МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЧАСТНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ

СМОЛЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ
Методические указания
к практическим занятиям по частной
микробиологии и вирусологии
СМОЛНЕНСК. 2015 год.

2
Под редакцией профессора Е.А.Федосова
В составлении пособия принимали участие преподаватели кафедры:

О.В.Азовскова, Е.Д. Гусева, В.С.Дукова, М.В.Егорова, Г.Г.Захарова,
С.В.Кирюшенкова, Р.С.Козлов, А.Федосов, Н.А.Фролова.
СМОЛЕНСК. 2015 год.
Рецензенты:
д.м.н., профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней СГМУ
М.М. Храмцов;
д.м.н., профессор, заведующий куафедрой биологии СГМУ А.С.Соловьѐв
Методические указания к практическим занятиям по частной микробиологии

и вирусологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов.
Под редакцией профессора д.м.н. Е.А.Федосова. 114 с.
Смоленск: Смоленский государственный медицинский университет, 2015 г.

3
ЗАНЯТИЕ №1
Тема:
 Патогенные кокки. Микробиологическая диагностика стафилококковых и
стрептококковых инфекций
План занятия:
1. Стафилококки и стрептококки: классификация, биологические свойства,
микробиологическая диагностика вызываемых ими заболеваний.
2. Микробиология скарлатины, ревматизма и гломерулонефрита.
3. Пневмококковая инфекция.
4. Особенности лабораторной диагностики сепсиса.
5. Препараты для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и
стрептококковых инфекций.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ:
Род Staphylococcus относитсят к семейству Micrococcaceae. Включает в себя 33
вида. Эти бактерии распространены повсеместно, колонизируют кожные покровы и
слизистые оболочки человека и животных, выделяются из воздуха, предметов
окружающей среды, особенно в условиях больничного стационара. Грамположительны,
каталазоположительны, факультативные анаэробы. Неприхотливы к питательным средам,
хорошо растут на средах с повышенной концентрацией NaCl.
Наибольшей патогенностью обладают коагулазоположительные стафилококки
(S. аureus), имеющие наибольшее значение в патологии человека. Большинство других
видов стафилококка относятся к коагулазоотрицательным, из них наибольшее значение
как возбудители заболеваний имеют менее патогенные S. еpidermidis, S. haemolyticus, S.
saprophyticus, поражающие в основном ослабленных лиц со сниженной
иммунологической защитой.
Стафилококки вызывают разнообразные гнойно-воспалительные поражения всех
органов и тканей человеческого организма. Наиболее часто встречается инфекция
кожных покровов. Они вызывают также пневмонию, септицемию, менингит, абсцессы
различной локализации, флегмоны, маститы, остеомиелиты, глазные инфекции, отиты,
пищевые отравления и др. При инфекциях мочевыводящей системы довольно часто
высеваются S.epidermidis и S. haemolyticus. Эти микроорганизмы могут служить также
причиной нозокомиального сепсиса и пневмоний у новорожденных и у других
ослабленных больных.
4
Патогенное действие стафилококков осуществляется за счет компонентов клеточной
стенки бактерий (тейхоевые кислоты и белок А) и микрокапсулы, при помощи токсинов и
ферментов.
Тейховые кислоты стимулируют воспалительную реакцию организма и усиливают
адгезию бактерий. Белок А золотистого стафилококка способен к неспецифическому
соединению с Fc-фрагментом IgG, в связи с чем инактивирует комплемент и тормозит
опсонизацию.
Ферменты: каталаза, коагулаза, гиалуронидаза, фибринолизин, ДНК-аза, лецитиназа и
др. Каталаза защищает бактерии от фагоцитоза, липаза и гиалуронидаза способствуют
проникновению бактерий в ткани и их адгезии. Плазмакоагулаза осуществляет
свертывание белков крови, способствуя этим образованию защитного слоя вокруг
микробной клетки, что защищает их от фагоцитоза, а свертываемость периферической
кровм при этом может снижаться. S. аureus в отличие от других видов стафилококков
обладает способностью ферментировать маннит в анаэробных условиях.
Золотистые стафилококки выделяют ряд экзотоксинов: гемолизин, эксфолиатины,
лейкоцидин, токсин синдрома токсического шока (TSST-1), энтеротоксины. Гемолизины
помимо их гемолитического действия на эритроциты обладает кардиотоксическим
действием, вызывая спазм коронарных сосудов и остановку сердца. Эксфолиатины А и В
способствуют возникновению синдрома «ошпаренной кожи», чаще всего у
новорожденных детей. Энтеротоксины A-F ответственны за развитие пищевой
бактериальной интоксикации. Штаммы золотистого стафилококка, продуцирующие
токсин TSST-1, вызывают синдром токсического шока, проявляющегося высокой
температурой, рвотой, диареей, появлением скарлатиноподобной сыпи, падением
артериального давления, что может приводить к гибели больного. Данный синдром
иногда разивается у менструирующих женщин, пользующихся специальными тампонами,
которые могут способствовать размножению вегетирующих во влагалище стафилококков.
Повсеместное распространение стафилококков способствует развитию как
эндогенной, так и экзогенной инфекции. Особую опасность представля.ют так
называемые госпитальные штаммы стафилококка, обладающие высокой вирулентностью
и полирезистентностью к антиимкробным препаратам. Основным источником таких
штаммов являются бактерионосители. Выделяемые от них бактерии как правило содержат
плазмидные факторы персистенции (антилизоцимный, антиинтерфероновый,
антикомплементарный), направленные на инактивацию защитных механизмов хозяина,
что обеспечивает длительное переживание бактерий и создает основу резидентного
бактерионосительства.
5
В клинической эпидемиологии с целью установления источника и путей
распространения патогенные стафилококки типируют с помощью стандартного набора из
20 бактериофагов, разделенных на 4 группы.
Бактерии семейства Streptococcaceae образуют 7 родов: Streptococcus, Enterococcus,
Aerococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus. Многие из них входят в состав
резидентной микрофлоры организма человека и животных, колонизируют кожу и
слизистые оболочки, пищеварительный тракт, дыхательные и половые пути. Некоторые
могут вызывать также разнообразные инфекции, в том числе и опасные для жизни.
Наибольшее значение имеют стрептококки и энтерококки, а остальные вызывают
спорадические или редкие случаи заболевания.
Стрептококки - это грамположительные каталазонегативные кокки. Первичная
идентификация стрептококков основана на их гемолитической активности на кровяном
агаре: α-гемолитические (зеленящие) стрептококки дают частичный гемолиз и
позеленение среды, β-гемолитические стрептококки вызывают полный гемолиз, γ-
гемолитические стрептококки дают гемолиз, визуально необнаруживаемый. Видовая
идентификация стрептококков осуществляется на основании результатов биохимических
и серологических тестов. Наибольшее распространение получила классификация
стрептококков по антигенной структуре Лэнсфильд и Гриффитса. Согласно этой
классификации стрептококки разделены на серологические группы по
группоспецифическому полисахаридному антигену С. Серогруппы обозначают
заглавными латинскими буквами и определяют с помощью реакции преципитации.
Внутри группы стрептококки разделяют на серовары по специфичности белковых М-, Р-
и Т-антигенов, которые определяют с помощью реакции агглютинации с типовыми
агглютинирующими сыворотками. Типовым видом стрептококков группы А является
S.pyogenes (β-гемолитический стрептококк группы А).
Стрептококки могут вызывать различные по локализации и степени тяжести
инфекции. Бета-гемолитический стрептококк группы А S.pyogenes вызывает у человека
фарингиты, хронические тонзиллиты, раневые инфекции, поражения кожи и мягких
тканей, синдром токсического шока, рожу и др. Некоторые штаммы пиогенного
стрептококка вырабатывают эритрогенный токсин, продукция которого кодируется
лизогенным фагом, и вызывают скарлатину. Эти инфекции опасны также развитием
иммунологически–опосредованных осложнений, таких как ревматизм и
гломерулонефрит, обусловленные перекрестным связыванием антистрептококковых
антител с клетками организма человека.
Факторами патогенности стрептококков группы А являются:
6
- адгезины (в частности, липотейхоевая кислота);
- белок М препятствует реализации фагоцитарных реакций и способствует развитию
аутоиммунопатологии;
- капсула защищает стрептококки от фагоцитов;
- фермент С5а-пептидаза инактивирует С5а-компонент комплемента, тем самым
подавляет активность фагоцитов;
- ферменты стрептолизин О и стрептолизин S разрушают эритроциты и другие клетки;
- фермент стрептокиназа активирует плазминоген, что приводит к растворению
фибриновых волокон;
- ДНК-азы и НАД-азы;
- эритрогенные токсины проявляют пирогенную активность и обусловливают
высыпания на коже.
Стрептококки группы В колонизируют носоглотку, ЖКТ, влагалище. Типовой вид –
S.agalactiae. Стрептококки группы В наиболее часто вызывают послеродовые инфекции,
эндокардиты, менингиты у новорожденных, неонатальный сепсис, инфекции
мочеполовых путей.
Негемолитические стрептококки (S.anginosus, S.mitis, S.sanguis, S.mutans,
S.salivarius, S.orais, S.bovis) дают неполный γ-гемолиз (за исключением S.anginosus). Их
ещѐ обозначают как оральные и зеленящие стрептококки. Они входят в состав микробных
ценозов ротовой полости и кишечника человека, но способны вызывать
оппортунистические инфекционные заболевания. Основную их часть составляют
бактериальные эндокардиты. Кроме того, они вызывают раневые инфекции, бактериемию,
абсцессы легких, печени, головного мозга. Способность вызывать эндокардиты
обусловлена особенностями строения клеточной стенки, облегчающей адгезию
стрептококков на поверхности клапанов.
Стрептококки биогруппы mutans содержат поверхностный белок, связываюший
гликопротеины слюны на поверхности зубов, и совместно с другими бактериями, в
основном с лактобациллами, образуют бактериальными бляшки на зубах. В дальнейшем
они образуют молочную кислоту из сахарозы, в отличие от других бактерий, даже при
низких значениях рН, что вызывает деминерализацию зубов.
Пневмококки и зеленящие стрептококки лишены групповых антигенов, поэтому не
включены в какую-либо серогическую группу.
Пневмококк - S.pneumoniae - не содержит группового антигена и серологически
неоднороден: по капсульному полисахаридному антигену выделяют 84 серовара.
Пневмококк – один из основных возбудителей бактериальных пневмоний,
регистрируемых вне стационара чаще всего у детей и лиц преклонного возраста. Он
может вызывать также бактериемию, эндокардиты, менингиты, артриты, синуситы, отиты.
7
Факторы вирулентности пневмококков: капсула, субстанция С (тейхоевая кислота
клеточной стенки взаимодействует с С-реактивным белком).
Энтерококки реагируют с сыворотками группы D, но они выделены в отдельный род
(17 видов) по стрептококковому антигену – глицеринтейхоевой кислоте. Энтерококки
обитают в кишечнике человека и животных, могут вызывать раневые инфекции,
бактериемии, пневмонию, эндокардит, менингит, перитонит, поражения
мочевыделительной системы. Наиболее часто поражения вызывают E. faecalis, E.faecium и
E.durans. В настоящее время они являются одними из самых частых возбудителей
госпитальных инфекций. Наибольшую тревогу вызывает высокая резистентность этих
микроорганизмов к антибиотикам, включая гликопептиды.
Поскольку энтерококки являются постоянными обитателями кишечника человека, они
используются в качестве санитарно-показательных микробов. Энтерококки отмирают во
внешней среде значительно раньше, чем E.coli, поэтому они всегда свидетельствуют о
свежем фекальном загрязнении. По количеству энтерококкои в сочетании с кишечной
палочкой судят о массивности фекального загрязнения.
Энтерококки устойчивы к неблагоприятным внешним воздействиям, в том числе к
нагреванию до 65°С в течение 30 мин., что делает их показателем термической обработки
или пастеризации. Их усточивость к высоким концентрациям NaCl (6,5-17%) и к
колебаниям рН от 3 до 12 позволяет использовать в качестве индикатора при
исследовании морской воды, соленых и кислых продуктов.
Грамположительные бактерии родов Peptostreptococcus (P.anaerobius, P.magnus) и

Peptococcus (P.niger) растут в анаэробных и микроаэрофильных условиях, образуя
большое количество молочной каислоты. Входят в состав микробиоценозов полости рта,
верхних дыхательных путей,толстой кишки и влагалища. Могут вызывать смешанные
эндогенные анаэробные инфекции: плевропневмонии, внутрибрюшинные абсцессы,
гинекологические поражения и послеродовой сепсис,
Цель занятия:
1. Ознакомить студентов с патогенными стафилококками и стрептококками, их
морфологией и критериями патогенности.
1. Изучить принципы лабораторной диагностики кокковых инфекций.
2. Ознакомиться с методами и целью установления источника "госпитальных"
штаммов возбудителей стафилококковой и других кокковых инфекций.
3. Научить студентов правильному подбору бакпрепаратов для диагностики, лече-
ния и профилактики заболеваний, вызванных патогенными кокками.
8
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Стафилококки, стрептококки. Таксономия и классификация. Биологические свойства.
Характеристика токсинов и ферментов патогенности.
2. Особенности патогенеза скарлатины, ревматизма, гломерулонефрита.
3. Методы микробиологической диагностики.
4. Препараты для специфической профилактики и терапии.
5. Роль стафилококка и других грам-положительных кокков в госпитальных инфекциях.
Уметь:
1. Дифференцировать кокки в микропрепаратах;
2. Определять критерии патогенности кокков;
3. Оценивать результаты фаготипирования стафилококков;
4. Оценивать результат иммунологических реакций при ревматизме;
5. Классифицировать бакпрепараты в соответствии с их назначением.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
При заболеваниях стафилококковой этиологии микроскопия мазка имеет
ориентировочное значение. Микробиологическая диагностика основана на выделении
чистой культуры возбудителя и определении его патогенных свойств. Для
транспортировки материала в лабораторию можно использовать среды с повышенной (5-
10%) концентрацией NaCl, на которых стафилококки хорошо сохраняются. Для
выделения стафилококков используют молочно-желточно-солевой агар, кровяной агар,
простой или сахарный бульон, можно с добавлением тиогликолята. Патогенные штаммы
на кровяном агаре вокруг колоний образуют зону гемолиза. На ЖСА часть патогенных
стафилококков вызывает лецитовителлазную реакцию, проявляющуюся в образовании
вокруг колонии зоны помутнения.
Идентификацию чистой культуры стафилококка производят на соновании изучения
морфологии колоний, продукции пламокоагулазы, гемолизина, способности
ферментировать углеводы в анаэробных условиях (проба Хью-Лейфсона), изучения их
чувствительности к антибиотикам. Для этой цели применяют микро-систему СТАФИ-тест
16 фирмы Lachema. Она представляет пластмассовую пластину, содержащую 96 ячеек с
высушенными питательными средами и субстратами для 8 ключевых тестов: глицерол,
сахароза, трегалоза, манитол, уреаза, ацетоин, фосфатаза и нитраты.
Антибиограмма выделенной культуры также может быть использована для ее
идентификации. Чувствительность к новобиоцину служит дифференциальным тестом для
9
S. еpidermidis (чувствителен) и S. saprophyticus (устойчив). К полимиксину В обычно
резистентны клинические штаммы S. аureus и S. еpidermidis, а метициллинрезистентные
штаммы стафилококка обычно устойчивы ко всем остальным антибиотикам, в том числе к
беталактамным. Стафилококки, устойчивые к фузидину, выделяются чаще всего от
бактерионосителей. Такие штаммы обладают также и другими персистентными
характеристиками (антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной,
антифагоцитарной активностью).
Плазмидный профиль и анализ рестрикции эндонуклеазы плазмид также может
быть использован для идентификации штаммов стафилококков, так как каждый штамм
имеет специфический плазмидный профиль.
Большое значение имеет эпидемиологическая идентификация, направленная на
определение идентичности штаммов, выделенных из разных источников, что важно для
установления источника заражения (выявление носителей), пути передачи возбудителя.
Для золотистого стафилококка применяют метод фаготипирования, основанный на
избирательной чувствительности этих микробов к литическому действию
стафилококковых бактериофагов, составляющий международный набор типовых фагов.
В качестве эпидемических маркеров можно использовать также антибиограмму и
плазмидный профиль стафилококков.
Для экспресс-диагностики S.aureus при бактериологическом исследовании
материала, взятого из носоглотки, отделяемого уха, раневых выделений, из молока, кала
используется агглютинация бараньих эритроцитов, сенсибилизированных фибриногеном.
Этот метод не применяется для идентификации S.aureus, выделенного из крови, из-за
возможной реакции с фибриногеном крови.
Для изучения этого явления к одной капле взвеси S.aureus добавляют 1 каплю
стабилизированных бараньих эритроцитов, сенсибилизированных фибриногеном. К
другой капле взвеси S.aureus добавляют контрольные бараньи эритроциты. Учѐт реакции
проводится через 15 секунд. Чѐткая реакция агглютинации с опытными эритроцитами при
отрицательной реакции с контрольными эритроцитами указывает на наличие S.aureus в
исследуемом материале.
При бактериологическом методе исследования культуру стрептококков выделяют на
кровяном агаре. Через 24 часа стрептококки группы А дают полный гемолиз. На жидкой
среде – придонный или пристеночный рост. В мазках выявляют типичные
грамположительные кокки, образующие цепочки. Но возможны и формы, напоминающие
коринебактерии или лактобациллы, или грамотрицательные формы. Стрептококки могут
образовывать L-формы. Для дифференцировки в кровяной агар добавляют пенициллин:
10
стрептококки принимают сферическую форму, а лактобациллы сохраняют вытянутую
форму.
Стрептококки группы А чувствительны к бацитрацину и гидролизуют паррамидонил-
β-нафтил-амид (ПИР-тест).
S.pyogenes можно выявить в мазках из зева, используя коммерческие наборы.
Групповой антиген экстрагируют химическими реагентами или ферментами и
идентифицируют в реакциях латекс-агглютинации, коагглютинации или ИФА.
Стрептококки группы В нечувствительны к бацитрацину и разлагают гиппурат.
Серотипирование проводят в реакции латекс-агглютинации или коагглютинации.
Серологические тесты используют для определения иммунного ответа (наличие
антитетл) пациентов на внеклеточные продукты (стрептолизин О, гиалуронидаза и
стрептокиназа) и клеточные компоненты (М белок, антиген группы А) гемолитических
стрептококков. Эти тесты используют для подтверждения инфекции у пациентов, у
котррых нет документально подтвержденной инфекции, но имеются клинические
проявления (ревматическая лихорадка, гломерулонефрит).
На основании морфологических и культуральных свойств трудно дифференцировать
пневмококки от зеленящих стрептококков. Кроме ланцетовидной формы диплококков
для S. pneumoniae характерны:
- наличие капсулы в нативном материале,
- растворение желчью,
- расщепление инулина,
- высокая вирулентность для белых мышей.
Культуры S.pneumonia, выделенные из полостей, можно серотипировать в реакции
латекс-агглютинации или коагглютинации.
При лабораторной диагностике сепсиса кровь, взятую шприцем из локтевой вены в
объеме 5-10 мл, с соблюдением правил асептики сеют у постели больного во флакон с
сахарным бульоном (в соотношении 1: 10) или комбинированной средой (скошенный
сахарный агар + сахарный бульон). Микроскопия выросшей культуры дает
предварительный ответ. С сахарного бульона производят пересев на кровяной агар.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Какие заболевания вызывают стафилококки?
2. Как классифицируют стафилококки?
3. Какие факторы патогенности стафилококков вы знаете?
4. Как определить наличие энтеротоксина и летального токсина у стафилококков?
5. По каким признакам дифференцируют золотистый стафилококк?
6. Как определить наличие гемолизина и некротоксина у стафилококков?
11
7. Как поставить реакцию плазмокоагуляции?
8. Как поставить пробу на ДНК-азу?
9. Как провести лабораторную диагностику стафилококковой пневмонии?
10. Как диагностировать стафилококковое бактерионосительство?
11. Какие плазмидные факторы патогенности способствуют персистенции стафилококков
в организме при бактерионосительстве?
12. Какие бакпрепараты для специфической профилактики и лечения стафилококковых
инфекций вы знаете?
13. Какие заболевания вызывают стрептококки?
14. Назовите семейство, род и наиболее часто встречающиеся виды патогенных
стрептококков.
15. В чем заключается принцип классификации стрептококков по антигенной структуре?
16. Как классифицируются стрептококки по Шотмюллеру?
17. Как осуществляется лабораторная диагностика стрептококковых заболеваний?
18. Какие факторы указывают на роль стрептококка в этиологии скарлатины?
19. С какой целью и как ставят реакцию Дика?
20. Какова роль стрептококка в этиологии ревматизма?
21. С какой целью определяют анти-О-стрептолизины при ревматизме?
22. Какие заболевания ваызывают пневмококки, по каким признакам их идентифицируют?
23. Какие виды стрептококков чаще всего участвуют в патогенезе кариеса?
24. Какие заболевания вызываают энтерококки, какова их классификация, по каким
признакам их идентифицируют?
25. Энтерококки как санитарно-показательные микробы. О чем свидетельствует их
обнаружение во внешней среде?
25 .Как провести лабораторную диагностику сепсиса, вызванного грамположительными
кокками?
ЗАНЯТИЕ №2
Тема:
 Микробиологическая диагностика менингококковой и гонококковой инфекции.
 Синегнойная инфекция.
1. Менингококковая инфекция: возбудители, их свойства, материал для исследования,
лабораторная диагностика.
2. Гонококки: биологические свойства, заболевания, вызываемые ими, материал для
исследования, микробиологическая диагностика.
12
3. Синегнойная палочка: свойства, заболевания, материал для исследования, методы
лабораторной диагностики.
4. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения менингококковой,
гонококковой и синегнойной инфекции.
5.Программированный контроль по разделу «Пиогенные кокки и синегнойная
инфекция».
Менингококки и гонококки - грамотрицательные кокки. Они обладают более выраженной
органотропностью по сравнению со стафило- и стрептококками. Эти кокки относятся к
семейству Neisseriaceae, роду Neisseria.
1. Neisseria meningitidis при заражении человека колонизирует заднюю стенку
носоглотки и, в зависимости от вирулентности штамма и резистентности зараженного
лица, вызывает бессимптомное носительство, назофарингит и генерализованные формы –
менингококцемию (сепсис) или менингит. Еще несколько видов нейссерий входят в
состав нормальной микрофлоры носоглотки: N.subflava, N.perflava, N.flavascens,
N.mucosa, N.sicca, N.lactamica. Некоторые из них выделяются при гнойных менингитах,
отитах, синуситах у ослабленных лиц. Кроме того, нейссерии содержат аллергены,
которые могут быть причиной аллергический заболеваний (астмы). В зависимости от
капсульного полисахарида менингококки делятся на серологические группы А, В, С, Х, Y,
Z, 29E, W-135 и др.
2. Гонококк Neisseria gonorrhoeae является возбудителем внерического
заблолдевания гонореи и гонококковой бленореи. Материалом для исследования на
гонококк служит гной и отделяемое уретры мужчин и женщин, отделяемое влагалища, а
также слизь с поверхности носоглотки, миндалин и прямой кишки (при подозрении на
экстрагенитальную гонорею).
3. Синегнойная палочка – Pseudomonas аeruginosa. Относится к семейству
Рseudomonadасеае, роду Pseudomonas, входящие в группу грамотрицательнызх
неферментирующих бактерий, т.е. неспособных осуществлять процессы брожения
(расщепление углеводов в анаэробных условиях). Это условнопатогенный микроб,
строгий аэроб, крайне неприхотлив и широко встречается во внешней среде. Он легко
контаминирует жидкости (дистиллированную воду в бутылях, антисептики, инфузионные
растворы, глазные капли, мыльные растворы и др.), являясь источником
внутрибольничных инфекций. При патологии часто выделяют из гноя при раневой
инфекции, при отитах, септицемии, инфекции глаз, урогенитальнного и респираторного
13
тракта. Наиболее часто выделяют у ожоговых больных. При синегнойной инфекции
перевязочный материал и гной окрашиваются в сине-зеленый цвет. Основной метод
диагностики - бактериологический.
1. Ознакомить студентов с биологическими свойствами грамотрицательных гноеродных
кокков (гоно - и менингококки) и с палочкой синезеленого гноя. Изучить принципы их
лабораторной диагностики.
2. Ознакомить с бакпрепаратами, применяемыми для диагностики, лечения и
профилактики заболеваний, вызванных патогенными нейссериями и палочкой
синезеленого гноя.
Знать:
 Патогенные (менингококки, гонококки) и непатогенные нейссерии. Таксономия.
Биологические свойства. Характеристика токсинов и ферментов патогенности.
Методы микробиологической диагностики. Препараты для диагностики,
специфической профилактики и терапии.
 Неферментирующие грамотрицательные бактерии: палочка синезеленого гноя.
Таксономия, билогические свойства. Роль в возникновении госпитальных
инфекций.
 Методы микробиологической диагностики. Препараты для специфической
профилактики и лечения.
Уметь:
1. Оценивать результаты микроскопирования микропрепаратов из гноя при острой
гонорее;
2. Оценивать результаты посева гноя при псевдомонадной инфекции на питательные
среды;
3. Классифицировать бакпрепараты в соответствии с их назначением
МЕТОДИЧЕСКИЕУКАЗАНИЯ:
1. Питательные среды для патогенных нейссерий должны быть богаты
аминокислотами, витаминами (кровяные, сывороточные, желточные среды) и
свежеприготовленными (хранение в холодильнике не более 1суток), перед
употреблением их подогревают в термостате. Бессывороточная среда Мюллера-Хинтона
содержит полный набор аминокислот и мясной экстракт как источник факторов роста.
При подозрении на менингококковую инфекцию материалом для исследования служит
ликвор и кровь (менингит и сепсис), носоглоточная слизь при назофарингите и
14
обследовании на бактерионосительство. Носоглоточную слизь берут с задней стенки
глотки ватным тампоном, закрепленном на клюшкообразном проволочном держателе.
Материал отправляют в лабораторию немедленно, не допуская охлаждения в утепленных
(30°-37°С ) контейнерах так как менингококки очень чувствительны к колебаниям
температуры. Для транспортировки материала свыше 3-х часов используют любой
питательный бульон или 2% пептонную воду с добавлением 5,0 мкг линкомицина на 1 мл
среды с целью подавления грамположительной флоры.
При бактериоскопическом исследовании спиномозговой жидкости и крови мазки
окрашивают анилиновыми красителями. Одновременно с бактериоскопией проводят
бактериологическое исследование. Слизь из носоглотки засевают на среды с добавлением
ристомицина, в отличие от менингококков способного подавлять рост других,
непатогенных нейссерий. Кроме того, последние могут расти на простых питательных
средах при температуре t°=22C, а N.meningitidis растѐт только на богатых средах при
t°=35-37°C.
Спиномозговую жидкость засевают на поверхность подогретого сывороточного
агара. Посев культивируют при t°=37°C и повышенном содержании СО2.
Для обнаружения менингококка в крови производят посев в сахарный бульон в
соотношении 1:10, а через сутки высевают на сывороточный агар. Независимо от
посевного материала, выделенную культуру идентифицируют по культуральным,
морфологическим, биохимическим свойствам. Серовар менингококка определяют только
с эпидемиологической целью. Для серологической диагностики применяют РНГА с
эритроцитами, сенсибилизированными группоспецифическими полисахаридами.
Экспресс-диагностика осуществляется с помощью реакции преципитации в геле,
встречного иммуноэлектрофореза, радиоиммунологического метода. Метод основан на
обнаружении в крови или спиномозговой жидкости специфического антигена.
2. В остром периоде гонореи показано бактериоскопическое исследование гноя
(окраска 1% водным раствором метиленового синего), которое дает характерную картину
незавершенного фагоцитоза при микроскопии. И это бывает достаточно для постановки
диагноза. В связи с тем, что в исследуемом материале, особеннос при хронической
гонореи, могут находиться и другие грамотрицательные бактерии, применяют прямой и
непрямой методы иммунофлюоресценции.
При хронической гонорее персистирующие в организме бактерии наиболее
подвержены полиморфизму (встречаются мелкие и крупные клетки, а также
палочковидные формы), отделяемое у больного очень скудное или совсем отсутствует.
Поэтому основным методом исследования при хронической форме болезни является
15
бактериологический, который наиболее эффективен после провокации, (химической,
механической, алиментарной, биологической), т.е. искусственного обострения. Для роста
необходимы свежеприготовленные влажные питательные среды с добавлением нативных
белков крови (например, агар Маклеода), сыворотки или асцитической жидкости.
Колонии, подозрительные на гонококковые, испытывают на наличие оксидазы.
3. При подозрении на синегнойную инфекцию используют бактериологический метод.
Элективной средой является ЦПХ. Идентификацию проводят по ряду тестов:
- наличие зеленого пигмента в щелочной или нейтральной среде или красного - в кислой;
- от культуры исходит запах жасмина, фиалки;
- положительный тест на оксидазу: на индикаторную бумагу петлей вносят культуру,
через 1-2 минуты появляется сине-фиолетовое окрашивание;
- окисление и ферментация глюкозы. Производят посев культуры уколом на среду Хью-
Лейфсона в две пробирки, одну из которых заливают вазелиновым маслом. Пробирки
выдерживают в термостате сутки. Изменение цвета среды из травянисто-зеленой в
желтый свидетельствует об окислении глюкозы. Под вазелиновым маслом цвет среды не
меняется; при микроскопии мазков обнаруживаются грамотрицательные подвижные
палочки.
1. Назовите семейство, род менингококков. Какие заболевания они вызывают?
2. Какие нейссерии входят в состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных
путей?
3. Как производят лабораторную диагностику менингококкового сепсиса и менингита?
4. Расскажите о правилах забора спиномозговой жидкости и ее доставки в лабораторию.
5. Как проводят лабораторную диагностику менингококкового носительства?
6. Как отличить менингококки от непатогенных нейссерий?
7. Назовите семейство, род гонококков. Какие заболевания они вызывают?
8. Что такое гонококковая бленнорея и как осуществить ее профилактику?
9. Как проводят лабораторную диагностику острой и хронической гонореи?
10. В каких случаях проводится провокация при гонорее и как это делается?
11. Назовите семейство, род и вид возбудителя синегнойной инфекции?
12. Как провести идентификацию синегнойной палочки?
13. Какие заболевания вызывает палочка синезеленого гноя и какова ее роль в
возникновении госпитальных инфекций?
14. Как проводится серотипирование менингококков и какое это имеет значение?
15. Как проводится специфическая профилактика менингококковой инфекции?
16
16. Каковы трудности антимикробной терапии гонореи и псевдомонадной инфекции?
ЗАНЯТИЕ №3
ТЕМА:
 Энтеробактерии. Микробиологическая диагностика эшерихиозов.
1. Классификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.
2. Общая характеристика бактерий семейства Enterobacteriaceae.
3. Характеристика бактерий рода Esherichia, роль эшерихий в организме человека.
4. Заболевания, вызываемые эшерихиями.
5. Принципы, правила забора и доставки материала для микробиологического
исследования при эшерихиозах.
6. Микробиологическая диагностика эшерихиозов.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ.:
1. Семейство Enterobacteriaceae (кишечные бактерии) включают 30 родов,
объединяющих более 100 вида бактерий. Это небольшие подвижные или (реже)
неподвижные грамотрицательные споронеобразующие палочки. Некоторые имеют
капсулу. Энтеробактерии аэробы или факультативные анаэробы, каталазоположительны
и оксидазаотрицательны. Хорошо растут на простых средах, большинство из них
разлагают углеводы с образованием кислоты и газа.
Энтробактерии обитают на растениях и в почве, входя в состав микробных
ассоциаций кишечника животных и человека. Ряд видов вызывают желудочно-кишечные
заболевания (дизентерия, сальмонеллезы, брюшной тиф и паратифы, эшерихиозы,
иерсиниоз), чуму. Многие виды могут служить возбудителями оппортунистических
инфекций. Бактерии семейства Enterobacteriaceae служат причиной 50% случае
внутрибольничных инфекций. При этом 80% всех госпитальных изолятов энтеробактерий
составляют три «проблемных» вида: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae subsp.
рneumoniaе, Proteus mirabilis. Поражения у человека вызывают также бактерии родов
Shiqella, Salmonella, Citrobacter, Serratia и др.
Патогенность энтеробактерий определяется факторами вирулентности и
токсичности. Все энтеробактерии содержат эндотоксин, который освобождается после
разрушения микробных клеток. Помимо эндотоксина в патогенезе поражений участвуют
факторы инвазивности – жгутики, энтеробактины, интегрины; факторы адгезии –
микроворсинки, поверхностные белки, факторы, обеспечивающие выживание
17
бактерий в цитоплазме фагоцитов и сыворотке крови; ферменты и разнообразные
термостабильные и термолабильные энтеротоксины.
Для выделения энтеробактерий используется большой арсенал селективно-
дифференциальных и дифференциально-диагностических сред: Эндо, Левина,
Плоскирева, SS-агар, висмут-сульфит агар, «Протеус ППМ», «Клебсиелла 5-АСК» и др.
Многие из этих сред не обеспечивают первичной идентификации «проблемных»
бактерий, в связи с чем необходимо выделение их в чистой культуре и идентификация
широким набором тестов.
В лабораторной практике идентификация видов и биоваров энтеробактерий
проводится по их фенотипическим признакам. Основным и наиболее сложным разделом
идентификации является изучение биохимических свойств бактерий при помощи набора
тестов. Способность ферментировать глюкозу, восстанавливать нитраты до нитритов,
утилизировать углеводы по ферментативному типу и отсутствие оксидазы отличают
энтеробактерии от других грамотрицательных бактерий палочковидной формы.
Исследование ведут в два этапа. На первом этапе колонии отсевают на агар Клиглера или
Олькеницкого ( трехсахарный агар с мочевиной и с солями железа), На втором этапе
уточняют родовую и видовую принадлежность выделенных культур, для чего делают
посев на цитратный агар Симонсена, полужидкий агар ( под пробку этой пробирки
помещают бумажку на индол), среды с аминокислотами (фениаланином,
лизином,аргинином и орнитином), и по необходимости на среду Кларка и различные
среды Гисса с адонитом, инозитом, сорбитом, рамнозой. Вид выделенных культур
определяют при помощи набора тестов, четко идентифицирующих внутривидовые
различия энтеробактерий.
В случаях, когда возникает необходимость провести более тонкую
дифференциацию выделенных штаммов, их изучают в реакции агглютинации с
диагностическими сыворотками, определяя О-, Н-, К-, Vi-антигены и устанавливая
серотип.
Упростить трудоемкий процесс биохимической идентификации бактерий можно с
помощью микрообьемной технологи, поскольку она пригодна для автоматизации и
стандартизации исследований. При этом используются специальные микрообьемные тест-
системы для автоматических бактериологических анализаторов или различные
коммерческие тест-системы биохимической идентификации бактерий для визуального
учета.
Автоматические анализаторы имеют высокую стоимость, что ограничивает их
применение. Коммерческие микрообьемные тест-системы по устройству представлены
18
двумя группами: содержащими субстрат реакции в питательной среде (API 20E
«BioMeriux», Франция; Enterotest «Lacheмa», Чехия; «Рапид-энтеро 200», Нииэм Пастера,
ОНТ, г. СПб.) или в шаблоне-носителе, т.е. на бумажных дисках, которые вносят в лунки
планшетов с суспензией бактерий (Minitec).
Например, тест-система API 20E предназначена для биохимической
идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных палочек в течение 18-24
часов. Состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25
мл, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 тестов: уреазы,
сероводорода, индола, ацетоина, -галактозидазы, аргининдигидролазы; ферментации
углеводов и др. Для исследования берут изолированную колонию со среды первичного
посева, готовят из нее суспензию бактерий и вносят во все микропробирки по 100 мкл
суспензии. Посевы инкубирую при 36° С в течение 18-24 ч, результаты учитывают
визуально, заполняют бланки с кодами цифрового профиля. Идентификацию проводят по
кодам или идентификационной таблице. Для идентификации редких видов
энтеробактерий, не предусмотренных тест-системами, применяют дополнительные тесты.
2. Escherichia coli - – основной возбудитель эшерихиозов у человека. Различают
две клинические формы эшерихиозов - парэнтеральные и кишечные. Парентеральные
развиваются при ослаблении иммунной системы организма, возникают как аутоинфекция
и протекают в виде менингитов, пневмонии, отитов, циститов, пиелитов, холециститов,
перитонитов, септицемии и др. Среди возбудителей кишечных эшерихиозов в
зависимости от наличия факторов патогенности условно выделяют энтеропатогенные
эшерихии, энтероинвазивные, энтеротоксигенные, энтерогеморрагические,
энтероадгезивные.
Кишечные палочки, вызывающие парэнтеральные и кишечные эшерихиозы, имеют
одинаковые морфологические, тинкториальные, биохимические свойства, но отличаются
по антигенной структуре и факторам патогенности. Антигенная структура этих бактерий
мозаична. Выделяют: термостабильные липополисахаридные соматические 0-антигены,
капсульные полисахаридные К-антигены, термолабильные жгутиковые белковые Н-
антигены. По сочетанию ОКН-антигенов различают серовары. По структуре О-антигена
эшерихии делятся на 176 сероваров, по К-антигену - на 94 и по Н-антигену - на 57
сероваров.
Энтеропатогенные E. coli, являются возбудителями колиэнтеритов. Патогенез
поражений обусловлен адгезий бактерий на эпителии и повреждением микроворсинок
кишечника, но не инвазией в его клетки. Практически все серовары имеют плазмиду,
19
кодирующею синтез белка, обозначаемого как фактор адгезивности энтеропатогенных
Escherichia coli.
Заболевания чаще вызываются сероварами О26, О55, О111. Колиэнтериты
встречаются преимущественно у детей до 2x-лeтнeгo возраста. Особенно высока
заболеваемость среди новорожденных, недоношенных и ослабленных детей. Дети,
находящиеся на естественном вскармливании, менее восприимчивы к возбудителям
колиэнтеритов, т. к. в женском грудном молоке имеются иммуноглобулины Ig А,
являющиеся антителами к энтеропатогенным кишечным палочкам и продуктам их
жизнедеятельности. Наличие антител у детей, которые находятся на естественном
вскармливании способствует формированию местной невосприимчивости слизистой
кишечника к продуктам жизнедеятельности возбудителей колиэнтеритов (в частности, к
экзотоксину).
Энтероинвазивные E. coli обладают общими антигенами с шигеллами,
размножаются внутри эпителиальных клеток кишечника. Как и шигеллы, они
неподвижны и не способны ферментировать лактозу. Инфекции, вызванные ЕIЕС,
регистрируются редко, однако отдельные вспышки возможны. Заболевания вызывают
серовары О143, О144. Вызывают дизентериеподобные заболевания у детей старшего
возраста и у взрослых.
Энтеротоксигенные E. coli - основные возбудители «диарей путешественников»и
детских диарей в странах Третьего мира. Факторы патогенности – пили и фимбриальные
фактора (CFA/I, CFA/II, CFA/IV), способствующие колонизации нижних отделов тонкой
кишки и определяющих способность к токсинообразованию. Выделяют термолабильный
и термостабильный энтеротоасины. Эффект высокомолекулярного термолабильного
ттоксина аналогичен действию токсина холерного вибриона. Основные возбудители –
штаммы О6, О25, О153. Вызывают холероподобные заболевания с явлениями
дегидратации у детей и взрослых.
Энтерогеморрагические E. coli составляют небольшую группу бактерий,
вызывающих диарею с примесью крови (геморрагический колит) при полном отсутствии
лейкоцитов в испражнениях и признаков лихорадки. Помимо диарей бактерии вызывают
гемолитико- уремический синдром. Энтерогеморрагические E. coli выделяют цитотоксин,
образуют шигоподобный токсин 1 и шигоподобный токсин 2. Наиболее частыми
возбудителями бывают серовары О157:Н7 и О26: Н11.
Энтероадгезивные E. coli впервые выделенные в 1985 г. Бактерии не образуют
цитотоксины, не проникают в клетки эпителия, не имеют плазмидного фактора адгезии.
Своѐ название получили за счет быстрого прикрепления к поверхности клеток.
20
Кишечная палочка является основным санитарно-показательным микробом.
Обнаружение ее во внешней среде указывает на фекальное загрязнение.
1. Ознакомить студентов с классификаций бактерий семейства кишечных и
выработать у них представление о ролиэтих бактерий в возникновении острых
кишечных инфекций, чумы, оппортунистических и госпитальных инфекций.
2. Изучить общие принципы диагностики заболеваний, вызываемых бактериями
семейства кишечных
3. Изучить свойства эшерихий, выработать представление о роли кишечной палочки в
микробной экологии и инфекционной патологии человека. Изучить методы
лабораторной диагностики эшерихиозов.
4. Научить студентов правильному подбору бакпрепаратов для диагностики. Лечения
и профилактики заболеваний, вызванных эшерихиями.
Знать:
1. Современную классификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae и их роли в
инфекционной патологии.
2. Основные принципы диагностики заболеваний, вызываемых бактериями
семейства Enterobacteriaceae.
3. Характеристику биологических свойств бактерий рода Esherichia.
4. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при эшерихиозах.
5. Основные клинические проявления заболевания при эшерихиозных инфекциях.
6. Методы лабораторной диагностики эшерихиозов.
7. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей эшерихиозных колиэнтеритов по
морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам;
2. Классифицировать бакпрепараты в соответствии с их назначением и обосновать
применение эубиотиков при лечении колиэнтеритов.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ:
Бактериологический метод является основным при диагностике эшерихиозов, он
основан на определении антигенных свойств, а не на изучении биохимических признаков.
Исследуемый материал (испражнения, рвотные массы, отделяемое зева и носа, смыв с
рук) высевают на дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина, Ассель-
21
Либермана. Колонии энтеропатогенных эшерихии на среде Эндо имеют малиново-
красный цвет без металлического блеска, на среде Левина - темно-синий. Из
изолированных колоний готовят и микроскопируют мазки, ставят оксидазный тест и
ориентировочную ренакцию агглютинации (РА) с поливаленнтными ОК –
антисыворотками (ОКА, ОКБ, ОКС, ОКД и ОКЕ). Затем определяют принадлежность к О-
группе в РА с прогретой при 100С культурой (для разрушения К-Аг) и
адсорбированными О-антисыворотками. Остаток колонии, давшей агглютинацию,
пересевают на МПА или среды Клиглера, Олькеницкого. В дальнейшем проводят
идентификацию для определения родовой и видовой принадлежности возбудителя.
1. Современная классификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.
2. Какие заболевания вызывают бактерии семейства Enterobacteriaceae?
3. Какие биологические свойства лежат в основе идентификации бактерий кишечной
группы?
4. Какие дифференциально-диагностические среды применяются при диагностике
кишечных инфекций?
5. Биологические свойства, антигенная структура кишечной палочки, ее экологические
особенности и роль в патологии человека.
6. Какой биохимический признак позволяет ориентировочно отличить эшерихии от
сальмонелл и шигелл?
7. Какие серовары вызывают заболевания у детей раннего возраста и у взрослых?
8. Методы лабораторной диагностики колиэнгеритов.
9. Биопрепараты, применяемые для диагностики, профилактики и лечения
колиэнтеритов.
ЗАНЯТИЕ №4
Тема:
 Энтеробактерии. Микробиологическая диагностика сальмонеллезов (тифо-
паратифозного заболевания).
План занятий:
1. Классификация и характеристика бактерий рода сальмонелл.
2. Заболевания, вызываемые сальмонеллами.
3. Патогенез тифо-паратифозных заболеваний.
4. Методы микробиологической диагностики на разных стадиях болезни.
5. Серодиагностика тифо-паратифозных заболеваний.
22
6. Особенности бактерионосительства при тифо-паратифозных заболеваниях.
Значение РНГА с Vi-эритроцитарным диагностикумом для выявления
бактерионосительства.
7. Эпидемические маркеры бактерий брюшного тифа. Фаготипирование.
8. Биопрепараты, используемые для диагностики, специфической
профилактики и лечения тифо - паратифозных заболевания.
Сальмонеллы - большая группа бактерий, классификация которых претерпела

значительные изменения по мере совершенствования знаний об их антигенной
структуре и биохимических свойствах .В настоящее время для
дифференцировки сальмонелл применяют схему Кауфмана – Уайта., все
серовары сальмонелл обозначены цифрами и буквами, означающими различные
антигены. При серологической идентификации этих бактерий во внимание
принимаются лишь 3 основных антигена (О -, Н- и Vi - Аг). Все известные
серовары на основе соматических О- Аг разделены на 67 серогрупп: А (02), В
(04), С (07) и др. Число сероваров, выделяемых на основе жгутиковых (Н-) Аг,
постоянно увеличивается, в настоящее время их количество достигло 2 324. Все
серовары Salmonella, согласно IX изданию определителя бактерий Берджи,
относятся к двум видам. Salmonella bongori содержит менее 10 очень редких
сероваров. Все остальные 2 500 сероваров выделены внутри вида Salmonella
choleraesuis (enterica), который может быть по фенотипическим и генетическим
свойствам разделен на 6 подвидов: choleraesuis, salamae, arizonae, diarizonae,
indica и houtenea. Патогенностью в основном для теплокровных обладают
бактерии подвидов choleraesuis и salamae. Поражения человека разделяют на три
группы: брюшной тиф и паратифы, гастроэнтериты (пищевые токсикоинфекции)
и сальмонеллезы (бактеремии и септицемии). Заболевания регистрируются
повсеместно, природный резервуар большинства возбудителей – человек,
различные животные и птицы Способ заражения – алиментарный, основные
пути передачи – водный и пищевой.
Брюшной тиф и паратифы – острые инфекционные поражения кишечника,

сопровождающиеся бактериемией, поражением лимфатической ткани
кишечника, лихорадкой и явлениями общей интоксикации. Брюшной тиф и
паратиф А – типичные антропонозы (резервуар инфекции - человек);
возбудители паратифов В и С выделены также от некоторых животных и птиц.
23
Больной выделяет возбудителя с испражнениями, мочой и слюной носитель –
только с испражнениями. Основной механизм передачи – фекально-оральный.
Как самостоятельное заболевание паратиф С регистрируется редко, обычно у
пациентов с иммунодефицитными состояниями.
1. Изучить принципы лабораторной диагностики тифо-паратифозных
заболеваний.
2. Ознакомить с правилами применения бакпрепаратов для диагностики,
лечения и профилактики тифо-паратифозных заболеваний.
Знать:
1. Классификацию и характеристику биологических свойств возбудителей
тбрюшного тифа и паратифов.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при сальмонеллезных
инфекциях.
3. Основные клинические проявления заболевания при брюшном тифе и паратифах.
4. Принципы лабораторной диагностики.
5. Препараты для идентификации, лечения и профилактики перечисленных
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей сальмонеллезных инфекций по
морфологическим, биохимическим, агглютинабельным, фаголизабельным
свойствам;
2. Интерпретировать результаты серологических реакций;
Лабораторная диагностика тифо-паратифозного заболевания проводится с
учетом стадии болезни. Она основана на обнаружении возбудителя и/или сецифических
антител. Для выделения возбудителя исследуют: кровь (гемокультура), мочу
(уринокулыура), испражнения (копрокультура), желчь (биликультура), а также костный
мозг (миелокультура). Кровь больных можно исследовать во все периоды заболевания,
но чем раньше от начала заболевания произведено исследование, тем более вероятно
обнаружение возбудителя в крови. После 10-го дня заболевания для бактериологического
подтверждения диагноза можно производить исследование испражнений, мочи и желчи.
24
Со второй недели болезни возможно исследование сыворотки крови на
обнаружение в ней специфических антител. Реакция Видаля является наиболее
доступным серологическим методом диагностики. Диагностическая ценность РА
снижается тем, что она может быть положительной также у привитых и переболевших.
Поэтому следует ее ставить в динамике. Большую ценность имеет реакция с 0-
диагностикумом, а не с Н-антигеном, поскольку у переболевших и вакцинированных
титры 0- антител быстро снижаются ниже диагностических, а антитела к Н-антигенам в
таких же условиях могут выявляться длительное время. Наиболее чувствительной
реакцией для определения 0-антител, особенно для ранней диагностики, является РПГА с
очищенным 0-антигеном, сорбированном на бараньих эритроцитах. Реакция Vi -
агглютинации применяется для выявления хронических бактерионосителей. Для
выявления Vi-антител чаще применяют РПГА с эритроцитарным Vi-антигеном, поскольку
реакция с микробным диагностикумом оказалась недостаточно чувствительной.
Брюшнотифозные и паратифозные бактерии, содержащие Vi-антиген, лизируются
Vi-бактериофагами. Различают видоспецифические фаги Vi-1 и типоспецифические фаги
Vi-2. Причем среди брюшнотифозных бактерий выделяют 78 фаговаров, а среди
паратифозных А и В - по 6 фаговаров. В настоящее время принята схема фаготипирования
Крэйги и Феликса. Определение фаговаров у бактерий помогает установить источник,
пути и способы распространения инфекции.
Экспресс-диагностика вирулентности брюшнотифозных бактерий проводят
методом заражения монослоя клеток HeLa, HEP –2. Определяют цитопатический эффект.
Изучение фаголизабельности проводится по следующей методике: в 2 пробирки с МПБ
засевают культуру, в одну из них добавляют специфический бактериофаг (опытная),
вторая служат контролем. Засеянные пробирки помещают в термостат на 18-24 часа. Если
культура фаголизабельна, то в опытной пробирке роста нет, в контрольной отмечается
рост культуры. Фаготипирование брюшнотифозных бактерий проводят по Vi фагу. На
чашку с МПА методом газона засевают молодую бульонную культуру, чашку
подсушивают и на сухую поверхность помещают по капле Vi- фагов в тест-разведениях.
Посев помещают в термостат на 19-24 часа. Лизис отмечается там, где тип фага
соответствует культуре.
1. Современная классификации бактерий рода Salmonella.
2. Возбудители брюшного тифа и паратифов А, В и С и их свойства.
3. Источники и пути заражения при тифо-паратифозных заболеваниях.
25
4. Патогенез тифо-паратифозных заболеваний и методы лабораторной диагностики
соответственно стадиям развития болезни.
5. Динамика антителообразовалия в разные периоды заболевания брюшным тифом и
паратифами.
6. Серодиагностика тифо-паратифозных заболеваний. Серологические реакции,
используемые для серодиагностики тифо-паратифозных заболеваний, техника их
постановки и учет реакций.
7. Можно ли по результатам диагностических серологических реакций определить
период тифо-паратифозного заболевания, ранее перенесенную инфекцию и
поствакцинальные серологические сдвиги?
8. Особенности бактерионосительства при брюшном тифе. Значение РПГА с О- и с
эритроцитарными антигенами в диагностике тифо-паратифозных заболеваний.
9. Получение адсорбированных, монорепепторных сывороток.
10. Какие основные биохимические признаки сальмонелл учитываются при их
идентификации.
11. Патогенетические особенности и характер иммунитета тифо-паратифозных
12. Определение фаговаров сальмонелл. Практическое значение этого метода.
13. Биопрепараты, используемые для специфической профилактики, лечения и
диагностики тифо - паратифозных заболеваний.
14. Какие селективные и дифференциально-диагностические среды применяются при
культивировании и идентификации сальмонелл?
ЗАНЯТИЕ №5
Тема:
 Микробиологическая диагностика острых гастроэнтеритов (пищевых
отравлений бактериального происхождения).
1. Классификация пищевых отравлений бактериального происхождения.
2. Понятие о пищевых токсикоинфекциях и бактериальных интоксикациях.
3. Характеристика основных возбудителей токсикоинфекций и бактериальных
интоксикаций.
4. Патогенез пищевых токсикоинфекций и пищевых бактериальных токсикозов.
5. Принципы лабораторной диагностики бактериальных токсикоинфекций.
6. Принципы лабораторной диагностики бактериальных интоксикаций.
7. Особенности забора и доставки исследуемого материала.
26
8. Методы обнаружения экзотоксинов стафилококка и клостридий.
9. Биопрепараты, применяемые для диагностики, профилактики и лечения пищевых
токсикоинфекций и бактериальных интоксикаций.
В современных условиях пищевые отравления, чаще всего протекающие по типу
острого гастроэнтерита, вызываются многочисленными микробами семейства
Enterobactcriaceae, родов – Escherichia, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia:
семейства Vibrionaceae -V.parahaemolyticus; семейства Bacillaceae - B.cereus, Cl.
perfringens, Cl.botulinum, семейства Streptococcaceae –Е..faecalis; семейства
Pseudomondaceae -Ps.aeruginosa.
Острые кишечные заболевания, возникающие при употреблении пищевых
продуктов, в которых произошло быстрое размножение микроба-возбудителя и
накопление токсина, называются токсикоинфекциями.
Если пищевые отравления связаны с употреблением пищи, содержащей
бактериальные экзотоксины, накопившиеся в продукте в результате размножения и
жизнедеятельности микробов, то говорят о пищевых интоксикациях (бактериальный
токсикоз). Они обусловлены экзотоксинами: нейротоксин выделяют Cl.botulinum,
энтеротоксин продуцируют Cl.perfringens и S. aureus.
Пищевые токсикоинфекций наиболее часто вызываются бактериями рода
Salmonella. Эти микроорганизмы широко распространены в природе и вызывают
заболевания как у животных, так и у человека - сальмонеллез /антропонозы,
зооантропонозы/. По серологической классификации Кауфмана - Уайта сальмонеллы -
возбудители пищевых токсикоинфекций относятся к 4 группам - В, С, Д, Е. От человека
выделено более 700 сероваров, среди которых доминируют 12 сероваров: S.typhimurium
(S.breslau), S.ententidis, S.anatum и другие. В последнее время в родильных домах и в
детских стационарах участились случаи внутрибольничных сальмонеллезов, основными
возбудителями которых являются особые биовары -S.typhimuruium, S.derby и другие.
Биовары госпитальных штаммов S.typhimurium обладают плазмидной устойчивостью к
антибиотикам и малопатогенны для мышей.
В настоящее время пищевые токсикоинфекции нередко вызываются условно-
патогенными бактериями родов Klebsiella и Proteus при массовом обсеменении
продуктов. Эти бактерии являются представителями факультативной флоры человека и
могут высеваться от здоровых людей. Они выделяются также из испражнений крупного
27
рогатого скота, полевых и домашних мышей, крыс. Иногда их обнаруживают на овощах
и на других растениях.
Возбудителями пищевых токсикоинфекции являются также протей и клебсиеллы.
Факторами передачи инфекции могут быть различные продукты питания (молоко и
молочные продукты, рыбные и мясные продукты, особенно фарш, а также овощи и
фрукты). Наиболее восприимчивы к кишечной клебсиеллезной и протейной инфекциям
дети первого года жизни, особенно недоношенные и ослабленные, находящиеся на
искусственном вскармливании, а также взрослые пожилого возраста с пониженной
резистентностью организма.
Кроме пишевых отравлений, бактерии родов Proteus (Р.mirabilis) и Klebsiella
гораздо чаще бывают причиной госпитальных инфекций. Это условно-патогенные
бактерии.
Род Proteus представлен 4 видами: Р.mirabilis, P.vulgaris, P.penneri, P.myxofaciens.
протеи обитают в кишечнике многих позвоночных и безпозвоночных, широко
встречаются во внешней среде:почве, сточных водах, разлагающихся органических
остатках. Некоторые виды, особенно P.vulgaris и P.mirabilis. вызывают инфекции
мочевых путей, вторичные гнойно-воспалительные процессы при ожогах, хирургических
вмешательствах, аутоинфекции при иммунодефицитах. Для бактерий характерен феномен
роения с периодическими циклами миграции, приводящей к образованию
концентрических зон пленки на влажной поверхности твердой питательной среды (Н-
форма), особенно при температуре 20-22 °С. Внесение в среду ингибиторов (соли
желчных кислот, мочевины, высокой концентрации поваренной соли) обусловливает
рост в неподвижной, О-форме. Подвижность бактерий используют для выделения чистой
культуры посевом в конденсационную воду скошенного агара по Шукевичу. На среде
Эндо вырастают бесцветные лактозо-негативные колонии. Факторы патогенности:
адгезины, с помощью которых они могут фиксироваться на слизистой мочевыводящих
путей; фимбрии, вызывающие агглютинацию эритроцитов, уреаза, способствующая в
результате разложения мочевины возникновению местного воспалительного процесса,
образованию кристаллов, камней и застою мочи; гемолизины; протеазы, вызывающие
нарушению структуры иммуноглобулинов класса А и повышению проницаемости
сосудов.
Бактерии рода протея являются третьей после кишечной палочки и энтерококков
(по значимости) группой санитарно-показательных микробов. При этом P.vulgaris
обычно рассматривают как показатель загрязнения объекта органическими веществами
(так как его чаще обнаруживают на гниющих остатках), а P.mirabilis – как показатель
28
фекального загрязнения (так как его чаще обнаруживают в фекалиях). Присутствие
протеев в воде, пищевых продуктах, смывах свидетельствует о крайне неблагополучном
санитарном состоянии. Пищевые продукты, загрязненные протеем, обычно
выбраковывают, а воду, содержащую протей, нельзя пить.
Род Klebsiella включает 4 вида: K.oxytoca, K.planticola, K.terrigena и типовой вид
K.pneumonia с подвидами K.pneumonia, K.ozaenae, K.rhinoscleromatis. Это прямые
неподвижные грамотрицательные палочки, сбраживают лактозу, входят в состав
кишечного биоценоза, иногда встречаются в ротоглотке здоровых людей, широко
встречаются во внешней среде. У штаммов, выделенных от человека и животных обычно
имеется капсула, после пассажей на питательных средах она может утрачиваться. По
капсульному антигену они подразделяются на 82 серовара. K.oxytoca и K.pneumonia
вызывают оппортунистические инфекции в виде бактериемий, пневмонии, инфекций
мочевых путей , часто вызывают внутриутробные инфекции у новорожденных, у больных
в отделениях интенсивной терапии. K.ozaenae, K.rhinoscleromatis являются возбудителями
хронических заболеваний верхних дыхательных путей – озены и риносклеромы.
1.Изучить принципы лабораторной диагностики пищевых отравлений
бактериального происхождения.
2. Познакомиться с принципами подбора и применения бакпрепараты для
идентификации, лечения и профилактики пищевых отравлений бактериального
происхождения.
Знать:
1. Классификацию и характеристику биологических свойств возбудителей птщевых
токссикоинфекций и бактериальных токсикозов.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при пищевых
токсикоинфекциях и бактериальных токсикозах.
3. Основные клинические проявления заболевания при пищевых отравлениях
бактериального происхождения.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей сальмонеллезных инфекций по
морфологическим, биохимическим, антигенным и другим свойствам.
29
При микробиологической диагностике пищевых токсикоинфекции

бактериологический метод (выделение чистой культуры и ее идентификация) является
основным, а серологический (обнаружение антител в сыворотке больного) -
ретроспективным. Биологический метод (заражение лабораторных животных)
применяется для обнаружения экзотоксинов, используя при этом параллельно эффект
нейтрализации токсина антитоксической сыворткой.
Исследуемый материал (рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения,
кровь, мочу от больных и секционный материал от умерших, а также остатки пищи)
засевают на среды накопления и на специальные среды для выделения чистых культур
бактерий, которые могли послужить причиной пищевых отравлений.
Для выделения сальмонелл исследуемый материал засевают на селенитовую среду
накопления, а затем на дифференциально-диагностические среды Эндо и Левина.
При выделении условно-патогенных бактерий (клебсиелл, протея, стафилококка и
Cl.perfringens) определяют микробную обсемененность исследуемого материала. Для чего
готовят разведения 103 -104 и высевают по 0,1 мл каждого разведения на
соответствующие среды. Клебсиеллы выделяют посевом на среды Эндо, Левина, а
стафилококки хорошо растут на селективных средах (солевой бульон, ЖСА и МСА).
Протей определяют посевом материала по методу Шукевича. В конденсационную
воду свежескошенного агара высевают по 0,1 мл исследуемого материала из разведения
103 -104. Уже через 10 часов можно наблюдать «ползучий» рост бактерий по поверхности
скошенного агара.
Анаэробные бактерии выделяют при посевах материала на среду Китт-Тароцци.
Выделенные чистые культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным,
биохимическим, серологическим свойствам для определения родовой и видовой
принадлежности.
1. Современная классификация бактерий рода Salmonella.
2. Сальмонеллы - возбудители пищевых токсикоинфекций и их свойства.
3. Какие основные биохимические и антигенные свойства сальмонелл учитываются для
их идентификации?
4. Основные биологические свойства бактерий родов Klebsiella u Proteus.
30
5. Какова роль бактерий родов Klebsiella и Proteus в патологии человека?
6. В чем состоит отличие пищевых токсикоинфекций от бактериальных интоксикаций?
7. Какие бактерии могут вызывать бактериальные пищевые интоксикации?
8. Источники, пути передачи и патогенез пищевых токсикоинфекций и бактериальных
токсикозов.
9. Методы микробиологической диагностики пищевых отравлений.
10. Биопрепараты, применяемые для диагностики, лечения пищевых токсикоинфекций и
бактериальных интоксикаций.
11. Протеи как санитарно-показательные микроорганизмы. О чем свидетельствует
обнаружение этих бактерий в воде и других объектах внешней среды?
ЗАНЯТИЕ №6
Темы:
 Микробиологическая диагностика шигеллезов.

 Микробиологическая диагностика дисбактериозов
1. Характеристика бактерий рода Shigella.

2. Заболевания, вызываемые шигеллами.
3. Принципы, правила забора, доставки материала и методы микробиологического
исследования при шигеллезах.
4. Экспресс-метод с использованием флюоресцирующих антител и оценка
результатов.
5. Биопрепараты для диагностики, специфической профилактики и лечения
шигеллезов.
6. Нормальная микрофлора человека и. ее физиологическая роль.
7. Понятие о «дисбактериозе» и причины его формирования. Качественные и
количественные изменения при дисбактериозе.
8. Дисбактериоз кишечника, степени дисбактериоза, критерии оценки.
9. Микробиологическая диагностика дисбактериоза кишечника.
10.Бактерийные биологические препараты для лечения больных кишечными
инфекциями и дисбактериозом.
1. Дизентерия (шигеллез) - острая кишечная инфекция, вызываемая бактериями
рода Shigella, семейства Enterobacteriaceae. Возбудители болезни отличаются друг от
31
друга по степени патогенности, а также по антигенным и биохимическим свойствам. Род
образуют прямые неподвижные факультативно-анаэробные палочки. Они
оксидазаотрицательны и каталазаположительны.
Согласно международной классификации шигеллы подразделяются на 4 группы: А
- Sh. dysenteriae, В - Sh. flexneri , С - Sh. boydii, Д - Sh. sonnei. Внутри подгрупп А,В,С,
бактерии делятся на серовары. Шигеллы подгруппы D подразделяются на биовары, а в
пределах биовара отличаются по колициногенности. Современная дизентерия чаще
вызывается Sh.sonnei, на втором месте стоит Sh.flexneri и, как правило, протекает легко, а
тяжелые формы вызывают Sh. dysenteriae, поскольку эти бактерии продуцируют сильный
экзотоксин.
Единственный природный резервуар шигелл – человек. Источник инфекции –
больные лица или бактерионосители. Наибольшую опасность как источники
представляют больные стертыми и легкими формами дизентерии. Патогенез дизентерии
связан с проникновением и размножением микробов в эпителиальных клетках слизистой
толстого кишечника. Клинические проявления болезни обусловлены токсическими
веществами местно поражающими слизистую оболочку толстого кишечника и
оказывающими общетоксическое действие на весь организм. В патогенезе дизентерии
имеет значение возникающий кишечный дисбактериоз и развитие аллергии.
Основным методом диагностики является бактериологическое исследование
испражнений. Вспомогательными методами - иммунофлюоресцентный метод и
серологический (РА, РПГА, РСК, ИФА).
2. Макроорганизм и его микрофлора являются сбалансированной экологической

системой. В самом кишечном биоценозе существуют зависимые связи между отдельными
родами, видами бактерий. Нарушение биологического равновесия между микробной
флорой и организмом приводит к развитию микробного дисбаланса или дисбактериоза.
Дисбактериоз - это стойкое качественное и количественное изменение
микрофлоры, выходящее за пределы физиологической нормы, при этом отдельные
представители микробиоценоза получают преимущества для роста и размножения и
становятся доминирующими. Так при дисбактериозе кишечника исчезают (или снижается
их число) облигатные представители микробных ассоциаций и, с другой стороны,
увеличивается число энтеробактерий, отсутствующих или встречающихся в малых
количествах в норме. Это сопровождается нарушением нормальных, физиологических
функций микрофлоры кишечника. Снижается барьерная функция нормальной
микрофлоры, нарушается участие нормальной микрофлоры в ферментативных процессах,
синтезе витаминов, изменяются показатели неспецифических факторов защиты
32
организма. Всегда отмечается снижение числа облигатной микрофлоры, обладающей
высокой антагонистической активностью и развитие гнилостных микробов, гноеродных
(стафилококк и др.), грибов рода Candida.
Качественные изменения состава микробного пейзажа в кишечнике выражается в
изменении ряда свойств кишечной палочки -основного симбионта аэробной микрофлоры,
снижение ее антагонистических свойств, потеря ферментативной активности,
подвижности, появление гемолитических штаммов эшерихий.
Причины формирования микроэкологических нарушений:
1. Перенесенные кишечные заболевания (дизентерия, колиэнтериты и др).
2. Длительное применение антибиотиков, антисептиков, гормонов,
иммунодепрессантов, лучевой терапии.
3. Хронические воспалительные процессы, злокачественные опухоли.
4. Пребывание в замкнутых коллективах, работа на предприятиях с проф.
вредностями, однообразное питание и другие причины.
Дисбактериозы различают по локализации (полости рта, глотки, носа, кишечника,

кожи, влагалища) и по этиологии (кандидозный, псевдомонадный, стафилококковый,
энтеробактериальный и смешанный).
Степени дисбактериоза:
1 степень - латентная, компенсированная форма. Характеризуется незначительными
изменениями в аэробной части микробиоценоза (увеличение или уменьшение количества
кишечной палочки), бифидофлора и лактофлора не изменены. Кишечной дисфункции нет.
2 степень - субкомпенсированная форма. На фоне незначительною снижения
количества бифидобактерий выявляется количественное и качественное изменение
кишечной палочки или других условно-патогенных микроорганизмов.
3 степень - значительное снижение уровня бифидофлоры (106 - 107) в сочетании со
снижением лактофлоры и резким изменением уровня кишечных палочек. Среди УПФ
появляются патогенные микроорганизмы (например, гемолитические. E.coli).
4 степень - отсутствие бифидофлоры, значительное уменьшение лактофлоры и
изменение количества кишечной палочки (снижение или увеличение), возрастание числа
как облигатных, так и факультативных и не характерных для здорового человека видов
УПМ в ассоциациях. Выраженная дисфункция кишечника. Выраженные изменения в
анаэробной части состава микрофлоры.
Микробиологическая диагностика:
33
Диагноз дисбактериоза устанавливается повторным (с интервалом 5-7 дней)
бактериологическим исследованием с использованием количественного определения
видов и вариантов микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза. Исследование
на кишечный дисбактериоз проводится одновременно с исследованием по диагностике
острых кишечных заболеваний.
1. Изучить принципы лабораторной диагностики бактериальной
дизентерии и дибактериоза.
2. Научить правильно применять бакпрепараты для диагностики, лечения
и профилактики дизентерии и дибиозов..
Знать:
 Классификацию и характеристику биологических свойств возбудителей
бактериальной дизентерии; патогенез, восприимчивость и иммунитет при
дизентерии.
 Основные клинические проявления заболевания при дизентерии.
 Принципы лабораторной диагностики дизентерии.
 Препараты для идентификации, лечения и профилактики дизентерии.
 Причины возникновения и патогенез дисбактериозов.
 Лабораторная диагностика дисбактериозов.
 Препараты, применяемые для коррекции микрофлоры при дисбиозах.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей бактериальной дизентерии по биохимическим и
антигенным свойствам.
2. Интерпретировать результаты бактериологического исследования микрофлоры
кишечника.
3. Классифицировать бакпрепараты в соответствии с их назначением (при дизентерии и
дизсбиозах).
Исследование микрофлоры кишечника включает следующие этапы:
1. Забор и транспортировка материала, подготовка к посеву исследуемого материала.
Этот этап сопровождается заполнением карты обследуемого пациента;
2. Посев исследуемого материала на селективные питательные среды с последующем
определением количественного и качественного состава микрофлора;
3. Регистрация полученных результатов с рекомендациями врача – бактериолога.
34
Материал забирают из последней порции фекалий стерильным шпателем и
помещают в пробирку. От момента взятия материала не должно проходить более 2 –х
часов.
Анаэробная микрофлора.
\. Количественное содержание бифидобактерий определяют высевая 1,0 мл суспензии
из разведения. (105 – 1010) на полужидкую печеночную среду Блаурокк. Через 48 часов
инкубирования при Т= 37°С пастеровской пипеткой отбирают характерные колонии в
виде гвоздиков, комет, крупинок. При просмотре мазков, окрашенных по Граму,
учитывают разведение, при котором в мазке выявляются Гр+ палочки, слегка согнутые с
разветвлением на одном из двух концов, расположенные в виде римской цифры V или в
виде скоплений, напоминающих китайские иероглифы. Все бифидобактерии не образуют
индол и каталазу, не восстанавливают нитраты.
2. Посев на бактероиды производят из разведении 106 , 107 и 108 для детей и 108 и 109
для взрослых на анаэробный кровяной агар с канамицином и желчью. Сразу после посева
чашки со средами должны быть помещены в микроанаэростат с газовой смесью (5%
СО2,,10 % Н2, 85 % N2) и помещают в термостат 37 С на 72 часа. Учет посевов включает в
себя макроскопическое и микроскопическое изучение изолированных колоний и их
подсчет. Bacteroides fragilis образует блестящие, иногда слизистые, круглые колонии
диаметром 3-5 мм, бежевого или коричневого цвета.
3. Молочнокислые палочки (лактобациллы) выделяют на плотной среде МРС-4. Посев
производят по 0,05 (0,1) мл из разведении 103 и 107 .Чашки с посевами инкубируют в
анаэростатах с газовой смесью без палладиевых катализаторов при 37 С в течении 48
часов. На этой среде лактобактерии обычно образуют крупные колоние, гладкие или
шероховатые, белого цвета. Кроме лактобактерий на этой питательной среде могут расти
другие молочно-кислые бактерии, принадлежащие к родам Lactococcus, Streptococcus.
Поэтому при учете чашек с посевами необходимо производить окраску по Граму
материала из всех типов колоний. Подтверждением принадлежности бактерий к роду
Lactobacillus является их морфология, отсутствие спор, каталазы и оксидазы.
Спорообразующие анаэробы (клостридии) выявляют посевом 1,0 (0,5) мл суспензии из
разведения 103 ,105 и 107 в растопленный столбик среды Вильсон- Блера. После 24 - 48
часов инкубации подсчитывают число черных колоний в глубине агара с образованием
газа (разрыв среды).
Факультативно-анаэробные микроорганизмы и аэробные микроорганизмы.
Бактерии семейства Enterobacteriaceae.
35
Каждый анализ на дисбактериоз должен сопровождаться обследованием пациента
на носительство сальмонелл и шигелл. С этой целью посев проводят на среды Плоскирева
и селенитовый бульон из 101 разведения. Для выделения других представителей
семейства Enterobacteriaceae, входящих в состав нормальной микрофлоры , используют
Питательные среды: Эндо, Левина, Плоскирева. Посевы на этих средах делают из 105 и
107 разведениях. Обязательное проведение всего объема исследований на выделение
патогенных микроорганизмов семейства кишечных. Лак+ и Лак- колоний отсевом на
среду Олькеницкого или Клиглера и короткую биохимическую галерею. При этом
идентификация проводится вида микроба. Определяют общее микробное число и число
Лак+ и Лак-колоний. Вместе с тем, для выявления дисбактериоза можно не
детализировать родовой состав лактозонегативных бактерий, а ограничиться
определением на среде Эндо общей суммы лактозонегативных колоний. Очень важно для
диагностики дисбактериоза определить доминирующую микрофлору и подсчитать ее
количество. Если посев разведения 105 не дает роста E.coli - это безусловный показатель
дисбактериоза, так как означает, что E.coli меньше 106 в 1 г фекалий.
Синегнойная палочка определяется посевом из разведении 103, 105, 107 на сектора
капельным методом с малахитовым агаром. Отмечают рост крупных колоний, зеленовато-
синего цвета, с характерным запахом, оксидаза+.
Гемолитичсские свойства микроорганизмов определяют путем посева суспензий из
разведения 105 на кровяной агар. Через сутки инкубации производят подсчет и
микроскопию колоний с зоной гемолиза. Определяют процент гемолитических культур
среди колоний одного вида.
Стафилококки определяют при посеве 0,05 мл на ЖСА и инкубируют 2 суток с
разведений 101 и 103. Для подтверждения принадлежности бактерий к виду S. aureus
необходимо провести тесты на выявление плазмокоагулазы и ДНК–азы.
Энтерококки выделяют на средах Enterococcus- аgar из разведений исходного материала
103 и 105 , колонии энтерококков на этой среде имеют характерную розовую, красную или
коричневую окраску.
Дрожжеподобные и грибы рода Candida выделяют на среде Сабуро с полимиксином.
Посев проводят из 101 и 103 разведений. Инкубируют в течение 3-5 дней при Т= 28-30°С
после чего проводят микроскопию препарата из живой культуры. К патогенным грибам
относят культуры почкующихся клеток при наличии длинных нитей мицелия
(псевдомицеллий)или коротких нитей (истинный мицеллий). В отличии от других
представителей этого рода, C. albicans в определенных условиях способны образовывать
характерные для них хламидиоспоры.
36
Количественное содержание всех видов микроорганизмов в 1 г фекалий Подсчет
количества каждого вида микроорганизмов в 1 г испражнений проводят по числу колоний,
выросших на питательных средах, с пересчетом на количество посевного материала и
степень его разведения по формуле:
М= 2  N  10п+1 , при посевной дозе 0,05 мл
М= N  10п+1 , при посевной дозе 0,1 мл
где М – число микробов в 1 г;
N – число колоний данного вида;
п – степень разведения.
1. Современная международная классификация бактерий рода Shigella.
2. Возбудители дизентерии и их свойства.
3. Источники и пути передачи дизентерии.
4. Патогенез дизентерии.
5. Методы лабораторной диагностики дизентерии.
6. Какие основные биохимические признаки шигелл учитываются при их идентификации?
7. Биопрепараты, используемые для специфической профилактики, лечения и диагностики
дизентерии.
8. Определение понятия «дисбактериоз».
9. Причины формирования микроэкологических нарушений у человека.
10. Степени дисбактериоза.
11. Показания для исследования на дисбактериоз.
12. По каким микробиологическим показателям Вы поставите нарушение микрофлоры
кишечника?
13. Назовите биологические препараты для лечения дисбактериоза кишечника.
ЗАНЯТИЕ №7
Тема: Микробиологическая диагностика холеры
1. Классификация бактерий семейства Vibrionaceae.
2. Характеристика бактерий рода Vibrio.
3. Отличия патогенных ви брионов от холероподобных.
4. Серовары, биовары холерных вибрионов.
5. Патогенез холеры.
6. Методы микробиологической диагностики холеры.
7. Биопрепараты, применяемые для диагностики, профилактики и лечения холеры.
37
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Семейство Vibrionaceae объединяет изогнутые подвижные палочки размерами 1,4 –

5,0 x 0,3 – 1,3 мкм. Патогенные и условно-патогенные для человека виды входят в
основном в состав рода Vibrio (всего 12 видов из 37). Наибольшее медицинское
значение имеют V.cholerae, V. parahaemoolyticus, V. vulnificus, V.mimicus и др.
Возбудители холеры: Vibrio cholerae asiaticae и Vibrio cholerae eltor, относящиеся к
серогруппе О1, a также серовар О139 (V.bengal). У холерных вибрионов выделяют
термостабильные О- и термолабильные Н-антигены. По структуре О – Аг V.cholerae
подразделяются на 139 сероваров. Н-антиген является общим для большой группы
вибрионов. Холеру могут вызывать лишь вибрионы сероваров О1 и О139 (V.bengal). О-
антиген у холерных вибрионов О1группы неоднороден. Он включает А, В, и С
компоненты, разные сочетания которых присущи сероварам Огава (АВ), Инаба (АС) и
Хикоджима (АВС). Возбудители холеры О1 на основании биохимических и
биологических различий разделяются на два биовара (биотипа) классический (Vibrio
cholerae asiaticae) и Эль-тор (Vibrio cholerae eltor). У шероховатях R-форм О-антиген
утрачивается, а у слизистых М-форм его структура меняется, поэтому для идентификации
таких бактерий используют OR-антисыворотку.
Вибрионы других сероваров (не-О1/О139) холеру не вызывают, поэтому их часто
называют холероподобными, неагглютинирующимися или НАГ-вибрионами, Но
некоторые из них (серовары О10, О20 и др.) способны вызвать гастроэнтериты, раневые
инфекции, бактеремии и септицемии. Чаще это наблюдается у лиц с заболеваниями
печени и селезенки, поскольку у них снижены бактерицидные свойства сыворотки крови
по отношению к холероподобным вибрионам, имеющим (в отличие от холерных
вибрионов О1) более выраженную капсулу. Такую же капсулу имеют вибрионы О139.
Большинство вибрионов обладают высокой сахаролитической и
протеолитической активностью. Все они оксидазоположительны. Однако возбудители
холеры в отличие от холероподобных не расщепляют арабинозу, но сбраживают сахарозу
и маннозу (группа 1 по Хейбергу).
Классические холерные вибрионы лизируются фагом IV (по Мукерджи), не растут
на средах с полимиксином В, реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами и
Фогес-Проскауэра – отрицательные, не обладают гемолитическими свойствами.
Вибрионы Эль-Тор лизируются одноименным монофагом 2, растут на средах с
полимиксином В, вызывают агглютинацию куриных эритроцитов и дают положительную
реакцию Фогес-Проскауэра. Вибрионы О139 во многом имеют одинаковые биологические
38
свойства с вибрионами Эль-Тор. Считают, что эти две разновидности возбудителей
холеры возникли в результате генетических рекомбинаций между классическим холерным
вибрионом и холероподобными. Патогенные свойства у всех возбудителей холеры
обусловлены их способностью выделять экзотоксин-холероген, вызывающий
обезвоживание организма.
Другие виды вибрионов (V. parahaemoolyticus, V. vulnificus, V.mimicus), могут вызывать
гастроэнтериты, раневые инфекции, иногда переходящие в сепсис. Их патогенность
связана главным образом наличием у них энтеротоксина и гемолизина.
Лабораторная диагностика холеры и вибриозов проводится путем бактериологического
исследования.
1. Изучить принципы лабораторной диагностики холеры и холероподобных
2. Научить правильно подбирать препараты для идентификации, лечения и
профилактики холеры.
Знать:
1. Характеристику биологических свойств возбудителей.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при холере и
холероподобных заболеваниях.
3. Основные клинические проявления заболевания при холере и холероподобных
заболеваниях.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей холеры и вибриозов по биологическим
свойствам;
2.Классифицировать биопрепараты в соответствии с их назначением
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ.
Испражнения больного, рвотные массы, промывные воды желудка, секционный
материал (кишечник) используют для приготовления микропрепаратов. Один из них
окрашивают по Граму или фуксином, другой обрабатывают люминисцентной
39
специфической сывороткой, третий исследуют в «висячей» или «раздавленной» капле.
Обнаружение вибрионов в микропрепаратах и при люминисцентной микроскопии
позволяет получить первый ориентировочный ответ. Одновременно с этим производят
посев на среды накопления. На всех этапах исследования посевы выращивают на 1%
пептонной воде 6-8 часов, пептонной воде с теллуритом калия 12-18 часов на щелочном
агаре 14-16 часов, на элективных плотных средах 18-24 часа.
Исследование больных, бактерионосителей и трупного материала проводится в

четыре этапа:
I этап. Материал засевают на накопительную среду, на щелочной агар или на элективные

среды (TCBS).
II этап (через 6-8 часов после начала исследования). Изучают рост на первой среде
накопления и производят высев на щелочной агар и вторую среду накопления. Если на
первом этапе из нативного материала получают положительный результат, пересев на
вторую среду накопления не производят.
III этап (через 12-14 часов после начала исследования). Изучают рост на второй среде
накопления; производят высев со второй среды накопления на щелочной агар. Отбирают
не менее 5 подозрительных колоний и высевают на среду Клиглера.
IV этап (через 18-24 часов после начала исследования). Бактериологическое исследование
производят поэтапно с обязательным исследованием оксидазоположительных колоний в
реакции агглютинации с О1 холерной сывороткой а также с холерными сыворотками RO
и О139 в реакции слайд- агглютинации.. Колонию микробов, давшую положительную
ориентировочную реакцию агглютинации с холерными О- сыворотками, отвивают на
скошенный щелочной агар или среду Клиглера и выделенную чистую культуру изучают
затем в развернутой реакции агглютинации с сыворотками О1 Огава и Инаба, О139,
ставят пробы с диагностическими фагами, определяют гемагглюнирующую активность,
чувствительность к полимиксину способность образовывать ацетил-метил карбинол. Из
культур готовят мазка для окраски по Граму и пробам с люминесцирующими
сыворотками. Затем проводят биохимическую идентификацию выросших
микроорганизмов.
Для ускоренной диагностики болезни применяют иммунолюминесцентный и
иммобилизационный методы и РНГА. Для выявления холерогена применяют тесты на
животных и в культуре ткани, а также с помощью коагглютинации, ИФА и ПЦР. Для
ретроспективной диагностики холеры можно применять серологические реакции на
40
вибриоцины (сохраняются до 4-6 месяцев после выздоровления) и на антитоксины
(определяются до 1-2 лет после выздоровления).
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
1. Какова классификация вибрионов?
2. Назовите основные виды бактерий рода Vibrio, имеющие медицинское значение.Какие
заболевания они вызывают?
3. По каким признакам отличаются холерные вибрионы от холероподобных?
4. Назовите возбудителей холеры. Каковы их основные биохимические свойства ?
5. Какие биовары холерных вибрионов Вам известны?
6. Какое диагностическое значение имеет триада Хейберга?
7. Какова антигенная структура холерных вибрионов и какие существуют серовары
холерных вибрионов?
8. Каковы основные источники и пути передачи возбудителей холеры?
9. Назовите факторы патогенности возбудителей холеры и каков патогенез холеры?
10. Назовите методы микробиологической диагностики холеры.
11. Назовите питательные среды, применяемые для диагностики холеры.
12. Каковы особенности транспортировки материала при диагностике холеры?
13. Как проводится ускоренная диагностика холеры?
14. Как проводится ретроспективная диагностика холеры?
15. Как проводится специфическая и неспецифическая профилактика холеры?
16. Каковы причины и механизм возникновения других возбудителей холеры, кроме
классического?
17. Что такое вибриозы? Какие бактерии их вызывают?
18. Какие заболевания вызывают галофильные вибрионы? Каковы их основные
биологические свойства?
ЗАНЯТИЕ №8
Тема:
 Возбудители зоонозных инфекций (чума, сибирская язва,
туляремия, бруцеллез).
1. Понятие о зоонозных и особоопасных инфекциях.
2. Понятие о бактериологическом оружии и биотерроризме.
3. Характеристика возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза.
4. Эпидемиология и патогенез чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза.
5. Принципы лабораторной диагностики зоонозных инфекций.
41
зоонозных инфекций.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ.
К группе зоонозных инфекций относятся болезни, которыми болеют

преимущественно животные. Заражение человека может осуществляться в результате
контакта с больными животными, при употреблении в пищу продуктов животного
происхождения, при укусах блох, слепней, клещей и др., при вдыхании пыли,
загрязненной выделениями больных животных. Возбудители чумы, туляремии, сибирской
язвы, бруцеллеза обладают выраженной инвазивностью и высокой вирулентностью.
Заболевания, вызываемые этими микробами, относятся к особо опасным инфекциям
(ООИ) и требуют к себе исключительного внимания. Среди названных бактерий особое
место принадлежит чуме наиболее опасной, быстро распространяющейся болезни,
угрожающей высокой смертностью, поэтому выделение возбудителей этих заболеваний с
диагностической целью проводится в лабораториях особо опасных инфекций,
работающих в особо строгом режиме.
Зоонозные инфекции сопровождаются ранним возникновением аллергической
перестройки в организме больного, что может быть выявлено путем постановки
диагностических кожно-аллергических проб с соответствующими аллергенами. Особую
ценность они имеют при туляремии, так как становятся положительными уже на 3-4 день
болезни.
1. Выработать понятие о зоонозных и особо опасных инфекциях, а именно: о
биологических свойствах возбудителей, о режиме лаборатории ООИ.
2. Изучить принципы лабораторной диагностики ООИ (чума, сибирская язва,
бруцеллез, туляремия).
3. Научить правильно подбирать биопрепараты для диагностики, лечения и
профилактики ООИ.
Знать:
1. Характеристику биологических свойств возбудителей зоонозных инфекций
(чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза).
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при разных
зоонозных инфекциях.
42
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей чумы, сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии по
морфологическим признакам в микропрепаратах.
2. Оценить результат реакции термопреципитации по Асколи с целью выявления
сибиреязвенного антигена.
3. Оценить результаты серологических реакций по определению антител в сыворотке
больных бруцеллезом и туляремией.
4. Классифицировать бакпрепараты в соответствии с их назначением.
Для лабораторной диагностики зоонозных инфекций используют следующие методы:

бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический, кожно-
аллергический.
Исследуемый материал в зависимости от вида инфекции и клинической формы
заболевания может быть различным: кровь, пунктат из бубона, соскоб из язвы, отделяемое
коньюктивы, налет из зева, мокрота, испражнения, продукты животного происхождения,
трупный материал.
Бактериоскопический метод, в том числе с применением иммунофлуоресценции, чаще
всего применяется при диагностике чумы и сибирской язвы.
Бактериологический метод применяется при всех зоонозных инфекциях, а при
туляремии для выделения чистой культуры возбудителя часто используют
биобактериологиеский метод, т.е. заражение лабораторных животных, что позволяет
повысить частоту обнаружения возбудителя в исследуемом материале.
При туляремии и бруцеллеза со второй недели болезни может проводиться
серодиагностика. Специфические антитела в сыворотке крови определяются в реакциях
прямой или непрямой агглютинации. Поскольку при бруцеллезе могут вырабатываться
неполные антитела, то для их обнаружения необходимо ставить реакцию Кумбса.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА.
1. Изучение биопрепаратов по теме «Зоонозные инфекции» (Таблица 1).
2. Решение ситуационных задач.

3. Знакомство со схемой размещения лаборатории особо опасных инфекций и
порядком одевания врача этой лаборатории.
43
Классификация бакпрепаратов, применяемых при диагностике, лечении и

профилактике ООИ.
Таблица 1.
нозоформа Чума Сибирская Туляремия Бруцеллез
язва
препараты
1. Профилактические препараты
Штамм EV Штамм СТИ- Штамм Штамм B.
Вакцины (живые) 1 (взвесь спор Гайского- abortus 19-В,А
бескапсульно Эльберта
го штамма)
Противочумный Сибиреязвен- - -
Иммуноглобулины ный
2. Лечебные препараты
- - - Убитые
Вакцины нагреванием
бруцеллы
Аллергены - - - бруцеллин
противочумный сибиреязвен- - -
Гаммаглобулины ный
3. Диагностические препараты
антраксин Б- тулярин бруцеллин
Аллергены - П-Н комплекс (взвесь (фильтрат
бактерий, убитых
убитых бульонных
нагреванием) культур
бруцелл)
чумной сибиреязвен- индикаторный
Бактериофаги ный - фаг для
фаготипировани
я
Сыворотки:
а) агглютинирующие чумная сибиреязвенн моновалентна поливалентная и
ая я моновалентная
б) преципитирующие чумная
сибиреязвенн туляремийная
в) люминесцирующие чумная ая бруцеллезная
поливалентная и туляремийная
моновалентная сибиреязвенн
г) меченные + ая -
пероксида +
зой
+
Диагностикумы:
а) корпускулярные - взвесь убитых взвесь убитых
бактерий бруцелл всех 3-х
44
туляремии видов, окр.
метиленовой
синькой
б) эритроцитарные - - взвесь (единый)
бараньих эритроциты
эритроцитов, барана,
сенсибилизир сенсибилизирова
ованных нные
туляремийны полисахаридным
м антигеном антигеном
бруцелл
1. Что такое зоонозные заболевания?
2. Что такое особоопасные инфекции?
3. Что такое бактериологическое оружие и биотерроризм? Существует ли реальная
опасность применения биорецептур?
4. Назовите морфологическую особенность чумных бактерий.
5. Как выглядит рост чумных бактерий на питательных средах?
6. Кто является источником чумы и каковы пути передачи инфекции?
7. Какой метод применяется для экспресс-диагностики чумы и сибирской язвы?
8. Назовите виды бруцелл и признаки, по которым они отличаются друг от друга?
9. На каких питательных средах выращивают возбудителей бруцеллеза?
10. Кто является источником инфекции при бруцеллезе и каковы пути ее передачи?
11. Как проводится бактериологическая диагностика бруцеллеза?
12. Какие серологические реакции применяются для диагностики буцеллеза?
13. С какой целью ставится антиглобулиновый тест (реакция Кумбса) при бруцеллезе?
14. Для чего применяются аллергические пробы при бруцеллезе и туляремии?
15. Как выделяют чистую культуру возбудителя туляремии?
16. На каких питательных средах выращивают возбудителей туляремии?
17. .Кто служит резервуаром туляремии в природе?
18. Каковы пути заражения человека туляремией?
19. .Какие существуют клинические формы чумы, туляремии, сибирской язвы и
бруцеллеза?
20. Что такое тулярин и для чего его используют?
21. Какие профилактические и лечебные препараты при туляремии Вы знаете?
22. Каковы особенности роста сибиреязвенных бактерий на различных питательных
средах?
23. Что такое реакция Асколи?
45
24. Какие бактерийные препараты применяются для профилактики сибирской язвы и
чумы?
ЗАНЯТИЕ №9
Тема:
 Возбудители клостридиальной и неклостридиальной
анаэробной инфекции.
 Микроаэрофильные грамотрицательные бактерии родов
Campylobacter и Helicobacter.
1. Классификация облигатных анаэробных бактерий.
2. Возбудители газовой гангрены: свойства, лабораторная диагностика,
специфическая профилактика и лечение.
3. Столбняк. Свойства возбудителя и его распространенность. Лабораторная
диагностика, специфическая профилактика и лечение.
4. Ботулизм. Свойства возбудителя, методы лабораторной диагностики. Лечение.
5. Неклостридиальная анаэробная инфекция: особенности биологии возбудителей,
методы лабораторной диагностики и лечения.
6. Кампилобактериозы и хеликобактериозы: биологические свойства возбудителей,
методы лабораторной диагностики и лечения.
перечисленных выше инфекций.
Облигатные анаэробные бактерии (ОАБ) представляют собой многочисленную
сборную группу микроорганизмов, относящихся к различным родам и семействам.
Морфологически они представлены как грамположительными, так и грамотрицательными
кокками, палочками, извитыми и ветвящимися формами, чувствительны к токсическому
действию кислорода. ОАБ, имеющие клиническое значение в патологии человека, можно
условно разделить на две группы.
1. К первой группе относятся грамположительные палочковидные бактерии,
образующие споры (клостридии). Они являются возбудителями заболеваний, которые
объединяются под общим названием клостридиозы. Эти заболевания в свою очередь
подразделяются на раневые клостридиозы, к которым относятся газовая гангрена и
столбняк, и энтеральные клостридиозы. Возбудители газовой гангрены, столбняка,
ботулизма относятся к семейству Bacillaceae, роду Clostridium. Ведущим фактором в
патогенез этих заболеваний является экзотоксин.
46
Газовая гангрена - полимикробное заболевание, развивающееся при попадании на
раневую поверхность почвы, обрывков одежды, обуви и других инородных частиц,
загрязненных спорами возбудителей. Развитию инфекции способствует создание
анаэробных условий в ране. Основными возбудителями анаэробной раневой газовой
инфекции являются Cl.pеrfringens, Cl. septicum. В развитии заболевания могут принимать
также участие Cl.histolyticum, Cl.novyi, Cl.sordelli и другие анаэробы. В мирное время
наблюдается посттравматическая, постоперационная, постабортальная и
постинъекционная газовая гангрена. Летальность составляет 50-90%. Для лабораторной
диагностики используют бактериологический и биологический методы исследования.
Столбняк (Tetanus) - острая раневая инфекция с ведущим синдромом поражения
центральной нервной системы. Столбняк возникает в результате попадания столбнячного
микроба в ткани организма из объектов внешней среды через поврежденные кожные
покровы и слизистые (порез, прокол, заноза, ожог, потертость). Веденных с нарушением
правил асептики. По этой же причине у новорожденных может возникнуть пупочный
столбняк. Для лабораторной диагностики столбняка эффективнее всего применяется
биологическая проба. Белым мышам в мышцы задней лапки вводится кровь или
отделяемое раны больного. Контрольной мышке вводится тот же материал с добавлением
противостолбнячной антитоксической сыворотки. При наличии в материале столбнячного
токсина у опытной мышки через сутки развиваются признаки местного столбняка.
Ботулизм является тяжелым пищевым бактериальным отравлением с высокой
летальностью до 45% и возникает в результате попадания в организм с пищевыми
продуктами C.botulinum и/или его токсина. Для лабораторной диагностики используют
бактериологический и биологический методы как и при газовой гангрене.В опытах на
мышах устанавливают тип ботулинистического токсина,вызвавший заболевание.
Кроме газовой гангрены энтеротоксигенные С.perfringens типа А могут вызывать
пищевые токсикоинфекции и некротические поражения кишечника. В последние два
десятиления значительное распространение получили антибиотико-индуцированные
энтеральные клостридиозы, обусловленные Cl.difficile., часто в результате
необоснованного применения антибиотиков с профилактической и терапевтической
целью. Наиболее тяжело протекает псевдомембранозный колит, приводящий к гибели
больных в 58% случаев. Заболевание возникает обычно на 7-8 день после начала
антибиотикотерапии по поводу любого другого заболевания, а так же встречается в виде
внутрибольничных вспышек у новорожденных и детей младшего возраста, у улюдей,
ослабленных длительным пребыванием в стационаре. Возбудители попадают в ЖКТ
47
контактно-бытовым путем посредством загрязненных фекалиями больных или
бациллоносителей предметов из окружения больных.
2. Бактерии второй группы более многочисленны и разнообразны по видовому
составу, принадлежат к различным таксономическим группам (Таблица1).
Таблица 1.Классификация клинически значимых облигатных анаэробных бактерий
Морфология Род Вид
Грамотрицательные
Bacteroides B.fragilis, B.vulgaris и др.
Prevotella P.melaninogenicus, P.oralis и

др.
Porphiromonas P.gingivalis,
Палочки
P.assacharalyticus
Fusobacterium F.nucleatum, F.necrophorum

и др.
Leptotrichia L.buccalis и др.
Mobiluncus M.curtisii, M.mulieris и др.
Wolinella W. recta и др.
Кокки Veilontlla V.atipica, V.dispar и др.
Грамположительные
Propionobacterium P.acnes и др.
Палочки Eubacterium E.lentum и др.
Lactobacillus L.acidophylus и др.
Bifidobacterium B.longum, B.bifidum и др.
Кокки Peptococcus P.niger и др.

48
Peptostreptococcus P.magnus, P.anaerobicus и

др.
Ветвящиеся Actinomices A.bovis и др.
Большинство из них являются условно-патогенными и преобладают в нормальной

микрофлоре человека и животных. При определенных условиях многие из них способны
вызвать сходный патологический процесс, клинически характеризующийся гнойно-
септическими заболеваниями разной локализации. Наибольшее клиническое значение
имеют грамотрицательные палочки рода Bacteroides, типовой вид – B.fragilis.
Морфология их варьирует от коккобациллярных до ветвящихся форм, спор не образуют,
но образуют капсулу. Все бактероиды содержат эндотоксин. Добавление гемина и
витамина К (менадиона) стимулирует рост. Чаще выделяются при смешанных инфекциях
в ассоциации с анаэробными кокками, фузобактериями и другими микроорганизмами. Для
бактерий группы B.fragilis -B.ovatus, B.vulgatus - ключевыми признаками яляется
способность расти в присутствии 20% желчных солей, резистентны к канамицину
(100мкг), ванкомицину ( 5 мкг) и колистину (10 мкг). Другие бактероиды (B.urealyticus,
B.gracilis) не растут в присутствии 20% желчных солей, резистентнык канамицину,
колистину, но чувствительны к ванкомицину. Бактероиды резистентны к пенициллинам,
цефалоспоринам, клиндамицину. Превотеллы (P.melaninogenica, P.intermedia, P.bivia) не
способны расти в присутствии 20% солей желчи, резистентны к канамицину и
ванкомицину, но чувствительны к колистину. Кроме того, они резистентны к
пенициллинам и уефалоспоринам. Препараты выбора для бактероидов и превотелл –
левомицетин, метронидазол, имипенем.
Для бактериологического исследования неклостридиальных инфекций
используют гной, полученный посредством пункций абсцессов полостей и органов.
Посевы производят на обогащенные анаэробные среды. Лучше они растут на агаре с
сердечно-мозговым экстрактом (среда Шедлера). Рост стимулирует внесение в
питательную среду гемина и витамина К. Культивирование проводится в анаэростатах,
заполненных газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого
газа. Диагностика неклостридиальной анаэробной инфекции может осуществляться также
методом газовой хроматографии, основанной на определении летучих жирных кислот
(пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой, изокапроновой,
капроновой), которые являются специфическими конечными продуктами метаболизма
49
анаэробных бактерий, выявляемых как в среде роста, так и в патологически измененных
тканях. Аэробные бактерии таких кислот не продуцируют.
3. Грамотрицательные бактерии родов Campylobacter и Helicobacter, в отличие от
ОАБ являются микроаэрофилами, так как не растут в строго аэробных или анаэробных
условиях. Для их роста необходимы газовые смеси с пониженным содержанием
кислорода (5-7%) и повышенным – углекислого газа (5-10%). Это мелкие, подвижные,
споронеобразующие, S-образные или образующие «крыло чайки» бактерии. Заболевания,
которые вызывают эти бактерии, получили название, соответственно,
кампилобактериозы и хеликобактериозы. Кампилобактериозы характеризуются в первую
очередь поражением гастроинтестинального тракта человека с развитием диарейного
синдрома, а в ряде случаев в инфекционный процесс вовлекаются другие органы и
системы. Ведущую этиологическую роль в инфекционной патологии человека среди
прочих кампилобактериозов играют Campilobacter jejuni и C.coli. Сред патогенных
хеликобактерий наиболее изучен Н.pylori. Этот микроб имеет тропизм к тканям
слизистой желудочно-кишечного тракта, локализуясь преимущественно в пристеночном
слое слизи. Колонизация может длиться бессимптомно многие годы. При определенных
условиях в зависимости от состояния макроорганизма и особенностей самого микроба
может активироваться воспалительный процесс, приводящий к возникновению гастритов,
язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Основные факторы
патогенности возбудителя – уреаза, цитотоксины, муциназа, липаза, адгезины и
гемолизины.
1. Выработать понятие о клостридиальных и неклостридиальных анаэробных и
микроаэрофильных инфекциях, а именно, о биологических свойствах
возбудителей:
 клостридиальных раневых инфекций (газовая гангрена, столбняк);
 клостридиальных энтеральных инфекций (С.perfringens, Cl.difficile,
C.botulinum);
 неклостридиальных гнойно-воспалительных анаэробных инфекций;
 микроаэрофильных инфекций (кампилобактериозы и хеликобактериозы).
2. Изучить принципы лабораторной диагностики анаэробных и микроаэрофильных
инфекций.
3. Научить правильно подбирать биопрепараты для диагностики, лечения и
профилактики анаэробных инфекций.
50
Знать:
1. Классификацию и характеристику биологических свойств возбудителей
анаэробных и микроаэрофильных инфекций.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при разных
анаэробных и микроаэрофильных инфекциях.
3. Принципы лабораторной диагностики анаэробных и микроаэрофильных
инфекций.
4. Правила забора материала при подозрении на анаэробную инфекцию.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей газовой гангрены, столбняка, ботулизма по
морфологическим, культуральным и биохимическим признакам .
При подозрении на газовую гангрену на исследование берут кусочки на границе
омертвевшей и здоровой ткани. Измельченная ткань засевается на жидкие и плотные
питательные среды и исследуются в микропрепаратах, окрашенных по Граму. Обращают
внимание на наличие в препаратах крупных грамположительных палочек, дающих бурное
газообразование на среде Китт-Тароцци, характерное для Bac.perfringens. Материал для
выявления неспорообразующей анаэробной микрофлоры берут, пунктируя стерильным
шприцем с плотными резиновыми кольцами на поршне. 3-5мл материала вносят путем
прокола резиновой пробки во флакончик с бескислородной газовой смесью. Допустимо
направление пробы в лабораторию в шприце, который предварительно заполнен
бескислородным азотом или СО2 на 1/2-1/3 объема и герметизирован со стороны иглы
путем вкола ее в резиновую пробку. Доставленный материал засевают на обогащенные
анаэробные питательные среды, не допуская его контакта с воздухом. И инкубируют в
термостате не менее 5-7 суток.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА
1. Решение ситуационных задач по выбору метода лабораторной диагностики
анаэробной инфекции.
2. Решение ситуационных задач по профилактике и лечению анаэробной инфекции.
51
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что такое клостридиальные инфекции?
2. Назовите возбудителей раневых клостридиальных инфекций.
3. Назовите возбудителей клостридиальных энтеральных инфекций.
4. Опишите биологические свойства возбудителя столбняка и патогенез развития
болезни.
5. Как проводится плановая специфическая профилактика столбняка?
6. В каких случаях и как проводится экстренная профилактика столбняка?
7. Как получают противостолбнячную сыворотку и как определяют ее активность?
8. Назовите семейство, род, виды возбудителей газовой гангрены.
9. В чем проявляется клиническая картина газовой гангрены? Каков ее патогенез?
10. Как осуществляется микробиологическая диагностика газовой гангрены?
11. Как проводится специфическая профилактика и лечение газовой гангрены?
12. В чем проявляется картина ботулинистического отравления? Каков его патогенез?
13. Каковы свойства ботулинистического токсина и как его обнаружить в лабораторных
условиях?
14. Как лечат больных ботулизмом?
15. Каковы биологические свойства бактероидов? Какую роль они играют в жизни
человека?
16. Какую роль играют в жизни человека бифидо-и лактобактерии?
17. Какие представители неклостридиальной анаэробной инфекции играют роль в
развитии гнойно-воспалительных процессов?
18. Каковы особенности забора и доставки материала при подозрении на
неклостридиальную анаэробную инфекцию?
19. На каких средах культивируют возбудителей неклостридиальной анаэробной
инфекции?
20. В чем сущность метода диагностики анаэробной инфекции с помощью
хроматографии?
21. Почему бактерии родов Campylobacter и Helicobacter называют
микроаэрофилами?
Каковы основные особенности их культивирования?
22. Назовите основные виды бактерий родов Campylobacter и Helicobacter и их
биологические свойства.
23. Какие заболевания вызывают бактерии родов Campylobacter и Helicobacter?
52
ЗАНЯТИЕ №10
Тема:
 Коринебактерии. Микробиологическая диагностика и
специфическая профилактика дифтерии.
1. Классификация коринебактерий, их роль в патологии человека.
2. Возбудитель дифтерии, биологические свойства.
3. Патогенез дифтерии.
4. Микробиологическая диагностика дифтерии.
5. Определение напряженности иммунитета при дифтерии.
6. Диагностические, лечебные и профилактические препараты,
применяемые при дифтерии.
Бактерии рода Corinebacterium представляют собой грамположительные,
неподвижные, неспорообразующие палочки. Нередко на концах и в середине клеток
имеются утолщения за счет зерен полиметафосфата («волютина»), окрашивающихся
метахроматично. Нуждаются в богатых питательных средах, содержащих
аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, с добавлением сыворотки или
крови. Безусловно патогенным для человека является только C.diphtheriae – возбудитель
дифтерии. Некоторые виды коринебактерий (C.pseudodiphthericum, C.xerosis,
C.amycolatum, C.jeikeium, C.urealyticum) входят в состав нормальной микрофлоры кожи
и слизистых человека, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis патогенны для животных. Однако
в последние десятилетия клиническая роль коринебактерий, ранее считавшихся
непатогенными для людей, возросла. Их все чаще выделяют, как возбудителей гнойно-
септических, респираторных и урологических заболеваний, от лиц подвергавшихся
иммунодепрессивной терапии, после тяжелых операций, наркоманов, онкологических и
гематологических больных, престарелых, ВИЧ-инфицированных. Устойчивость
некоторых видов к антибиотикам способствует их распространению как агентов
госпитальной инфекции.
Патогенез дифтерии
Дифтерия – это острое инфекционное заболевание, которое проявляется локальным
поражением верхних отделов дыхательных путей (фарингит, ларингит и др.), реже -
кожи и системными проявлениями (поражением сердца, почек и периферических
нервов). Возбудителем дифтерии являются только токсигенные штаммы C.diphtheriae,
которые могут встречаться в виде нескольких биотипов: gravis, mitis, intermedius.
53
Нетоксигенные штаммы не способны вызвать дифтерию, однако могут быть причиной
гнойно-септических заболеваний.
Источником инфекции являются больные люди и здоровые бактерионосители,
обладающие уровнем антитоксических антител, достаточным для нейтрализации
действия токсина. Дифтерией могут заболеть лица, не имеющие иммунитета, а также
при снижении антитоксина в сыворотках иммунизированных ниже защитной
концентрации (0,03 АЕ). C.diphtheriae может передаваться воздушно-капельным или
контактно-бытовым путями. Считают, что эффективную роль в колонизации очага
поражения микробом играют фермент нейраминидаза и поверхностный корд-фактор.
Токсинообразование у лизогенных штаммов C.diphtheriae связано с
инфицированием умеренным бактериофагом - -фагом, который «встраивает» в геном
коринебактерий ген дифтерийного токсина, называемый tox-геном. Иногда
способность к токсинообразованию обнаруживается также у C.ulcerans и
C.pseudotuberculosis, в результате чего описаны случаи дифтериеподобных поражений
зева человека, вызванные, в частности, C.ulcerans.
Дифтерийный токсин является белком, состоящим из трех структурно-
функциональных доменов: каталитического, трансмембранного и рецептор-
связывающего. На основании расщепления под действием трипсина трансмембранный
и рецептор-связывающий домены объединяются под общим названием «фрагмент Б», а
каталитический – «фрагмент А». Функция фрагмента Б заключается в присоединении к
поверхности клетки-мишени, проникновении внутрь клетки, «вставке»
трансмембранной части в мембрану клетки для обеспечения проникновения
каталитического домена в цитозоль. Результатом взаимодействия фрагмента А с
фактором элонгации ЕF-2 является необратимое нарушение синтеза белка с
последующей гибелью клетки. Дифтерия встречается только у человека, но для многих
животных введение дифтерийного токсина в дозе 100-150 нг/кг массы тела является
летальной. Основной метод лабораторной диагностики дифтерии – бактериологический.
1. Выработать четкое понятие об инфекциях, вызываемых патогенными
коринебактериями.
2. Изучить принципы лабораторной диагностики дифтерии.
3. Научить подбирать антимикробные препараты для диагностики, лечения и
профилактики анаэробных инфекций.
54
Знать:
1. Характеристику биологических свойств возбудителей.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при дифтерии.
3. Основные клинические проявления заболевания при дифтерии.
5. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей дифтерии по морфологическим, тинкториальным,
биохимическим и токсигенным свойствам.
2. Интерпретировать результаты внутрикожных проб.
3. Интерпретировать результаты серологических реакций.
4. Классифицировать биопрепараты в соответствии с их назначением.
Эффективность диагностики дифтерии во многом зависит от сроков и качества забора
материала. Для исследования проводят забор слизи из ротоглотки и носа одновременно
двумя отдельными тампонами одновременно. При редкой локализации (кожи, глаз и др.),
кроме мазка из соответствующего участка, также необходимо производить забор из
ротоглотки и носа. Обследованию подлежат больные дети и взрослые с острыми
воспалительными явлениями в носоглотке (ринит, ларинготрахеит, ларингит, круп),
больные ангинами с патологическим выпотом на миндалинах, больные с инфекционным
мононуклеозом, стенозирующим ларинготрахеитом. Забор материала следует проводить
до начала применения антибиотиков и доставлять в лабораторию не позднее 2 ч после
забора.
В соответствии с рекомендациями ВОЗ, посев материала следует производить на
чашку с 5% кровяным агаром (неселективная среда) и кровяно-теллуритовый агар
(селективная среда, например: среда Клауберга, Тинсдаля и др.).
Через 24-48 часов на кровяных средах колонии имеют характерный сероватый цвет,
иногда с желтоватым оттенком. Существуют определенные культуральные особенности
у различных биотопов C.diphtheriae. Так, биотип gravis образует выпуклые колонии с
приподнятым центром диаметром 2-3 мм («цветок ромашки»); биотип mitis – гладкие
колонии с блестящей поверхностью, диаметром 1-2 мм; биотип intermedius – гладкие,
плоские колонии с ровными краями и диаметром 0,5-1 мм. На кровяно-теллуритовых
средах C.diphtheriae образуют черные матовые колонии, что является результатом
восстановления теллурита до теллурида.
55
Далее проводится микроскопия мазка с окраской по Граму, Нейссеру и Леффлеру и
последующей идентификацией в соответствии с биохимическими тестам указанными в
табл. 1. Особое внимание обращают на скрининговые тесты (наличие пиразиминидазы и
цистеиназы), которые используют при наличии подозрительных на потенциально
токсигенные коринебактерии.
Заключительной, основной задачей является определение токсигенности
дифтерийных коринебактерий. Наиболее часто используют разновидность метода
Оухтерлони тест Элека, который основан на встречной иммунодиффузии токсина и
антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального
соотношения концентраций токсина, продуцируемого коринебактериями, и
антитоксином, нанесенном на диск или полоску фильтровальной бумаги, через 24-48
часов происходит их взаимодействие с образованием преципитатов в идее белой линии
или «усов». Считают, что продуктивность токсигенных штаммов коринебактерий in
vitro, а вместе с тем чувствительность теста Элека можно повысить предварительным
пассированием бактерий на среде 199 с добавлением к ней сыворотки крови. Высокой
чувствительностью к дифтерийному токсину in vitro обладают культивируемый клетки
Vero после добавления к ним токсигенных штаммов. Из перспективных методов следует
отметить также иммуноферментный анализ и иммунохроматографический тест, которые
позволяют получить результата в течение 3-4 ч после выделения чистой культуры. Для
выявления tox-гена предложена полимеразная цепная реакция.
Определение напряженности иммунитета к дифтерии
«Золотым стандартом» является реакция нейтрализации токсина в культуре клеток
Vero. Считается, что концентрация антитоксических антител менее 0,01 МЕ/мл
указывает на отсутствие иммунитета; 0,01-0,09 МЕ/мл – частичная защита и более 0,1
МЕ/мл – на длительную защиту.
В России наиболее часто используется реакция пассивной гемагглютинации РПГА с
коммерческими тест-системами. В реакции взаимодействуют эритроцитарный
дифтерийный антигенный диагностикум (эритроциты с абсорбированным дифтерийным
анатоксином) и антитоксические противодифтерийные антитела, присутствующие в
сыворотке пациента. Условно-защитным титром считается титр 1:20. Реакция
применяется для выявления наиболее восприимчивых к дифтерии популяции людей для
последующей вакцинации или ревакцинации.
1. Назовите клинически значимые виды коринебактерий. Какие заболевания они могут
вызывать у человека?
56
2. Назовите неселективные и селективные среды для выращивания дифтерийных
бактерий.
3. Каковы морфологические и культуральные характеристики возбудителя дифтерии?
4. Какие существуют биотипы C.diphtheriae и как их отдифференцировать ?
5. Кто является источником дифтерии и каковы способы заражения дифтерией?
6. Охарактеризуйте основные особенности патогенеза дифтерии.
7. Почему не все штаммы C.diphtheriae способны вызывать дифтерию?
8. Кто подлежит обследованию на дифтерию?
9. Каковы особенности забора материала при обследовании на дифтерию?
10. Какими методами можно установить токсигенность коринебактерий?
11. Какие биологические тесты применяются для обнаружения и титрования
дифтерийного токсина и антитоксинов?
12. Каков иммунитет при дифтерии и как его можно выявить?
13. Какие препараты используются для специфической профилактики и терапии
дифтерии?
Тема:
 Микобактерии. Возбудители туберкулеза, проказы, микобактериозов.
1. Классификация микобактерий.
2. Патогенные микобактерии: биологические свойства возбудителей туберкулеза
и проказы.
3. Микробиологические методы диагностики туберкулеза и проказы.
4. Условно-патогенные (нетуберкулезные) микобактерии – возбудители
микобактериозов.
5. Препараты, применяемые при диагностике, лечении и профилактике
туберкулеза, проказы и микобактериозов.
Бактерии рода Mycobacterium насчитывает около 200 паразитических и

сапрофитических видов. Наибольшее распространение нашла классификация Раньона, в
основу которой положены способность образовывать пигмент и скорость роста.
Безусловно патогенными являются бактерии туберкулезного комплекса: M.tuberculosis,
M.bovis, M.africanum, M.microti, вызывающие туберкулез и M.leprae, вызывающие
проказу. Другие клинически значимые микобактерии называют нетуберкулезными, а
57
вызываемые ими заболевания – микобактериозами и они рассматриваются как
оппортунистические инфекции. В отличие от патогенных микобактерий, которые
паразитируют только в организме человека и теплокровных животных, нетуберкулезные
микобактерии попадают в организм человека из внешней среды (почва, вода), где они
постоянно обитают (M.kansasii, M.abcessus, M.fortuitum, M.avium complex). Эти бактерии
удается выделить для культивирования от больных людей и из объектов внешней среды,
в то время как ряд других микобактерий (M.ulcеrans, M.hemophilum), так же, как и
возбудитель проказы, обнаруживаемых у больных людей, не поддаются
культивированию. Сапрофитические микобактерии (M.smegmatis, M.phlei) чаще всего
являются быстрорастущими (менее 7 суток) и имеют значение для дифференциальной
диагностики (обесцвечиваются спиртом).
1. Туберкулезом заболевают не все, но почти все инфицируются туберкулезной
палочкой, Чаще всего заражение происходит воздушно-капельным путем, реже
алиментарным. В том и другом случае развивается первичный туберкулезный комплекс.
Повторная встреча организма с туберкулезной инфекцией, либо ее выход из старых
очагов, находящихся в организме, приводят к вторичному туберкулезу. Туберкулезный
процесс может быть «закрытым» и «открытым». В последнем случае в патологическом
материале обнаруживают туберкулезные палочки. Возбудители туберкулеза -
грамположительные, кислото-, щелоче- и спиртоустойчивые палочки, аэробы,
характеризующиеся медленным ростом и требующие для своего роста специальных сред.
Туберкулезные бактерии в организме человека могут поражать любую ткань, но
предпочтение отдается тканям, достаточно хорошо снабжаемым кислородом.
Лабораторному исследованию для обнаружения туберкулезных бактерий подлежит
мокрота, гной, моча, спинно-мозговая жидкость, промывные воды бронхов, желудка. Для
диагностики пользуются бактериологическим, бактериоскопическим, биологическим,
серологическим, кожно-аллергическим, генетическими (ПЦР) методами.
2. Заражение проказой происходит при контакте с больным проказой и воздушно-
капельным путем. Инкубационный период - 3-5 лет, но может быть и более
продолжительным. Поражаются кожа, слизистые оболочки, лимфатические узлы,
нервные стволы, внутренние органы. Лабораторная диагностика осуществляется путем
исследования соскобов с пораженных участков кожи, слизистых оболочек, мазков из гноя
окрашенных по методу Циля-Нильсена.
1. Выработать понятие об инфекциях, вызываемых микобактериями.
2. Изучить принципы лабораторной диагностики туберкулеза и проказы.
58
3. Научить подбирать препараты, применяемые для диагностики и специфической
профилактики туберкулеза.
Знать:
1. Характеристику биологических свойств возбудителей туберкулеза, проказы и
микобактериозов.
2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при туберкулезе и
проказе.
3. Основные клинические проявления заболеваний, вызываемых патогенными и
условно-патогенными микобактериями.
4. Принципы лабораторной диагностики туберкулеза, проказы и микобактериозов.
5. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний,
вызванных микобактериями.
Уметь:
1. Готовить микропрепараты из мокроты и красить их по Цилю-Нильсену.
2. Интерпретировать результаты изучения биологических свойств возбудителей
туберкулеза.
3. Интерпретировать результаты аллергических проб.
Классифицировать биопрепараты в соответствии с их назначение
1. Бактериоскопический метод исследования при туберкулезе и микобактериозах
является одним из основных и наиболее распространенных. Однако возможности метода
ограничены, поскольку в материале можно обнаружить единичные микобактерии, если в
1 мл материала содержится не менее 5-10 тыс. бактериальных клеток. Поэтому
предпочтительнее готовить мазки из приготовленного для культурального исследования
осадка, полученного после специальной предварительной обработки материала
детергентами и последующего центрифугирования. Приготовление мазков для
исследования является опасной процедурой, так как в ее процессе происходит
рассеивание аэрозолей, содержащих возбудитель. Все мазки из осадка готовят после
выполнения процедуры посева на питательные среды. Осадок предварительно
нейтрализуют 1-2 каплями 6% соляной кислоты. Мазки фиксируют на пламени
спиртовки только после полного высыхания на воздухе! Для окраски мазков применяют
метод Циля-Нильсена (микобактерии окрашиваются в ярко-красный цвет) и
люминесцентные красители (аурамин и родомин). Во втором случае красители заливают
59
на 1 час, а затем обесцвечивают дважды по 3-5 мин. 3% раствором солянокислого спирта
в течение 25-60 сек. и осуществляют гашение фона раствором метиленового синего. При
окраске люминесцентными красителями нельзя подогревать мазки, промывание мазков в
процессе окраски следует проводить только дистиллированной водой, так как
водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменить свечение.
Аурамин и родомин связываются с поверхностными воскоподобными ктруктурами
микробной клетки. При облучении окрашенных клеток ультрафиолетовыми лучами они
начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на темно-зеленом воне. За счет
свечения вокруг клетки образуется ореол, в результате чего видимые размеры светящейся
клетки превышают ее физические размеры. Чувствительность люминесцентной
микроскопии в сочетании с методом обогащения материала приближается к
чувствительности метода посевов. Положительный результат микроскопического
исследования свидетельствует лишь о выявлении кислотоустойчивых микобактерий, но
ни в коем случае не микобактерий туберкулеза, так как не позволяет дифференцировать
их от возбудителей микобактериозов. Достоверный диагноз туберкулеза может быть
установлен только с помощью лабораторного исследования при обнаружении
микобактерий комплекса M.tuberculosis в исследуемом материале при комплексных
микроскопических и культуральных исследованиях.
2. Метод посевов позволяет выявить микобактерии при наличии в исследуемом
материале нескольких десятков жизнеспособных клеток возбудителя. Рост микобактерий
туберкулеза происходит очень медленно, и сопутствующая микрофлора, которая часто
загрязняет клинический материал, может мешать их развитию. Поэтому диагностический
материал, если он не взят стерильно из закрытых полостей (спинномозговая, плевральная,
синовиальная, кровь и др.), обязательно подвергается специальной обработке,
обеспечивающей деконтаминацию, а мокрота подвергается разжижению. В качестве
детергента часто применяют 10% раствор трехзамещенного фосфата натрия, которые
добавляют к мокроте в равном объеме и оставляют на 18 часов в термостате при 37 С,
после чего центрифугируют15 минут при 3000g и к осадку добавляют 1-2 капли соляной
кислоты до получения нейтрального рН. При сильном загрязнении материала применяют
серную кислоту. Для посева используют разнообразные среды, но предпочтение часто
отдается плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена. Средняя продолжительность роста
микобактерий на питательных средах составляет 20-46 суток. Рост отдельных штаммов
появляется через 60 дней, поэтому при отсутствии роста посевы выдерживают в
термостате не менее 2,5-3 месяцев.
60
Более быстрый результат можно получить применив метод глубинного
культивирования микрокультур (метод Прайса). Толстый нефиксированный мазок
мокроты обрабатывают серной кислотой, отмывают водой и помещают во флаконы с
цитратной кровью. Через 7-10 дней при положительном результате в мазках, окрашенных
по Цилю-Нильсену, по димкроскопом можно обнаружить микроколонии туберкулезных
палочек.
Для подтверждения принадлежности выделенных микобактерий к комплексу

туберкулезных обязательно проводится их изучение на основании специальных
лабораторных тестов:
Mycobacterium tuberculosis complex
Дифференциальные тесты M.tuberculosis M.bovis
Основные биохимические тесты на наличие
Никотиновой кислоты (ниациновый тест) + -
Нитратредуктазы + -
Термостабильной каталазы - -
Пиразинамидазы + -
Рост на среде с 1000 мкг/мл - -

салициловокислого натрия
3. При биологическом методе исследуемый материал вводится внутрибрюшинно

морским свинкам. Через 2 недели биоптаты из лимфатических узлов зараженных свинок
исследуют на наличие туберкулезных палочек в окраске по Цилю-Нильсену. После
гибели животных во внутренних органах обнаруживаются множественные туберкулезные
бугорки.
4. Для определения инфицированности организма туберкулезными бактериями чаще

всего применяют аллергическую пробу Манту: 0,1 мл очищенного туберкулина,
содержащего 5 т.е (туберкулиновые единицы), вводится внутрикожно на сгибательную
поверхность предплечья. При положительном результате наблюдается образование
красноватой папулы в диаметре 5 мм и более.
61
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Каждый студент готовит препарат из мокроты и окрашивает его по методу
Циль-Нильсена и зарисовывают.
2. Студенты просматривают препараты лепром кожи (гистопрепараты)
1. Каковы принципы классификации микобактерий.
2. Какие заболевания вызывают патогенные и условно-патогенные микобактерии?
3. Каковы биологические свойства микобактерий?
4. Какие микобактерии вызывают туберкулез?
5. Какие лабораторные животные применяются для диагностики туберкулеза?
6. Кто является источником заражения туберкулезом. Каковы способы заражения?
7. Какие методы применяются для лабораторной диагностики туберкулеза?
8. Как повысить вероятность обнаружения микобактерий в патологическом материале
при микроскопическом методе исследования?
9. Каков алгоритм люминесцентного метода исследования материала при туберкулезе?
10. Какие питательные среды применяются для выращивания микобактерий и как долго
их выращивают?
11. Какой метод можно применить для ускоренного выращивания микобактерий
туберкулеза?
12. Какие биохимические и культуральные тесты применяются для дифференцировки
микобактерий туберкулезного комплекса?
13. Каковы основные особенности патогенеза туберкулеза?
14. Назовите основные факторы вирулентности микобактерий туберкулеза.
15.Что такое туберкулин? Какими свойствами он обладает?
15. Что такое нестерильный иммунитет (при туберкулезе)? Какую роль он играет в защите
от туберкулеза?
16. С какой целью ставятся кожно-аллергические пробы при туберкулезе?
17. Как ставится кожно-аллергическая проба Пирке?
18. В чем проявляется положительная проба Пирке и о чем это свидетельствует?
19. Какая вакцина применяется для создания иммунитета против туберкулеза?
20. В каких случаях необходимо проводить ревакцинацию против туберкулеза?
21. Какие микобактерии вызывают микобактериозы, в чем это проявляется?
22. Каковы принципы химиотерапии туберкулеза?
23. Каковы особенности патогенеза проказы?
24. Какие методы применяются для лабораторной диагностики проказы?
62
Тема:
 Спирохеты. Лабораторная диагностика сифилиса, лептоспирозов, боррелиозов.
1. Классификация спирохет. Заболевания, вызываемые патогенными спирохетами.
2. Возбудители сифилиса и эндемических трепонематозов (фрамбезия, пинта,
беджель): биологические свойства трепонем.
3. Микробиологическая диагностика сифилиса на различных стадиях болезни.
4. Лептоспирозы: биологические свойства возбудителей, лабораторная диагностика.
5. Боррелиозы: биологические свойства возбудителей. Болезнь Лайма.
6. Биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики
спирохетозов.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Спирохеты представлены тонкими спирально завитыми бактериями длиной до 500
мкм. Подвижны. В их состав входят свободноживущие, комменсальные и
паразитические бактерии. Медицинское значение имеют представители родов
Treponema, Borrelia, Leptospira, Spirillum. Некоторые из них хорошо окрашиваются
анилиновыми красителями, другие – требуют специальных методов окраски.
Род Treponema включает патогенные для человека бактерии T.pallidum (подвиды
pallidum, pertinue, endemicum), T.carateum, T.vincentii. Это спиральные бактерии длиной 5-
20 мкм, хорошо окрашиваются методом импрегнации серебром, но плохо по
Романовскому-Гимзе.
T.pallidum подвида pallidum вызывает сифилис: хроническое венерическое
заболевание с циклическим течением. От больных матерей могут рождаться дети с
врожденным сифилисом. Трепонемы подвида pertinue вызывает хронический
генерализованный спирохетоз, известный как тропическая гранулема или фрамбезия.
Подвид endemicum является возбудителем эндемического сифилиса (беджель).
T.carateum вызывает хронический генерализованный спирохетоз, именуемый «пинта»
или «карате». T.vincentii обитает в ротовой полости человека, но у ослабленных людей в
симбиозе с фузобактериями и бактероидами может вызвать некротическую ангину
Плаута-Венсана. У здоровых людей в полости рта можно обнаружить также
сапрофитическую T.denticola, а на наружных половых органах – T.refringens. От бледной
трепонемы они отличаются по некоторым морфологическим признакам и по характеру
подвижности.
63
Возбудители лептоспирозов относятся к роду Leptospira, виду L.interrogans,
объединяющего более 160 сероваров, из которых у человека заболевание чаще всего
вызывают L.iсterohaemorragiсa - возбудитель желтушного лептоспироза и L.grippotyphosa
- возбудитель водной лихорадки. Основной резервуар инфекции - различные дикие и
домашние животные. Они выделяют возбудителей с мочой, которые могут долго
сохраняться в воде. В природе существуют также непатогенные лептоспиры L.biflexa.
Спирохеты рода Borrelia вызывают заболевания, которые называются боррелиозами.
К их числу относится эпидемический (вшивый) возвратный тиф (B.recurrentis) и группа
эндемичных клещевых возвратных тифов. В последнее время в различных регионах мира,
в том числе в Центральных областях России отмечается подъем заболеваемости болезни
Лайма (хроническая мигрирующая эритема), возбудителем которой является
B.burgdorferi. Человек заражается после укуса клещей, для которых характерна
трансовариальная передача, а поэтому наряду с дикими животными они играют большую
роль в сохранении природного резервуара инфекции. При отсутствии эффективного
лечения болезнь в результате аутоиммунных процессов приобретает хроническое течение
и приводит к тяжелым поражением опорно-двигательного аппарата и других органов.
1. Выработать четкое понятие о сохетозах, а именно, о биологических свойствах
возбудителей, эпидемиологии и патогенезе вызываемых ими заболеваний.
2. Изучить принципы лабораторной диагностики спирохетозов.
3. Уметь подбирать биопрепараты для диагностики, лечения и профилактики
спирохетозов.
Знать:
1. Классификацию и биологические свойства спирохет (трепонем, лептоспир,
боррелий).
2. Эпидемиологию, патогенез и лабораторную диагностику сифилиса, лептоспирозов и
боррелиозов (болезни Лайма).
3. Методы профилактики и терапии сифилиса, лептоспирозов и боррелиозов.
Уметь:
1. Дифференцировать возбудителей сифилиса, лептоспирозов, боррелиозов по
морфологическим признакам в микропрепаратах.
2. Интерпретировать результаты серологических реакций при обследовании на сифилис.
3. Классифицировать биопрепараты в соответствии с их назначением при спирохетозах.
64
1. Выбор метода диагностики сифилиса зависит от периода заболевания. На ранних
стадиях заболевания в материале из твердого шанкра возбудителя обнаруживают
микроскопией в темном поле, или в окраске по Романовскому-Гимзе, или методом
иммунофлюоресценции.
Со второй половины первого и в последующие периоды заболевания диагноз
устанавливается с помощью серологических исследований. Они включают
неспецифические и специфические тесты.
Неспецифические (нетрепонемные) тесты применяются в качестве скрининговых,
а также для определения эффективности проводимого лечения. К их числу относится
реакция связывания комплемента с несколькими антигенами (р. Вассермана): с
озвученным трепонемным и неспецифическим кардиолипин-лецитин-холестериновым. В
последнее время все чаще применяется модифицированная осадочная флокуляционная
проба на стеклах (р.микропреципитации) с неспецифическим антигеном. Ограничивает
применение этих реакций отсутствие неспецифических антилипидных антител на
ранней и поздних стадиях болезни. Кроме того, нетрепонемные (реагиновые) реакции
могут быть ложно-положительными на поздней стадии беременности и при некоторых
патологических состояниях (системные аутоиммунные нарушения, эндемические
трепонематозы, распад опухолей, лептоспирозы, лепра, после перенесенных вирусных
инфекций, применение наркотиков и др.), сопровождающихся деструктивными
процессами с высвобождением из поврежденных клеток липопротеиновых веществ. Эти
вещества, как и липиды трепонем, способствуют выработке клетками иммунной системы
неспецифических (вассермановских) антител реагинового типа.
Реакция микропреципитации: 3 капли смеси сывороток тщательно смешивают с 1
каплей кардиолипинового антигена. При положительном результате происходит
выпадение хлопьев.
Специфические (трепонемные) тесты применяют для уточнения диагноза
сифилиса, поставленного на основании предварительных исследований. К их числу
относятся реакция иммобилизации трепонем (РИБТ), реакция микроагглютинации (РА),
реакция непрямой агглютинации, ИФА и методы иммунофлюоресцентной диагностики.
Реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) ставят с взвесью трепонем,
полученных из зараженного яичка кролика, к которой добавляют комплемент и
исследуемую сыворотку. В контрольной пробирке смешивают идентичную взвесь
спирохет и сыворотку здорового человека. При наличие антител в сыворотке больного
спирохеты обездвиживаются.
65
Реакция непрямой иммунофлюоресценции ставится с исследуемой сывороткой,
разведенной 1/200. Еѐ инактивируют и наносят на стекло на 30 мин. к взвеси
культуральных тканевых спирохет, зафиксированных ацетоном. Затем препарат
промывают, высушивают и обрабатывают флюоресцирующей сывороткой против
глобулинов человека. При положительном результате в люминесцентном микроскопе
наблюдается свечение спирохет.
2. Для диагностики лептоспироза на первой неделе заболевания исследуют кровь в
«раздавленной капле» в темном поле. При положительном результате обнаруживаются
серебристые подвижные изогнутые нити с завитками.
Бактериологические исследования проводят путем посева крови на водно-
сывороточную Уленгута или фосфатно-сывороточную среды с добавлением кроличьей
сыворотки под слоем вазелинового масла. После 5-6 дневной инкубации в термостате при
температуре 28°С производят исследование среды на наличие лептоспир в «раздавленной
капле» в темном поле.
Биологический метод. Морских свинок или крольчат заражают внутрибрюшинно или
подкожно кровью больного. Зараженные животные находятся под наблюдением до
месяца. При заболевании или гибели животного из крови готовят препараты и исследуют
их в темном поле. При положительных результатах производят высев для выделения
чистых культур.
Серодиагностику лептоспироза проводят постановкой реакции агглютинации с
эталонными культурами лептоспир разных серогрупп. Учет результатов реакции проводят
в препаратах «раздавленная капля» в темном поле. В положительном случае отмечают
агглютинацию лептоспир в виде «паучков». Диагностический титр сыворотки 1/100 и
выше.
Для лабораторной диагностики болезни Лайма применяют микроскопический и
серологические методы.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА:
1. Постановка и учет реакции Вассермана (см. таблицу)
Таблица 1. Схема основного опыта реакции Вассермана
номера пробирок
Ингредиенты 1 2 3
Исследуемая сыворотка 0,2 0,2 0,2
Антиген 1 (специфический) 0,2 - -
66
Антиген 2 (неспецифич.) - 0,2 -
Комплемент в рабочей дозе 0,2 0,2 0,2
Физиологический раствор - - 0,2
В термостат на 30-40 минут
Гемолитическая система 0,4 0,4 0.4
В термостат на 30-40 минут
Учет результатов
1. Классификация спирохет.
2. По каким признакам дифференцируются спирохеты друг от друга?
3. Какие заболевания вызывают патогенные трепонемы?
4. Назовите возбудителей эндемических трепонематозов.
5. Назовите способ заражения сифилисом.
6. Каковы способы заражения эндемическими трепонематозами?
7. Как выращивают трепонемы, предназначенные для диагностических целей?
8. Эпидемиология и патогенез сифилиса, стадии болезни.
9. Что такое врожденный сифилис?
10. В чем проявляется первичный сифилис?
11. Что такое серонегативный и серопозитивный период при сифилисе?
12. От чего зависит выбор методов лабораторной диагностики сифилиса?
13. Как проводится микроскопическое исследование материала при сифилисе?
14. Что такое реагиновые (вассермановские) антитела? В каких случаях они образуются,
какими свойствами обладают?
15. Назовите неспецифические серологические тесты, применяемы для диагностики
сифилиса. С какой целью их выполняют?
16. Назовите специфические серологические тесты, применяемы для диагностики
сифилиса. В каких случаях они применяются?
17. Какие ингридиенты необходимы для постановки реакции Вассермана?
18. Что служит антигеном для реакции Вассермана?
19. В каких случаях и как ставится реакция микропреципитации?
20. В чем заключается метод иммобилизации трепонем? В каких случаях его
применяют?
21. В каких случаях применяют метод иммунофлюоресценции при диагностике
сифилиса?
22. Какие спирохеты вызывают лептоспирозы? Назовите в качестве примера.
23. Назовите основные биологические свойства лептоспир.
24. Кто является источником лептоспирозов? Как ими заражаются?
25. Какие методы применяются для микробиологической диагностики лептоспирозов?
67
26. Что такое боррелиозы? В чем различие эпидемического и эндемических
боррелиозов?
27. Болезнь Лайма: особенности возбудителя, источник, способ заражения?
28. Какие препараты применяются для диагностики, лечения и профилактики
спирохетозов: сифилиса

Язык

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЧАСТНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ

Загружено:

Сведения о документе

Авторское право

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЧАСТНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ

Загружено:

Авторское право:

СМОЛЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

СМОЛНЕНСК. 2015 год.

Под редакцией профессора Е.А.Федосова

В составлении пособия принимали участие преподаватели кафедры:

СМОЛЕНСК. 2015 год.

д.м.н., профессор, заведующий куафедрой биологии СГМУ А.С.Соловьѐв

Методические указания к практическим занятиям по частной микробиологии

Смоленск: Смоленский государственный медицинский университет, 2015 г.

Грамположительные бактерии родов Peptostreptococcus (P.anaerobius, P.magnus) и

Сальмонеллы - большая группа бактерий, классификация которых претерпела

Брюшной тиф и паратифы – острые инфекционные поражения кишечника,

При микробиологической диагностике пищевых токсикоинфекции

 Микробиологическая диагностика шигеллезов.

1. Характеристика бактерий рода Shigella.

2. Макроорганизм и его микрофлора являются сбалансированной экологической

Дисбактериозы различают по локализации (полости рта, глотки, носа, кишечника,

Семейство Vibrionaceae объединяет изогнутые подвижные палочки размерами 1,4 –

Исследование больных, бактерионосителей и трупного материала проводится в

I этап. Материал засевают на накопительную среду, на щелочной агар или на элективные

К группе зоонозных инфекций относятся болезни, которыми болеют

Для лабораторной диагностики зоонозных инфекций используют следующие методы:

2. Решение ситуационных задач.

Классификация бакпрепаратов, применяемых при диагностике, лечении и

Таблица 1.Классификация клинически значимых облигатных анаэробных бактерий

Морфология Род Вид

Bacteroides B.fragilis, B.vulgaris и др.

Prevotella P.melaninogenicus, P.oralis и

Fusobacterium F.nucleatum, F.necrophorum

Leptotrichia L.buccalis и др.

Mobiluncus M.curtisii, M.mulieris и др.

Wolinella W. recta и др.

Кокки Veilontlla V.atipica, V.dispar и др.

Propionobacterium P.acnes и др.

Палочки Eubacterium E.lentum и др.

Lactobacillus L.acidophylus и др.

Bifidobacterium B.longum, B.bifidum и др.

Кокки Peptococcus P.niger и др.

Peptostreptococcus P.magnus, P.anaerobicus и

Ветвящиеся Actinomices A.bovis и др.

Большинство из них являются условно-патогенными и преобладают в нормальной

Бактерии рода Mycobacterium насчитывает около 200 паразитических и

Для подтверждения принадлежности выделенных микобактерий к комплексу

Mycobacterium tuberculosis complex

Дифференциальные тесты M.tuberculosis M.bovis

Основные биохимические тесты на наличие

Никотиновой кислоты (ниациновый тест) + -

Рост на среде с 1000 мкг/мл - -

3. При биологическом методе исследуемый материал вводится внутрибрюшинно

4. Для определения инфицированности организма туберкулезными бактериями чаще

Таблица 1. Схема основного опыта реакции Вассермана