Nombres: José Leonardo Barragán, Jinez Rodríguez Ivonne Estefanía, Marquez Cadena

Milton Paul, Ruiz Basantes Melany Amanda, Van Ronzelen López Víctor Augusto

NRC: 4533
Fecha: 6 de Noviembre de 2018

Comparación de la cinética bacteriana en bacterias productoras de PHA, Bacillus

licheniformis y Burkholderia sacchari, usando 3 distintas fuentes de carbono.
Resumen
El presente trabajo estuvo orientado determinar el efecto de diferentes fuentes de carbono
(xilosa, yacón y almidón) sobre la cinética bacteriana de las bacterias Bacillus licheniformis
de tipo salvaje y Burkholderia sacchari de tipo mutante, que son utilizadas para la
producción de PHA.
Se inocularon las bacterias de un cultivo puro y se prepararon los medios de cultivo
respectivos en el laboratorio, una vez listos se comenzaron a medir la absorbancia de la
bacteria con el medio a una longitud de onda de 600 nm en el espectrofotómetro cada 4 horas.
Mediante la absorbancia medida se controlaron las fases de crecimiento que experimentaba la
bacteria mediante pasaba el tiempo mostrando así que se mantuvo en un estado exponencial
después de pasadas las 24 horas, cerca de las 72 horas ya se mostraron en fase estacionaria,
siendo esta última fase óptima para la producción de PHA. Y ya pasadas las 72 h ya las
bacterias murieron.
Tanto la absorbancia y fases de crecimiento de las bacterias permitieron determinar la
cinética de las mismas pudiendo determinar las curvas de crecimiento.
Palabras clave: Bacillus licheniformis, Burkholderia sacchari, cinética bacteriana, PHA
Introducción
Antecedentes
La utilización de la xilosa, el segundo azúcar más abundante en materiales hemicelulósicos,
es necesario para la transformación eficiente de la biomasa a productos químicos de alto valor
(Guamán, Barba, Zhang, & Oliveira, 2018). El almidón es ya conocido como una fuente rica
en carbono siendo este un polisacárido muy utilizado. El yacón en una planta andina
domestica muy poco conocida, aunque esta ha sido de gran importancia en la alimentación
(Castillo, Seminario, & Manrique, 2003) Esto se debe a que es una fuente rica en carbono.
Es conocido que ciertas bacterias logran transformar la xilosa en polihidroxialcanoatos
(PHA), y un ejemplo de esto es la Burkholderia sacchari, aunque su rendimiento es bajo, este
debe mejorarse para ser económicamente viable (Guamán, Barba, Zhang, & Oliveira, 2018).
Esta bacteria es de interés debido a su capacidad para metabolizar las distintas fuentes de
carbono logrando altas densidades celulares y acumular altos niveles de (PHA) (Raduan,
Mendonça, & Guamán, 2015).
Tenemos también a otra bacteria, Bacillus licheniformis, la cual se ha demostrado producir
(PHA). En un estudio se demostró que estas bacterias acumulaban los máximos niveles de
(PHA) 007 a 68.80% del peso de las células secas (Sangkharak & Prasertsan, 2012)

Justificación
Conocer la cinética bacteriana de Burkholderia sacchari y Bacillus licheniformis permite
identificar el tiempo que dura su fase estacionaria, en la cual hay más producción de PHA.
Objetivos
● Comparar la cinética bacteriana entre Bacillus licheniformis y Burkholderia sacchari,
usando 3 distintas fuentes de carbono.
Específico
● Determinar en qué medio se reproducen más rápido y por tanto cuál es más apto para
el punto de vista industrial despreciando costos.
● Determinar el tiempo que las bacterias permanecen en fase estacionaria según el
medio.

Marco Teórico
Cinética bacteriana
La reproducción de bacterias se produce por diferentes procesos como la fisión binaria y la
gemación teniendo como resultado un aumento en el número de microorganismos (Prescott,
2009). En esta investigación se realizan cultivos de microorganismos en medios líquidos, es
decir en un sistema cerrado donde la concentración de nutrientes va disminuyendo y la
cantidad de microorganismos y residuos aumentan (Prescott, 2009). El estudio de su
crecimiento mide los cambios poblacionales totales y se lo realiza por medio de una curva de
crecimiento la cual se divide en varias fases: Fase de latencia, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte.
Fase de latencia:
El crecimiento bacteriano no se da inmediatamente debido a que las bacterias
necesitan sintetizar primero cofactores esenciales, ribosomas, ATP o enzimas para
logara degradar el nuevo medio de cultivo para posteriormente iniciar con el
crecimiento (Prescott, 2009).
Fase exponencial:
También llamada como fase logarítmica debido a la velocidad máxima constante a la
que crecen los microorganismos. La velocidad de crecimiento depende del potencial
genético y de las condiciones del medio, en esta fase la población bacteriana tienes
 características uniformes en cuanto a sus propiedades químicas y fisiológicas
(Prescott, 2009).
Fase estacionaria:
Esto ocurre cuando el crecimiento poblacional total se detiene y se observa una línea
horizontal en la curva de crecimiento. El número total de microorganismos viables es
constante y puede ser debido al equilibrio entre muerte y división celular o solo se ha
detenido la división por la falta de nutrientes (Prescott, 2009).
Fase de muerte:
Se asume que las bacterias mueren por falta de nutrientes o por acumulación de los
desechos tóxicos. Recientemente se han propuesto dos hipótesis donde las bacterias
no pueden crecer debido a que son viables, pero no cultivables o a causa de una
muerte celular programada (Prescott, 2009).
Este crecimiento microbiano es medido por métodos analíticos donde se mide la luz
transmitida. La turbidimetría es una técnica óptica donde intervienen fenómenos ópticos y las
propiedades de la luz, esta mide la absorbancia del cultivo de bacterias en medio líquido
(Acebo & Hernández, 2013). La solución bloquea y refleja la luz que pasa a través de esta, la
luz se absorbe de forma directamente proporcional a la concentración de células vivas o
muertas que existen en el cultivo (Acebo & Hernández, 2013).
PHA
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son biopolímeros, bioplásticos o biopoliésteres sintetizados
por microorganismos como una reserva de carbono y energía (González et al., 2012). La
polimerización de los ácidos hidroxialcanoicos tiene lugar por acción de enzimas que
condensan el grupo hidroxilo formando un enlace éster (Lemos, 2015). Son almacenados
como líquidos móviles y amorfos en el citoplasma y está rodeado por una mono capa de
fosfolípidos con enzimas polimerasas y despolimerasas (González et al., 2012).
Se forma a partir del exceso de carbono, el microorganismo cuenta con enzimas degradativas
que pueden recuperar el carbono almacenado cuando escasee el alimento en periodos de
estrés nutricional ( Lemos, 2015).
Tabla 1. Principales nutrientes cuya limitación da lugar a los PHA en diferentes
microorganismos. Obtenido de: Babel y Steinbuchel, 2001).
Burkholderia sacchari
Muchas bacterias pueden producir polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de varias fuentes de
carbono, estos se guardan dentro de la bacteria como gránulos intracelulares ante una
respuesta de estrés; una bacteria capaz de producir PHA debido a un estrés nutricional es
Burkholderia sacchari. Esta bacteria se puede aislar del suelo cerca de plantaciones de caña
de azúcar, en capaz de asimilar glucosa, xilosa y varios carbohidratos más (Gómez et al,
1996).
Esta bacteria ha demostrado que acumula hasta un 75% del peso seco celular como PHA.
Tiene un crecimiento óptimo a una temperatura de 30°C. Esta bacteria es muy versátil ya que
puede utilizar muchas fuentes de carbono para su nutrición, más de 30 documentadas; incluso
puede utilizar bagazo de caña de azúcar hidrolizado para usarlo como fuente de carbono
(Mendonça et al, 2014).
La bacteria es de tipo Gram negativo y fue aislada por primera vez desde suelo brasileños en
un programa de recolección de bacterias capaces de producir PHA desde sacarosa. Al
encontrar una cepa denominada LFM 101 y que tenía como características al género
Burkholderia y haciendo alusión al motivo del hallazgo de esta cepa se completó el nombre
Burkholderia sacchari. El estrés inducido a esta bacteria usualmente es bajo la limitación de
un nutriente esencial para el crecimiento como puede ser el fósforo, oxígeno o nitrógeno
(Galindo, 2007).

Bacillus licheniformis
Las bacterias pueden utilizar alcanos de cadena mediana como fuentes de energía y carbono;
la oxidación de los mismos es un fenómeno común que ocurre en suelo y agua y aquellos que
se encuentran comprendidos entre 13 y 20 carbonos han podido ser oxidados por bacterias del
género Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter y Bacillus. En lo que respecta al género
Bacillus este se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y según una identificación
se determina que Bacillus licheniformis es reconocida como una especie más de Bacillus que
es de interés biotecnológico ya que mediante esta cepa se puede obtener la bacitracina que es
un tipo de antibiótico (Vivas, Martínez, García, & Salgado, 2008).
Entonces Bacillus licheniformis es una bacteria Gram-positiva, de tipo móvil, tiene un
parecido genético con Bacillus subtilis; esta habita normalmente en agua y el suelo donde
puede producir esporas como un mecanismo de proliferación. Se considera un bacilo de tipo
anaerobio facultativo, es decir que puede desarrollarse tanto en presencia como en ausencia
de oxígeno (Espitia, Petro, Padilla, & Romero, 2012).
La pared celular de Bacillus licheniformis se compone de mucopéptido conformado por
cadenas lineales de amino azúcares y cadenas peptídicas cortas de 3 a 5 aminoácidos; y el
crecimiento óptimo de la bacteria es de 50°C, aunque puede resistir a temperaturas más altas
o bajas debido a la presencia de esporas (Ramírez, 2016). Estas son las características que
permiten a la bacteria ser indispensable en biorremediación.
Fuentes de Carbono
La xilosa es un monosacárido del tipo aldopentosa. Posee una estructura de cinco carbonos y
un grupo funcional aldehído que le confiere la característica de azúcar reductor. De manera
general esta azúcar se extrae de la madera y de manera industrial su producto reducido, el
xilitol, se utiliza como aditivo endulzante (NCBI, s.f.). Las bacterias son eficientes al
momento de metabolizar hexosas, pero presentan problemas si sólo poseen xilosa; sin
embargo, existe una amplia gama de bacterias recombinantes que fermentan este azúcar
(García, 2016), como es el caso de Burkholderia sacchari (Guamán, 2018). Por otro lado, en
Bacillus licheniformis, la utilización de xilosa como fuente de carbono es inducible por la
presencia de la misma (Scheller & Hillen, 1994).
El almidón es una macromolécula compuesta por amilosa y amilopectina. Es descompuesta
por la una variedad de bacterias muchas de las cuales se encuentran en el aparato digestivo de
animales rumiantes (Flint, Scott, Duncan, Louis & Forano, 2012). Se ha logrado aislar
enzimas alfa-amilasa a partir de Bacillus licheniformis (Saito, 1973; Morgan & Priest, 1981;
Krishnan, & Chandra, 1983) lo que demuestra que esta bacteria es capaz de degradar el
almidón.
El yacón, Smallanthus sonchifolius, es una planta propio de la Cordillera de los Andes. Esta
planta es capaz de almacenar carbohidratos en sus tubérculos en forma de
fructooligosacáridos (FOS) (Paredes, et al., 2018). El jarabe de yacón se propone como un
alternativo para el azúcar común e incluso como suplemento alimenticio, debido que los FOS
presentan algunos beneficios para la salud (Brunno, et al., 2016; Gardner, 2017) .

Materiales y Métodos
Los cultivos puros de las bacterias Burkholderia sacchari y Bacillus licheniformis, así como
los medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono y estrés en nitrógeno, fueron
proporcionados por la tesista Cristina Balseca.
Se inoculó en el medio a partir de un cultivo puro, las dos bacterias: Burkholderia sacchari y
Bacillus licheniformis. Se usó como base la fórmula C 1 V 1=C 2 V 2 , en la cual tanto el volumen
inicial para ambas bacterias fue de 100 ml y la absorbancia inicial de 0.05. El valor de
absorbancia final de cada microorganismo fue medido después de 24 H de incubación; con
dicho valor se halló el volumen final a trabajar. En Burkholderia sacchari el volumen final
fue de 5 ml, mientras que en Bacillus licheniformis fue de 5.5 ml.
Luego de preparados los medios y con una absorbancia inicial de 0.05, se colocaron en
incubación a 37°C con agitación constante. La absorbancia se midió a una longitud de onda
de 600 nm en un espectrofotómetro marca Thermo Scientific Genesys 10UV. Para la
medición de volumen en las celdas del espectrofotómetro se utilizó una micropipeta de 1000
microlitros y las celdas fueron llenadas con 2 mL tanto de la solución blanco (medios sin
inocular) como de los medios incubados.
Las mediciones en el horario diurno se realizaron aproximadamente a las 9:00, 11:00 am,
14:00 y 16:00 pm. Los horarios nocturnos fueron calculados mediante interpolación lineal
cada cuatro horas después de la última medición.
Resultados
En las siguientes tablas se representan los datos de absorbancia en función del tiempo de la
bacteria Bacillus licheniformis (Bl) y Burkholderia sacchari (Bs) medidos en 3 días distintos.
Los datos en fondo gris fueron interpolados.
Tabla 1: Variación de la absorbancia en Bl, como fuente de carbono xilosa (X).

Tabla 2: Variación de la absorbancia en Bl, como fuente de carbono almidón (A).

 Tabla 3: Variación de la absorbancia en Bl, como fuente de carbono yacón (Y).

Graficando los valores de las 3 tablas se obtiene la figura 1.

 Figura 1: Variación de la absorbancia en Bl durante 3400 minutos aproximadamente.
En la figura 1 se observa un pico de crecimiento de Bl en el medio de almidón. En los tres
medios la absorbancia va de acuerdo a las diferentes fases de vida bacterianas hasta llegar a
aproximadamente 2200 minutos en donde se empiezan a alterar los valores.
A las 24h se presentó un cambio de color a rojo en los medios xilosa y almidón que contenía
Bl.

Tabla 4: Variación de la absorbancia en Bs, como fuente de carbono xilosa (X)

Tabla 5: Variación de la absorbancia en Bs, como fuente de carbono almidón (A)

 Tabla 6: Variación de la absorbancia en Bs, como fuente de carbono yacón (Y)

Graficando los valores de las tablas 4,5 y 6 se obtiene la figura 2.

 Figura 2: Variación de la absorbancia en Bs durante 3400 minutos aproximadamente.
En la figura 2 se observa mejor crecimiento de Bs en el medio de xilosa, pues se muestra con
menor variación en la gráfica. En los medios de almidón y yacón la absorbancia va de
acuerdo a las diferentes fases de vida bacterianas hasta llegar a aproximadamente a los 2200
minutos en donde se alteran los valores.

Discusión
La figura 1 demuestra la fase exponencial bacteriana en los tres medios hasta
aproximadamente 1600 minutos, siendo los medios de yacón y almidón los que presentan
valores de absorbancia más grandes que su contraparte de xilosa. La fase estacionaria no se
logra ver con claridad, con excepción del medio almidón, en donde dura aproximadamente
500 minutos. A partir del minuto 2000 se nota un descenso en la absorbancia en los tres
medios, luego de lo cual vuelve a aumentar, forma un pico en el minuto 3200 y desciende.
Dado que a partir del minuto 2200 se presentan inconsistencias en los datos obtenidos
tomaremos el ciclo vida de la bacteria hasta este minuto.
Para explicar los datos inconsistentes con la teoría podemos remitirnos a 3 principales fuentes
de errores que ocurrieron en el desarrollo del experimento, así como en la obtención de
resultados. En primer lugar, tenemos errores de operador, para garantizar la reducción de
aparición de errores se recomienda que un solo operador haga el trabajo práctico (UMA,
2016). Al ser este un proyecto en común con un fin didáctico todos los integrantes formaron
parte del trabajo manual en distintas mediciones y en distintas horas, aumentando así la
cantidad de errores.
Por otro lado, tenemos el error por método de medición. En el presente proyecto utilizamos la
turbidimetría como indicador del crecimiento bacteriano, sin embargo, este método tiene sus
limitaciones. Pues el método no es capaz de brindar información exacta acerca de las UFC,
de igual manera no distingue entre células y solutos que pueden hacer más turbio el medio
(Willey, Sherwood & Woolverton, 2014).
Como punto final, la interpolación utilizada fue lineal la cual presenta desventajas
demostradas en el ámbito matemático como presentar saltos cuando se calcula la primera
derivada en los puntos a interpolar (Uniandes, 2011). Existen más métodos de interpolación
que saltan estos obstáculos como la interpolación polinomial o la de tipo spline cúbico y
permiten una aproximación más real.
En la figura 2 se describe la cinética bacteriana de Burkholderia sacchari, y se observa
claramente que tiene un crecimiento mucho más estable y coherente en el medio de xilosa en
comparación a los medios de almidón y yacón. En los tres medios se puede determinar que la
fase de latencia dura aproximadamente 2 horas y media, en esta fase no existe división celular
inmediata pues la célula se encuentra sintetizando componentes nuevos (Willey, Sherwood &
Woolverton, 2014), la fase logarítmica está caracterizada por presentar la velocidad máxima
de crecimiento equilibrado, por la constante tasa de síntesis de componentes (Willey,
Sherwood & Woolverton, 2014) para la B. sacchari está comprendida entre las 2 horas y
media y las 28 horas aproximadamente, después de esto le sigue la fase estacionaria en la
cual existen variaciones discordantes, pero obviando los errores que se pudo haber cometido
se puede decir que los valores se encuentran relativamente constantes pues no existen
crecimientos bruscos, sino caídas sujetas a errores.
La especificidad y preferencia de consumo del medio de xilosa por B. sacchari se debe a que
ésta bacteria es una cepa transformada obtenida de una investigación en Brasil (Guamán et
al., 2018) cuyo plásmido contiene genes potenciadores que sobreexpresan transportadores
(xylE y xylFGH), catabólicos (xyl A y xylB) y reguladores (xylR); todos ellos implicados en la
utilización de xilosa a través de la vía xilosa isomerasa (Guamán et al., 2018), con el fin de
mejorar la tasa de crecimiento y producción de poli 3-hidroxibutirato (Guamán et al., 2018).
El motivo para someter la cepa de Burkholderia sacchari a las mismas condiciones que
Bacillus licheniformis es que fue usada como un control positivo para la producción de PHA
y de esta manera obtener un patrón comportamental que forme un camino guía para la cepa
silvestre ecuatoriana, por ello al analizar ambas gráficas se tiene que B. licheniformis tiene un
comportamiento similar al B. sacchari en el medio de crecimiento en base a xilosa, pues
existen menos datos inconsistentes y se puede diferenciar al menos dos fases de la cinética
bacteriana.
Sin embargo, el desarrollo de B. licheniformis en almidón y yacón, presenta un crecimiento
más rápido en la fase exponencial de tal forma que posiblemente estos medios sean los más
adecuados para la producción de PHA, es necesario repetir la cinética debido a los puntos
incoherentes que se encuentran en donde debería empezar la fase estacionaria.
El cambio de color ocurrido en los medios de xilosa y almidón con Bl se debe a que cuando
el pH del medio es menor a aproximadamente 4,4 varios de los productos que se obtiene son:
ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico, ácido succínico y por tal productos el medio
cambiará al color rojo (Osman, 2008).
Conclusión
-Se logró comparar la cinética bacteriana entre las dos bacterias y se obtuvo las distintas
curvas de las bacterias en las diferentes fuentes de carbono.
-Se determinó que Bs tiene un mejor crecimiento en el medio de xilosa mientras que en en Bl
presenta un pico de crecimiento en almidón por lo que estos medios son los más aptos para
cada bacteria a nivel industrial.

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Anexos