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Control biológico

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Phialomyces macrosporus Disminuye la gravedad de la antracnosis en las plántulas de café al

competir por los nutrientes y la resistencia inducida
Gabriel Alfonso Álvarez Rodríguez, Mario Sobral de Abreu, Felipe Augusto Moretti Fereira Pinto, Ana Cristina Andrade Monteiro,
Ándres Mauricio Pinzón Núñez, Mario Lucio Vilela de Resende, Jorge Teodoro de Souza, Flavio Henrique Vasconcelos de Medeiros ⇑

Departamento de Fitopatología, Universidad Federal de Lavras, Lavras 37200-000, Minas Gerais, Brasil

Destacar Gráficamente abstracto

Phialomyces macrosporus redujo la gravedad de la

antracnosis ( Colletotrichum gloeosporioides) en el cafe

P. macrosporus promueve el crecimiento de las plantas y

coloniza las raíces y tallos de las plántulas de café endofíticamente.
P. macrosporus protege las plántulas de café mediante una combinación de inducir resistencia y competencia
por los nutrientes.

P. macrosporus es un prometedor agente

biológico de antracnosis en las plántulas de café.

información del artículo

resumen
Historia del articulo:
Recibido el 22 de mayo de 2016 Revisado el 18 Colletotrichum gloeosporioides Es un hongo fitopatógeno que debilita gradualmente las plántulas de café y las plantas adultas y reduce la
de agosto de 2016 Aceptado el 23 de agosto de calidad de las bayas. No hay productos comerciales en el mercado para controlar esta enfermedad y, por lo tanto, la prospección de
2016 Disponible en línea el 26 de agosto de diferentes agentes de biocontrol es una opción viable.
2016 Phialomyces macrosporus fue seleccionado entre 10 hongos saprofitos por su mayor actividad contra C. gloeosporioides en plántulas de
café. Aplicación foliar de P. macrosporus a las plántulas de café siete días antes de la inoculación de C. gloeosporioides redujo la gravedad
de la enfermedad en un 32 a 41%. Phialomyces macrosporus creció en la superficie de las hojas de café y aumentó la permeabilidad de la
Palabras claves: cutícula, seguido de mayores actividades de peroxidasa de guaiacol (POX), catalasa (CAT) y fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) y la
Antioxidantes acumulación en el contenido total de fenol y la deposición de lignina, consistente con El fenómeno de resistencia inducida. Tampoco hay
Coffea arabica evidencia de micoparasitismo en vivo o in vitro fue observado. Sin embargo, este hongo redujo la esporulación del patógeno tanto en el
Competencia
medio de cultivo como en las lesiones foliares necróticas por la competencia por los nutrientes, lo que fue confirmado por in vitro
Colonización endofítica Resistencia
experimentos sobre el uso de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno. Este saprófito antagónico fue capaz de promover el crecimiento
sistémica inducida Hongos saprófitos
de las plantas y colonizar raíces y tallos de forma endofítica. Los resultados de este estudio indican que el hongo saprofito P.
macrosporus actúa mediante una combinación de resistencia inducida y competencia por nutrientes en la reducción de la gravedad de la
antracnosis en las plántulas de café.

2016 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

⇑ Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: fl aviomedeiros@dfp.u fl a.br (FHV Medeiros).

http://dx.doi.org/10.1016/j.biocontrol.2016.08.009
1049-9644 / 2016 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
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1. Introducción
2. Materiales y métodos
Café ( Coffea arabica L.) es el principal agricultor internacional
2.1. Plántulas de café
producto comercial para varios países de América Latina, África y Asia ( DaMatta, 2004 ) Los
principales productores mundiales de café son Brasil, Vietnam, Indonesia, Colombia e India. Aunque
El cultivo de granos de café 'Caturra IAC-99' se peló, se depuló para obtener las semillas, que
Brasil es el mayor productor y exportador de café arábica del mundo, se ha observado una
se desinfectaron superficialmente por inmersión en etanol al 70% durante 1 minuto y NaOCl al
disminución en la producción en los últimos años FAO, 2013 ) Entre los factores que contribuyen a
1% durante 5 minutos y se enjuagaron tres veces en agua destilada estéril. Las semillas se
estos bajos rendimientos se encuentran la enfermedad biótica, como el tizón halo ( Pseudomonas
remojaron en agua destilada estéril durante 3 días y se transfirieron a arena blanca para
syringae pv. garcae),
pregerminación. Las plántulas de dos meses de edad se trasplantaron a bolsas de polietileno (250
90 mm) lleno con una mezcla de 1.5 kg de tierra, arena blanca y estiércol de ganado (2: 1: 0.5 v:
óxido de café Hemilea vastatrix Berk y Br.), Mancha ocular marrón ( Cercospora coffeicola
v: v). Las plántulas se mantuvieron en el invernadero durante la duración de los experimentos.
Berkeley y Cooke), mancha foliar de phoma ( Phoma tardío ( RB Stewart) H. Verm) y antracnosis (
Colletotrichum

spp.).
Hay al menos cinco especies en el género Colletotrichum
asociado a enfermedades del café. C. kahawae que está restringido al continente africano y causa
2.2. Microorganismos y condiciones de cultivo.
la enfermedad de la baya del café ( Hindorf y Omondi, 2011 ) y otras cuatro especies: C.
gloeosporioides,
Los hongos saprofitos Phialomyces macrosporus (Phm), Chloridium virescens var. clamidosporio Cvc),
C. acutatum C. capsici y C. boninense ( Phuong et al., 2010 ) Sin embargo, en la mayoría de los
Memnoniella echinata
campos productores de café en todo el mundo,
(Mec) Dictyochaeta obesispora ( Dob) Sarcopodium circinatum
C. gleosporioides Es la especie más ubicua. C. gloeosporioides
en sí está compuesto por numerosas especies filogenéticas y se conoce como C. gloeosporioides complejo (Sci) Curvularia eragrostidis ( Cer), Pithomyces chartarum ( Pch),
de especies ( Weir et al., 2012 ) En Brasil, hay informes de Colletotrichum enfermedades causadas Stachybotrys nephosfora ( Sne) Thozetella cubensis ( Tcu) y Thozetella sumergir ( Tsu) se
por el C. gloeosporioides complejo de especies y otros Colletotrichum obtuvieron de la Colección de Cultivos de Microorganismos de Bahía (CCMB), Universidad Estatal
Feira de Santana, Bahía, Brasil ( Tabla S1 ) Se cultivaron durante 10 días en CCA (zanahoria 30 g,
especies e incluyen antracnosis en ramas, hojas, flores y frutos, provocando defoliación, muerte maíz 30 g, agar 20 g en un litro de agua destilada) a 25 C. Después de la incubación, se
regresiva y, en algunos casos, el colapso completo de la planta ( Paradela Filho et al., 2001; Pasin suspendieron dos discos (50 mm) que contenían conidios y micelio en 100 ml de CC líquido, se
et al., 2009 ) Aunque es una enfermedad generalizada, aún no se ha desarrollado una estrategia de cultivaron durante 10 días en un agitador orbital a 26 ± 1 C y 120 rpm y la suspensión se ajustó
control para enfrentar un eventual brote epidémico. a 10 6 6 conidias / ml. Las inoculaciones de hongos antagonistas se realizaron rociando las hojas
para que se escurrieran, a menos que se indique lo contrario.
Por lo tanto, para hacer frente a la demanda de una estrategia de gestión, se pueden utilizar
diferentes alternativas basadas en agentes abióticos (compuestos químicos) y / o bióticos
(microorganismos). Entre los diferentes compuestos químicos, los inductores de resistencia se
emplean comercialmente en diversos cultivos y tienen una actividad de amplio espectro ( El aislado patogénico CML3086 identificado como perteneciente a la
Oostendorp
et al., 2001 ) El inductor de resistencia sistémica ampliamente utilizado es Acibenzolar-S-metil (Bion) ( BonalCCdo. gloeosporioides El complejo de especies se obtuvo de la Colección Micológica Lavras (CML),
et al., 2005 ) que aumenta la actividad de diferentes proteínas relacionadas con la patogénesis en las Lavras Federal University, Lavras, Minas Gerais, Brasil y se usó en todos los experimentos. Se
plántulas de café ( Guzzo et al., 2009 ) cultivó durante 8 días en MEAmedio (extracto de malta 20 g, agar 20 g en un litro de agua
destilada) a 25ºC. C y las suspensiones se ajustaron a 2 10 6 6 conidias / ml. Las suspensiones
conidiales de todos los hongos se usaron inmediatamente para tratar plantas o se conservaron a
Además de los inductores químicos, los microbios beneficiosos también pueden desencadenar 80 ° C en glicerol al 20% (v: v).
una resistencia sistémica y pueden tener una variedad de otros mecanismos. En la última década,
el control biológico del café se ha concentrado en el uso de antagonistas bacterianos y fúngicos
que muestran potencial para minimizar la aplicación de fungicidas ( Haddad et al., 2014 ) La
aplicación de hongos saprofitos puede interferir en el progreso de la enfermedad por la competencia
de nutrientes, resistencia inducida, antibiosis, hipovirulencia y micoparasitismo ( Andrews, 1992; 2.3. Detección de antagonistas de C. gloeosporioides en plántulas de café
Druzhinina et al., 2011 ) Además, cuando los hongos saprófitos colonizan la superficie de la planta,
secretan diferentes metabolitos, como la cutinasa, para una mejor unión a la superficie de la hoja
Se roció cada hongo saprofítico hasta la escorrentía en las plántulas de café de 7 meses de
y desencadenan respuestas de defensa de la planta contra los patógenos ( L'Haridon et al., 2011; Espino-
Rammer et al., 2013 ) Estas respuestas pueden incluir una mayor acumulación de enzimas de edad, 7 días antes de la inoculación del patógeno. La inoculación de C. gleosporioides en las
defensa y deposición de lignina y compuestos fenólicos en la pared celular ( Yacoub et al., 2016; hojas fue hecho por una gota de 100 l Se colocó L suspensión en dos puntos diferentes en el
Singh et al., 2014 )
lado abaxial de las hojas y se colocó un disco de papel de filtro húmedo (1,3 cm de diámetro)
para simular una microcámara húmeda. La inoculación se realizó en la quinta hoja completamente
expandida de las plántulas ( Maia et al., 2013 ) El compuesto químico Acibenzolar-S-metilo en
En el marco del Programa SISBIOTA (CNPq / FAPESP), se analizó una colección de hongos
saprofitos aislados de la hojarasca de una región árida de Brasil para controlar las enfermedades
de las plantas. Algunos aislamientos eran agentes potenciales de biocontrol del moho blanco ( Se incluyó 0.01% (p / v) como control positivo para resistencia inducida y agua destilada como
Sclerotinia control negativo. Se evaluó la gravedad de la enfermedad en las plantas 5, 10, 15 y 20 días
sclerotiorum) en soja ( Barros et al., 2015 ) y antracnosis ( Colletotrichum graminicola) en sorgo ( después de la inoculación de acuerdo con Maia y col. (2013) y los datos utilizados para calcular el
Resende et al., 2015 ) Los objetivos del presente estudio fueron seleccionar de los 10 hongos saprofitos área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) ( Shaner y Finney, 1977 )
una
cepa que reduzca la enfermedad de antracnosis y determine el modo de acción utilizado para
controlar la enfermedad en la hoja. En todos los experimentos, las plantas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con
tres réplicas y ocho plántulas por parcela. El experimento fue realizado dos veces. P.
macrosporus fue el hongo con el mayor potencial para la reducción de la enfermedad y su modo de
acción se estudió más a fondo.
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2.4. Crecimiento de plantas y colonización endofítica.
Se inocularon plántulas de café de dos meses cultivadas en 1,5 kg de una mezcla de tierra y
arena blanca (2: 1 p / p) aplicando una suspensión de esporas de P. macrosporus, igualmente
distribuido en cuatro puntos de forma transversal alrededor de la plántula en el suelo a un
volumen total de 15 ml por planta. Las plantas se mantuvieron en un invernadero a 25–28 ° C y
no fueron fertilizadas. Seis meses después de la inoculación se evaluaron los siguientes
parámetros de crecimiento: altura de la planta, longitud de la raíz, peso seco de las raíces y
parte aérea, número de hojas por planta.
Se midió la concentración de clorofila. en vivo en plántulas de café de 8 meses por
espectroscopía no destructiva con el medidor de longitud de onda dual (Modelo SPAD-502) para
estimar directamente el contenido de clorofila ( Monje y Bugbee, 1992 ) El quinto par de hojas
se
utilizó en estos ensayos y las mediciones de clorofila se realizaron en ambos lados de las hojas ( Netto
et al., 2005 ) CO fotosintético 2 se midió el intercambio en vivo en el séptimo par de hojas de
plántulas de café de 8 meses de edad por análisis de gas infrarrojo no destructivo - IRGA (modelo
de licor
Li-6400XT). Las lecturas se realizaron por las mañanas, entre las 7 y las 9:00 a.m. ( Silveira et
al., 2015 )
Las plantas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con tres réplicas y cuatro
plántulas por parcela. Los experimentos descritos anteriormente se realizaron dos veces. Los
tratamientos fueron: i)
P. macrosporus en plántulas de café y ii) control no inoculado.
Para la colonización endofítica, se inocularon plántulas de tres meses de edad con P.
macrosporus rociando una suspensión de esporas en las hojas. La colonización de P. macrosporus
fue evaluado después
7, 14 y 21 días después de la inoculación. En cada tiempo de muestreo, para cada planta, 15
fragmentos (aproximadamente 0,5 cm 2 o 0.5 cm de largo) de raíces, tallos y hojas se depositaron
en medio CCA y se incubaron a 25 C por 10 días. Cada fragmento se observó por microscopía óptica
para detectar la presencia de P. macrosporus.
Las plantas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con cinco réplicas y una
plántula por parcela. El experimento fue realizado dos veces. Los tratamientos fueron: i) P.
macrosporus en plántulas de café y ii) control no inoculado.
2.5. Análisis de la cutícula de la hoja de café.
Se realizaron evaluaciones de permeabilidad de la cutícula para estudiar los cambios
inducidos por la aplicación de P. macrosporus en la superficie de las hojas de café. El sexto par
de hojas de plántulas de café de 7 meses de edad se utilizó en estos ensayos. Para el ensayo de
extracción con clorofila, las hojas se separaron, se pesaron y se sumergieron en 30 ml de etanol
al 80% en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave a 90 rpm. Se extrajeron
alícuotas a los 2, 5, 10, 20, 30 y 40 minutos después de la inmersión en etanol. El contenido de
clorofila se determinó midiendo la absorbancia a 647 y 660 nm y la concentración mM de
clorofila total por gramo de tejido de peso fresco se calculó con la ecuación: (7.93 (A 660 Nuevo
Méjico))
+ (19,53 (A 647 nm)) g 1 ( Sieber et al., 2000 )
Las observaciones en la superficie de las hojas de café se realizaron mediante la prueba de
azul de toluidina. Las plantas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con tres réplicas y
cinco hojas por réplica. El experimento fue realizado dos veces. Los tratamientos fueron: i)
Control sin cámara húmeda; ii) Control con una cámara húmeda durante 12 h; iii) P. macrosporus
en la cutícula con una cámara húmeda durante 12 h. Los controles y las hojas tratadas se
recogieron 12 h después de la inoculación. Las hojas de café se trataron con 6 ml de solución de
azul de toluidina al 0,025% y se incubaron a alta humedad durante 2 h. Las hojas se lavaron
suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de solución de azul de toluidina ( L'Haridon
et al., 2011 ) Para la tinción con calco fluor blanco, las hojas se blanquearon en etanol absoluto
durante la noche, equilibradas en NaPO 0,2 M 4 ( pH 9) durante 1 h, y
121
incubado durante 10 minutos en 0,5% de calco fluor blanco en 0,2 M NaPO 4 ( pH
9) Las hojas fueron enjuagadas en NaPO 4 4 tampón para eliminar el exceso de calco fluor blanco y
visto bajo luz UV ( L'Haridon et al., 2011 ) Las observaciones de microscopía electrónica de
barrido (SEM) de la cutícula de la hoja se realizaron de acuerdo con Alves y col. (2012) .
2.6. Evaluación de enzimas de defensa.
El quinto par de hojas de plántulas de café de 7 meses se usó en estos ensayos ( Fernandes et
al., 2014 ) Siete días antes de la inoculación del patógeno, suspensiones de P. macrosporus
y Acibenzolar-S-metil se rociaron sobre las plántulas. Las hojas se sumergieron en nitrógeno
líquido y se almacenaron en un congelador profundo (80 C). Aproximadamente 900 mg de cada
muestra se molieron en un polvo fino y se almacenaron a 80 ° C hasta la extracción de la enzima.
Las plantas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con tres réplicas y cuatro
plántulas por parcela. El experimento fue realizado dos veces. Los tratamientos fueron: i) Control con
lesión; ii)
C. gloeosporioides + lesión; iii) P. macrosporus + C. gloeosporioides
+ lesión; iv) Acibenzolar-S-metil + C. gloeosporioides + lesión. Las hojas de control y
tratadas se recolectaron a las 0, 24, 48 y 96 h.
Para actividad de peroxidasa, 1300 l L el tampón de extracción (400 mM de KH 2 POLVO 4 [ pH
7.8], 10 mM de EDTA, 200 mM de ácido ascórbico y agua destilada) se añadieron a 200 mg de cada
muestra, se mezclaron por inversión y se centrifugaron inmediatamente a 14,000 rpm durante 20
minutos a 4ºC. C, el sobrenadante se usó para la enzima posterior. Para medir la actividad de la
peroxidasa de guaiacol (POX, EC 1.11.1.7), 10 l L del sobrenadante se mezcló con 100 l L de 100 mM
KH 2 POLVO 4 [ pH
7.0], 45 l L de guayacol 50 mM (Sigma-Aldrich) y 45 l L de 125 mM H 2 O 2, incubado durante 10
minutos a 30 C, la absorbancia se determinó a intervalos de 1 min durante 10 min a 480 nm y se
expresó
como re 480 nmmgP 1 min 1 ( Urbanek et al., 1991 ) Para medir la actividad de catalasa (CAT, EC
1.11.1.6), 10 l L del sobrenadante se mezcló con 100 l L de 200 mM de KH 2 POLVO 4 [ pH 7], 250 mM H
2 O 2 y 80 l L agua destilada, incubada durante 3 minutos a 25 Las lecturas de C y absorbancia se
realizaron a intervalos de 0,5 min durante 3 min. El contenido de CAT se determinó midiendo la tasa
de disminución de la absorbancia a 240 nm y el coeficiente de extinción molar de 18 mM 1 cm 1 (
Havir y McHale, 1987 ) Para la extracción de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL, EC
4.3.1.5), 700 l L de tampón de extracción (50 mM de NaPO 4 [ pH 6,5], se añadió PMSF 1 mM y PVP al
1% a 200 mg de cada muestra, se mezcló por inversión y se centrifugó inmediatamente a 14,000
rpm durante 25 min a 4ºC. C. El sobrenadante se usó para el ensayo de actividad enzimática
mezclando
5 l L de extracto enzimático a 145 l L Tris-HCl [pH 8.8], 50 l L de 40 mM L- Fenilalanina ( PAGS 98%,
Sigma-Aldrich), incubados durante 20 minutos a 37 C, se determinó la absorbancia a intervalos de
2 minutos durante 20 minutos a 280 nm y se expresó como re
280 nmmgP 1 min 1 ( Mori et al., 2001 )
2.7. Valoración de lignina y fenol total
El sexto par de hojas de las plantas descritas en la evaluación de las enzimas de defensa
descritas anteriormente se utilizaron en estos ensayos ( Fernandes et al., 2014 ) Las muestras se
liofilizaron durante 76 hy ca. Se transfirieron 30 mg de las muestras liofilizadas a tubos de
microcentrífuga de 2 ml, se homogeneizaron con 1,5 ml de metanol al 80%, se agitaron durante
15 h en la oscuridad a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12,000 rpm durante 5 minutos
a temperatura ambiente. El sobrenadante se usó para fenoles totales y el precipitado se usó para
cuantificar la lignina.
Para la cuantificación de la lignina, se añadió la fracción precipitada sólida con 1,5 ml de
metanol al 80%, se agitó vigorosamente en un vórtice, se centrifugó a 12,000 rpm durante 5
minutos, luego se desechó el sobrenadante y el residuo sólido se secó durante 48 ha temperatura
ambiente. Las muestras se mezclaron con 1,5 ml de ácido tioglicólico y
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ácido clorhídrico (HCl) 2 M (porción 1:10), se mezcla suavemente mediante inversión y se coloca
en agua a 90ºC. C durante 4 h, centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min, se descartó el
sobrenadante y se usó el residuo sólido. Al residuo sólido, se añadieron 1,5 ml de agua destilada
y desionizada, se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se desechó y el
residuo sólido se resuspendió con 1,5 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 0,5 M y se incubó en un
agitador a 100 rpm. durante 15 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Las muestras se
centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo
de microcentrífuga de 2 ml y se mezcló con 200 l L de HCl 1 N e incubado durante 4 ha 4 C, las
muestras se centrifugaron nuevamente a
10.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se desechó y el residuo sólido se resuspendió
en 2 ml de NaOH 0,5 M. El contenido de lignina se determinó leyendo la absorbancia a 280 nm y
se expresó como l g de lignina soluble por miligramo de masa seca ( Doster y Bostock, 1988 )
Para contenido total de fenol, 150 l L del sobrenadante de metanol descrito anteriormente se
mezcló con 150 l L 0.25 N Folin-Ciocalteau por 5 min, homogeneizado con 150 l L 1 M Na 2 CO 3
durante 10 minutos y diluido con agua sin sal durante 1 hora a temperatura ambiente. El
contenido total de fenol se determinó midiendo la absorbancia a 725 nm y se expresó como
de ácido clorogénico por miligramo de masa seca ( Spanos y Wrolstad, 1990 )
2.8. Utilización de fuentes de carbono y nitrógeno.
Colletotrichum gloeosporioides y P. macrosporus se cultivaron en placas de MEA al 2%
durante 10 días a 25 C y 100 l L de suspensiones de esporas que contienen 10 6 6 se
transfirieron conidios / ml a cada pocillo de Biolog FF MicroPlate TM ( Biolog Inc.). Las
microplacas se incubaron a 25ºC. C, después de 72 h, se determinó la absorbancia a 490 nm
(actividad mitocondrial) y 750 nm (crecimiento de micelio) usando un lector de microplacas. Los
datos de absorbancia de 490 nm y
750 nm se analizaron por separado ( Kraus et al., 2004 ) El índice de superposición de nicho (NOI)
se calculó para el ensayo en función del número de fuentes de carbono y nitrógeno utilizadas por
P. macrosporus que también fueron utilizados por C. gloeosporioides dividido por el número
total de fuentes de nutrientes utilizadas por C. gloeosporioides
( Thornton et al., 2008 )
Las microplacas se distribuyeron en un diseño de bloques al azar con tres réplicas. El
experimento fue realizado dos veces.
2.9. Ensayos de antagonismo microbiano.
La supuesta actividad micoparasitaria de P. macrosporus in vitro
en contra C. gloeosporioides fue evaluado por doble confrontación. Los hongos se transfirieron a
los lados opuestos de placas de agar con extracto de malta al 2% a 1 cm del borde y se incubaron
durante 7, 14 y 21 días a 25 C con 12 h de luz ( Larralde et al., 2008 ) Cuando los hongos se
encontraron, se tomaron muestras de la intersección micelial y se visualizaron bajo luz y microscopía
electrónica de barrido para detectar evidencias de micoparasitismo ( Alves et al., 2012 ) La
supuesta actividad micoparasitaria de P. macrosporus en contra C.
gloeosporioides también fue evaluado en vivo al inocular el patógeno en las hojas de café según
Maia y col. (2013) . Después de la aparición de la primera necrosis foliar a 100 l L de suspensión
de P. macrosporus fue depositado sobre las lesiones. Después de 7, 14 y 21 días de la inoculación
del antagonista, se tomaron muestras de la lesión y se visualizaron bajo microscopía electrónica
de barrido. La recuperación de P. macrosporus se realizó enchapado cuadrado (0.5 0,5 cm) tejidos
foliares enfermos y sanos en CCA. El experimento se distribuyó en un diseño de bloques al azar
con cinco réplicas y se realizó dos veces.
La capacidad putativa de P. macrosporus para producir diferentes moléculas o enzimas
tóxicas para el patógeno se evaluó mediante confrontación
tinción con azul Trypan. Poco después, las placas de confrontación con 15 ml de solución de azul
de tripano al 0,1%, se extendieron con una varilla de vidrio y después de 10 minutos de
incubación a temperatura ambiente se enjuagaron con agua destilada y se fotografiaron ( Zhang
et al., 2015 ) El experimento se distribuyó en un diseño de bloques al azar con cinco réplicas y se
realizó dos veces.
Producción de compuestos volátiles fungitóxicos por P. macrosporus
fue evaluado cultivando P. macrosporus en un lado de un Petri bipartito y C. gloeosporioides en el
lado opuesto. Las placas se incubaron a 25ºC. C y 12 h de luz durante 5 días. El ensayo se realizó
cultivando los hongos en MEA, CCA y en combinaciones de ambos medios. El control negativo
contenía solo el patógeno en un lado de las placas. El efecto de P. macrosporus en C.
gloeosporioides se cuantificó comparando el índice de crecimiento micelial (MGI), determinado
según Maguire (1962): MGI = [ R ( LA SI)]/
N, donde, A es el diámetro actual del micelio, B es el diámetro del micelio anterior y N es el
número de días entre dos mediciones. Las evaluaciones se detuvieron cuando los controles
negativos llegaron al borde de la placa.
Los tratamientos se instalaron en un diseño de bloques al azar, con cinco réplicas (bloques)
en un solo experimento, totalizando una placa de Petri bipartita por réplica. El experimento fue
realizado dos veces.
lg
2.10. Análisis estadísticos
Los datos de diferentes experimentos se probaron para determinar la normalidad y se
sometieron a un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Scott-Knott
(P
= 0.05) en el examen y la prueba de Tukey (P = 0.05) para los siguientes experimentos. Datos
sobre el efecto de P. macrosporus en características de crecimiento se compararon con el t-
prueba (P = 0.05). Los conjuntos de datos repetidos se analizaron por separado y solo se
mostraron los datos de una de las repeticiones cuando los resultados tuvieron una tendencia
similar. Todos los análisis se realizaron en el software R ( R Core Team, 2013 )
3. Resultados
3.1. Selección de antagonistas contra C. gloeosporioides
Los hongos saprofitos Phialomyces macrosporus, Chloridium virescens var.
Chlamydosporium, Memnoniella echinata, Dictyochaeta obesispora, Sarcopodium circinatum,
Curvularia eragrostidis, Pithomyces chartarum, Stachybotrys nephosfora, Thozetella cubensis y
Thozetella sumergirse redujo la gravedad de la enfermedad en comparación con el control con el
patógeno solo. Esta reducción varió de
6.5 a 41% ( Figura 1 A) y P. macrosporus proporcionó la mayor reducción y, por lo tanto, se eligió
para experimentos posteriores sobre el modo de acción. En un segundo experimento, P. macrosporus
redujo la gravedad de la enfermedad en un 32 a 41% en comparación con el control con
C. gloeosporioides. El acibenzolar-S-metilo redujo la gravedad de la enfermedad en un 11 a 18% (
Figura 1 SI).
3.2. Colonización endofítica y promoción del crecimiento.
Inoculación de plántulas de café con P. macrosporus conducir a un mayor crecimiento como lo
demuestra la mayor masa seca de las plántulas tratadas en comparación con el control ( tabla 1 )
La absorción de nitrógeno y fósforo aumentó en las plántulas tratadas, pero el contenido de
manganeso fue menor en las plantas tratadas ( tabla 1 ) Aunque el contenido de clorofila no fue
significativamente diferente entre los tratamientos (valor P: 0.3615), la fotorrespiración fue
mayor en las plántulas de café inoculadas con P. macrosporus ( tabla 1 ) y modificó la arquitectura
de la plántula ( Fig. S1 )
 GAA Rodríguez y cols. / Control biológico 103 (2016) 119–128 123

Figura 1. Detección de hongos saprofitos contra C. gloeosporioides en plántulas de café y colonización endofítica. Potencial de detección de hongos antagonistas (A), eficacia de P. macrosporus en la reducción de la gravedad de la antracnosis
(B), colonización endofítica de las plántulas de café (C). Se rociaron plántulas de café de siete meses con los antagonistas y C. gloeosporioides se aplicó siete días después y se evaluó la gravedad de la enfermedad para calcular el área bajo la
curva de progreso de la enfermedad (AUDPC). La colonización endofítica se evaluó en plántulas de café de tres meses de edad inoculadas con una suspensión de esporas de P. macrosporus. Las medias seguidas de la misma letra no son
significativamente diferentes según la prueba de Scott-Knot para 1A y Tukey (P <0.05), para 1B. Phm = Phialomyces macrosporus, Cvc = Chloridium virescens var. clamidosporio, Mec = Memnoniella echinata, Dob = Dictyochaeta obesispora, Sci = Sarcopodiu
circinatum, Cer = Curvularia eragrostidis, Pch = Pithomyces chartarum, Sne = Stachybotrys nephosfora, Tcu = Thozetella cubensis, Tsu = Thozetella sumergida, Col = Colletotrichum gloeosporioides, Bion = Acibenzolar-S-metilo (25 gr / ha).

Phialomyces macrosporus raíces endófitas penetradas y colonizadas y tallos de plántulas de

3.4. Inducción de enzimas de defensa.
café en condiciones no estériles. La colonización de raíces y tallos aumentó con el tiempo. El
hongo se recuperó del 73% de las piezas de raíz desinfectadas en la superficie y del 14% de las
Las enzimas de defensa guaiacol peroxidasa (POX), catalasa (CAT) y fenilalanina
piezas del tallo después de 21 días de la inoculación en el suelo ( Figura 1 C). Phialomyces
amoniaco-liasa (PAL) no fueron inducidas por el patógeno solo, pero P. macrosporus fue capaz de
macrosporus no fue recuperado de las hojas de café.
inducir su expresión en las plántulas de café desafiadas con C. gloeosporioides

3.3. Penetración de P. macrosporus en hojas de café.
La permeabilidad de la cutícula aumentó con la aplicación de
P. macrosporus con y sin cámara húmeda. Hubo un daño en la cutícula medido por la liberación de
clorofila ( Figura 2 A), que no sucedió en la cámara húmeda sin el hongo. La mayor liberación de
clorofila se observó en la cámara húmeda durante 12 h, así como con la tinción de la pared celular
con calco fluor white y toluidine blue ( Figura 2 B - C), indicando que P. macrosporus aumento de
la ruptura de la cutícula ( Figura 2 D) y la permeabilidad intracelular ( L'Haridon et al., 2011 )
( Fig. 3 ANTES DE CRISTO). La actividad de las enzimas antioxidantes POX y CAT fue mayor en el
segundo día (valor P: 0,0001) de P. macrosporus
aplicación y desafiante con C. gloeosporioides ( Fig. 3 A, B). La mayor actividad de PAL (valor P:
0,0002) fue inducida por P. macrosporus y Acibenzolar-S-metilo antes de la inoculación de C.
gloeosporioides y disminuyó posteriormente en todos los tratamientos ( Fig. 3 C).
3.5. Contenido total de fenol y cuantificación de lignina
Los niveles de fenol antes de la inoculación con el patógeno a las 0 h no fueron
significativamente diferentes entre los tratamientos (valor P:
0.3956) e igualmente a las 96 h después de la inoculación con el patógeno, los niveles de fenol
fueron similares entre los tratamientos (valor p:
124 GAA Rodríguez y cols. / Control biológico 103 (2016) 119–128

tabla 1
Efecto de Phialomyces macrosporus sobre las características de crecimiento de las plántulas de café. Se inocularon plántulas de café de dos meses aplicando una suspensión de P. macrosporus en
el suelo alrededor de las plántulas y las evaluaciones se realizaron seis meses después.

P. macrosporus 1 Controlar 1

Crecimiento de la planta

Altura de la planta (cm) 21,85 Los, * * 20.06 los

Longitud de raíz más larga (cm) 20,91 los 20,88 los
Masa seca foliar (gr) 7.03 los 4.88 si
Raíz de masa seca (gr) 1,64 los 1,77 los
Volumen de raíz (mm 3) 7.13 los 10,13 los
Número de hojas por planta 24,38 los 21,75 si

Absorción de nutrientes 2
N (dag / kg) 3.95 los 3,63 si

P (dag / kg) 0,21 los 0,18 si

K (dag / kg) 2,33 los 2,30 los
Ca (dag / kg) 0,69 los 0,68 los
Mg (dag / kg) 0.24 los 0.25 los
S (dag / kg) 0.25 los 0.23 los
Zn (mg / kg) 15,75 los 13.25 los
Fe (mg / kg) 329,50 los 346,00 los
Mn (mg / kg) 48,00 si 58,50 los
B (mg / kg) 62,60 los 63,20 los

Contenido de clorofila ( l mol / cm 2) 3

0,04 los 0,04 los
Clorofila A
Clorofila B 0,02 los 0,02 los
Clorofila total 0,07 los 0,06 los

Fotorespiración 4 4
CO 2 concentración 4.51 los 3.90 si

1 Se tomaron muestras de doce plantas por tratamiento.

2 Se realizaron análisis de hojas para los siguientes nutrientes: Nitrógeno (N), Fósforo (P), Potasio (K), Calcio (Ca), Magnesio (Mg), Azufre (S), Zinc (Zn), Hierro (Fe), Manganeso (MN) y

Boro (B).
3 El análisis de clorofila se realizó mediante espectroscopía empleando un medidor de longitud de onda dual.
4 4 El análisis de la fotorrespiración se realizó con el Analizador de gases infrarrojos (IRGA).
* *
Las medias seguidas de la misma letra no son significativamente diferentes según el t- prueba (P = 0.05).

0.1369). Sin embargo, cuando se compararon los diferentes tiempos de evaluación, 0 y 96 h,

y Col en agar de extracto de malta (MEA) hubo la mayor reducción (42.3%) en el índice de
hubo un aumento en los niveles de fenol para los tratamientos Col y Phm + Col y una disminución
crecimiento micelial (MGI) y en la esporulación de Col (57.8%). Por otro lado, cuando ambos P.
de Bion
macrosporus y C. gloeosporioides se cultivaron con reducción de CCA en MGI y la esporulación
+ Col ( Fig. 4 LA). En ambos tiempos de análisis, 0 y 96 h, no hubo diferencias significativas entre
fue de 11.3% y 14.3% respectivamente. La reducción en MGI y esporulación fue de 37% y 33%,
los tratamientos para el depósito de lignina ( Fig. 4 SI). Sin embargo, entre 0 y 96 h hubo un
respectivamente, cuando ambos hongos se cultivaron en MEA ( Fig. S3B )
aumento en la acumulación de lignina inducida por Phm + Col y una disminución en el tratamiento
con C. gloeosporioides solo ( Fig. 4 SI).

3.6. Utilización de fuentes de carbono y nitrógeno.
C. gloeosporioides y P. macrosporus utilizó las mismas 95 fuentes de carbono y nitrógeno y,
en consecuencia, el índice de superposición de nicho (NOI) fue 1 ( Fig. 5 ) Sin embargo, los
hongos
diferían en su eficacia para usar estas fuentes de carbono y nitrógeno. Mientras C. gloeosporioides utilizó
13 fuentes de carbono y nitrógeno con más eficacia que P. macrosporus, Este hongo antagonista
utilizó 21 fuentes con más eficacia que C. gloeosporioides ( Fig. 5 )
4. Discusión
En el presente estudio, el potencial de diez hongos saprofitos diferentes para reducir la
antracnosis, causado por C. gloeosporioides en cafe fue evaluado. El aislado más prometedor fue
P. macrosporus que consistentemente redujo la gravedad de la enfermedad en un 32–41% en dos
experimentos independientes. Este hongo promovió el crecimiento de las plantas, colonizó raíces
y tallos endofíticamente y no produjo ningún efecto fitotóxico en las plántulas de café. Además,
P. macrosporus Compitió por los nutrientes en las lesiones foliares y la resistencia inducida
contra el patógeno.

P. macrosporus parece ser una especie saprófita común y se aisló de muestras de suelo y
hojarasca en Nueva Zelanda, Japón y Brasil ( Misra y Talbot, 1964; Tokumasu y Aoiki, 2002 )
3.7. Antagonismo microbiano
Colonizó endofíticamente los tejidos internos de las raíces y los tallos de las plántulas de café y
también las lesiones causadas por C. gloeosporioides en hojas de cafe. Aunque no era capaz de
El micelio de C. gloeosporioides no fue inhibido, modificado o colonizado por P. macrosporus (
colonizar hojas de café sanas de manera endofítica, era capaz de causar perturbaciones que
Fig.
conducen a una mayor permeabilidad de la cutícula y parecía haber inducido a la planta a reconocer
S2A ) Observaciones bajo microscopio óptico y SEM en vivo y in vitro no mostró evidencia de
patrones moleculares asociados al daño (DAMP) que inducen respuestas de resistencia observadas
micoparastismo en ninguna de las 20 muestras examinadas ( Fig. S2B, C ) Había, sin embargo,
para el patógeno Botrytis cinerea ( L'Haridon et al., 2011 ) En este estudio, la mayor
menos conidios de C. gloeosporioides a los 21 días de inoculación de P. macrosporus in vivo en las
permeabilidad de la cutícula coincidió con un aumento en la respuesta de fenilalanina amoniaco-
necrosis de la hoja. La recuperación de P. macrosporus del área necrótica fue del 45% en un total
liasa (PAL) antes del ataque del patógeno y el consiguiente aumento en la deposición de
de 20 lesiones foliares necróticas examinadas. Phialomyces macrosporus se recuperó solo de las
áreas necróticas.

P. macrosporus fue capaz de producir compuestos volátiles tóxicos para

C. gloeosporioides en los dos medios diferentes probados ( Fig. S3A ) Cuando P. macrosporus se
cultivó en agar de zanahoria y harina de maíz (CCA)
 GAA Rodríguez y cols. / Control biológico 103 (2016) 119–128 125

- MC-Phm + MC + Phm + MC-Phm

re

- MC-Phm + MC + Phm + MC-Phm

Figura 2. Efectos de P. macrosporus en la cutícula de las plántulas de café: MC Phm: sin cámara húmeda y sin Phm ( P. macrosporus), + MC Phm - cámara húmeda sin Phm,
+ MC + Phm - cámara húmeda y Phm. Contenido de clorofila en las hojas inoculadas con P. macrosporus se midió espectrofotométricamente (A), superficie de hojas de café teñidas con calco fl nuestro blanco observado bajo luz UV (B),
superficie de hojas de café teñidas con azul de toluidina (C), imagen de microscopía electrónica de barrido de la superficie de la cutícula (D). Las flechas indican áreas dañadas observadas con diferentes métodos. Barra de escala = 100 l metro.
126 GAA Rodríguez y cols. / Control biológico 103 (2016) 119–128

LA LA
Columna Phm + Col Bion + Col Controlar
**
3500
3500 Automóvil club Automóvil clAuubtobmritóávniilccolub británico
Actividad de peroxidasa guaiacol (Δ 280 nm mgP-1 Min-1)

británico
Automóvil club británico Automóvil club británico

ug catechol (mg de materia seca) -1

3000 aB
3000 aB
**
2500
2500 aB
2000
2000
1500
1500
1000

00 24 48 96 1000
0500
Horas
0500

0h 96 h
si 14000 45000
si Col Phm + Col Bion + Col Control
Automóvil club británico
12000 40000 Automóvil club británico Automóvil club británico
**
Automóvil club británico
10000 35000 Automóvil club británi co
Actividad de catalasa (18 mM-1 cm-1)

aB a B Automóvil club británico

8000
30000
6000

(mg de materia seca) -1

25000

μg de lignina
4000
20000
2000
15000
0
00 24 48 96
10000
Horas
5000
C 0
0h 96 h
Actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (Δ 280 nm mgP-1 Min-1)

**
4.5 5 Columna Phm + Col
Bion + Col Controlar
Fig.4. Concentración de compuestos espesantes de la pared celular: fenol total (A) y lignina (B),
3.5 4 en hojas de café tratadas con Col ( C. gloeosporioides), Phm ( pags.
macrosporus), Bion o Control (sin tratamiento). El fenol total y la lignina se extrajeron de las hojas y se
cuantificaron por espectrofotometría. Las medias seguidas de la misma letra minúscula no son significativamente
2.5 3
diferentes en el mismo tiempo de muestreo (0 o 96 h) y las medias seguidas de la misma letra mayúscula no son
**
significativamente diferentes entre los tiempos de muestreo (0 y 96 h) según la prueba de Tukey (P <0.05).
1.5 2 ** **

0.5 1
00

00 24 48 96 muerte celular y la consiguiente reducción observada del área necrótica ( Figura 1 )

Horas

El filoplano generalmente se considera un ambiente limitado en nutrientes ( Andrews, 1992 ) Para

Fig. 3. Actividad de las enzimas de defensa: peroxidasa guaiacol (A), catalasa (B), fenilalanina amoniaco-liasa (C). Se
recogieron hojas de plántulas de café tratadas y de control y se determinó la actividad enzimática por
espectrofotometría. Las flechas negras indican Colletotrichum inoculación. Los asteriscos indican medios que son
significativamente diferentes entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Tukey (P <0.05).
lignina y compuestos fenólicos en las paredes celulares y una mejora posterior de la actividad de
las enzimas antioxidantes POX y CAT, como también observaron otros autores en las respuestas
de resistencia inducidas típicas ( Henry et al., 2012; Newman et al., 2013; Sattler y Funnell-Harris,
2013 )
El engrosamiento de la pared celular juega un papel importante en la resistencia del café contra Colletotrichum ( Silva et
al., 2006; Loureiro et al., 2012 )
Para evitar estas barreras físicas. Colletotrichum spp. secretan proteínas efectoras para
suprimir las respuestas de resistencia del huésped ( Stephenson et al., 2000 ) Generalmente,
estas proteínas efectoras son secretadas por los apresorios, las hifas de penetración y las hifas
biotróficas para mantener la viabilidad del huésped en la fase biotrófica y luego inducen la
muerte celular por la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y cambian a la fase
necrotrófica ( Kleemann et al., 2012 ) Curiosamente, encontramos que P. macrosporus aumentó la
deposición de lignina y el contenido total de fenol en un 21 y 16%, respectivamente, aumentó las
enzimas antioxidantes POX y CAT y también la actividad de PAL. Estas observaciones sugieren
que P. macrosporus
Estalla la actividad enzimática antioxidante y disminuye la acumulación de ROS que es un factor
clave de virulencia en el arsenal utilizado por Colletotrichum especies ( Kleemann et al., 2012 )
Esto lleva a una reducción
tener éxito en este entorno adverso, los hongos utilizan diferentes estrategias, como el hiperpastismo
y la competencia por los nutrientes ( Andrews, 1992 ) El micoparasitismo es una interacción biotrófica
en la que un organismo se beneficia a expensas de un hongo ( Druzhinina et al., 2011 ) A pesar de
que P. macrosporus no antagonizó C. gloeosporioides a través del micoparasitismo disminuyó la
esporulación del patógeno en las lesiones foliares. Esta disminución en la esporulación puede
explicarse por la competencia por los nutrientes durante la fase necrotrófica de C.
gloeosporioides y también fue respaldado por el valor del índice de superposición de nicho de 1,
lo que sugiere que se produce competencia por los nutrientes. Además, la glucosa, la xilosa, la
asparagina y la prolina son desencadenantes clave de la esporulación para
C. gloeosporioides ( Sangeetha y Rawal, 2008; Kumara y Rawal, 2008 ) y estos nutrientes son
componentes principales de las bayas y hojas de café ( Cavatte et al., 2002 ) Coincidentemente P.
macrosporus creció más rápido que el patógeno para glucosa y asparagina y similar para todos los
demás, probablemente compitiendo por su uso en la superficie de la hoja viva y saprófita en el
rastrojo del cultivo ( Fig. 5 ; Tabla S2 ), fortaleciendo aún más la hipótesis de la competencia por
los nutrientes como uno de los mecanismos de biocontrol que juegan un papel en esta interacción.
Mientras que la P. macrosporus- la resistencia inducida mediada puede contribuir a la reducción
de la colonización inicial del patógeno, el antagonista probablemente reducirá C. gloeosporioides esporulación
en los tejidos necróticos. C. gloeosporioides utiliza una estrategia hemibiotrófica intracelular con una
fase biotrófica que es seguida por una fase necrotrófica destructiva. Esta fase necrotrófica culmina
con la absorción de los nutrientes depositados en los muertos.
 GAA Rodríguez y cols. / Control biológico 103 (2016) 119–128
Fig. 5 Fuentes de carbono y nitrógeno utilizadas de manera diferente por Col ( C. gloeosporioides) y Phm ( P. macrosporus) de acuerdo con la t- prueba (P <0.05). Se transfirieron suspensiones de esporas de Col y Phm a placas Biolog FF y se
evaluó el crecimiento 72 h después de la transferencia.
tejidos vegetales que se utilizan para la reproducción ( Perfect et al., 1999 ) Otros hongos
saprofitos, como Ulocladium atrum, También compite por nutrientes en los tejidos de las hojas
muertas y controla el patógeno Botrytis cinerea de forma similar ( Ronseaux et al., 2013 ) Las
estrategias alternativas de competencia, como la producción de sideróforos, la competencia por el
espacio y la producción de enzimas también pueden haber ocurrido en la interacción entre P.
macrosporus y C. gloeosporioides en tejidos muertos de hojas de café, pero no se investigaron en
detalle. En nuestros estudios P. macrosporus se aplicó en las hojas de café 7 días antes del
patógeno, pero este saprófito aparentemente no coloniza las hojas de manera endofítica. Los
estudios futuros deben dirigirse a la aplicación del antagonista en las lesiones foliares para
mejorar aún más los niveles de control.
Muchos microorganismos generan una mezcla de compuestos orgánicos volátiles (COV) que
pueden ser tóxicos para otros, incluidos los hongos beneficiosos y fitopatógenos ( Morath et al., 2012;
Kottb et al., 2015; Macías-Rubalcava et al., 2010 ) Los COV pueden afectar a los hongos al
reducir el
crecimiento micelial, la esporulación y la germinación ( Morath et al., 2012; Li et al., 2012 ) En este
estudio, encontramos que los volátiles producidos por P. macrosporus tener un efecto significativo en
la esporulación de C. gloeosporioides in vitro y este efecto inhibitorio dependía de la fuente de
nutrientes. Sin embargo, una prueba definitiva del papel de estos volátiles en la esporulación del
patógeno. en vivo aún espera la confirmación debido a la naturaleza transitoria de los VOC en
entornos abiertos.
El hongo antagonista P. macrosporus crece rápido y produce una gran cantidad de esporas
en los medios de cultivo comunes. Sin embargo, las fuentes optimizadas de carbono y nitrógeno
aliadas con una formulación adecuada deben explotarse para mejorar la germinación y mejorar su
supervivencia en las hojas y mejorar aún más la actividad antagonista de este agente de
biocontrol contra C. gloeosporioides.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a la Fundación Estatal de Apoyo a la Investigación de Minas Gerais
(FAPEMIG); Beca del Consejo Nacional para el Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq)
48021620134, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología del Café (INCT-Café); y
SISBIOTAFAPESP, por proporcionar el apoyo financiero necesario para el desarrollo de este
trabajo; a CNPq por brindar asistencia a los autores.
Apéndice A. Datos suplementarios
Los datos complementarios asociados con este artículo se pueden encontrar, en la versión
en línea, en http://dx.doi.org/10.1016/j.biocontrol.2016.
08.009 .
127
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