мл трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют в
термостате 40 мин и делают высев на среду Эндо. Контроли: 1. Высев культуры реципиента на среду Эндо (рост
бесцветных колоний). 2. Высев на среду Эндо лизогенной культуры Е coli Lac+, из которой после облучения
получен трансдуцирующий фаг (рост вишнево-красных колоний). На среде Эндо засеянной из опытной смеси
вырастают и красные и бесцветные колонии.
3. Постановка опыта трансформации. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру
стафилококка, чувствительную к пенициллину в качестве реципиента и раствор ДНК, выделенной из донорской
культуры St. устойчивой к пенициллину. В стерильную пробирку вносят по 1мл культуры стафилококка
чувствительного к пенициллину и раствор ДНК, полученный из культуры St резистентной к пенициллину,
инкубируют 40 мин., после чего производят высев на среду с пенициллином. На чашке вырастают отдельные
колонии резистентного к пенициллину стафилококка. Контроль: Высев культуры St реципиента на ту же среду
(отсутствие роста колоний).
4. Опыт элиминации R -фактора. Бригада студентов из трех-четырех человек разводит бульонную культуру Е
coli R+ до концентрации 10-4 и переносит 0,1мл разведенной культуры в 1мл бульона (контроль) и в 1мл бульона,
к которому добавлен 50мкг/мл акридиновый оранжевый, ph в обеих пробирках 7,6. После 18-24 инкубации в
термостате из каждой пробирки готовят разведения культуры 10-4 и по 0.1мл высевают на чашки МПА
содержащим по 200 мкг/мл тетрациклина и левомицетина,. Посевы ставят в термостат на сутки, после чего
56
подсчитывают количество колоний в контрольном и опытном посевах. Количество колоний, выросших на
чашке, засеянной из опытной пробирки значительно меньше, чем в чашке, куда высеяна культура из контрольной
пробирки, так как акридиновый оранжевый разрушает плазмидный R -фактор.
5. Каждый студент готовит препарат из культуры Pr.vulgarus, выросшей на обычном или карболовом агаре и
сравнивает его с препаратом напарника.
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Генетическая карта хромосомы Е coli (схема).
2. Действие колицинов на индикаторную культуру Е coli.
3. Опыты конъюгации, трансформации, трансдукции, элиминации R.-фактора.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
Что такое рекомбинации у бактерий?
2. Что такое трансформация?
3. Что такое трансдукция?
4. Что такое конъюгация?
5. Что является трансформирующим агентом ?
6. Какие плазмидные элементы бактерий Вы знаете ?
7. Какую роль играют плазмиды в жизнедеятельности бактерий ?
8. Каким образом можно изменить генотип бактерий ?
9. Какими биологическими свойствами обладают рекомбинанты ?
10. В чем заключается феномен диссоциации бактерий7
11. Какими признаками характеризуются S-и R-формы бактерий?
12. Что такое мутация?
13. Каким образом можно изменить генотип бактерий?
14. Какие вы знаете мутагенные факторы?
15. Что такое модификация у бактерий?
16. Что такое минимальная среда и когда она используется?
17. Что такое ауксотроф?
18. Как получить ауксотрофы?
19. Каково значение фенотипической и генотипической изменчивости в экологии
20. микробов?
21. В каких областях микробиологии применяется адаптационная изменчивость микробов
22. Как проводится картирование хромосом у бактерий?
23. Каковы достижения генной инженерии в микробиологии?
24. Что лежит в основе генетических методов диагностики инфекционных заболеваний?
25. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом ПЦР?
26. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом молекулярной гибридизации
нуклеиновых кислот?

ЗАНЯТИЕ №11
Тема:
 Инфекция и иммунитет
План занятия:
1. Инфекционный процесс, формы его проявления, пути передачи, динамика развития
инфекционного процесса.
2. Патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы ее выявления и оценки.
3. Методы экспериментального заражения и иммунизации животных.
4. Бактериологическое исследование трупов животных.
5. Неспецифические клеточные и гуморальные факторы защиты организма человека (фагоцитоз, лизоцим,
комплемент и др.) методы их изучения и оценки.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Инфекция - эволюционно сложившийся процесс взаимодействия трех факторов: патогенных микробов,
макроорганизма и окружающей среды. Крайней степенью выраженности этого взаимодействия является инфек-
ционное заболевание.
57
Патогенность микроорганизмов - потенциальная способность вызывать инфекционное заболевание у
человека и животного. Это видовой генотипический признак микробов. Несмотря на большое разнообразие
патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, все они пользуются примерно одинаковыми или сходными
молекулярными инструментами для достижения своих целей при развитии инфекционного процесса.
Сравнительно недавно установлено, что большая часть генов патогенности располагается на хромосомах
отдельными кластерами из функционально связанных групп. Их стали называть «островками» или «островами»
(в зависимости от величины) патогенности. Они располагаются на дискретных и часто имеющих чужеродное
происхождение участках ДНК, кодирующих группы вирулентных признаков. Мобильность «островов»
патогенности связана с тем, что они могут входить в состав ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид и
участвовать в горизонтальном переносе генетической информации. Интеграция и экспрессия генов
вирулентности лежит в основе формирования новых свойств у родственных непатогенных видов бактерий
различных таксономических групп.
Вирулентность - это степень патогенности или фенотипическое проявление патогенности. Вирулентность
измеряют следующими единицами: DLM (dosis letalis minima) - минимальная смертельная доза микроорганизмов
вызывающая гибель 70-80 % подопытных животных определенного вида и массы; DCL (dosis certa letalis) -
безусловно смертельная доза, вызывающая 100 % гибель взятых в опыт животных; LD 50 - доза. вызывающая
гибель 50% зараженных животных. Патогенность и вирулентность микроорганизмов обеспечивается наличием
специальных биологических факторов, образуемых в результате метаболических процессов в бактериальной
клетке. Их называют факторами патогенности. Каждый из них ответственен за проявление конкретных свойств
микроорганизма в инфекционном процессе:
факторы адгезии и колонизации (пили, фимбрии, адгезины) – с их помощью бактерии распознают рецепторы
на мембранах клеток, прикрепляются к ним и заселяют клетки;
факторы инвазии и агрессии (ферменты гиалуронидаза, плазмакоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза,
лецитиназа, ДНК-за и др.) – благодаря им бактерии проникают в ткани и распространяются;
антифагоцитарные факторы – либо маскируют бактерии от фагоцитоза (капсула), либо подавляют
фагоцитоз (белок А у стафилококка, белок М у стрептококков, корд-фактор у микобактерий, V-W- антигены у
Y.pestis);
эндотоксины (липополисахариды и связанные с ними белки клеточной стенки) – имеются у
грамотрицательных бактерии, высвобождаются после гибели клетки и обладают воспалительным и пирогенным
действием;
экзотоксины - токсические микробные протеины, обычно ферменты, секретируемые в окружающую среду,
которые убивают клетки хозяина в исключительно малых концентрациях (дифтерия, столбняк, ботулизм и др.).
Заражение лабораторных животных проводят с различными целями:
а) для моделирования инфекционных заболеваний;
б) для выделения чистой культуры возбудителя болезни;
в) для определения факторов вирулентности и измерения летальной дозы;
г) для проверки качества вакцин и имунных сывороток.

Заражение животных производят разными способами (подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно,


внутрибрюшинно, внутривенно, через рот, в мозг, интраорбитально и др.) в зависимости от задач исследования и
используемых животных.

ИММУНИТЕТ
Иммунитет – защита организма от генетически чужеродных веществ (антигенов) экзогенного или
эндогенного происхождения с целью сохранения и поддержания гомеостаза, структурной и функциональной
целостности организма.
Различают естественный (врожденный) и приобретенный (адаптивный) иммунитет.
А) Факторы естественного иммунитета:
 покровные ткани (кожа, слизистые оболочки);
 микробоцидные экзосекреты (соляная к-та желудочного сока, бактериоцидные компоненты слюны,
литические пищеварительные ферменты кишечника, лизоцим, -лизин и т.п.);
 сосудистые реакции с целью не пропустить во внутреннюю среду чужеродные агенты (быстрый
локальный отек в очаге повреждения);
 первичный фагоцитоз микробных тел нефтрофилами и макрофагами;
 естественные клетки-киллеры (NK-клетки);
58
 система белков комплемента;
 белки острой фазы – С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин (МСЛ)
 цитокины (интерфероны α, β, фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 6;
хемокины);
 липидные медиаторы (простогландины, лейкотриены, фактор активности
тромбоцитов);
 нормальная микрофлора тела человека.

Б) Приобретенный (адаптивный) иммунитет осуществляют Т- и В лимфоциты.

Основные функции факторов естественного иммунитета: фагоцитоз, опсонизация, активация комплемента,


хемотаксис, локальное воспаление, реакции острой фазы, лихорадка.
Фагоцитоз, опсонины
Фагоцитоз — поглощение фагоцитом корпускул, бактерий или крупных макромолекулярных
комплексов. Процесс фагоцитоза усиливают опсонины, обволакивающие объект фагоцитоза.
Фагоцитирующие клетки организма подразделяются на макрофаги и микрофаги. Макрофаги – это
полиморфноядерные гранулоциты крови: нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Макрофаги различных
тканей вместе с моноцитами крови и костного мозга объединены в систему мононуклеарных фагоцитов
(СМФ).
Моноциты составляют 5-10 %, а нейтрофилы — 60-70% лейкоцитов крови. Поступая в ткань, моноциты
формируют популяцию тканевых макрофагов: купферовские клетки (или звездчатые
ретикулоэндотелиоциты печени), остеокласты костной ткани, альвеолярные и интерстициальные макрофаги,
микроглия ЦНС.
Процесс фагоцитоза. Фагоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на
хемоаттрактанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемента (С5а,СЗа) и цитокины.
Плазмалемма фагоцита обхватывает бактерии или другие корпускулы и собственные поврежденные клетки. Затем
объект фагоцитоза окружается плазмалеммой, и мембранная везикула (фагосома), погружается в цитоплазму
фагоцита. Мембрана фагосомы сливается с лизосомой, и фагоцитированный микроб разрушается, рН закисляется
до 4,5; активируются ферменты лизосомы. Фагоцитированный микроб разрушается под действием ферментов
лизосом, катионных белков дефенсинов, катепсина G, лизоцима и других факторов. При окислительном
(дыхательном) взрыве в фагоците образуются токсичные антимикробные формы кислорода — перекись водорода
Н202, супероксиданион 02», гидроксильный радикал ОН», синглетный кислород. Кроме этого антимикробным
действием обладают окись азота и радикал N0».
Защитная роль фагоцитов от инфекционных агентов была впервые обнаружена И.И.Мечниковым. Кроме
этого фагоциты (А-клетки) осуществляют презентацию антигенной информации эффекторным клеткам
иммунной системы (Т- и В лимфоциты), запуская тем самым реакции иммунного ответа. В заключительную
стадию иммунного ответа Т-лимфоциты выделяют цитокины, активирующие макрофаги (приобретенный
иммунитет). Активированные макрофаги вместе с антителами и активированным комплементом (СЗЬ)
осуществляют более эффективный фагоцитоз (иммунный фагоцитоз), разрушая, фагоцитированные
микробы, иногда выступают в роли киллеров.
Фагоцитам присуща также секреторная функция, связанная с выработкой монокинов (интерлейкин-1, фактор
некроза опухолей) и других биологически активных веществ, играющих важную роль в иммуногенезе.
Фагоцитоз может быть завершенным, в результате гибели захваченного микроба, и незавершенным, при
котором микробы не погибают. Примером незавершенного фагоцитоза является фагоцитоз гонококков,
туберкулезных палочек и лейшманий.
Опсонины (лат. opsonin — усиливающий) — белки, обволакивающие микробы и усиливающие их
фагоцитоз. Роль опсонинов выполняют иммуноглобулины, белки острой фазы, липополисахарид-
связывающий протеин; компоненты комплемента (СЗЬ, С4Ь), сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D.
Грамположительные бактерии (стафилококки, стрептококки, пропионибактерии и др.) способны
неспецифически адсорбировать гуморальные факторы в виде капсулоподобного покрова. За счет этого они
более интенсивно фагоцитируются по сравнению с грамотрицательными бактериями (поэтому ряд авторов не
рекомендует для оценки фагоцитоза использовать грамположительные бактерии). Так, стафилококки,
обработанные сывороткой крови, неспецифически адсорбируют белки сыворотки (иммуноглобулины,
комплемент, альбумин и др.) в виде капсулоподобного покрова, условно названного иммуноглобулиновым
покровом.
59
NK-клетки (естественные киллеры) убивают клетки- мишени на основе лектинового распознавания или
антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). NK-клетки убивают клетки-мишени, которые (в
какой-либо момент) не экспрессируют МНС I. Цитотоксическое действие NK-клеток обусловлено
перфоринзависимым механизмом и сходно с действием цитотоксических лимфоцитов. При соединении NK-
клетки с Fc-фрагментом антител, прикрепленных к клеткам с чужеродными антигенами, развивается
антителозависимая клеточная цитотоксичность и гибель клетки-мишени.
Имеются две основные субпопуляции NK: одна из них участвует в антителозависимой клеточной
цитотоксичности. Вторая - находится в синусоидах печени. Схожие клетки имеются в матке. Эти клетки
убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами и антигенами плода, обуславливая
толерантность к этим антигенам.
Различают также LAK-клетки и Ту5-клетки.
LAK-клетка (лимфокин-активированный киллер — lymphokine-activated killer) происходит из небольшой
субпопуляции NK-клеток. Она цитотоксична к опухолевым клеткам, особенно под влиянием интерлейкинов
(IL2, IL1, IL6, IL15), интерферонов, TNFoc и других цитокинов. LAK-клетки активируют Т-лимфоциты и
эозинофилы. LAK-терапию применяют в лечении меналомы и почечной карциномы.
Ту5-клетки, или NK-T-клетки, являются небольшой субпопуляцией Т-клеток: возможный аналог NK-клеток.
Находятся в барьерных органах и слизистых оболочках. Могут элиминировать возбудителей туберкулеза и
оппортунистической инфекции.

Комплемент (С) — система сывороточных белков (более 20 компонентов), которые каскадно (цепочкой)
активируются при наличии в организме чужеродного антигена. Активация комплемента происходит по
классическому, альтернативному и лектинозависимому пути. При активации комплемента образуется
мембраноатакующий комплекс (МАК), формирующий трансмембранный канал в мембране клетки.
Образовавшиеся фрагменты комплемента являются опсонинами (СЗЬ, С4Ь), участвующими в фагоцитозе и
анафилатоксинами (напр., СЗа, С5а), принимающими участие в анафилактических реакциях.
Классический путь активации комплемента начинается с присоединения С1 к комплексу антиген—
антитело (к Fc-фрагменту антитела), последующим расщеплением С4, С2-компонентов комплемента и
образованием СЗ/С5-кон-вертаз (протеаз) классического пути.
Альтернативный путь активации комплемента происходит без участия антител, в результате активации
антигеном системы комплемента и факторов В, D, Р, Н с образованием СЗ/С5-конвертаз (протеаз)
альтернативного пути.
Лектиновый путь активации комплемента инициируется маннан-связывающим белком (МСБ) —
лектином крови, структурным аналогом Clq. МСБ связывается с маннозой поверхности микробной клетки
с последующим расщеплением С4-, С2-компонентов комплемента и образованием СЗ-конвертазы
классического пути (С4Ь2а).
Мембраноатаиующий комплекс. Активация комплемента заканчивается формированием
мембраноатакующего комплекса (МАК), состоящего из С5-, С6-, С7-, С8-, С9-компонентов комплемента,
которые внедряются в мембрану клетки и образуют канал диаметром 10 нм. В результате образования
многочисленных МАК-комплексов клетки разрушаются.
Белки острой фазы воспаления (С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин) появляются в крови
при тяжелых, системных воспалительных процессах. Они синтезируются в печени по сигналу цитокинов (TNF,
IL-1, IL-6). При острой инфекции их можно определить в течение первых двух дней (когда нет еще антител). В
этот ранний период СРП и МСЛ связывают и опсонизируют бактерии для фагоцитоза или активируют
комплемент.
Эндогенные пептиды – антибиотики – новое направление исследований в изучении факторов естественного
иммунитета. Пептиды-антибиотики состоят из 13-80 аминокислот, синтезируются эукариотическими клетками и
обладают способностью убивать бактерии. В настоящее время известно более 400 наименований пептидов-
антибиотиков. Они обнаружены в клетках растений, насекомых, лягушек, а также млекопитающих животных
(кроликов, свиней, коров) и человека.

Цель занятия
1. Изучить особенности и динамику развития инфекционного процесса, формы его проявления, пути
передачи.
2. Изучить патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы выявления и оценки.
3. Освоить основные методы экспериментального заражения бактериологического исследования трупов
животных.
60
4. Изучить виды и формы иммунитета.
5. Изучить неспецифические механизмы защиты организма. Фагоцитоз.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Определение понятия «инфекция».Общая характеристика инфекционного процесса.
2. Понятия: патогенность и вирулентность. Факторы патогенности.
3. Определение понятия «иммунитет». Общая характеристика иммунной системы и ее основные функции.
4. Неспецифические факторы защиты организма: клеточные (фагоцитоз, естественные киллеры),
гуморальные (система комплемента, интерфероны, лизоцим, белки острой фазы, противовирусные
ингибиторы и др.).

Уметь:
1. Дать оценку значимости инфекционного процесса.
2. Провести бактериологическое исследование трупа лабораторных животных.
3. Дать оценку значимости неспецифических факторов защиты организма.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ.
Для оценки доиммунных биологических механизмов резистентности к инфекции изучают:
1) содержание лизоцима, интерферона, комплемента, цитокинов в биологически активных средах (сыворотка,
слюна, ликвор, слезная жидкость и т.д.)
2) фагоцитарную реакцию клеток крови, лимфатических узлов, селезенки и др. лемфоидных органов.
Содержание лизоцима в слюне или сыворотке крови определяют методом титрования с использованием культуры
Micrococcus lysodeikticus. Лизис бактерий можно наблюдать по просветлению или измеряя
спектрофотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с
разведениями лизоцима.
Содержание комплемента сыворотки крови определяют методом титрования по 50% гемолизу. Метод основан на
комплементзависимом лизисе нагруженных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента
принимается такое количество комплемента, которое вызывает 50% гемолиз в стандартных условиях. Отдельные
компоненты системы комплемента определяют иммунохимическими методами при помощи моноклональных
сывороток.
Экспериментальное заражение животных и бактериологическое исследование трупов.
1. Студенты отрабатывают различные методы заражения лабораторных животных: накожный методы
(кролик, морская свинка), внутрикожный метод, подкожный, внутривенный (вена уха кролика,
ретроорбитальное пространство у мышей), внутрибрюшинный метод. Знакомятся с правилами фиксации
животных, осваивают правила асептики и антисептики.
2. Для обнаружения микроба, вызвавшего гибель животного, определения его локализации в организме
производят вскрытие трупа мышки, зараженной накануне В. anthracoides.
3. Мышь фиксируют брюшком вверх на дощечку булавками за 4 лапки.
4. Шерсть животного протирается ватой, смоченной дезраствором или спиртом.
5. Делают срединный разрез кожи, осматривают брюшину, лимфоузлы.
6. Вскрывают брюшную полость, макроскопически изучают органы брюшной полости,отмечая их внешние
изменения.
7. Готовят мазки-отпечатки из органов брюшной полости (селезенка, печень, почки) берут орган пинцетом,
срезают кусочек ножницами и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу.
8. Вскрывают грудную полость, осматривают органы грудной полости,
фиксируя их внешние изменения.
9. Готовят мазки-отпечатки из легочной ткани.
10. Стерильной пастеровской пипеткой после прижигания поверхности сердечной мышцы берут кровь из
сердца и делают посев на сахарный бульон и готовят мазок на стекле.
11. Мазки-отпечатки, приготовленные на стекле, высушивают, фиксируют в жидком фиксаторе и
окрашивают по Граму.
12. При микроскопии мазков необходимо обнаружить В. аthracoides и сделать заключение о форме
инфекционного процесса и вирулентности возбудителя. Данные вскрытия заносятся в протокол.
61

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток


Фагоцитоз с латексом.
1. Кровь из пальца 0,1 мл с гепарином помещаем в центрифужную пробирку и добавляем 0,1 мл латекса
(Латекс - 10% полистерольная опалесцерующая суспензия с размером частиц 1,5 мкм). Пробирку инкубируем в
термостате 37 С в течение 30 мин. Каждые 10 мин инкубации пробирку встряхиваем.
2. Центрифугирование 5 мин. Надосадочная жидкость отбирается пипеткой, а из осадка делаем мазок на
предметном стекле, высушиваем на воздухе, фиксируем этиловым спиртом и окрашиваем по Романовскому-
Гимзе.
3. Учет результатов: в иммерсионном микроскопе (увеличение 630) подсчитываем процент фагоцитирующих
клеток - фагоцитарный показатель (вычисляем количество фагоцитирующих клеток на 100 лейкоцитов).
Далее определяем среднее количество поглощенных частиц латекса на 1 клетку (фагоцитарное число -
фагоцитарный индекс).
У здоровых людей ФП - 40-80%, а ФЧ - 6-9 частиц на 1 фагоцит (при размере частиц латекса 1,5 мкм).

Фагоцитоз с культурой стафилококка.


Реактивы - пирогенал (стимулятор фагоцитоза), гепарин, суточная культура стафилококка, краситель
Романовского-Гимзе
Постановка опыта:
1. Кровь из пальца 0,2 мл помещаем в первую пробирку с гепарином и во вторую пробирку, куда добавляем 0,1
мл пирогенала для стимуляции фагоцитоза (стимулированный фагоцитоз - ФС). В каждую из пробирок добавляем
суточную культуру стафилококка в объеме 0,05 мл (стандарт мутности - 1 млрд).
2. Инкубируем пробирки в термостате 30 мин, центрифугируем, отбираем надосадочную жидкость.
3. Из осадка делаем мазок, высушиваем, фиксируем этиловым спиртом, окрашиваем по Романовскому-Гимзе.
4. Учет результатов при иммерсионной микроскопии (увеличение 630):
1 пробирка:
Спонтанный фагоцитоз - учет результатов через 30 мин. Определяется фагоцитарный показатель и
фагоцитарный индекс.
Завершенный фагоцитоз - учет результатов через 120 мин. Определяется фагоцитарный показатель и
фагоцитарный индекс.
Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) определяется как отношение фагоцитарного индекса 30 мин к
фагоцитарному индексу 120 мин (ИЗФ= ФИ 30 мин/ФИ 120 мин )
Если ИЗФ более 1, то это указывает на завершенный характер фагоцитоза.
Если ИЗФ менее 1, это указывает на незавершенный характер фагоцитоза.
2 пробирка:
Стимулированный фагоцитоз (в присутствии пирогенала). После инкубации и центрифугирования из
осадка готовим мазки, которые высушиваем, фиксируем и окрашиваем аналогичным способом. В мазках
подсчитываем фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза через 120
мин.
Стимуляция пирогеналом может привести к завершенности фагоцитоза. Эти данные необходимо
учитывать при коррекции иммунодефицитных состояний.

Изучение функционального состояния фагоцитов по кислородному метаболизму


( метод хемилюминесценценции )
1. Из периферической крови выделяем взвесь лейкоцитов (нейтрофилов).
2. Во флаконы для сцинтилляционного счета добавляем раствор Хенкса и люминол (люминол обладает
свойством окисляться под влиянием кислородных метаболитов и генерировать квант света (длина волны 425 nm).
3. Во флаконы вносим суспензию нейтрофилов, перемешиваем и помещаем в счетную камеру для регистрации
фонового показателя хемилюминесценции.
4. Через 45-60 мин во флаконы вносим суспензию зимозана или латекса и снова измеряем
хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Далее делаем пересчет
импульсов на 1 клетку и выражаем хемилюминесценцию условно в импульс/минута/клетка. Результат
хемилюминесценции оценивается по максимальному значению (пик А) на кинетической кривой.
62
Для постановки опыта нужен жидкостный сцинтилляционный -спектрометр
(хемилюминометр) и специальные стеклянные флаконы для сцинтилляционного счета.

ДЕМОНСТРАЦИЯ:
1. Гемолитическая активность стафилококков на кровяном агаре.
2. Лецитиназная активность стафилакокков на ЖСА.
3. Реакция плазмокоагуляции.
4. ДНК-азная активность микробов.
5. Реакция титрования лизоцима слюны с тест-микробом Micrococcus lysodeikticus.
6. Мазки гноя с незавершенным фагоцитозом (от больных острой гонореей).
7. Мазки из культуры Klebsiella pneumoniae с капсулой (окраска по Бурри-Гинсу)

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Освоение методов экспериментального заражения животных
2. Провести бактериологическое исследование мышей, погибших от экспериментальной
инфекции. Заполнить протокол вскрытия.
3. Приготовить мазки-отпечатки из органов мышей, окрасить их по Граму, промикроскопировать, обнаружить в
мазках-отпечатках возбудителя, сделать выводы.
4. Изучить по готовым демонстрациям факторы патогенности микробов.
5. Микроскопия готовых мазков с фагоцитозом латекса.
6. Микроскопия мазков гноя от больных с гонореей.
7. Определение титра лизоцима в слюне в реакции титрования.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Понятие "инфекция", "инфекционное заболевание". Условия возникновения. Формы проявления: местная,
генерализованная инфекция.
2. Что такое рецидив, реинфекция, суперинфекция?
3. Что такое смешанная инфекция, вторичная инфекция?
4. Что такое бактериемия, септицемия, септикопиемия, токсинемия?
5. Что такое бактерионосительство?
6. Понятие "патогенность" и "вирулентность". Единица измерения вирулентности, методы определения.
7. Периоды динамика инфекционного процесса.
8. Токсины микробов. Экзо- и эндотоксины, их природа, характеристика, отличия.
9. Факторы патогенности у микробов: инвазивность, ее материальная основа; адгезия. Защита от фагоцитоза.
10. Экспериментальная инфекция. Цели и задачи. Способы заражения животных.
11. Защитные механизмы и факторы естественной резистентности:
барьерные и бактерицидные свойства кожи, слизистых оболочек, значение
нормальной микрофлоры.
12. Лизоцим, комплемент, его свойства, роль в естественной резиД.-тентности.
13. Бактерицидность выворотки крови и факторы ее обеспечивающие:
В-лизины. система пропердина. нормальные антитела.
14. Фагоцитоз как клеточный неспецифический защитный фактор. Виды фагоцитов, стадии фагоцитоза.
Незавершенный фагоцитоз.
15. Постановка опыта фагоцитоза, определение активности и завершенности реакции. Опсоно-фагоцитарная
реакция.
16. Вскрытие и бактериологическое исследование трупа животного, погибшего от экспериментальной инфекции.
Для педиатрического факультета:
17. Реактивность новорожденных и детей первых месяцев жизни, отличие от реактивности взрослых.
18. Состояние факторов естественной резистентности у детей раннего возраста.

ЗАНЯТИЕ 12 (рубежный контроль по разделу « Физиология микроорганизмов»)


63
ЗАНЯТИЕ №13 (коллоквиум)

Темы:
 Система иммунитета организма человека. Антигены. Антитела.
 Специфические формы иммунного ответа.
План занятия:
1. Органы иммунной системы: центральные и периферические. Лимфоидные и
вспомогательные клетки: Т- и В-лимфоциты, субпопуляции Т- и В-лимфоциты,
макрофаги (А-клетки).
2. Специфические формы иммунного ответа: синтез антител, клеточный иммунитет, реакции
гиперчувствительности, иммунологическая память и толерантность.
3. Понятие о межклеточной кооперации в иммуногенезе. Медиаторы иммунного ответа (цитокины,
лимфокины, интерлейкины).
4. Антигены: полноценные, неполноценные (гаптены). Антигены бактерий и вирусов. Антигены групп
крови, аутоантигены, опухолевые, эмбриоспецифические, трансплантационные антигены человека.
5. Антитела (иммуноглобулины). Химическая структура, функция. Классы иммуноглобулинов. Неполные
антитела. Динамика и механизм образования антител.
6. Феноменология взаимодействия антигена с антителом. Практическое значение реакций антиген-антитело
в лабораторной аналитике.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Система иммунитета – это совокупность клеток, органов и тканей, осуществляющих реакции
приобретенного (адаптивного) иммунитета. Факторами клеточного иммунитета являются: В-лимфоциты, Т-
хелперы (Thl, Th2), цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры), иммунные фагоциты; гуморального - антитела
(иммуноглобулины).
Формы иммунного реагирования:
1. Антителообразование
2. Иммунный фагоцитоз
3. Киллерная функция лимфоцитов
4. Аллергические реакции (ГНТ, ГЗТ)
5. Иммунологическая память
6. Иммунологическая толерантность

Главный элемент системы иммунитета – лимфоциты – популяция клеток, морфологически относительно


однородны, но гетерологичны в функциональном отношении и по своим поверхностным маркерам. Они
способны отличать собственные структуры организма от генетически чужеродных и элиминировать последние,
включая для этого механизмы иммунного ответа. Все клетки крови, в том числе и лимфоциты, возникают из
единой гемопоэтической стволовой клетки, которая находится у эмбрионов в костном мозге и печени, а у
взрослых только в костном мозге. В процессе дифференцировки на мембранах системы иммунитета появляются
макромолекулы гликопротеинов (CD-антигены - cell differentiation antigens или cluster definition – антигены
кластеров дифференцировки клеток). Они специфичны для определенной стадии развития. В настоящее время
их известно более 200. CD-антигены, а также различные рецепторы на поверхности лимфоцитов используются в
качестве маркеров для их идентификации.
Развитие и созревание лимфоидной ткани у новорожденных происходит под влиянием микроорганизмов
нормальной микрофлоры, заселяющей слизистые оболочки. У экспериментальных животных - гнотобионтов,
выращенных в стерильных, безмикробных условиях, тимус и другие лимфоидные органы остаются
недоразвитыми.
Различают центральные и периферические органы иммунной системы, в которых развиваются,
созревают и дифференцируются клетки иммунной системы. Центральные органы иммунной системы —
костный мозг и тимус.
Кроветворный костный мозг — место рождения всех клеток иммунной системы и созревания В-
лимфоцитов. Тимус (вилочковая железа) отвечает за развитие Т-лимфоцитов. В тимусе отбираются Т-
лимфоциты (CD4 и CD8) и уничтожаются высокоавидные к собственным антигенам клетки. Гормоны
тимуса завершают функциональное созревание Т-лимфоцитов, повышают секрецию ими цитокинов.
64

Периферическими лимфоидными органами следует считать селезенку, лимфоузлы, миндалины, пейеровы


бляшки, циркулирующие лимфоциты крови, лимфоидная ткань, ассоциированная с кожей, со слизистыми
оболочками желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового трактов В центральных органах
начинается процесс созревания лимфоцитов (в основном без влияния антигенов), в периферических органах в
присутствии антегенов заканчивается дозревание лимфоцитов. Антигены проникают из просвета кишки в
пейеровы бляшки через эпителиальные клетки (М-клетки).
Существует два класса лимфоцитов: Т-лимфоциты, прошедшие дифференцировку в тимусе, и В-лимфоциты -
созревающие в костном мозге. Т-лимфоциты осуществляют реакции клеточного типа, обеспечивая защиту от
внутриклеточных и грибковых инфекций, внутриклеточных паразитов, опухолевых клеток и чужеродных
трансплантатов. В-лимфоциты осуществляют гуморальный иммунитет, вырабатывая антитела, направленные
чаще всего против внеклеточных бактерий, вирусов и чужеродных белков.
Помимо лимфоцитов, в иммунных реакциях участвуют и другие типы клеток, в частности, макрофаги,
дендритические клетки, выполняющие вспомогательные функции. Они захватывают попавший в организм
антиген, перерабатывают его, подготавливая таким образом для контакта с лимфоцитами.
Т-лимфоциты (тимусзависимые. лимфоциты) дифференцируются в тимусе. Т-лимфоциты имеют
антиген-распознающий рецептор — TcR (Т-клеточный рецептор). TcR распознает антигенный пептид, свя-
занный с МНС антиген-презентирующих клеток (АПК). В результате, при действии костимулирующих
факторов, клетки дифференцируются в Т-хелперы или цитотоксические Т-лимфоциты. Важными
корецепторными взаимодействиями между Т-лимфоцитом и антиген-презентирующей клеткой являются, так
называемые, Т-регуляторные (Т-рег.) клетки (CD28 — CD80 и CD154 (CD40L) — CD40).
Т-хелперы (Th — от helper— помощник) имеют Т-клеточный рецептор (TcR) и корецептор CD4, которые
участвуют в распознавании комплекса антигенный пептид + МНС II класса антиген-презентирующих
клеток. Нативные Т-хелперы под действием различных факторов дифференцируются на Thl и Th2: Thl-
лимфоциты отвечают за стимуляцию клеточного иммунитета; Тh2-лимфоциты — за стимуляцию
гуморального иммунитета.
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ или Т-киллеры) имеют Т-клеточный рецептор (TcR) и корецептор CD8,
которые участвуют в распознавании комплекса антигенный пептид + МНС I класса Активированные,
дифференцированные цитотоксические Т-лимфоциты вызывают гибель клеток-мишеней в результате контакта и
участия перфорина, гранзимов, Fas-рецепторов (CD95) и факторов некроза опухолей.
К реакциям клеточного типа относятся инфекционная аллергия, отторжение трансплантатов, реакция
«трансплантат против хозяина» (РТПХ).
В-лимфоциты дифференцируются в костном мозге (или в бурсе — фабрициевой сумке, находящейся в клоаке
птиц). Выполняют роль АПК и, после преобразований (в результате связывания антигена) В-лимфоциты
дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела.
В-лимфоциты получают антиген при его рецептор-опосредованном поглощении или от фолликулярных
дендритных клеток (FDC), несущих иммунные комплексы антиген-антитело. В-лимфоциты экспрессируют
следующие молекулы: 1) Антиген-распознающий В-клеточный рецептор (BcR), представленный главным
образом мембранными иммуноглобулинами — мономерами mlg M, mlg D; 2) Ко-рецепторный комплекс мемб-
ранных молекул [CD19/CR2 (CD21)/TAPA-1], связанных с системами внутриклеточного проведения сигналов; 3)
BcR-ассоциированные молекулы [Igoc (CD79a) и Ig(3 (CD79b)], необходимые для сигнальной трансдукции; 4) Ко-
стимулирующие молекулы (CD80, CD40 и др.) для дополнительных стимулов и переключения синтеза разных
изотипов антител; 5) Адгезивные молекулы (ICAM-3 и др.) для контакта клеток.

Иммунный ответ: гуморальный, клеточный


Иммунный ответ происходит в результате взаимодействия (кооперации) дендритных клеток, макрофагов, Т- и
В-лимфоцитов, цитокинов. Различают гуморальный и клеточный иммунный ответ.
Презентация антигена, кооперация иммунокомпетентных клеток
Презентация (presentation) - представление антигена Т-лимфоцитам осуществляется в результате
следующих процессов: поглощения антигена антиген-презентирующей клеткой (АПК); расщепления его
внутри клетки ферментами; связывания образующихся антигенных пептидов с молекулами МНС («загрузка»
антигенных пептидов в желобки собственных молекул МНС I, II класса); выхода их на поверхность клетки
для контакта с Т-лимфоцитами. Антиген распознают рецепторы В- и Т-лимфоцитов.
Профессиональными антигенпрезентирующими, (АПК) для лимфоцитов являются дендритные клетки,
В-лимфоциты и макрофаги. Роль АПК могут также выполнять эндотелиальные клетки, юные бласты,
кератиноциты и некоторые другие клетки, способные при активации экспрессировать МНС и цитокины.
65
Дендритные клетки (DC) (отростчатые, ветвистые клетки) - основные представители
антигенпрезентирующих клеток (АПК). Они активируют наивные Т-лимфоциты при первом контакте их с
антигеном.
Дендритные клетки костномозгового происхождения находятся в слизистых оболочках и коже (клетки
Лангерганса, или белые отростчатые эпидермоциты). Они более активны, чем макрофаги, в индукции имунного
ответа. Захватив и переработав антиген, DC перемещаются в регионарные лимфоидные образования,
тимуезависимые зоны (в виде интердигитальных клеток), где с помощью молекул МНС презентируют антиген Т-
лимфоцитам. В тимусе имеются интердигитальные медуллярные клетки, являющиеся антигенпрезентирующими
клетками.
Дендритные клетки некостномозгового происхождения — фолликулярные дендритные клетки (FDC —
Follicular Dendritic CeLL) находятся в первичных и вторичных фолликулах лимфоузлов, селезенки и
лимфоидной ткани слизистых оболочек. Они несут на поверхности иммунные комплексы антиген-антитело
(без поглощения) и презентируют антиген В-лимфоцитам с помощью антительного Fc-рецептора (FcyR) и
рецептора к комплементу (CR1, CR2), связанных с мембраной FDC. Фолликулярные дендритные клетки не
имеют молекул МНС II. Во вторичных В-клеточных фолликулах лимфоидной ткани обнаружены дендритные
клетки центров размножения. Они имеют молекулы МНС II, могут мигрировать и взаимодействовать с Т-
лимфоцитами.
Антиген-распознающие рецепторы В- и Т-лимфоцитов
Антигенраспознающий В-клеточный рецептор В-лимфоцитов (BcR — англ. B-cell Receptor) построен из
молекулы мембранного иммуноглобулина (mlg, состоящий из двух одинаковых тяжелых Н-цепей и двух
одинаковых легких L-цепей) и двух молекул CD79 (Iga, Igp). Мембранные иммуноглобулины представлены
мономерными mlgM и mlgD. BcR имеет трансмембранные и внутрицитоплазматические сегменты, пе-
редающие внутриклеточные сигналы.
Антигенраспознающий Т-клеточный рецептор Т-лимфоцитов (TcR — англ. T-cell Receptor) имеет две формы
— оф и у8, которые соединены в мембране клетки с молекулой CD3. Димеры ар и уб, так же как молекулы
иммуноглобулина, имеют V- и С-домены. TcR совместно с корецепторами CD8 или CD4 распознает комплекс
антиген-пептид + МНС первого (I) или второго (II) класса антиген-презентирующие клетки.
В иммунном ответе клетки взаимодействуют при межклеточном контакте мембранами и с помощью
цитокинов. Различают следующие молекулы межклеточной адгезии: селектины, муциноподобные адрессины
сосудов, интегрины, кадгерины, хоминговые рецепторы и молекулы из суперсемейства иммуноглобулинов.
Thl-хелперы CD4+ распознают на поверхности длительно инфицированных макрофагов микробные пептиды в
комплексе с МНСII класса. Происходит активация макрофагов и гибель внутриклеточных микробов.
Селектины — молекулы (рецепторы) поверхности лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов,
взаимодействующие с лигандами (муциноподобными молекулами адрессинов CD34, GlyCAM-1 и MAdCAM-1)
эндотелия сосудов. Участвуют в остановке клеток для их миграции через эндотелий сосудов.
Интегрины — молекулы поверхности Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, дендритных клеток,
нейтрофилов, взаимодействующие с молекулами клеточной адгезии, фрагментами комплемента или с
компонентами внеклеточного матрикса.
Суперсемейство иммуноглобулинов представлено молекулами, сходными (по доменам) с иммуноглобулинами:
молекулы МНС I и II классов, Т-клеточный рецептор, молекулы CD2, CD3, CD4, CD8, ICAM, VCAM, LFA-1 и
некоторые Fc-рецепторы.
Кадгерины — кальцийзависимые адгезивные молекулы.
Хоминговые рецепторы — молекулы, ответственные за попадание лимфоцитов в лимфоидную ткань.
Гуморальный иммунный ответ (антителообразование). Основой гуморального иммунного ответа является
активация В-лимфоцитов и их дифференцировка в антителообразующие плазматические клетки —
плазмациты (Р).
Иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов (BcR) распознает антиген и клетка поглощает его. После
процессинга (расщепления поглощенного антигена до низкомолекулярных пептидов и встраивания их в МНС II
класса) В-лимфоциты представляют образовавшийся комплекс Тп2-хелперам, которые взаимодействуют с ним
рецептором TcR и корецептором CD4. Тп2-хелперы экспрессируют СD40-лиганд (CD40L, или CD154). Последний
связывается с CD40 на В-лимфоците и клетки активируются комплексом CD40+CD40L. Происходит
пролиферация В-лимфоцитов. Под влиянием интерлейкинов (IL-4, 5, б, 10 и др.), образуемых Тh2-хелперами
происходит переключение иммуноглобулиновых генов В-лимфоцитов, которые синтезируют иммуноглобулины
различных классов. Указанная схема характерна для обычных лимфоцитов В-2 (CD5"). Другая популяция В-
лимфоцитов, обозначаемая В-1 (CD5+), находится в лимфоидных образованиях слизистых оболочек, кожи и
секретирует преимущественно IgM, участвуя в антибактериальном иммунитете.
66
Клеточный иммунный ответ. При клеточном иммунном ответе участвуют популяции Thl-хелперов
CD4+ и цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ (ЦТЛ).
Цитокины — белки главным образом активированных клеток иммунной системы, обеспечивающие
межклеточные взаимодействия. К цитокинам относятся интерфероны (ИФН), интерлейкины (ИЛ),
факторы некроза опухоли (ФНО), колониестимулирующие факторы (КСФ), факторы роста, хемокины.
Цитокины действуют по эстафетному принципу: воздействие цитокина на клетку вызывает образование ею
других цитокинов (цитокиновый каскад). Особенностями цитокинов являются:
1) высокая идентичность их биологического эффекта, например, для ИЛ -2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15,
ИЛ-18;
2) способность отдельных групп цитокинов взаимодействовать с одной и той же рецепторной
субъединицей, что характерно для новых интерлейкинов семейства ИЛ-10 (ИЛ-19 — ИЛ-25).
Интерлейкины (ИЛ) — цитокины, ответственные за межклеточные взаимодействия между лейкоцитами.
Описано свыше 25 интерлейкинов. Идентифицированы новые интерлейкины: ИЛ-19 — ИЛ-27.
ИЛ-1 продуцируется макрофагами и, в меньшей степени, — дендритными клетками, эндотелиоцитами,
фибробластами, NK, кератиноцитами, некоторыми клонами Th2. Он стимулирует продукцию Т-хелперами ИЛ-
2, способствует проявлению рецепторов к ИЛ-2 на Т-лимфоцитах, влияет на созревание В-лимфоцитов,
стимулирует образование молекул МНС и образование гепатоцитами белков острой фазы. Усиливает функции
нейтрофилов и NK. Оказывает провоспалительное и пирогенное действие, обеспечивает взаимосвязь иммунной,
нервной и эндокринной систем.
ИЛ-2 вырабатывается Т-лимфоцитами, главным образом Thl, а также цитотоксическими лимфоцитами
(CD8+) 1 порядка. Активирует дифференцировку Thl и Т-киллеров, стимулирует NK и синтез
иммуноглобулинов В-лимфоцитами.
ИЛ-3 продуцируется Т-лимфоцитами и стволовыми клетками. Является ростовым фактором стволовых и
ранних предшественников гемопоэтических клеток.
ИЛ-4 продуцируется Th2, В-лимфоцитами и тучными клетками. Стимулирует дифференцировку ThO BTh2 и
синтез иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Подавляет генерацию цитотоксических лимфоцитов, NK, а также
продукцию ИФН-у и противоопухолевую активность макрофагов.
ИЛ-5 синтезируется Th2. Способстует пролиферации и диф-ференцировке стимулированных В-лимфоцитов,
усиливает продукцию IgA, активирует эозинофилы.
ИЛ-6 вырабатывается макрофагами, Т- и В-лимфоцитами. Стимулирует пролиферацию тимоцитов, В-
лимфоцитов, активирует предшественников цитотоксических лимфоцитов, гранулоцитов и макрофагов.
Активирует образование гепатоцитами белков ост-рой фазы, оказывает провоспалительное действие, обеспечивает
взаимосвязь иммунной, нервной и эндокринной систем.
ИЛ-7 продуцируется стромальными клетками костного мозга и тимуса. Является ростовым фактором пре-
В- и пре-Т-лимфоцитов.
ИЛ-8 синтезируется моноцитами, макрофагами, фибробластами. Вызывает миграцию нейтрофилов и
базофилов в очаг воспаления и их дегрануляцию, выделение супероксидного радикала. Стимулирует
ангиогенез.
ИЛ-9 продуцируется главным образом Т-лимфоцитами. Стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов,
активирует тучные клетки, усиливает эффекты эритропоэтина.
ИЛ-10 синтезируется Th2, а также цитотоксическими Т-лимфоцитами второго порядка и макрофагами.
Стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, подавляет синтез ИЛ-2 и ИФН-у клетками
Thl, угнетает клеточный иммунный ответ, продукцию провоспалительных цитокинов.
ИЛ-11 продуцируется стромальными клетками костного мозга. Стимулирует деление и дифференцировку
предшественников гемопоэза, колониеобразование мегакариоцитов, увеличивает количество тромбоцитов и
эритроцитов в периферической крови. Угнетает продукцию провоспалительных цитокинов.
ИЛ-12 продуцируется моноцитами, макрофагами и, в меньшей степени, В-лимфоцитами и дендритными
клетками. Стимулирует рост и дифференцировку Th (ThO => Thl), Т-киллеров, NK. Индуцирует продукцию ИФН-
у Т-лимфоцитами и NK, угнетает апоптоз Thl, синтез IgE. Вместе с ИЛ-4 регулирует баланс Thl и Th2.
ИЛ-13 синтезируется Th2 и тучными клетками. Стимулирует рост и дифференцировку В-лимфоцитов,
подавляет функцию моноцитов/макрофагов, в частности секрецию провоспалительных цитокинов.
ИЛ-14 продуцируется в основном Т-лимфоцитами. Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов и подавляет
продукцию иммуноглобулинов.
ИЛ-15 вырабатывается моноцитами, эпителиоцитами и гладкомышечными клетками. По действию на Т -
лимфоциты ИЛ-15 сходен с ИЛ-2, что объясняется способностью специфически связываться с ИЛ-2-
рецепторами. Активирует NK и В-лимфоциты.
67
ИЛ-16 синтезируется эозинофилами и CD8+ Т- лимфоцитами. Активирует хемотаксис CD4+ Т-
лимфоцитов.
ИЛ-17 продуцируется активированными CD4+ Т-лимфоцитами, а также NK. Основными клетками-
мишенями цитокина являются эпителиоциты, эндотелиоциты и фибробласты. Он усиливает выработку ИЛ-б,
ИЛ-8, гранулоцитарного КСФ, про-стагландина Е2, увеличивает экспрессию ICAM-1, стимулирует активность
фибробластов.
ИЛ-18 образуется активированными макрофагами, а также гепатоцитами. Стимулирует синтез Т-
лимфоцитами ИФН-у, макрофагами — ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО. Кроме того, он активирует NK.
Факторы некроза опухоли (ФНО). Различают: собственно фактор некроза опухоли, или ФНО-а;
лимфотоксины, или ФНО-р. ФНО-а продуцируется макрофагами, а также тучными клетками и лимфоцитами.
Он обусловливает развитие токсического шока и кахексии (старое название - кахектин), индуцирует
острофазные белки и стимулирует ангиогенез. Может индуцировать апоптоз. Способен вызывать
геморрагический некроз ряда опухолей. ФНО-р продуцируется Т- и В-лимфоцитами, обладает аналогичным
действием.
Интерфероны (ИФН) — гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие
стимулы. Блокируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной
системы. Различают две серологические группы интерферонов: I тип — ИФН-ά и ИФН -ß; II тип — ИФН-γ.
Интерфероны I типа оказывают противовирусные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферон II
типа регулирует специфический иммунный ответ и неспецифическую резистентность.
В норме ИФН-ά продуцируется мононуклеарными фагоцитами (отсюда одно из названий —
«лейкоцитарный ИФН»), а ИФН-ß — фибробластами («фибробластный ИФН»). Под воздействием микроба они
секретируются многими клетками. Усиливают продукцию ИФН пирогенное действие ИЛ-1 и понижение рН в
межклеточной жидкости на фоне повышения температуры. Защитное действие ИФН I типа реализуется
посредством ингибирования репликации РНК или ДНК под воздействием олигоаденилат-синтетазы, которую
продуцируют интерферон-содержащие клетки. ИФН I типа, связываясь со здоровыми клетками, защищает
их от вирусов. Антивирусное действие ИФН I типа может обуславливаться и тем, что он способен угнетать
клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокислот, например триптофана. Этот механизм, а также
способность индуцировать программированную клеточную гибель некоторых опухолей лежат в основе
противоопухолевого действия ИФН I типа. Кроме того, ИФН I типа усиливает литическое действие NK на
клетки-мишени, в т. ч. трансформированные клетки, индуцирует экспрессию антигенов МНС I и, наоборот,
подавляет формирование тех же антигенов МНС II.
ИФН-γ («иммунный ИФН») продуцируется Т-лимфоцита-ми и NK. Стимулирует активность Т- и В-
лимфоцитов, моноцитов/макрофагов и нейтрофилов. Усиливает экспрессию молекул МНС I, МНС II.
Стимулирует дифференцировку ThO в Тh 1. Иммунный ИФН вместе со своим антагонистом ИЛ-4 поддер-
живает баланс Thl/Th2. Помимо этого, ИФН-γ регулирует апоптоз целого ряда нормальных, а также
некоторых инфицированных и трансформированных клеток. Так, он индуцирует апоптоз активированных
макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз
периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов.
Колониестимулирующие факторы (КСФ) — цитокины, регулирующие деление, дифференцировку
костномозговых стволовых клеток и редшественников клеток крови. Кроме того, они могут стимулировать
дифференцировку и функциональную активность некоторых клеток вне костного мозга.
Трансформирующий фактор роста (ТФР-р) — полифункциональный ростовой фактор, к которому
относятся также факторы роста фибробластов, тромбоцитов, эндотелия, ин-сулиноподобный фактор роста,
эпидермальный ростовой фактор и др. ТФР-р продуцируется многими клетками (основные продуценты —
макрофаги), в т.ч. некоторыми опухолевыми клетками. ТФР-Р — мощный деактивирующий фактор для мо-
ноцитов/макрофагов, существенно снижающий их цитотоксическую и цитокин-продуцирующую активность, а
также экспрессию на их поверхности молекул МНС. В этом отношении он действует синергично с другими
макрофаг-деактивирующими цитокинами (ИЛ-4, -10 и -13). ТФР-р относят к преимущественно
противовоспалительным цитокинам, благодаря его способности снижать продукцию нитросоединений,
реакционно-способных радикалов и провоспалительных цитокинов клетками моноцитарно-макрофагального
ряда. Однако в ряде случаев он способен оказывать и провоспалительные эффекты.
Регулирует процессы программированной клеточной гибели нормальных и трансформированных клеток. ТФР-р
угнетает апоптоз Thl, а вместе с ИЛ-2 ингибирует апоптоз Th2. Вероятно, ТФР-р, угнетая апоптоз клеток
иммунной системы, играет важную роль в генерации клеток памяти. Избыточная активность этого и некоторых
других ростовых факторов может приводить к гиперпролиферативным процессам, таким как гломе-рулонефрит,
68
склерозирование кожи, цирроз печени и др., а также к прогрессирующему опухолевому росту. ТФР-р — один
из медиаторов, обуславливающих иммуносупрессию при неопластических заболеваниях.
Хемокины — низкомолекулярные цитокины (около 40 -MIP, МСР, RANTES, ИЛ-8 и др.), ответственные за
хемотаксис клеток (привлекают в очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты). Регулируют подвижность
лейкоцитов.
В процессе первичного ответа эффекторов клеточного и гуморального ответа образуются также Т- и В-
лимфоциты памяти, которые при повторной встрече с этим же антигеном более быстро и эффективно, также
превращаясь в эффекторные к лимфоциты, реализуют вторичный иммунный ответ. На практике принцип
повторной или неоднократной иммунизации (гипериммунизации) позволяет получать высокие титры антител в
сывороточных иммунных препаратах или высокий защитный эффект при вакцинации.

Формы иммунного реагирования


Иногда при повторном введении антигенов могут развиться вторичные иммунные реакции
повышенной интенсивности, сопровождающиеся повреждением тканей. Такое явление получило название
аллергии. Развитие гиперчувствительности имеют иммунную природу и характеризуются необычной
реактивностью клеток на антиген. В 1975 г. Гелл и Кумбс предложили классификацию ракций
гиперчувствительности, которая состоит из четырех типов. Первые три осуществляются с помощью антител,
четвертый опосредуется Т-лимфоцитами.
К первому типу относится гиперчувствительность немедленного типа, при котором комплекс
антиген-антило (иммуноглобулин класса Е) связывается посредством Fc-рецепторов с мембраной тучных
клеток или базофилов (специфическая фаза) и приводит к секреции и выбросу медиаторов: гистамина,
ацетилхолина, хемотактических факторов, простагландинов, лейкотриенов (фармакологическая фаза). В
результате их действия происходит увеличение дилятации капилляров и усиление их проницаемости. Плазма
крови из сосудистого русла попадает в ткани, что приводит к отеку. Вместе с тем развивается спазм гладкой
москулатуры бронхов, мочевого пузыря, матки. Реакция развивается через быстро (около 30 минут), что и
отражается в названии реакций. В зависимости от локализации органа, в котором происходит реакция, исход
ее различен. При легочной локализации в отсутствии своевременного лечения возможен летальный исход
(анафилаксия при введении гетерологичных сывороточных препаратов, пенициллина). Чаще встречаются
локальные анафилактические реакции (атопии): сенная лихорадка, аллергическая астма, крапивница, пищевая
аллергия.
Второй тип гиперчувствительности опосредуется антителами IgM и IgG, направленными против
антигенов собственных клеток. Цитолитический эффект осуществляется путем фиксации комплемента с
указанными выше иммуноглобулинами с образованием либо комплекса литической атаки, либо опсонизации
клетки IgG и C3 для поглощения ее макрофагами или нейтрофилами, либо антитело-зависимой
цитотоксичности К-клетками. Эти механизмы могут быть основными при резус-несовместимости,
аутоиммунной гемолитической анемии, лекарственной гемолитияечской анемии, агранулоцитозе, при
переливании несовместимой крови.
Третий тип гиперчувствительности опосредуется иммунными комплексами, котрые представляют
собой комплексы IgG и IgG с антигенами. Иммунные комплексы могут сохраняться в тканях или
циркулировать в крови. В норме иммунные комплексы поглощаются макрофагами или они лизируются
комплементом. Активация комплемента приводит к повреждению тканей. Образовавшиеся в процессе
активации комплемента его активные фракции (С3 и С5) могут участвовать в выбросе гистамина из
базофилов, что приводит к расширению капилляров, поступлению плазмы в ткани, аггрегации тромбоцитов
сосудов и последующему некрозу тканей.
Клеточно-опосредованная реакция, лежащая в основе гиперчувствительности четвертого типа,
развивается не ранее, чем через 24-48 часов после внедрения антигена и поэтому имеет название
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Суть этой реакции состоит во взаимодействии Т-
лимфоцитов (эффекторов ГЗТ), которые были предварительно сенсибилизированы антигеном, с тем же
антигеном. В результате происходит активация Т-лимфоцитов и секреция ими лимфокинов. Последние в
свою очередь локально увеличивают проницаемость сосудов и способствую инфильтрации тканей
лейкоцитами в месте проникновения антигена. Моноциты, макрофаги и гранулоциты, активированные
лимфокинами, освобождают в окружающие ткани ферменты, медиаторы, повреждая тем самым окружающие
ткани. В этих же условиях могут активироваться также Т-киллеры, которые связываются с антигенами на
поверхности клеток-мишеней и, выделяя цитокин (белок перфорин), разрушаю их. Примером
гиперчувствительности замедленного типа может служить инфекционная аллергия при туберкулезе,
туляремии, бруцеллезе и др. инфекциях (в том числе, кожные реакции с соответствующими бактериальными
69
аллергенами), контактная чувствительность (контактные дерматиты на косметические и туалетные
средства, лекарственные препараты , химические вещества и т.д.).
В некоторых случаях иммунная система реагирует на антигены особой реакцией, обратной иммунному
ответу специфической неотвечаемостью (иммунологическая толерантность). Такое состояние в ряде
случаев возникает в результате элиминации специфического клона, в других – в результате гиперфункции
супрессорных клеток, в третьих - защиты соответствующих мишеней (иногда это опухолевые клетки) с
помощью блокирующих антител. В тех случаях, когда ткани сформировались после созревания системы
иммунитета, иммунологическая инертность может быть обусловлена наличием тканевого барьера
(гематоэнцефалитического, гематоофтальмического и т.д.). Изменение такого рода взаимоотношений
(нарушение тканевого барьера, изменение антигенности тканей под воздействием различных факторов,
появление в лимфоидной ткани чужеродных клонов лимфоцитов) может приводить к восстановлению или
возникновению иммунологической реактивности, а вместе с тем - к развитию аутоиммунного процесса. В
то же время усиление иммунологической реактивности к опухолевым антигенам в аналогичных условиях,
сопровождающееся исчезновением блокирующих антител и появлением цитотоксических лимфоцитов или
снижением функции супрессоров может привести к уничтожению злокачественных клеток.
Дифференцировка и взаимодействие клеток системы иммунитета, а также с клетками других систем
организма, осуществляется в результате прямого контакта посредством большой группы рецепторов,
получивших название адгезинов, а также с помощью регуляторных молекул – цитокинов. Цитокины,
выделяемые преимущественно клетками системы иммунитета, получили название интерлейкинов (ИЛ). На
лейкоцитах для них также имеются соответствующие рецепторы.

Антиген — генетически чужеродное вещество (белок, полисахарид, липополисахарид, нуклеопротеин) с


характерными химическими группировками, которое может вызывать в организме антителообразование и
другие формы иммунного ответа, а также взаимодействовать с антителами и антигенраспознающими
клетками.

Антиген содержит несколько различных или повторяющихся эпитопов. Эпитоп (антигенная детерминанта)
— отличительная часть молекулы антигена, обусловливающая специфичность антител и эффекторных Т-
лимфоцитов при иммунном ответе. Эпитоп комплементарен активному центру антител или Т-клеточному
рецептору. Антигены, вызывающие аллергию, называются аллергенами, а иммунологическую толерантность
— толерогенами.
Антигены (полноценные) – это вещества (белки), которые при парентеральном введении в организм
вызывают иммунную реакцию, а также взаимодействуют с продуктами этой реакции – антителами или
активированными лимфоцитами.
Антигены бактерий: 0-антиген (липополисахарид клеточной стенки), Н-антиген (белок жгутика) и
капсульный К-антиген, в частности Vi-антиген.
Гаптен — неполноценный антиген в виде небольшой химической группы. Самостоятельно гаптен не
вызывает иммунный ответ, но может взаимодействовать с антителами или сенсибилизированными
лимфоцитами. Гаптен вызывает иммунный ответ только после соединения с белком (комплекс белок-
гаптен) или с другим полимером-носителем.
Антигены тканей, которые при трансплантации индуцируют развитие иммунологических реакций,
приводящих к отторжению трансплантата, называют трансплантационными или антигенами
гистосовместимости.
Антигены главного комплекса гистосовместимости (МНС — Major histocompatibility complex).
МНС у человека называются HLA (англ. Human leukocyte antigens). Антигены МНС I класса имеют все
ядросодержащие клетки, а МНС II класса — только антигенпрезентирующие клетки Антигены МНС I и II
классов участвуют в презентации (представлении) клетками антигенного пептида Т-лимфоцитам: продукты
МНС I класса представляют антигенный пептид CD8+ Т-лимфоцитам, а МНС II класса — CD4+ Т-
лимфоцитам.
Некоторые микроорганизмы могут иметь в своем составе антигены, входящие в состав антигенов человека и
животных. Это может обусловить с одной стороны . ослабление эффективности системы иммунитета, с другой -
развитие перекрестных реакций, приводящих к повреждению тканей хозяина, содержащих эти антигены.
Аутоантигены – антигены, против которых развивается аутоиммунный ответ. В качестве аутоантигенов могут
быть антигены (нормальные) забарьерных органов (хрусталик, нервная ткань), а также антигены,
модифицированные физическими, химическими или микробными агентами.
70
Суперантигены — антигены микробов, взаимодействующие с МНС II класса антиген-
презентирующих клеток (АПК) и Т-клеточным рецептором (TcR) Т-лимфоцитов, вне антигенсвязывающей
щели, т.е. не в активных центрах. Суперантигены присоединяются как бы сбоку молекул МНС II и TcR. Они
блокируют возможный специфичный иммунный ответ и вызывают поликлональную активацию лимфоцитов,
выброс цитокинов и, затем, гибель Т-лимфоцитов с явлениями иммунодефицита. Суперантигенами являются:
энтеротоксины стафилококков; токсин синдрома токсического шока; суперантигены стрептококков, вируса
Эпстайна—Барр и др.
Антитела - иммуноглобулины классов G, M ,A, D и Е, продуцируемые В- лимфоцитами (плазматическими
клетками); состоят из мономеров, димеров, тримеров или пентамеров.
Антитела – это гамма-глобулины, способные специфически соединяться с антигеном, под
воздействием которого они образовались. Кроме того, антитела могут лизировать клетки, оказывать
опсонизирующее действие, активировать систему комплемента, реализовывать аллергические реакции
немедленного типа.
Мономеры иммуноглобулинов состоят из двух тяжелых (Н-цепи) и двух легких (L-цепи)
полипептидных цепей, связанных дисульфидной связью Эти цепи имеют константные (С) и вариабельные
(V) участки. По типу тяжелой цепи различают 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, {gA, IgD, IgE. Папапин
расщепляет молекулу иммуноглобулина на два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента— Fab (Fragment
antigen binding) и Fc (Fragment сristallizable).
Антиген-связывающий участок (активный центр антител) Fab-фрагмента иммуноглобулина, образован
гипервариабельными участками Н- и L-цепей; он связывает эпитопы антигена. В активном центре имеются
специфичные комплементарные участки к определенным антигенным эпитопам. Fc-фрагмент связывает
комплемент (при образовании комплекса антиген-антитело), взаимодействует с мембранами клеток и
участвует в переносе IgG через плаценту.
Мономеры иммуноглобулинов имеют два активных центра, что позволяет им взаимодействовать
одновременно с двумя антигенными детерминантами (полные антитела). Неполное антитело имеет лишь один
активный цент.
При первичном иммунном ответе вырабатываются тяжелые иммуноглобулины (IgM), при вторичном –
легкие (IgG). При дисфункции иммунного ответа, что может зависеть от конституционных особенностей
индивидуума и/или особенностей антигена (аллергена), продуцируется повышенное количество
иммуноглобулинов класса Е, способствующих возникновению аллергических реакций немедленного (первого)
типа .
Кроме мономерной структуры IgA, присутствующих в сыворотке крови, вырабатываются секреторные
sIgA, которые находятся на слизистой оболочке, в слюне, слезах, молозиве и грудном мол оке. Блокируя
вирусы и бактерии. Димер имеет секреторный компонент, защищающий антитело от разрушения
ферментами.

Свойства антител
Антитела, например IgG, вместе с другими опсонинами усиливают фагоцитоз, могут участвовать в
активации комплемента (IgM, IgG), входят в состав рецепторов В-лимфоцитов (IgM, IgD), участвуют в
реакциях антиген-антитело. Они отличаются по аффинности и авидности.
Антигенные свойства антител
Изотип антител (класс, подкласс иммуноглобулинов — IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD,
IgE) определяется С-доменами тяжелых цепей; выявляется с помощью антисыворотки против Fc-
фрагментов тяжелых цепей в реакции радиальной иммунодиффузии (см. Реакция преципитации) и др.
Идиотип антител определяется антигенсвязывающими центрами Fab-фрагментов антител, т. е.
антигенными свойствами вариабельных участков (V-областей). Идиотип состоит из набора идиотопов —
антигенных детерминант V-области антитела
Аффинность (аффинитет) антител — сродство антител к антигенам.
Авидность антител — прочность связи антитела с антигеном и количество связанного антигена
антителами.
Моноклональные антитела. Моноклональные антитела являются однородными и высокоспецифичными.
Их продуцирует гибридома — популяция гибридной клетки, полученной слиянием антителообразующей
клетки определенной специфичности с «бессмертной» опухолевой клеткой миеломы.
Процессы, лежащие в основе механизма образования антител, а также взаимодействия с антителом in vivo и
in vitro характеризуются высокой специфичностью. Это предопределило их широкое применение для
диагностики инфекционных заболеваний, для определения групп крови, видовой специфичности белка, подбора
71

донора при трансплантации тканей и т.д. Для выявления специфических антител или идентификации антигена
применяют следующие реакции антиген-антитело:

Цель занятия:
1. Изучить развитие, становление, анатомию, клеточный состав и функционирование системы
иммунитета.
2. Изучить специфические формы иммунного ответа: клеточный и гуморальный ответы,
иммунологическая память, иммунологическая толерантность.
3. Иметь представление о роли гиперчувствительности и аутоиммунных реакций в возникновении
иммунопатологических нарушений.
4. Выработать четкое преставление об антигенах и антителах, их роли в иммунном ответе.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Иммунная система организма человека и ее функции. Клетки иммунной системы: Т- и В-лимфоциты,
макрофаги (А-клетки). Субпопуляции Т- и В-клеток. Клеточные маркеры. Клеточная кооперация.
Цитокины.
2. Формы иммунного ответа: клеточный и гуморальный иммунный ответ, иммунологическая
толерантность, иммунологическая память.
3. Иммунопатология. Гиперчувствительность. Аллергия немедленного и замедленного типа.
Аутоиммунитет.
4. Антигены, их свойства, классификация.
5. Антитела, их свойства, механизм образования, первичный и вторичный иммунный ответ Биологическая
роль различных классов иммуноглобулинов в противоинфекционной защите организма, в
возникновении аллергии немедленного типа.

Уметь:
1. Обосновать практические мероприятия, предпринимаемые при иммунологической диагностике,
специфической профилактике и специфической терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний.

ОСНАЩЕНИЕ ЗАНЯТИЯ
Таблицы и схемы по иммунологии

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что такое система иммунитета, каково ее значение? Какие органы относят к центральным и
периферическим?
2. Назовите основные классы и субклассы клеток иммунной системы. Каковы их основные функции и
маркеры?
3. Назовите основные проявления клеточного и гуморального иммунитета.
4. Что такое иммунологическая память и иммунологическая толерантность? Какова их роль?
5. Что такое цитокины, какова их роль в иммунной системе?
6. Каков механизм межклеточной кооперации в реализации первичного иммунного ответа? Какие клетки
при этом участвуют?
7. Что лежит в основе возникновения иммунопатологических реакций? Какова их роль в возникновении
заболеваний?
8. Что такое гиперчувствительность немедленного и замедленного типов, каков механизм из развития?
9. Что такое аутоиммунитет, какова его роль в возникновении заболеваний?
10. Что такое антигены: (полноценные, неполноценные)?
11. Каково антигенное строение бактерий и вирусных частиц? Каково их практическое значение?
12. Что такое трансплантационные антигены?
13. Что такое аутоантигеы? В каких случаях они могут появляться и проявлять себя?
14. Что такое антитела (иммуноглобулины)? Какие бывают классы и виды антител?
15. Каково химическое строение антител. Где они образуются?
16. Что такое неполные антитела, как их обнаружить?
17. Что такое первичный и вторичный иммунный ответ, каковы их отличия?
72

18. Каковы принципиальные основы серодиагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний?


19. Какие методические приемы используются для выявления специфичности антигенов и антител?

ЗАНЯТИЕ №14.

Темы:
 Методы выявления и идентификации специфических антигенов
и специфических антител.
 Реакции агглютинации, преципитации, их варианты.
 Иммунофлюоресцентный метод.
 Реакция нейтрализации.

План занятия.
1. Реакция агглютинации: механизм, роль ингредиентов, варианты, методы постановки,
практическое значение.
2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакция обратной непрямой
гемагглютинации ( РОНГА).
3. Метод выявления неполных антител (реакция Кумбса).
4. Реакция преципитации: механизм, ингредиенты, варианты постановки, разновидности
(кольцепреципитация, преципитация в агаре, иммуноэлектрофорез, р. флокуляции). Практическое применение.
5. Иммунофлюоресцентный метод Кунса, прямой и непрямой варианты. Практическое использование.
6. Реакция нейтрализации токсина антитоксином.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и


здоровых людей. В основе их лежат реакции специфического взаимодействия антигена с антителом. Поскольку
антигены идентифицируют с применением антител иммунных сывороток, эти методы получили название
серологических (от лат. «serum» - сыворотка).
Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз
болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных
биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов,
рецепторов клеток и др.
При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных
свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т.е. сывороток крови гипериммунизированных
животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация
микроорганизмов.
Для определения антител или антигенов применяют следующие реакции антиген—антитело:
1. реакция агглютинации;
2. реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации;
3. реакция коагглютинации;
4. реакция Кумбса;
5. реакция торможения гемагглютинации;
6. реакция преципитации;
7. реакция нейтрализации;
8. реакция связывания комплемента;
9. реакция радиального гемолиза;
10. реакция иммунного прилипания;
11. реакция иммунофлюоресценции;
12. иммуноферментный анализ;
13. радиоиммунный метод, или анализ;
14. иммуноблотинг;
15. иммунная электронная микроскопия.
73
В зависимости от диагностической чувствительности все эти реакции можно условно
разделить на три уровня. К первому уровню (наименьшему) относятся реакции прямой агглютинации,
преципитации, РСК. Ко второму – реакции непрямой агглютинации, нейтрализации токсина,
иммунофлюоресценции. К третьему – ИФА, иммуноблотинг (разновидность ИФА) и РИА. В последние годы
разработаны и постоянно совершенствуются еще более чувствительные методы, индикации специфического
взаимодействия антиген-антитело с помощью лазерного луча и компъютерного анализа, основанные на
изменении в этих условиях поляризационных свойств среды (метод биочипов).
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий,
эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.
Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул, «скле енных»
антителами. В качестве антигена (корпускулярного!) в этой реакции выступают: бактериальные клетки, клетки
крови, индифферентные нерастворимые частицы или клетки с адсорбированными на них антигенами. Реакцию
агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в
сыворотке крови больного; определения групп крови.
1. Определение возбудителя, выделенного от больного. Ориентировочная реакция агглютинации на
стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь
бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.
Поскольку родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической
агглютинирующей сывороткой, это затрудняет их идентификацию. Поэтому из агглютинирующих сывороток
удаляют групповые антитела путем адсорбции их родственными бактериями (р.Кастеллани). В таких сыворотках
сохраняются антитела, специфичные только для одного вида микроорганизмов. Полученные таким способом
сыворотки называют монорецепторными адсорбированными диагностическими сыворотоками.

2. Определение антител в сыворотке крови больного Развернутая реакция агглютинации с сывороткой


крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген)
происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
— Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-
антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Реакция ставится с разными разведениями исследуемой сыворотки для определения титра антител. Нарастание
титра специфических антител в сыворотке больного говорит об инфекционном заболевании. Это реакции
титрования иммунной сыворотки, р. Видаля для диагностики брюшного тифа, р. Райта для диагностики
бруцеллеза и др.
Реакция агглютинации для определения групп крови. Реакцию агглютинации для определения групп крови
применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами
иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, не
содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп
А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации. В РНГА выявляют антитела сыворотки крови больного с
помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с
адсорбированными на них антигенами.
Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с
соответствующими антителами сыворотки крови , что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно
пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде
«пуговки».
РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к
которым добавляют эритроцитарный диагностикум.
Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум — эритроциты, на которых
адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему
эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной
непрямой гемагглютинации — РОНГА).
Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антительного
диагностикума — антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка
74
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии,
обработанные иммунной диагностической сывороткой, неспецифически адсорбируют антитела сыворотки.
Антитела диагностикума взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами,
выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков,
антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Реакция торможения гемагглютинации. Гемагглютинины некоторых вирусов (миксовирусы) склеивают
эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов,
что необходимо для последующей постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Она основана
на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате
чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих
вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут
агглютинировать эритроциты различных животных.
Реакция коагглютинации. В реакции использовано свойство стафилококков, содержащих протеин А,
неспецифически адсорбировать антимикробные антитела. При добавлении к таким диагностическим препаратам
неизвестного микроорганизма может произойти коагглютинация, если адсорбированные антитела специфичны
для данного микроорганизма.

Непрямые (пассивные) реакции агглютинации.


Эти реакции называются непрямыми (пассивными) т.к. при их проведении используют антигены (или
антитела), искусственно адсорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц.
Реакция непрямой (пассивной) агглютинации основана на способности клеток (эритроцитов) или
некоторых химических частиц (латекс) адсорбировать на своей поверхности антигены и гаптены бактерий,
антигены вирусов, риккетсий. При этом
носитель приобретает новую антигенную специфичность и вступает во взаимодействие с имунными
сыворотками, специфичными для адсорбированного антигена.
Можно адсорбировать на сенсибилизированных эритроцитах не только антигены, но и специфические
антитела. Такие препараты называют антительными эритроцитарными диагностикумами. Постановка
реакции агглютинации с таким диагностикумом называется обратной РНГА (или РОНГА).
Антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы широко используются для постановки
непрямой реакции гемагглютинации.
РНГА обычно ставят на плексигласовых планшетках с лунками. Исследуемую сыворотку предварительно
инактивируют при 56˚С в течение 30 минут для разрушения комплемента и разводят от 1:10 до 1:12 000 и более,
разливают в лунки до 0,5 мл и добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в
течение двух часов в термостате и считают положительной, если осадок эритроцитов имеет форму "зонтика" с
зубчатыми краями и покрывает почти все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в
центре дна лунки в виде компактного диска с ровными краями (см. демонстрацию).
Непрямые варианты реакции агглютинации делают ее более чувствительным методом и расширяют
возможности ее применения. Реакции этого типа широко применяются для диагностики инфекционных
заболеваний (выявление специфических антител в сыворотке больного при брюшном тифе, туляремии, гриппе,
риккетсиозах, хламидиозах), а также для определения гонадотропного гормона в моче при установлении
беременности, для выявления лекарственной аллергии, определения поствакцинального иммунитета при
дифтерии и т.д.
Реакция Кумбса - реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция
Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными,
одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вы-
зывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для
этого к резус-положительным эритроцитам с сорбированными на них неполными антителами добавляют
антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека получены путем иммунизации
кролика человеческим гамма-глобулином). В случае положительного результата наблюдается феномен
склеивания эритроцитов. Следовательно, р. Кумбса является разновидностью непрямой реакцией
гемагглютинации.
С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым
лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: Эритроциты резус-положительного
плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли
75
через плаценту от резус-отрицательной матери. Можно также выявлять неполные антитела против антигенных
микробов (например, при бруцеллезе)
Реакция преципитации (РП) - осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) -
специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса
антиген-антитело в виде осадка наблюдается, если эти ингредиенты находятся в эквивалентных количествах.
Антиген в р. преципитации должен быть прозрачным.
Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и
др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или
агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Р. преципитации ставят с целью выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей


антитела.
Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные
методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный
антиген может быть получен путем его экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического
материала или из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы,
туляремии). В судебно-медицинской практике с помощью р. преципитации определяют видовую специфичность
белка (крови, спермы), в санитарной практике - выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической
иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке крови. Таким образом, знание этой реакции необходимо
для врачей многих специальностей.
При постановке РП разводят не сыворотку, а антиген. За титр преципитирущей сыворотки принимают то
наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает
образование видимого преципитата.

Р. кольцепреципитации - на слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый антиген и


через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Широкое распространение получила
реакция термопреципитации (р.Асколи) на антиген возбудителя сибирской язвы, использующая антигены,
экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья.

Р. микропреципитации применяют для выявления низких титров антител. При ее постановке в исследуемую
сыворотку крови вносят антиген в убывающей концентрации; при отсутствии антител разведение сыворотки
крови антиген уменьшает ее оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств антител
образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды (учет результатов осуществляется
нефелометрическим методом).
Р. флокуляции – это РП в системах токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Проявляется появлением
хлопьевидного осадка. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксических сывороток
или анатоксина.

РП в геле (иммунодиффузия) в различных модификациях: простая иммунодиффузия (по Уанье),


встречная иммунодиффузия (по Оухтерлони), радиальная иммунодиффузия (по Манчини).
Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесенного сверху в лунки и ли пробирки с агаром,
диффундировать в гель. При постановке реакций двойной (встречной) диффузии Аг и Ат вносят в отдельные
лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах.
Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у
возбудителя дифтерии.

Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с элетрофорезом. Для этого слой агара наносят на
предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую их канавку. В лунки
вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные Аг с разной скоростью перемещаются
между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и, в случае
положительного результата, в геле образуются зоны преципитации.

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении антигенов со специфическими антителами, меченными


флюорохромными красителями, благодаря чему с помощью люминесцентного микроскопа эти антигены
(связанные с антителами) выявляются в виде светящихся изображений на несветящемся фоне препарата.
76
Основная сложность метода заключается в изготовлении люминесцирующих (флюорохромных)
сывороток. Для этого из исходной иммунной сыворотки выделяют и концентрируют глобулиновую фракцию
(антитела), которая соединяется с флюорохромом (например, изотиоцианатом или другим хроматографически
чистым красителелем).
При проведении исследований применяют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции: При
прямом методе готовят препарат, содержащий исследуемые антигены (мазок из патологического материала,
крови, отпечаток или срез различных органов и тканей, и др. материалы, содержащие микроорганизмы),
фиксируют его жидким фиксатором и обрабатывают специфическим люминесцирующим иммуноглобулином.
После инкубации отмытый от избытка иммуноглобулина и высушенный препарат рассматривают в
люминесцентный микроскоп, возбуждая свечение ультрафиолетовым светом. Светящиеся изображения
антигенов будут наблюдаться только при соответствии их взятому меченому иммунноглобулину.
Прямой метод технически прост и высокоспецифичен, но требует большого набора различных
люминесцирующих иммуноглобулинов (на каждый антиген - отдельная специфическая сыворотка).
При непрямом методе препарат, приготовленный таким же образом, обрабатывают обычной (несветящейся)
специфической сывороткой (полученной путем иммунизации кролика), промывают буферным раствором и затем
заливают люминесцирующую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов кролика)
и снова промывают. При микроскопии видны светящиеся изображения антигена, если он соответствует взятой
иммунной сыворотке, так как в этом случае к образовавшемуся комплексу антиген + антитело присоединяется
люминесцирующая антиглобулиновая сыворотка. Следовательно, при непрямом методе иммунная сыворотка (в
нашем случае кроличья) служит антителом для исследуемого антигена и, в свою очередь, является антигеном для
соответствующей антиглобулиновой люминесцирующей сыворотки (содержащую антитела против
иммуноглобулинов кролика, меченные флюорохромом). С помощью непрямого метода можно определять также
наличие антител в сыворотках.
В практической микробиологии и вирусологии ИФ-метод является методом экспресс-диагностики
многих инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы.
Метод нейтрализации токсина антитоксином.
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их
токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их
нейтрализацией. Реакция нейтрализации является биологическим методом, так как проводят путем введения
смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При
отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов,
токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности
взаимодействия комплекса антиген—антитело. Таким методом можно определит:
а) наличие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке пациентов;
б) наличие токсина в исследуемом материале при ботулинистическом пищевом отравлении.
Цель занятия:
1. Изучить механизмы взаимодействия антиген-антитело: принципы и методы постановки реакций

агглютинации, преципитации и иммунофлюоресценции.


2. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Реакции антиген-антитело: реакции прямой (ориентировочную и развернутую) и непрямой
агглютинации (РНГА, РОНГА, р. Кумбса).
2. Реакции преципитации: кольцепреципитации , р.Асколи, микропреципитации, р. флокуляции, р. Манчини.
3. Р.иммобилизации, р.нейтрализации токсина, р.прямой и непрямой иммунофлуоресценции.
Уметь:
1. Учесть и оценить результаты серологических реакций.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ.

1. Постановка реакции агглюцинации на предметном стекле для идентификации неизвестной культуры


микробов по антигенным свойствам. Необходимо иметь: диагностическую агглютинирующую сыворотку, испы-
тываемую культуру на МПА, физиологический раствор.
77
На одну половину предметного стекла нанести каплю диагностической сыворотки в разведении 1/10,
на другую - каплю физиологического раствора (контроль). Петлей взять исследуемую культуру с МПА и внести
ее сначала в каплю с физиологическим раствором, потом в каплю с иммунной сывороткой. Покачивая стекло,
равномерно распределить ингредиенты реакции. Склеивание происходит в течение первых минут наблюдения,
когда при покачивании стекла в мутной капле образуются хлопья (зернышки), которые укрупняясь,
перемещаются к периферии. В контрольной капле остается равномерная муть.
2. Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках с целью установления титра агглютинирующей
сыворотки.
Необходимо иметь:
 агглютинирующую сыворотку для титрования.
 взвесь убитых микробов (диагностикум), специфичный для данной сыворотки.
 физиологический раствор.
Титрование диагностигностической агглютинирующей сыворотки

№№ пробирок 1 2 3 4 5 6
Разведение 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 К
сыворотки
Ингредиенты
реакции
1. Физ. раствор 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
(в мл)
2. Аггл. 1,0 1,0 1,0 1,0
сыворотка в 1,0 —> —> —> —>
разведении
1:500 (в мл) (1,0) (1,0) (1,0) (1,0)
3. Диагностикум 2 2 2 2 2 2
(в каплях)

Учет результата

Агглютинирующую сыворотку добавляют в первую пробирку и затем переливают 1 мл разведенной


сыворотки во 2 пробирку, затем из 2 в третью и т.д. Из 5 пробирки удаляют 1 мл смеси (в дез.р-р) для сохранения
определенного объема. Штатив с пробирками помещаем в термостат на 2 часа, после чего учитываем
предварительный результат. Окончательный результат учитывается через 24 часа, после пребывания реакции при
комнатной температуре.
При отсутствии агглютинации жидкость остается равномерно мутная, при полной агглютинации
образуются хлопья агглютината в прозрачной жидкости.
За титр агглютинирующей сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором происходит
агглютинация
3. Постановка реакции кольцепреципитации с целью определения видовой специфичности белка крови.
Необходимо иметь: ткань с кровяным пятном, преципитирующие сыворотки к белку человека, курицы, свиньи и
др., физиологический раствор.
а) приготовление преципитиногена для постановки реакции путем экстрагирования белка крови из кровяного
пятна с помощью физраствора. Фильтруем антиген через бумажные фильтры.
б) техника постановки реакции кольцепреципитации: в узкие пробирки (диаметром 0,5см) вносит 0,2-0,3 мл
преципитируемой сыворотки. Затем тонкой пастеровской пипеткой по стеклу, осторожно, держа пробирку в
наклоненном положении, наслаиваем 0,2 мл раствора антигена. Пробирку переводим в вертикальное
положение. Учет реакции производят через 1-2 минуты. В случае положительной реакции на границе между
сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде белого кольца. В контроле (норм.
сыворотка + антиген) преципитата нет.
4. Постановка реакции преципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенности дифтерийных
культур (р. Илека).
На чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтрованной бумаги, пропитанную
антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6-0,8 см от края полоски засевают методом
бляшек исследуемые культуры дифтерийной палочки. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. В качестве
78
контроля используют заведомо токсигенную культуру При наличии токсигенной культуры в месте
взаимодействия токсина с антитоксином образуется линия преципитации в виде дуги.
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Развѐрнутая реакция агглютинации в пробирках. ―О‖ и ―Н‖-агглютинация.
2. РНГА на планшетках.
3. Реакция преципитации в геле, поставленная с целью определения токсигенности дифтерийных культур.
4. Реакция преципитации в геле, поставленная с целью определения иммуноглобулинов в сыворотке крови
(р. Манчини).
5. Наборы диагностикумов, антигенов, иммунных сывороток, флюоресцерующих
6. гаммаглобулинов.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью изучения
антигенных свойств культуры микробов.
2. Поставить развѐрнутую реакцию агглютинации в пробирках для определения титра агглютинирующей
сыворотки.
3. Приготовить антиген для реакции преципитации и поставить реакцию кольцепре
ципитации для определения видовой специфичности белка крови, учесть результат, сделать
заключение.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Реакции иммунитета: две фазы реакции, характеристика.
2. Реакция агглютинации: участники реакции, их характеристика, методы постановки реакции,
практическое применение реакции агглютинации.
3. Какие модификации позволяют повысить чувствительность реакции агглютинации?
4. Что такое диагностикум, для чего он применяется? Как приготовить О- Н- и Vi-диагностикумы и
антительный диагностикум?
5. В чем заключается методика постановки реакции агглютинации на предметном стекле и развернутой
реакции в пробирках?
6. Что такое коагглютинация, когда она применяется?
7. Как ставится реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, ее сущность, постановки, методика
постановки, практическое применение.
8. Реакция Кумбса для выявления неполных антител, ее сущность.
9. Реакция преципитации: ингредиенты, их характеристика, механизм, методы поста
1. новки, практическое использование.
10. Техника постановки реакции кольцепреципитации. В каких случаях она применяется?
11. Сущность реакции преципитации в агаре. В чем преимущество преципитации в агаре по сравнению с
кольцепреципитацией ?
12. Понятие об иммуноэлектрофорезе. сущность, применение.
13. Метод иммунофлюоресценции. Прямой и непрямой методы ИФ. Сущность. Практическое использование.
14. В чем заключается серологический метод иммобилизации? В каких случаях он применяется?
15. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Сущность. Практическое использование.

ЗАНЯТИЕ №15.

Темы:
 Реакции с участием комплемента реакции иммунного лизиса; реакция связывания комплемента.
 Реакции с использованием меченых антител или антигенов: иммуноферментный анализ,
радиоиммунный анализ.
 Кожные пробы (аллергические и иммунобиологические).
План занятия:
1. Реакция иммунного лизиса: ингредиенты, механизм реакции; разновидности реакции лизиса.
2. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение.
79
3. Реакция связывания комплемента (РСК). Ингредиенты. Особенности постановки и учета
реакции. Практическое значение.
4. Реакции с использованием меченых антител или антигенов: иммуноферментный анализ (ИФА),
радиоиммунный анализ (РИА). Особенности постановки. Практическое значение.
5. Кожные пробы. Классификация. Практическое применение.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ:
Одним из важнейших свойств иммунной сыворотки является ее способность лизировать (растворять) чужие
клетки. Сущность этой реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами
клеток (эритроцитов, бактерий, лимфоцитов и др.), на их поверхности образуется комплекс, который активирует
комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток. В зависимости от характера
корпускулярного антигена различают бактериолизис, спирохетолизис, гемолизис (гемолиз), лимфоцитолизис и
др. формы лизиса.
Реакции иммунного лизиса активно идут во время инфекционного заболевания (т.е. в живых организмах,
где активно работают все белки системы комплемента. В этом их огромный защитный эффект. Вне живого
организма (in vitro) многие бактерии устойчивы к литическому действию комплемента, поэтому реакция
бактериолизиса для диагностических целей применяется редко. Однако реакция лизиса используется при
типировании (выявлении) антигенов гистосовместимости (у человека ситема HLA) на лимфоцитах. К
типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их лтмывают и
добавляют комплемент. Если соответствующий антиген есть, то наступает лизис лимфоцитов и мертвые клетки, в
отличие от живых, окрашиваются трипановым синим.
В лабораторной практике широко применяется явление гемолиза - в качестве индикаторной системы в
реакции связывания комплемента (РСК). РСК ставят как для обнаружения в исследуемой сыворотке антител, так
и для выявления антигенов в исследуемом материале. В опытной системе образование комплексов антиген-
антитело и фиксация к ним комплемента не сопровождается видимыми изменениями, если антиген не является
клеткой. Поэтому для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную систему, состоящую из
эритроцитов барана, обработанных антителами-гемолизинами. Лизис эритроцитов может наступить только в
присутствии свободного комплемента (сыворотка морской свинки), а это возможно лишь в том случае, если в
опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется (РСК отрицательна, есть гемолиз).
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Ее широко используют для диагностики
многих инфекционных заболеваний: сифилиса (р.Вассермана), риккетсиозов (сыпной тиф, лихорадка Ку),
вирусных заболеваний (грипп, корь, парагрипп и др.).

Р. радиального гемолиза в геле.


Реакция радиального гемолиза в геле – это вариант р. гемолиза и РСК в геле. Эту реакцию ставят в лунках
геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической
сыворотки вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом,
можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. Если в гель добавить эритроциты, на
которых адсорбированы антигены различных возбудителей (вирусов гриппа, краснухи и т.д.), а в лунки вносить
сыворотки больных, то антитела сыворотки взаимодействуют с вирусными антигенами на эритроцитах, после
чего к этому комплексу присоединяется комплемент и наступает гемолиз в агаре.
Р. локального гемолиза в геле, предложена Н.Йерне (1963 г.) - применяют для подсчета клеток-
антителопродуцентов.
Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезенки, после иммунизации животного
эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят
комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей
антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной
иммунологии, т.к. дает возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и клеточных
популяций иммунной системы после различных воздействий.
Реакции с применением меченых антител и антигенов - составляют основу современных методов
экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, благодаря высокой чувствительности этих методов,
позволяющих определять минимальные количества антигенов (антител) в исследуемом материале (нанограммы).
Иммуноферментный метод (анализ) – ИФА – выявление антигенов (или антител) с помощью
соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой, β-
галактозидазой или щелочной фосфатазой).
80
Наиболее распространен твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции
(антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках полистироловой планшеты. Ддя
выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках планшеты, затем вносят исследуемую сыворотку, в
которой хотят обнаружить антитетла к данному антигену. После инкубации лунки промывают дляудаления
несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, мечяенные ферментом (обычно
пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись
водорода) и хромоген (орто-фенилдиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. По
изменению цвета и интенсивности окраски раствора судят о наличии и колическтве антител. Если необходимо
определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый
материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченую ферментом, и смесь растворов субстрата
для фермента и хромогена. Измерение количества продуктов реакции ИФА проводится в автоматизированном
варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра или автоматических ридерах, измеряя оптическую
плотность растворов в лунках при определенной длине волны.
К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА: конкурентные
методы ИФА, сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена) и др. Для постановки ИФА
выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.
Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение
в различных областях биологии и медицины. ИФА используется для определения антигенов или антител при
различных бактериальных, вирусных и протозойных инфекциях, в частности, при диагностике ВИЧ-инфекции.
ИФА применяется также для определения концентрации лекарственных препаратов, гормонов, цитокинов в
организме, присутствия в нем раковых клеток, гельминтов.
Иммуноблотинг - (от англ. ―blot‖ – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью
известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА.
Первоначально методом электрофореза выделяют все антигены вируса и получают коммерческий реагент на
специальной нитроцеллюлозной пленке. При постановке иммуноблотинга на пленку с известными антигенами
наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к
ИФА – на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом и хромогенный
субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело, на
носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблотинга позволяет обнаружить антитела одновременно
на все антигены возбудителя. Поэтому его проводят часто для подтверждения предполагаемого диагноза
(например, при ВИЧ инфекции), выставленного на основании положительной реакции обычной ИФА (т.е. с
каким-либо одним антигеном), что позволяет избежать диагностических ошибок из-за случайных совпадений.
Радиоиммунный анализ (РИА). Принцип радиоиммунного анализа (РИА) основан на выявлении комплекса
АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы
йода (125 J или 131
J). Учет реакции проводят с помощью специальных счетчиков  или -излучения. Метод
высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопаснось работы
с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

Кожные пробы
Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят
провокационные тесты. Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм, чаще всего
внутрикожно или накожно. Иногда сублингвально, ингаляционно или в конъюнктиву глаза. Обычно, спустя 30
минут оценивают немедленные аллергические реакции, через 24-48 часов – замедленные.
На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные
(сублингвальные, конъюнктивальные) реакции в виде покраснения и припухлости. С помощью этих реакций
можно установить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание. Поскольку геторологичные
сывороточные белки при повторном введении могут стать причиной развития анафилактического шока, в основе
которого также лежит аллергия немедленного типа, перед введением такого рода иммунных препаратов для
выявления аллергии, а вместе с тем для временной десенсибилизации, ставится кожная проба с
соответствующим аллергеном.
Реакции замедленной гиперчувствительности развиваются обычно на бактериальные антигены. Поскольку
это является результатом инфицированности организма, такого рода кожные реакции можно использовать как
один из методов диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, бруцеллез и др.) и оценки
эффективности вакцинации живой противотуберкулезной вакциной. Во всех этих случаях в качестве аллергена
используется вытяжка из соответствующих микробов (туберкулин, тулярин, бруцеллин и т.д.). Например, для
81

выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза, чаще всего ставится кожно-аллергическая проба Манту
когда туберкулин PPD вводится внутрикожно.
Для оценки иммунитета против дифтерии используют кожную иммунобиологическую пробу Шика, а для
скарлатины – Дика. В этих пробах используют экзотоксины соответствующих микробов. Реакции основаны на
нейтрализации токсина антитоксинами
in vivo. При наличии у испытуемого антител, они нейтрализуют токсин в коже, поэтому гиперемии не будет
(реакция отрицательна). Наоборот, при отсутствии антител, экзотоксин вызывает гиперемию (реакция
положительна).
Цель занятия.
1. Изучить принципы и методы постановки реакций лизиса, РСК и твердофазных реакций ИФА,
иммуноблотинга и РИА.
2. Изучить принципы и методы постановки кожно-аллергических и кожных иммунобиологических проб и
механизм их развития.
3. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований и кожных проб.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Диагностические реакции антиген-антитело: РСК, ИФА, РИА, иммуноблотинг.
2. Кожно-аллергические реакции для выявления гиперчувствительности немедленного и замедленного
типа, кожные иммунобиологичекие реакции для определения антитоксического иммунитета.
Уметь:
1. Оценить результаты постановки РСК, ИФА, кожно-аллергических и иммуно-биологических кожных
реакций.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Р. титрования гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, полученная путем иммунизации
кролика эритроцитами барана, перед титрованием разводится (см. схему разведения гемолитической сыворотки).
Для постановки опыта титрования гемолитической сыворотки 0,5 мл каждого разведения сыворотки необходимо
соединить с 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (антиген) и 0,5 мл комплемента (свежая сыворотка морской
свинки в разведении 1:10). Реакция идет в термостате при 37°С в течение 40-60 мин (см. схему титрования
гемолитической сыворотки).
Титром гемолитической сыворотки называется то наибольшее ее разведение, которое в количестве 0,5 мл в
присутствии 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, растворяет 0,5 мл 3 % взвеси эритроцитов барана в течение
1 часа пребывания в термостате при 37°С. Титр гемолитической сыворотки должен быть не ниже 1:1200.
Титрование комплемента (см. схему) необходимо для определения титра и рабочей дозы комплемента. Для
титрования комплемента используется р. гемолиза. Донорами комплемента являются морские свинки, сыворотка
которых разводится 1:5 и используется для установления титра комплемента (разведения от 1:10 до 1:40), к
которому добавляется гемолитическая система.
Гемолитическая система состоит из прогретой гемолитической сыворотки взятой в тройном титре
(антитело) и 3 % взвеси эритроцитов (антиген), взятых в равных соотношениях.
Реакция ставится в термостат на 40 мин при t 37°С. Учет реакции проводится по наличию или отсутствию
гемолиза (лаковой крови).
Титром комплемента называется его минимальное количество (максимальное разведение), при котором
еще происходит гемолиз. Для постановки РСК комплемент берут в рабочей дозе - титр увеличенный на 20-25%.

Постановка основного опыта реакции связывания комплемента


(см. схему №4).
Постановке реакции предшествует подготовка всех ингредиентов, так как для постановки РСК они
берутся в строго определенных соотношениях.
В качестве антигена используются растворенные антигены бактерий, риккетсий, антигены вирусов,
грибов и др. Антигены могут обладать антикомплементарным действием (т.е. способностью инактивировать
комплемент), поэтому антиген титруется перед постановкой РСК с помощью реакции гемолиза. Титром
антигена считается наибольшая доза его, которая не проявляет антикомплементарного действия, т.е. при которой
прекращается задержка гемолиза. Для РСК используют рабочую дозу антигена, которая равна 1/2 его титра.
82
Исследуемая сыворотка (антитело) инактивируется при 56°С в течение 30 мин. для
уничтожения в ней собственного комплемента.
Комплемент титруется и определяется его рабочая доза (см. выше).
Эритроциты барана и гемолитическая сыворотка смешиваются в равных объемах (гемолитическая
система), при этом инактивированная гемолитическая сыворотка берется в тройном титре.
Подготовленные ингредиенты реакции делят на две системы: тест-систему (антиген, антитело, комплемент) и
индикаторную систему (гемолитическая система). Сначала реакцию ставят в тест-системе (см. схему опыта) и
инкубируют ее в термостате t=37°С в течение 45 мин, затем в реакцию вводят индикаторную систему.
Если в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела на известный антиген, то образуется
комплекс антиген-антитело, на котором адсорбируется комплемент, и гемолиза не произойдет (реакция по-
ложительная, гемолитическая система остается мутной). Если в сыворотке нет специфических антител, комплекс
антиген-антитело не образуется, комплемент останется свободным после первой фазы реакции и адсорбируется
комплексом эритроциты-гемолизины, в результате наступит растворение эритроцитов - гемолиз (реакция РСК
отрицательная).
ДЕМОНСТРАЦИИ:
1. Реакция иммунного гемолиза: титрования гемолитической сыворотки
2.Титрования комплемента, определение рабочей дозы комплемента
3. Гемолитическая система
4. РСК (основной опыт). Положительный и отрицательный результат
5. Препараты: комплемент, гемолитическая сыворотка, антигены для постановки РСК
6. Тест-системы для постановки ИФА
7. Тест-системы для постановки иммуноблотинга
8. Таблицы, схемы, рисунки.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Постановка основного опыта РСК с исследуемыми сыворотками
(первая и вторая фазы реакции).
2. Учѐт результатов РСК, схему и результаты РСК записать в тетрадь
Схема № 1. Разведение гемолитической сыворотки
№№ пробирок 1 2 3 4 5 6 7

ингредиенты
гемолитическая сыворотка 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
в разведении 1:100 ( мл)
физ.раствор (мл) 0,9 1,1 1,4 1,7 1,9 2,4 2,9
полученное разведение __1__ __1__ __1__ 1__ 1__ 1__ 1__
сыворотки 1200 1500 1800 2000 2500 3000
1000
83

Схема № 2. Титрование гемолитической сыворотки

гемолитическая сыворотка 3% взвесь комплемент в физ. возможный


пробирок

(мл) эритроцитов разведении раствор результат


1:10 (мл) (мл)
№№

из соответствующего
разведения
1 0,5 1/1000 0,5 0,5 1,0 полный
гемолиз
2 0,5 1/1200 0,5 0,5 1,0 полный
гемолиз
3 0,5 1/1500 0,5 0,5 1,0 полный
гемолиз
4 0,5 1/1800 0,5 0,5 1,0 неполный
гемолиз
5 0,5 1/2000 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза

6 0,5 1/2500 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза

7 0,5 1/3000 0,5 0,5 1,0 нет гемолиза

8 контроль 0,5 0,5 1,5 нет гемолиза

В термостат 37°С на 40 мин

Схема № 3. Титрование комплемента


№№ пробирок 1 2 3 4 5 6 7 8

ингредиенты
комплемент в разв. 1:5 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 -
изотонический раствор 0,3 0,4 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,2
количество смеси, 0,4 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 -
удаляемой из проб
получаемые разведения 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 -
комплемента
гемолитическая система 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

В термостат 37°С на 30 мин


84

Схема № 4. Основной опыт реакции связывания комплемента


о к к
№№ пробирок 1 2 3 4 5 6 7

ингредиенты (в мл)

исследуемая сыворотка в разв. 1:5 0,2 - - 0,2 - - -


положительная сыворотка (контроль) - 0,2 - - - - -
отрицательная сыворотка (контроль) - - 0,2 - - - -
антиген 0,2 0,2 0,2 - 0,2 - -
изотонич.р-р хлорида натрия - - - 0,2 0,2 0,4 0,6
комплемент в рабочей дозе 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
Инкубация на холоде при 0-4°С в течение 18-24 ч
или при 37°С в течение 30 мин
гемолитическая система 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Инкубация при 37°С в течение 30 мин
результат

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Реакции иммунного лизиса, разновидности, механизм.
2. Комплемент, его компоненты. Участие в иммунологических реакциях. Активация комплемента по
классическому типу.
3. Реакции бактериолиза, их биологическая роль, практическое значение.
4. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение.
5. Реакция связывания комплемента (РСК: системы, участвующие в реакции ингредиенты . Механизм РСК.
6. Подготовка всех ингредиентов .для РСК: а) титрование комплемента и установление его рабочей дозы; б)
титрование гемолитической сыворотки, в) приготовление гемолитической системы, г) инактивация
исследуемой сыворотки, д) титрование антигена.
7. Схема постановки основного опыта РСК. Положительный и отрицательный результат РСК. Практическое
применение РСК.
8. Каков принцип постановки твердофазных диагностических иммунологических реакций?
9. Как поставить и учесть результаты ИФА и РИА?
10. Что такое иммуноблотинг, в каких случаях проводится это исследование?
11. Как определить природу аллергена, вызвавшего аллергические заболевание, в основе которого лежит
гиперчувствительности немедленного типа?
12. Каков механизм инфекционной аллергии, в основе которой лежит гиперчувствительности замедленного
типа?
13. Как можно выявить инфекционную аллергию и с какой целью проводят ее определение?
14. В каких случаях проводят кожные иммунобиологические реакции (Дика и Шика), о чем свидетельствуют
положительные реакции в этих случаях, каков их механизм?

ЗАНЯТИЕ №16.
Тема:
 Иммунный статус организма человека.
 Иммунопрофилактика и иммунотерапия болезней человека.

План занятия:
1. Иммунный статус человека и его значение.
2. Тесты для оценки иммунного статуса и методы их определения
3. Имунобиологические препараты, их классификация и области применения:
 вакцины, анатоксины, фаги, эубиотики
85
 иммуноглобулины и иммунные сыворотки
 иммуномодуляторы для иммунокоррекции: эндогенные (интерлейкины, интерфероны, гормоны
тимуса, миелопептиды и др.) и экзогенные (левамизол, адъюванты, циклоспорин, синтетич. и др.)

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ:
Иммунный статус – это структурное и функциональное состояние иммунной системы человека,
определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей. На состояние иммунной
системы влияют возрастные, климатогеографические, социальные, экологические и многие другие факторы.
"Биологические часы" иммунной системы – это тимус, инволюция которого с возрастом приводит к угасанию Т-
клеточных реакций.
Иммунный статус можно объективно оценить путем постановки комплекса лабораторных тестов. Для оценки
состояния естественного иммунитета изучают
 фагоцитарные показатели
 состояние системы белков комплемента
 содержание белков острой фазы и цитокинов (интерферона, интерлейкина)

Для изучения лимфоцитарного иммунитета, в частности, его гуморального звена, определяют:


1. Количество В-лимфоцитов в периферической крови и их бласттрансформацию под действием
поликлональных митогенов (например, LPS).
2. Содержание иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.
3. Титры специфических антител и катаболизм иммуноглобулинов.

Для оценки состояния клеточного звена адоптационного иммунитета определяют:


 количество Т-лимфоцитов и их субпопулящий в периферической крови
 функциональную активность Т-клеток под действием Т-митогенов (р.бласттрансформации под действием
конканавалина А и/или фитогемагглютинина)
 содержание гормонов тимуса
 уровень секретируемых цитокинов
 состояние ГЗТ с различными аллергенами

В зависимости от результатов исследования все эти тесты выполняются в определенной последовательности,


а поэтому подразделяются на 2 уровня.

Тесты 1-го уровня:


 определение количества и морфологии лимфоцитов периферической крови
 определение Т- и В-лимфоцитов по СД рецепторам или в реакции Е-РОК и ЕАС-РОК
 определение сывороточных Ig
 определение фагоцитарной активности лейкоцитов
 кожные тесты
 рентгенография, рентгеноскопия лимфоидных органов

Эти тесты определяются в любой клинико-иммунологической лаборатории и достаточны для первичного


выявления лиц с иммунопатологией.

Тесты 2-го уровня:


 гистохимический анализ лимфоидных органов
 анализ CD-маркеров различных субпопуляций лимфоцитов с использованием моноклональных антител
 бласттрансформация Т- и В-клеток
 определение цитотоксичности лимфоцитов
 определение активности ферментов, ассоциированных с ИД
 определение синтеза и секреции цитокинов
 определение гормонов тимуса
 анализ респираторного взрыва фагоцитов
 определение компонентов комплемента
86
 анализ смешанных клеточных культур лимфоцитов

Иммунодефициты – это нарушения нормального иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или
нескольких механизмов иммунного ответа. В случае выявления отклонений от нормы показателей иммунного
статуса назначают иммунокоррегирующую терапию.

Иммунобиологические препараты:
Вакцины – препараты для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.
В качестве действующего начала в вакцинах используют:
 живые, ослабленные микроорганизмы (бактерии, вирусы)
 инактивированные микробные клетки
 отдельные антигенные компоненты бактерий и вирусов (протективные антигены)
 вторичные, продуцируемые микробными клетками метаболиты, например, токсины и их обезвреженные
дериваты – анатоксины
 полученные химическим синтезом молекулярные антигены микробов, вирусов
 полученные генно-инженерным способом антигены микроорганизмов, вирусов

Аттенуированные живые вакцины: содержат аттенуированные штаммы бактерий, вирусов (т.е. штаммы с
пониженной вирулентностью, но сохранившие антигенные свойства). Их получают путем воздействия на
патогенные штаммы неблагоприятных для микробов факторов: химических (ингибиторы роста), физических
(температура, радиация), биологических (пассажи через организмы животных, культуры клеток, куриные
эмбрионы). Примеры: туляремийная, сибиреязвенная, чумная, бруцеллезная, гриппозная, коревая,
полиомиелитная, паротитная вакцины.
Дивергентные живые вакцины: созданы на основе природных штаммов микроорганизмов, имеющих общую
антигенность с возбудителем для человека. Примеры: оспенная вакцин (вирус коровьей оспы), BCG (вакцина
содержит возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота)
Живые рекомбинантные вакцины (векторные): при создании таких вакцин используют непатогенные
микроорганизмы (кишечная палочка, вирус осповакцины, дрожжи), в геном которых встроены гены патогенных
микробов, отвечающие за синтез протективных антигенов. Пример: дрожжевая вакцина против гепатита В.
Убитые вакцины содержат культуру бактерий или вирусов, убитых тем или иным способом (нагревание,
действие УФ-лучей, ионизирующей радиации, обработка формалином, спиртом, фенолом). В результате
инактивации бактерии и вирусы теряют жизнеспособность, но сохраняют антигенные и иммуногенные свойства.
Корпускулярные вакцины: состоят из инактивированных цельных клеток бактерий (цельноклеточные) или
состоят из вирионов (цельновирионные). Примеры: цельноклеточные вакцины – коклюшная, холерная
моновакцина, брюшнотифозная; цельновирионные – в. против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита,
герпеса. Субклеточные, субвирионные, молекулярные вакцины состоят из отдельных структурных
элементов микробов или вирусов, несущих специфические протективные антигены (субклеточные, субвирионные
вакцины): менингококковая, гриппозные (Ваксигрипп, Гриппол). Для вирусных вакцин такого рода часто
применяют термин «расщепленные вакцины
В последние 20 лет в России ведутся работы по созданию прниципиально новых вакцинирующих препаратов
контролируемого содержания. В их основе определенные высокоочищенные антигены, в том числе
синтетические или рекомбинантные аналоги протективных антигенов возбудителей. Приоритетность и
оригинальность этих работ заключается в том, что одновременно для целевых антигенов создаются полимерные
молекулы-носители, позволяющие значительно повысить иммунный ответ у индивидуумов с генетически
обусловленной слабовыраженной реактивностью.
Анатоксины – препараты, получаемые из экзотоксинов микробов, путем их обезвреживания (дифтерийный,
столбнячный, стафилококковый). Чтобы получить анатоксин, бактерии культивируют на жидкой питательной
среде и отделяют их от экзотоксинов методом фильтрования. К полученному фильтрату добавляют
формальдегид 0,4%-ной концентрации для обезвреживания токсина. Обезвреживание происходит при
температуре 37°С-40°С в течение 4 недель. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но
сохраняются антигенные и иммуногенные свойства токсинов. Анатоксин подвергают очистке от балластных
веществ. Анатоксины дозируют в антигенных или имуногенных единицах (ЕС – единицы связывания или Lf –
единицы флокуляции). К очищенному анатоксину для усиления его иммуногенных свойств добавляют адъювант.
Адъюванты – (adjuvant – помощник) – это группа веществ, повышающих иммуногенные свойства вакцин и
анатоксинов. В качестве адъювантов используют различные по природе и физико-химическим свойствам
87

вещества: гель гидрата окиси или фосфата алюминия, липиды, эмульгаторы, полимерные соединения,
полисахариды бактерий или сами убитые бактерии (полный адъювант Фрейнда – взвесь убитых микобактерий в
минеральном масле), сапонины и др.
Механизм действия адъювантов:
 создание "депо" антигена в месте введения препарата, в результате чего пролонгируется действие антигена на
иммунную систему организма;
 усиление воспалительной реакции и активизация иммунокомпетентных клеток и угнетение функции Т-
супрессоров;
 активация процесса захвата антигена и его переработки макрофагами.
Адъюванты повышают иммуногенность вакцин в десятки и более раз, особенно молекулярных белковых
антигенов (анатоксинов), которые без адъювантов быстро расщепляются ферментами организма. Примеры: АД,
АДС, АС-анатоксины, стафилококковый анатоксин.
Ассоциированные вакцины и поливакцины. Препараты, которые содержат комплекс различных антигенов
и применяются для одновременной иммунизации против нескольких инфекций. Примеры: АКДС,
секстаанатоксин (сорбированные на гидроокиси алюминия столбнячный, ботулинический А, В, Е и гангренозные
перфрингенс и нови-анатоксины); полиомиелитная – живая пероральная вакцина из 3-х аттенуированных
штаммов вирусов I, II, III типов; живая вакцина против кори, краснухи, паротита.
Различают первичную иммунизацию (вакцинацию) и повторную иммунизацию (ревакцинацию). При
первичной иммунизации создается первичный активный искусственный иммунитет и повышенная способность
реагировать на антиген (иммунологическая память), в результате чего при ревакцинации организм более
активно и быстро отвечает на антиген. Вакцины, анатоксины обеспечивают выработку специфического
активного искусственного иммунитета спустя 2-3 недели после первичной иммунизации и через 2-7 после
ревакцинации (повторной иммунизации).
В нашей стране, в соответствии с принятым федеральным законом №157, ФЗ "Об иммунопрофилактике
инфекционных заболеваний", проводится обязательная вакцинация против туберкулеза, гепатита В,
полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, коревой краснухи, паротита. В "календаре" (с
2002г.) указаны схемы и сроки прививок с момента рождения и в определенные периоды жизни каждого
человека.

Возраст Вакцинация
Новорожденные (до 12 часов жизни) Первая вакцинация против вирусного гепатита
В
Новорожденные (3-7 дней) Вакцинация против туберкулеза
1 месяц Вторая вакцинация против вирусного гепатита
В
3 месяца Первая вакцинация против дифтерии, коклюша,
столбняка, полиомиелита
4,5 месяца Вторая вакцинация против дифтерии, коклюша,
столбняка, полиомиелита
6 месяцев Третья вакцинация против дифтерии, коклюша,
столбняка. Третья вакцинация против гепатита
В.
12 месяцев Вакцинация против кори, краснухи,
эпидемического паротита
18 месяцев Первая ревакцинация (повторная вакцинация)
против дифтерии, коклюша, столбняка,
полиомиелита
20 месяцев Вторая ревакцинация против полиомиелита
6 лет Ревакцинация против кори, краснухи,
эпидемического паротита
7 лет Ревакцинация против туберкулеза, Вторая
ревакцинация против дифтерии и столбняка
13 лет Вакцинация против краснухи (девочки),
вакцинация против гепатита В (ранее не
88
привитым)
14 лет Третья ревакцинация против дифтерии,
столбняка, туберкулеза, полиомиелита
Взрослые Ревакцинация против дифтерии и столбняка
каждые 10 лет после последней ревакцинации

Вакцины лечебные назначают при затяжных формах инфекций (дизентерия, бруцеллез, орнитоз, сап,
брюшной тиф), для активации иммунитета и десенсибилизации организма. Лучший лечебный эффект имеют
аутовакцины, т.е. вакцины, приготовленные из собственных микроорганизмов, вызвавших заболевание
(фурункулез).
Иммунные сыворотки и гамма-глобулины. Применяются для экстренной защиты (пассивная иммунизация)
организма от заболевания (лиц, пребывающих в инкубационном периоде или уже заболевших). По механизму
действия сыворотки бывают антитоксические (противодифтерийная, противостолбнячная,
противоботулиническая) и антимикробные (противоменингококковая).
Из сывороток получают концентрированный препарат - гамма-глобулин. Гетерологичный гамма-глобулин
получают из сыворотки гипериммунизированных животных (против бешенства, сибирской язвы).
Гомологичный гамма-глобулин получают из плацентарной и донорской крови людей, имеющих высокие титры
антител против определенных антигенов (противогриппозный, противокорввый, противостолбнячный гамма
глобулин). Гомологичные гаммаглобулины (и антисыворотки), в отличие от гетерологичных, при введении
почти не вызывают аллергических осложнений).
К иммунобиологическим препаратам также относятся бактериофаги и эубиотики.
Бактериофаги – препараты, в которых содержатся вирусы бактерий, способные поражать бактерии.
Применяют для профилактики и лечения ряда бактериальных инфекций (брюшной тиф, дизентерия, холера,
гнойные инфекции). Эти препараты также назначаются с профилактической целью контактным в очагах.
Лечебный и профилактический эффект фагов умеренный, поэтому их применяют в комплексе с другими
лечебными и профилактическими препаратами.
Диагностические бактериофаги используются для фагодиагностики и фаготипирования бактерий, что имеет
эпидемиологическое значение.
Эубиотики – препараты, приготовленные из живых, выращенных на питательных средах непатогенных
бактерий, относящихся к облигатным представителям нормальной микрофлоры человека (бифидумбактерии,
лактобактерии, кишечная палочка, энтерококки). Соответственно препараты эубиотиков называют:
"Бифидумбактерин", "Лактобактерин" "Колибактерин".1 доза эубиотиков составляет 10 7-108 микробных клеток.
Их применяют через рот, два-три раза в день, длительными курсами (1-6 месяцев). В аптечную сеть для
реализации поступают в основном сухие лиофилизированные препараты. Но более эффективными являются
жидкие свежеприготовленные эубиотики, поскольку, кроме бактерий, в жидкости уже содержатся в большом
количестве биологически активные вещества. Часто их называют «заквасками», потому что с их помощью
можно заквашивать молоко, используя в качестве лечебно-профилактического продукта. Эубиотики
восстанавливают видовой и количественный состав бактерий, нарушенный в результате дисбактериоза,
повышают устойчивость организма к инфекциям.
Пробиотики – кроме живых микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры человека или
выделенных из внешней среды, могут содержать ферменты, биологически-активные вещества и другие
компоненты, способствующие формированию нормального микробиоценоза. Например: "Бактисубтил",
"Линекс".
Для иммунокоррекции применяются также и многие другие неспецифические иммуностимулирующие
препараты различного происхождения.
Тималин. Представляет собой комплекс полипептидных фракций, выделенных из вилочковой железы
крупного рогатого скота. Регулирует количество Т- и В- лимфоцитов, стимулирует реакцию клеточного
иммунитета, усиливает фагоцитоз.
Тактивин. Препарат полипептидной природы, получен из тимусов крупного рогатого скота. Нормализует
качественные и количественные показатели Т системы иммунитета, стимулирует продукцию лимфокинов, в том
числе интерферонов.
Левомизол. Тетрагидро-6-фенилимидазо-тиазоло гидрохлорид. Стимулирует регуляторную функцию Т-
лимфоцитов, нормализует клеточный иммунитет.
Натрия нуклеинат. Натриевая соль нуклеиновой кислоты, получаемой гидролизом дрожжей и дальнейшей
очисткой. Стимулирует деятельность костного мозга, вызывает лейкоцитарную реакцию, стимулирует лейкопоэз.
89

Продигиозан. Высокополимерный липополисахаридный комплекс, выделенный из микроорганизмов Serratia


marcescens. Стимулирует факторы неспецифической и специфической резистентности организма. Активирует Т-
систему и функцию коры надпочечников.
Пирогенал. Липополисахарид, микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi. При введении в
организм вызывает повышение температуры и сдвиги в функциях организма: лейкопения, сменяющаяся
лейкоцитозом, увеличение проницаемости тканей, улучшение восстановительных процессов.
Полиоксидоний. Синтетический полимер. Стимулирует активность макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов.
Миелопид. Комплекс пептидов из костного мозга. Оказывает влияние на все компоненты иммунной системы.
Ликопид. Производное мурамилпептидов клеточной стенки бактерий L.bulgaricus, стимулирует функцию
макрофагов.
Цель занятия:
1. Ознакомить студентов с критериями необходимости изучения иммунного статуса у определенной
категории больных, с принципами и методами проведения этих исследований.
2. Познакомить студентов с иммунобиологическими препаратами, применяемыми для
иммунопрофилактики, иммунотерапии (иммунокоррекции) инфекционных заболеваний у человека.

Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Иммунодефицитные состояния: классификация, причины и механизм их возникновения, принципы и
методы диагностики.
2. Принципы и методы повышения специфической и неспецифической резистентности к инфекционным
заболеваниям человека.
3. Препараты, применяемые для создания активного и пассивного иммунитета и повышения эффективности
неспецифической защиты от инфекций. Их классификацию и принципы получения.
4. Календарь прививок.

Уметь:
1. Обосновать необходимость проведения обследования иммунного статуса пациента, дать объективную
оценку по результатам иммунограммы.
2. Обосновать необходимость применения вакцин, сывороточных и иммуностимулирующих
(неспецифических) препаратов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Для оценки функционального состояния иммунной системы и диагностики патологических изменений еѐ
активности разработаны специальные клинические и лабораторные методы, которые предполагают
дифференцированную характеристику функциональной активности Т- и В-систем иммунитета.

В основе определения принадлежности лимфоцитов к той или иной субпопуляции лежат следующие
характеристики (смотри занятие №13):
1. Наличие на поверхности лимфоцитов антигенных маркеров (СD-антигены: cell differentiation antigens или
cluster definition – антигены кластеров дифференцировки клеток), которые представляют собой гликопротеины
(gp), специфичные для определенной стадии дифференцировки (СD-"кластер" дифференцировки). Такие
антигены выявляются с помощью люминесцирующих моноклональных антител.
2. Наличие на поверхности лимфоцитов рецепторов, с помощью которых лимфоциты распознают антигены и
некоторые другие химические структуры, например:
а) Fc-рецептор для Fc фрагмента иммуноглобулинов. Он присутствует у В-лимфоцитов.
б) С-рецептор для комплемента. Присутствует у В-лимфоцитов.
Функциональные различия Т- и В-лимфоцитов можно выявить in vitro. Для этой цели чаще всего применяют
реакцию бласттрансформации. Она основана на способности малых лимфоцитов при культивировании их in vitro
превращаться под влиянием митогенного стимула в бластные формы, проявляющие при этом большую
митогенную активность. В качестве митогенного стимула могут быть использованы аллогенные антигены
гистосовместимости (микст-культура лимфоцитов - MLC) или некоторые субстанции растительной или бактери-
90
альной природы. Среди митогенов выделяют митогены для Т-лимфоцитов (ФГА и Кон А), и
митогены для В-лимфоцитов (ЛПС клеточной стенки бактерий и PWM – из растения фитолаки).

Оценка Т-клеточной системы иммунитета (клеточный иммунитет)


1. Определение общего числа лимфоцитов.
2. Определение числа зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и их субпопуляций –
хелперов (CD4) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8).
3. Определение реакции Т-лимфоцитов на ФГА (Т-митоген) в реакции
бласттрансформации (РБТЛ).
4. Определение соотношения CD4/ CD8.
5.Постановка кожных проб ГЗТ.
6. Дополнительные уточняющие методы:
- определение CD25 (рецептор ИЛ-2) и HLA-DR на Т-лимфоцитах
- исследование продукции цитокинов (γ-интерферона, ИЛ-2,-4,-6 и ФНО);
- определение пролиферативного ответа на специфический антиген в РБТЛ;
-определение готовности клеток к апоптозному антигену Fas-CD95,
находяшемуся на Т-хелперах, на CD8-лимфоцитах имеется Fas-лиганд–FasL.

Оценка В-клеточной системы иммунитета (гуморальный имунитет)


1. Определение числа В-лимфоцитов (CD20 или CD19).
2. Определение количества неспецифических иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE) методом радиальной
иммунодиффузии (реакция Манчини).
3. Определение циркулирующих в крови иммунных комплексов.
4. Определение функциональной активности лимфоцитов с помощью реакции
бластной трансформации лимфоцитов на В-клеточный митоген (LPS, PWM)
5. Дополнительные уточняющие методы:
- определение количества специфических иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE);
- определение продукции интерлейкина-6;
- определение секреторного IgA.

Показатели системы комплемента


Определение компонентов комплемента (C1q, C1, C3, C4, C5 и др.) в сыворотке крови и функциональной
активности комплемента (СН50).

Система фагоцитов (нейтрофилов).


1. Определение числа нейтрофилов.
2. Опреление фагоцитарного числа (процент клеток, участвующих в фагоцитозе) и индекса фагоцитоза
(число микробов, захваченных одной клеткой).
3. Определение бактерицидности фагоцитов.
4. Дополнительные уточняющие тесты:
- определение активности хемотатксиса фагоцитов;
- опреление способности нейтрофилов к адгезии к пластику и наличия
клеток с адгезивными молекулами CD11/ CD18.

ДЕМОНСТРАЦИИ:

1. Микропрепараты реакции бласттрансформации лимфоцитов


2. Реакция Манчини на стеклах с агарозным гелем для определения разных классов иммуноглобулинов.
3. Наборы вакцинных препаратов; наборы иммунных сывороток, гаммаглобулинов (лечебных и
диагностических). Набор аллергенов.
4. Наборы эубиотиков, бактериофагов, цитокинов.
5. Таблицы, схемы, рисунки.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Микроскопия препаратов с реакцией бласттрансформации
91

2. Учет реакции радиальной иммунодиффузии (р.Манчини) для определения уровня различных классов
иммуноглобулинов в сыворотке крови.
3. Оценка иммунного статуса по готовым бланкам иммунограммы больных.
4. Знакомство с наборами вакцинных препаратов, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов,
неспецифических иммуномодуляторов.
5. Знакомство с препаратами эубиотиков, бактериофагов, цитокинов.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что такое иммунный статус человека, какие показатели его характеризуют?
2. В каких случаях изучают иммунный статус?
3. Иммунодефицитные заболевания: принципы классификации, этиология и патогенез их развития.
4. Аутоиммунные заболевания: причины возникновения, применение иммунологических методов для их
диагностики
5. По каким маркерам можно отличить Т- и В-лимфоциты?
6. Что такое антигены дифференцировки (CD-антигены), каково их практическое значение в клинической
иммунологии, как их определить?
7. Что такое мембранные иммуноглобулины, для каких клеток они характерны и как их определить?
8. Как определить функциональную активность Т- и В-лимфоцитов in vitro и in vivo?
9. Что такое реакция боласттрансформации?
10. Какие митогены применяются в клинической иммунологии и с какой целью? (Классификация и примеры).
11. Как оценивается функциональная активность В-звена иммунной системы?
12. В чем суть реакции радиальной иммунодиффузии (р. Манчини) и с какой целью она ставится ?
13. Каковы принципы иммунокоррекции первичных и вторичных иммунодефицитов?
14. Что такое вакцины (классификация) и каковы принципы их получения?
15. В каких случаях применяются лечебные вакцины?
16. Что такое химическая вакцина?
17. Каковы принципы получения генно-инженерных вакцин?
18. В каких случаях используется такой метод их получения?
19. Что такое анатоксин, как он получается и для чего применяется?
20. Что такое адъюванты, для чего они применяются, каков механизм их действия?
21. Что такое «адъювантная» болезнь, в каких случаях она может возникать?
22. Что такое «календарь прививок», какие вакцины при этом применяются?
23. Что такое «коллективный» иммунитет, как он создается и какое это имеет значение для предупреждения
инфекционных заболеваний?
24. Какими недостатками обладают современные вакцины и каковы пути их устранения?
25. Как получить иммунные сыворотки и для чего они применяются?
26. Что такое гомологичные и гетерологичныке гаммаглобулины, как они получаются, для чего
используются?
27. Какие осложнения могут возникать у пациента после введения гетерологичных сывороточных препаратов
и как их избежать?
28. Какие препараты применяются для неспецифической иммунокоррекции и каков механизм их действия?
92