Resumen

Sumersión de órganos de la planta perturba la homeostasis al limitar la difusión de oxígeno, dióxido de

carbono y etileno. En el arroz (Oryza sativa L.), el haplotipo en el multigénica SUBMERGENCE1 ( SUB1 .) locus
determina si las plantas a sobrevivir inmersión prolongada SUB1 codifica dos o tres factores de transcripción
de la familia el grupo VII de etileno factor de respuesta: SUB1A , SUB1B ySUB1C . La presencia de SUB1A-1 y
su fuerte inmersión disparado por la inducción de etileno mediada confiere tolerancia a la sumersión a
través de una estrategia de supervivencia de la quietud que inhibe la giberelina (GA) inducida por el
consumo de hidratos de carbono y el crecimiento de la elongación. SUB1C es siempre presente y actúa
aguas abajo de la mejora de la Asamblea General la capacidad de respuesta durante la inmersión.  En este
estudio, la expresión heteróloga ectópica de arroz SUB1A y SUB1C enArabidopsis thaliana fue utilizado para
explorar los mecanismos conservados de acción asociadas a estos genes utilizando indicadores de
desarrollo, fisiológicos y moleculares. Al igual que en plantas de arroz transgénicas que expresan
ectópica SUB1A-1 , plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan constitutivamente SUB1A muestran la
insensibilidad y la hipersensibilidad GA ácido abscísico. Ectópico SUB1C expresión tiene efectos más
limitados en el desarrollo, las respuestas al estrés y el transcriptoma. La observación de un fenotipo de
retraso en la floración en las líneas de sobre-expresión de SUB1A llevó a la conclusión de que la inhibición de
la iniciación floral es un componente de la estrategia de supervivencia reposo en el arroz. En conjunto, estos
análisis demuestran conserva, así como funciones específicas para grupos de factores de respuesta VII de
etileno en la integración de las respuestas abióticos con el desarrollo.

Introducción

Los cultivos y plantas silvestres son frecuentemente devastada por inmersión parcial o total debido a la
menor disponibilidad de oxígeno y dióxido de carbono, con frecuencia acompañado de un aumento en
etileno. En cuestión de minutos a horas, el anegamiento de las raíces, y, en algunos casos, la inmersión de
los órganos aéreos, lleva a un cambio de aeróbica a metabolismo anaeróbico y, en días o semanas, para
completar el agotamiento de las reservas de hidratos de carbono con resultado de muerte (  Bailey-Serres y
Voesenek, 2008, 2010 ). Es bien sabido que las células de las plantas privadas de la síntesis de proteínas de
oxígeno límite para conservar la energía, y mostrar una mayor producción de enzimas asociadas con el
catabolismo de la sacarosa, la glucólisis y fermentación ( Bailey-Serres y Voesenek, 2008 ). Con el
advenimiento de las técnicas genómicas, las transcripciones que son inducidos y traducido selectivamente
en condiciones de baja tensión de oxígeno han sido ampliamente descrito para Arabidopsis
thaliana (revisado porBailey-Serres y Voesenek, 2010 ). El cuadro de mRNAs traducidos en la falta de
oxígeno se extiende desde las enzimas metabólicas de los factores de transcripción, los componentes de
señalización de la vía, generadores y reguladores de las especies reactivas del oxígeno, la pared celular de las
enzimas de modificación y de las proteínas de choque térmico ( Liu et al. , 2005 ; Loreti et al. , 2005 ,Branco-
Price et al. , 2008 ; Mustroph et al. , 2009 ). Hay una gran coincidencia entre los bajos de oxígeno y de ARNm
inducidos por inmersión, y algunos genes fuertemente regulados hasta que codifican proteínas de función
desconocida modular tanto la tolerancia a bajos niveles de oxígeno y la inmersión (  Mustroph et al. ,
2010 ; Lee . et al , 2011 ) .

La comprensión de los mecanismos de respuesta fisiológicos y de desarrollo asociados con bajos niveles de
oxígeno el estrés y la inmersión se ha beneficiado de los estudios de especies cruzadas
incluyendo Arabidopsis thaliana , palustris Rumex y Oryza sativa (Bailey-Serres y Voesenek, 2008,
2010 ; Mustroph et al. , 2010 ) . Dos respuestas de aclimatación han sido identificados: la estrategia de
escape de bajo oxígeno (LOES) y la estrategia de la quietud de bajo oxígeno (LOQS;  Bailey-Serres y Voesenek,
2008 ). LOES implica un conjunto de características, incluyendo una alta tasa de consumo de hidratos de
carbono, lo que permite el alargamiento rápido de los órganos aéreos para mantener las hojas por encima
del nivel del agua. En arroz de aguas profundas, cuyas regiones internodal rápidamente alargada cuando
está parcialmente sumergido, LOES está mediado por lo menos tres hormonas ( Bailey-Serres y Voesenek,
2008 ), y por SNORKEL1 y SNORKEL2 ( SK1 / SK2 ), que son el factor de respuesta de etileno en tándem (FER )
los genes (Hattori et al. , 2009 ). Por otro lado, quiescencia implica tensión inducida por la represión del
consumo de carbohidratos, concomitante con la inhibición de crecimiento de las plantas.  Esta estrategia de
la tolerancia se invierte una vez que el estrés se alivia. En arroz de tierras bajas, LOQS está determinada por
la SUB1A gen de SUBMERGENCE1 ( SUB1 ), un locus de codificación multigénica dos (SUB1B y SUB1C ) o tres
( SUB1A , SUB1B y SUB1C ) FERs ( Fukao et al. , 2006 ; Xu . et al , 2006 ). Curiosamente, a pesar de su acción
la antítesis, los SK y SUB1A genes son miembros de la misma subclade de FERs, designados por el grupo
VII Nakano et al. (2006) .

El etileno mediada por la inducción de SUB1A . iniciados LOQS SUB1C también es inducida por etileno, pero
la acumulación de su ARNm durante la inmersión es más probable impulsado por una mayor receptividad a
GA, que sigue la reducción de etileno-promovida en ácido abscísico (ABA; Fukao y-Bailey Serres,
2008 ). Cuando SUB1A-1 está presente en el SUB1 haplotipo, hay un menor consumo acelerado de las
reservas de hidratos de carbono para el metabolismo anaeróbico en el tejido aérea ( Fukao et al. , 2006 ) y la
acumulación cada vez mayor de arroz SLENDER 1 (SLR1) y arroz SLENDER 1-COMO 1 (SLRL1) proteínas, que
inhiben el crecimiento de elongación por la represión de la señalización GA ( Fukao y Bailey-Serres,
2008 ). Debido a la abundancia de SUB1C ARNm es regulada por la Asamblea General y el regulado
por SUB1A ( Xu et al. , 2006 ), se planteó la hipótesis de que SUB1C es importante para el catabolismo de los
hidratos de carbono GA-mediada y el crecimiento de alargamiento ( Fukao et al. , 2006 ).

El arroz ( O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare) y Arabidopsis (Columbia-0) genomas codifican 15 y cinco del
grupo VII FERs, respectivamente ( Nakano et al. , 2006 ). En Arabidopsis, pobre en oxígeno el estrés y la
inmersión hasta de regular los ARNm de los dos ERFs grupo VII [ HIPOXIA RESPUESTA
ERF1 ( HRE1 ) / AtERF73 (At1g72360) y HRE2 / AtERF71 (At2g47520)] ( Licausi et al. , 2010 ; Leeet al . ,
2011 ). En plántulas, la sobre-expresión de HRE1 constitutivamente ARNm eleva anaeróbicas de respuesta,
incluidaDEHYDROGENASE1 ALCOHOL ( ADH1 ), mientras que el hre1 hre2 doble mutante muestra la
inducción limitada de estos mRNAs en respuesta a la tensión de oxígeno baja (  Licausi et al. , 2010 ). Otro
grupo VII ERFs también contribuyen a la regulación de ADH1 en Arabidopsis, incluyendo la oscuridad y los
genes inducibles de etileno- RAP2.2 ( Hinz et al. , 2010 ) y RAP2.12 ( Papdi et al. , 2008 ). A pesar de su papel
en la restricción del catabolismo de los hidratos de carbono, SUB1A regula positivamente  ADH1 ARNm
anaeróbicas y otras de respuesta en el arroz durante la inmersión ( Fukao et al. , 2006 ; Jung . et al ,
2010 ; Mustroph . et al , 2010 ).

Para examinar la conservación evolutiva en el papel del grupo VII ERFs y para obtener información sobre la
función de SUB1s individuales, heteróloga sobre-expresado el arroz SUB1A y SUB1C en Arabidopsis. Aunque
la expresión ectópica de estos genes no mejoró la supervivencia de inmersión, la expresión de  SUB1A inhibe
la capacidad de respuesta GA y estimuló la capacidad de respuesta ABA, como se observa en el arroz (  Fukao
y Bailey-Serres, 2008 ; Fukao . et al , 2011 ). Además, hemos encontrado que la expresión deSUB1A floración
fuertemente retardada tanto de Arabidopsis y el arroz, concomitante con reducciones en los mRNAs
asociados con la inducción de la floración. Nuestros resultados sugieren la conservación de las vías reguladas
por el grupo ERFs VII a través de especies de plantas.

Resultados

OxSUB1A y OxSUB1C plantas muestran fenotipos pleiotrópicos

Transgénicas Arabidopsis (Col-0) Se produjeron plantas que expresan ectópica N-terminal-FLAG

etiquetados SUB1A o SUB1C bajo el control del promotor CaMV 35S
( OxSUB1A y OxSUB1C ). OxSUB1A plantas homocigotos tenían hojas compactas, roseta amplios y redondos
con peciolos cortos en comparación con Col-0 ( Figura 1a, b y S1a Figura). Las rosetas
de OxSUB1C homocigotos tenían anormalidades menos dramáticos que incluyeron pecíolos cortos y la baja
de hojas rizadas. Estos cambios morfológicos graves se acompañan de alteraciones en el tamaño y la forma
de células de la epidermis abaxial de la hoja y del tallo (Figura S1b).
Figura 1.  fenotipos pleiotrópicos de las plantas de Arabidopsis que expresan arroz SUB1 genes. Roseta de
hojas, pecíolos y antera fenotipos de Col-0, OxSUB1A y OxSUB1C las plantas que crecen bajo un fotoperíodo
de día largo. (A) OxSUB1A-L5 desarrolla hojas cortas y redondeadas yOxSUB1C-L10 desarrolla hojas cortas y
rizadas (30 días de edad, las plantas). La barra vertical negro representa 5 cm. (B) peciolo longitudes de 23
días de edad plantas ( n  = 12). Los valores son medias ± SD. Las letras indican diferencias significativas entre
los genotipos en la etapa misma hoja ( P  <  0,05, Student t  test). (C-H) antera filamento y fenotipos
dehiscencia.(C) Col-0 flor. (D) OxSUB1A-L5 flor con filamentos cortos. (E) OxSUB1A-L12de flores con
filamentos cortos y muestra la inhibición de las anteras. (F)OxSUB1C-L10 flor que muestra la inhibición de la
dehiscencia de las anteras. (G, h) Las flores de Col-0 plantas tratadas con 1 o 5 μ m de carbón activado en
polvo, respectivamente. Sépalos delanteros fueron retirados para visualizar las anteras y estambres. La barra
vertical negro representa 2 mm. (I) La acumulación de proteínas y SUB1A SUB1C en 12 días de edad, las
plántulas de las líneas de expresión de. Las plántulas se sumergieron en 100 μ m MG132 (+) o falso tratado
con (-) durante 4 horas antes de la cosecha. Etiquetados-FLAG SUB1 proteínas se inmunoprecipitaron,
fraccionado por SDS-PAGE, y detectó utilizando anti-FLAG antisuero monoclonal. La masa molecular
aparente se indica.

Debido a la severa reducción en la producción de semillas en la mayoría de las

personas OxSUB1A y OxSUB1C plantas transgénicas, sólo líneas parcialmente fértiles se pudo establecer. La
línea OxSUB1A-L5 sólo se produce la semilla después de los primeros 20 flores, y OxSUB1A-L12 produjo
semillas en inflorescencias laterales tarde en el desarrollo reproductivo. Dos SUB1C sobre-expresión de las
líneas, OxSUB1C-L6 y L10-OxSUB1C , produjo algunas silicuas fértiles de las flores tempranas y tardías (16 ±
7%). El examen de los órganos florales reveló que OxSUB1A líneas desarrolladas filamentos de las anteras
que eran demasiado cortos para auto-polinizan el estigma y no dehiscentes ( Figura 1C-E ), mientras
que OxSUB1C anteras no son dehiscentes ( Figura 1f ). El acortamiento de los filamentos de las anteras y la
dehiscencia de la reducción fueron promovidos en Col-0 por el tratamiento con paclobutrazol (PAC), un
inhibidor de la biosíntesis de GA ( Figura 1 g, h ). Sin embargo, ni la antera, ni defectos de fecundidad
de OxSUB1A y OxSUB1C flores fueron revertidos por la aplicación de GA durante la floración (Figura S2).

 El proteosoma regula la abundancia y la SUB1A SUB1C en Arabidopsis

Para evaluar si las diferencias en OxSUB1A y OxSUB1C fenotipos correlacionado con diferencias en la

acumulación de la Bandera de etiquetado SUB1 proteínas entre los transformantes individuales, se realizó la
inmunoprecipitación seguida de un análisis de inmunoblot con los extractos de las plántulas (  Figura 1i ). El
pre-tratamiento de las plántulas con el inhibidor de proteosoma 26S MG132 niveles significativamente
elevados de SUB1A y SUB1C. De acuerdo con nuestra hipótesis de que las diferencias en los fenotipos se
correlacionan con los niveles de acumulación de proteínas, la abundancia fue menor en SUB1A OxSUB1A-
L5 , que era la más fértil de las líneas de OxSUB1A (Figura S2 B).  Los niveles de etiqueta FLAG-SUB1C niveles
fueron más bajos en OxSUB1C-L6 de OxSUB1C-L10plántulas, aunque ambas líneas producen pocas
semillas. Estos resultados demuestran que la acumulación de ambos SUB1s está regulada por proteosoma
dependiente de la proteolisis en Arabidopsis. Estudios similares indican que SUB1A niveles son proteosoma-
regulado del arroz (Takeshi Fukao, resultados no publicados).

 La sobreexpresión de la SUB1A en Arabidopsis reduce la supervivencia de la oscuridad y

prolongada inmersión

La inducción de la inmersión o constitutiva fuerte sobre-expresión de SUB1A-1 confiere tolerancia a la

inmersión durante 14 días o más en el arroz ( Xu et al. , 2006 ; Fukao et al. , 2006 ; Singh et al. ,
2009 ). Recientemente, Vashisht et al. (2011) determinó la supervivencia de inmersión entre 86 accesiones
de Arabidopsis e identificó la variación natural importante. Para comparar la tolerancia a la sumersión de
la OxSUB1A , OxSUB1C y Col-0, se utilizaron los mismos métodos de tratamiento y el análisis
como Vashisht et al. (2011) para evaluar el tiempo medio letal (LT 50 ) de inmersión ( Figura 2a ). Se
encontró que la LT 50 en OxSUB1C plantas fue casi idéntica (7.00-7.06 días) a la de Col-0, mientras que la de
los dos OxSUB1A líneas transgénicas fue de 4,8 ± 0,2 días ( Figura 2b ). En marcado contraste con la
tolerancia a la sumersión conferida por SUB1A-1 en el arroz, la expresión ectópica de este gen en la
supervivencia de Arabidopsis inmersión disminuyó. Los altos y más bajos de LT 50 valores de las accesiones
de Arabidopsis evaluados fueron 11 y 4 días, respectivamente ( Vashisht et al. , 2011 ), lo que indica
que OxSUB1A plantas transgénicas eran extremadamente sensibles a la inmersión. Debido a que el
tratamiento de inmersión se llevó a cabo en la oscuridad para aumentar la gravedad, que también supervisó
la respuesta de estos genotipos a la oscuridad prolongada bajo condiciones no inundadas (aire). Esto reveló
que OxSUB1A es hipersensible a la oscuridad, como se indica por el rápido amarilleamiento de las hojas de
roseta en la oscuridad ( Figura 2a ).Independiente OxSUB1A amarillentas hojas también más rápidamente
que los otros dos genotipos (Figura S3). También se calculó un índice de riesgo que integra la inmersión y
oscuros LT 50 (datos de Vashisht et al. , 2011 ). OxSUB1A líneas tenían un cociente de riesgo ≤ 1, lo que
indica que su supervivencia fue mayor en la inmersión que en la oscuridad en el aire ( figura 2c ) . En
conjunto, estos datos indican que la expresión ectópica de arroz SUB1A-1 en Arabidopsis no mejora la
tolerancia a la sumersión, ni la supervivencia en la oscuridad, muy probablemente debido a la senescencia
acelerada.
Figura 2.  Inmersión supervivencia de OxSUB1A y OxSUB1C genotipos. (A) Col-0 y dos OxSUB1A y
dos OxSUB1C líneas transgénicas se hicieron crecer hasta la etapa de diez hojas y sumergido bajo la
oscuridad durante 10 días. Las plantas de control se mantuvieron en el aire en la oscuridad.Las fotografías
fueron tomadas inmediatamente después de la inmersión-o la liberación de la oscuridad. (B) El tiempo
medio letal (LT 50 ) ± SE para cada genotipo, obtenido a partir del número de supervivientes después de 9
días de recuperación para cada duración de la inmersión ( n  = 10 plantas) (Vashisht et al ., 2011). (C)
Proporción de riesgo, determina a partir de la supervivencia en inmersión y la oscuridad, en comparación
con la supervivencia en la oscuridad solo, después de 9 días de recuperación. Los genotipos con un hazard
ratio ≤ 1 son más capaces de sobrevivir la oscuridad de la inmersión.

 OxSUB1A y OxSUB1C semillas son hipersensibles a ABA y el PAC

La sobreexpresión de la SUB1A-1 en el arroz disminuye la capacidad de respuesta GA y aumenta la

sensibilidad de la ABA durante la germinación de la semilla ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ; Fukao et al. ,
2011 ). Para evaluar si la respuesta a estas hormonas es igualmente alterada en OxSUB1A y OxSUB1C plantas
transgénicas de Arabidopsis, las pruebas de germinación se llevaron a cabo. Se encontró que en relación con
Col-0, la germinación de OxSUB1A y OxSUB1C semillas se retrasó 2 días, y era hipersensible a la inhibición
por el PAC y la ABA ( Figura 3a-c ). La germinación de las semillas en la presencia de carbón activado en
polvo con diversas dosis de AG confirmó que ambos OxSUB1A y OxSUB1C plantas han reducido
significativamente la capacidad de respuesta a GA durante la germinación ( Figura 3d ). La sensibilidad
observada alterado de estas semillas transgénicas para la ABA y GA es similar al efecto de un embarazo
ectópico SUB1A expresión en el arroz ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ; Fukao . et al , 2011 ).
Figura 3.  fenotipos de germinación de semillas de OxSUB1A y OxSUB1Cgenotipos. (A) Tiempo de la
germinación de las semillas estratificadas en agar MS que contienen 1% w / v de sacarosa cultiva bajo un
fotoperíodo de día largo. (B, c) Porcentaje de semillas germinadas después de 4 días en presencia de
diversas concentraciones de ABA o carbón activado en polvo.Los valores son medias ± SD. (D) Porcentaje de
semillas germinadas después de 4 días en presencia de diversas concentraciones de GA y 10 μ mAPA. Los
valores son medias ± SD. Los asteriscos indican una diferencia significativa de Col-0 ( P  <  0,05,
Student t  test). Cada punto de datos representa tres experimentos independientes ( n  = 30). El
experimento se realizó dos veces con resultados similares.

Figura 4.  los ángulos de la hoja y la cinética de crecimiento de hyponastic Col-

0, OxSUB1A y OxSUB1C plantas. (A) ángulo absoluto peciolo de las hojas 7-10, respecto a la horizontal, de
aproximadamente 25 días de edad plantas cultivadas bajo un fotoperíodo de día corto (  n  >  10, con una
media ± DE). Las letras indican diferencias significativas ( P  <  0,05, anova ). (B, c) etileno tratamiento (5 L l -
1 ). (D, e) El etileno tratamiento combinado con un tratamiento previo con 50 μ m GA. (F, g) bajo la luz del
tratamiento (reducción de 200 a 15 μE m -2  s -1 radiación fotosintéticamente activa). (H, i) bajo la luz del
tratamiento combinado con un tratamiento previo con GA. (J, k) de alta temperatura de tratamiento (38 °
C). (L, m) de alta temperatura de tratamiento combinado con el tratamiento previo con GA. Datos
transgénicas de línea están indicados por círculos y Col-0 datos se indican por una línea.Los datos de b-m)
son las medias ± SE ( n  >  10). Los ángulos que se muestran fueron pairwise sustraído y normalizado a 0 °
( Benschop et al. , 2007 ). La figura muestra S2 resultados similares para dos líneas transgénicas adicionales.
  OxSUB1A y OxSUB1C plantas transgénicas muestran hyponasty reduce el pecíolo, en respuesta a
los estímulos ambientales

A fin de examinar los efectos de SUB1 expresión en la GA-regulados los procesos, se compararon las
respuestas de crecimiento de hyponastic OxSUB1A , OxSUB1C y las hojas de Col-0. En primer lugar, el
posicionamiento de la hoja se midió. Escarapela deja 7-10 de Col-0 tenía un ángulo de la hoja inicial de
aproximadamente 18 ° con relación a la horizontal, mientras que el ángulo de la hoja máxima observada
para las hojas de desarrollo emparejados de OxSUB1A plantas transgénicas fue de aproximadamente 5 °
( Figura 4a ).OxSUB1C roseta deja también mostró un reducido significativamente peciolo ángulo (> 60%) en
relación con Col-0. Aplicación de AG condujo a un crecimiento hyponastic peciolo de que el aumento del
ángulo de la hoja en Col-0 a 33 ° y restaurado los ángulos de las hojas de  OxSUB1A y OxSUB1C a valores
estadísticamente indistinguibles de GA-tratada Col-0 plantas ( Figura 4a ).

A continuación, se evaluó la dinámica de crecimiento hyponastic peciolo en estos genotipos promovidas por
etileno gaseoso, la intensidad de luz baja o alta temperatura (38 ° C) ( Millenaar et al. , 2009 ; van Zanten . et
al , 2009, 2010 ). OxSUB1A líneas habían reducido las respuestas a los tres tratamientos relativos a Col-0
( Figura 4b, F, J y S4 Figura), a menos de pre-tratados con AG ( Figura 4d, H, L y S4 Figura). La dinámica de
hyponasty peciolo en OxSUB1C líneas fue similar a la de OxSUB1A plantas transgénicas, que no sean
el OxSUB1C-L6 respuesta al calor, que era similar a la de Col-0 (Figura S4). GA pre-tratamiento restauró la
respuesta de OxSUB1Cplantas transgénicas a etileno y poca luz, pero no al calor ( Figura 4e, I, M y S4
Figura). En conjunto, estos datos indican que SUB1A ySUB1C de expresión de los límites de movimiento de
las hojas hyponastic en respuesta a señales ambientales de una manera consistente con la reducción de la
sensibilidad GA.

 Fenotipos alterados de floración de OxSUB1A y OxSUB1C líneas son GA-regulado

Las alteraciones morfológicas de la pleiotrópicos SUB1 de expresión de las líneas incluidas la arquitectura

alterada del tallo de inflorescencia y el tiempo de floración. OxSUB1A plantas de menor longitud de los tallos
florales, que Col-0 ( Figura 5a ) y alargado más lentamente (0,5 cm por día para OxSUB1A frente a 2,6 cm por
día de Col-0). GA aplicación de revertir parcialmente la reducción en la longitud del tallo de la
inflorescencia OxSUB1A plantas ( Figura 5a ). Aunque OxSUB1A inflorescencia surge eran más cortas, se
desarrollaron más flores o silicuas que Col-0 (55 ± 10 frente a 40 ± 5, respectivamente), con entrenudos más
cortos, y el primer fruto coloca más cerca de la base del tallo ( Figura 5b ). Por el
contrario, OxSUB1C longitudes inflorescencia fueron similares a los de Col-0, pero estas plantas transgénicas
desarrollado más flores o silicuas (71 ± 7) que cualquiera de Col-0 o OxSUB1A plantas
transgénicas.Sorprendentemente, Ox SUB1A plantas transgénicas mostraron un retardo pronunciado en la
floración ( Figura 5c ). Estas líneas tenía el doble del número de hojas de roseta en empernado cuando se
cultivan bajo un día corto (SD) fotoperíodo ( Figura 5e ), y retenido un fenotipo de floración tardía, incluso
bajo una floración-inductivo de día largo (LD) fotoperíodo ( Figura 5f ). Sin embargo, el número de hojas en
época de floración fue restaurada a la de Col-0 en SD o LD condiciones de aplicación exógena de GA. Por el
contrario,OxSUB1C plantas transgénicas mostraron un comportamiento normal de tiempo de la floración en
ambos fotoperíodos ( Figura 5d-f ).
Figura 5.  tallo floral con flores y los fenotipos de tiempo de Col-0,OxSUB1A-L5 y L10-OxSUB1C plantas. (A)
evolución en el tiempo del desarrollo de la elongación del tallo con la inflorescencia (símbolos abiertos) y sin
aplicación de GA (símbolos cerrados) hasta la producción de flores ha terminado en condiciones de día largo
( n  = 14-18; media ± desviación estándar). (B) Representación gráfica de la arquitectura de la inflorescencia
del tallo principal: distancia de la base de la roseta de cada silicua y longitud de los entrenudos bajo
condiciones de día largo ( n  = 5).(C, d) un representante de 66 días de edad, las plantas cultivadas bajo
condiciones de días cortos. (C) Representante OxSUB1A-L12 planta presenta un fenotipo de floración
aberrante. (D) Representante OxSUB1C-L10 planta que muestra el tiempo de floración normal. Las barras
verticales negras representan 5 cm. (E, f) Número de hojas en roseta en el momento de floración de las
plantas cultivadas en días cortos (e) o largo del día (f) las condiciones con simulacros o 100 μ  m de aplicación
de GA cada 3 días a partir de 7 días. Dos líneas independientes fueron evaluados para cada constructo
transgénico. Los datos se expresan como el número de hojas cuando las yemas florales fueron visibles
primero ( n  = 18; medios ± DE).Las letras indican diferencias significativas ( P  <  0,05, Student t  test).

 SUB1A reprime la floración de inducción en los genes de Arabidopsis y el arroz

Para investigar más el retraso en la floración observada bajo condiciones de inducción floral en
LD OxSUB1A plantas transgénicas, se cuantificó la acumulación temporal de transcripciones clave asociadas
con la regulación de la floración. Como inductores de la floración-CONSTANS ( CO ) y la proteína
florígeno locus T de floración ( FT ) mRNAs son inducidos 6-10 días después de la germinación bajo
condiciones LD en Arabidopsis ( Yoo et al. , 2005 ), los experimentos se realizaron en siete días de edad, las
plantas de semillero .Estos análisis confirmaron que los niveles de CO y FT mRNAs fueron significativamente
menores en OxSUB1A plantas transgénicas en comparación con el Col-0 ( Figura 6a, b ). Es probable
que SUB1A igualmente influye en la inducción floral en el arroz, ya que las plantas de arroz transgénicas que
sobreexpresan constitutivamente SUB1A-1 ( UBI: SUB1A ) flor de un mes más tarde de la Liaogeng de control
no transgénico cultivar (LG, SUB1 haplotipo SUB1B-2 , SUB1C-2 ) ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ). Para hacer
frente a esta posibilidad, las líneas de arroz antes mencionados y las líneas casi isogénicas M202 (  Sub1 )
(haplotipo SUB1A-1 , SUB1B-1 , SUB1C-1 ) y M202 (haplotipo SUB1B-2 , SUB1C-2 ) fueron examinados para la
acumulación de codificación de las transcripciones DENOMINACIÓN FECHA 1 ( Hd1 ) y la partida 3a
FECHA ( Hd3a ), que son el arroz orthologs de CO y FT , respectivamente, en una tarjeta SD de floración-
inductivo fotoperíodo, así como durante la inmersión. Estos experimentos se realizaron en 33 días de edad,
las plantas, ya que esto es dentro del plazo que Hd3a niveles de mRNA de los informes, alcanzó su máximo
en japonica cv. Nipponbare plantas cultivadas en condiciones de SD ( Kojima et al. , 2002 ). A medida que
nuestros estudios previos sobre las respuestas de la inmersión de estos genotipos se realizaron en 14 días de
edad, las plantas ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ), también se evaluó el efecto de la inmersión en
elSUB1A acumulación de transcripción en la etapa de desarrollo de 33 días de edad ( La figura 6c ). Estos
experimentos revelaron un máximo de SUB1A mRNA en ZT3 (Tiempo Zeitgeber, ZT0 es igual a principio de la
luz del día), seguido de un descenso durante el día y un segundo aumento transitorio de aproximadamente
ZT14 (medianoche). Hemos encontrado que en las condiciones SD y no sumergido, la abundancia
de Hd1 y Hd3a ARNm alcanzó su punto máximo durante la noche, similar a la de CO y FT en Arabidopsis
(Figura 6D, E ). Inmersión aumentado aún más Hd1 la abundancia de ARNm durante la noche, pero este
aumento fue menor en M202 (Sub1 ) las plantas. Por el contrario, el nivel de Hd3a transcripciones
disminuyó en un 50% en las plantas sumergidas M202, y estos fueron reprimidos por completo en el M202
( Sub1 ) las plantas durante el período de 24 h.

Para hacer frente a la disparidad entre el CO / HD1 oscilaciones de ARNm en Arabidopsis y el arroz, Hd1 la

expresión del ARNm se siguió durante 24 horas en UBI: SUB1A-1 plantas transgénicas y su desarrollo
coincide plantas no transgénicas LG (47 y 33 días de edad, respectivamente). En cuanto a CO y FT mRNAs
en OxSUB1A plantas transgénicas, la sobre-expresión de SUB1Asignificativamente en el arroz
humedecido Hd1 y Hd3a acumulación de mRNA durante la noche ( Figura 6f, g ). Por otra parte, Hd3amRNAs
fueron indetectables en UBI: SUB1A plantas. Muy probablemente, las diferencias en la regulación
de HD1 y Hd3a mRNAs en los dos japonica LG cultivares y M202 reflejar diferencias genotípicas ( Figura 6d-
g ). Estos datos indican que la expresión ectópica o sumersión inducida de SUB1A afecta a la abundancia de
ARNm que codifican dos reguladores conservados de inducción floral en el arroz.
Figura 6.  SUB1A regula las flores tiempo loci de control CONSTANS ( CO ) y locus T de floración ( FT ) en
Arabidopsis, y su orthologs DENOMINACIÓN FECHA 1 ( Hd1 ) y la partida 3a FECHA ( Hd3a ) en el arroz. (A, b)
Transcripción acumulación en plántulas de Arabidopsis 7-días de edad cultivadas bajo condiciones de día
largo en el aire. (A) de CO ARNm. (B) FTARNm. (C-e) La expresión de genes en condiciones de días cortos en
el desarrollo combinado de 33 días de edad, M202 y M202 ( Sub1 ) las plantas de arroz en el crecimiento
normal en el aire o después de 2 días de inmersión
total. (C) SUB1A ARNm. (D) Hd1 ARNm. (E) Hd3a ARNm. (F, g) Transcripción de acumulación bajo
condiciones de días cortos en las plantas de arroz de 47 días de edad, sobre-expresión de SUB1A-1 ( UBI:
SUB1A-3 ) y 33 días de edad, las plantas de LG (el desarrollo emparejado no transgénico de
control). (F) Hd1 ARNm. (G) Hd3a ARNm. La abundancia de transcripción se determinó por RT-PCR
cuantitativa y normalizado a la mayor abundancia en el genotipo de control (media ± SE).  Los experimentos
se llevaron a cabo dos veces, con muestras replicadas independientes que muestran resultados
similares. Los asteriscos y letras representan una diferencia significativa entre los genotipos y los
tratamientos ( P  <  0,05, Student t  test).
  Ectópico SUB1A y SUB1C altera la expresión del transcriptoma de plántulas

Para evaluar la red transcripcional movilizados por la expresión heteróloga constitutiva

de SUB1A y SUB1C en Arabidopsis, vectores Affymetrix ATH1 se hibridó con el ARN aislado de 7 días de edad
plántulas crecidas bajo condiciones LD, produciendo conjuntos de datos altamente reproducibles (  R 2  ≥
0,99) (Tabla S1a ). Se encontró que el ARNm de 182 estaban regulados hasta en OxSUB1Aplántulas, y 97
mRNAs regulados a la baja (sesión de señal 2 Ratio (SLR) ≥ | 1 |, ajustado P valor ≤ 0,05, Tabla S1b), mientras
que 35 mRNAs fueron reguladas en el OxSUB1C plántulas y mRNAs 11 se redujeron reguladas. Una ontología
de genes (GO) el análisis reveló que los SUB1A hasta los genes regulados se asociaron con las respuestas a
estrés biótico, el almacenamiento de la pared celular asociada, los lípidos y la sensibilidad de ABA
(ajustados P valores de 9.10e-15, 3.29E-6, de 3.01E 5 y 3-1.60E, respectivamente; Tabla S1c).  La expresión
diferencial de genes conocidos para controlar la biosíntesis de GA, GA señalización o de la floración no era
evidente, probablemente debido a las diferencias transcriptoma capturados que eran de gran tamaño o un
reflejo de muchos tipos de células.Catorce mRNAs fueron regulados hasta en
tanto OxSUB1A y OxSUB1C plantas, lo que representa casi la mitad de los ARNm elevados
en OxSUB1C plántulas. Estos incluyen bajo nivel de oxígeno inducida por ADH1 (At1g77120), los genes
asociados con la infección por patógenos ( Bgl2 , At3g57260; PCC1 , At3g22231; defensina-COMO ,
At3g59930), almacenamiento de lípidos ( OLE1 , At4g25140; OLE2At5g40420) y el almacenamiento de las
proteínas ( CRA1 , At5g44120) . Otras transcripciones asociados con las proteínas y el almacenamiento de
lípidos también estaban regulados hasta en tanto OxSUB1A y OxSUB1C plantas, aunque la coincidencia se
limita entre los dos genotipos. En el caso de genes regulados, no hay solapamiento se encontró entre las
plantas transgénicas. Sin caracterizar los factores de transcripción y las quinasas, así como proteínas de
función desconocida, representaron el 30% de los mRNAs regulados hasta en OxSUB1A .

Para validar el análisis de microarrays, que confirmada por RT-PCR cuantitativa que
tanto OLE1 y OLE2 mRNAs fueron regulados hasta en siete días de edad, las plántulas de dos Estados
independientes OxSUB1A y OxSUB1C plantas transgénicas (Figura S5a, b).Oleosinas forman la superficie
exterior de los cuerpos de petróleo, la restricción de la coalescencia de los cuerpos pequeños del petróleo, y
puede influir en el contenido celular de lípidos triglicéridos ( Shimada et al. , 2008 ). Para evaluar el efecto de
una mayor OLE1y OLE2 los niveles de mRNA en el tamaño de aceite para el cuerpo, las plántulas fueron
teñidos con Rojo Nilo y examinadas por microscopía confocal. Aunque los cuerpos de los lípidos fueron
evidentes en Col-0 hipocotilos (Figura S5C, d), que no eran detectables en OxSUB1A o OxSUB1C hipocotilos
(Figura S5e-h). Un PROTEOLYSIS6 mutante ( prt6-1 ) que retiene los cuerpos grandes de aceite en hipocotilos
( Holman et al. , 2009 ) se usó como un control (Figura S5i, j). Estos datos revelan que la expresión ectópica
de SUB1A ySUB1C afecta el almacenamiento o la movilización de las reservas de lípidos en las plantas de
semillero.

También se compararon los genes expresados diferencialmente en OxSUB1A y OxSUB1C a los de las plantas
de semillero sobre-expresión de la Arabidopsis grupo VII ERFs HRE1 o HRE2 ( Licausi et al. , 2010 ) y la
germinación de las semillas de los mutantes de germinación ABA-hipersensibles agh1-1 y agh3- 1 , ambos
son proteína fosfatasa 2C mutantes ( Nishimura et al. , 2007 ; Tabla S1D).ADH1 fue el único gen que estaba
regulada diferencialmente en OxSUB1A , OxSUB1C y 35S :: HRE1 plántulas
transgénicas.Curiosamente, ADH1 , que codifica una proteína clave anaeróbico, fue significativamente las
reguladas en el 35S :: HRE2 plántulas.Estos datos indican que la sobre-expresión de arroz individual y ERFs
Arabidopsis grupo VII en Arabidopsis claramente cambia el transcriptoma en plántulas crecidas en
condiciones aerobias. Comparación con ABA-mutantes hipersensibles identificado 40 genes expresados
diferencialmente en OxSUB1A cuyos niveles se incrementaron también en el agh1-1 mutante, y los genes
que fueron 18 las reguladas en los dos genotipos. Un solapamiento muy similares en los genes expresados
diferencialmente se observó entre OxSUB1Ay agh3 1 . Esto apoya fuertemente la conclusión de que
la OxSUB1A transcriptoma de plántulas se vuelve a configurar de una manera consistente con ABA
hipersensibilidad.
Discusión

Esta evaluación de la expresión heteróloga en Arabidopsis ectópica del grupo VII ERFs SUB1A y SUB1C del
arroz demostraron que la acción general de SUB1A se superpone parcialmente con el de SUB1C . Aunque la
expresión ectópica de SUB1A en Arabidopsis reduce en lugar de una mayor tolerancia a la inmersión en la
oscuridad ( Figura 2 ), encontramos elementos comunes en los procesos de desarrollo y las respuestas
ambientales regulados por SUB1A en el arroz y Arabidopsis.

 SUB1A y SUB1C sobreexpresión altera la Asamblea General de señalización durante el desarrollo

en Arabidopsis y el arroz

Giberelina promueve la germinación de la semilla, el alargamiento celular, el crecimiento hyponastic y la

transición hacia el desarrollo reproductivo ( Djakovic-Petrovic et al. , 2007 ; Achard y Genschik, 2009 ). En
Arabidopsis, esto se logra a través de factores de transcripción DELLA, que son responsables de la regulación
de la transcripción de las enzimas de inactivación de GA, componentes positivos de señalización del ABA y
los genes de la homeostasis (GA Zentella et al. , 2007 ). La unión de GA a su receptor provoca proteosoma
mediada por volumen de negocio de los factores de transcripción DELLA, promoviendo así la GA-mediada
por la respuesta.GA respuesta es mayor en el arroz durante la inmersión debido a la degradación de la ABA
en forma independiente de SUB1A ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ). En los genotipos que poseen SUB1A-1 , la
disminución inducida por la inmersión en la ABA se acompaña de rotación limitada de la ortholog della SLR1,
así como la hiper-acumulación de SLRL1 ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ), que carece de un dominio della
( Itoh et al. , 2005 ). En consonancia con la reducción de la capacidad de respuesta GA por SUB1A en el arroz,
los fenotipos de Arabidopsis OxSUB1A y OxSUB1C plantas transgénicas sugieren defectos en GA-mediadas
por procesos. Ambas limitaciones se muestran en la celda, peciolo y la elongación del tallo (  Figuras 1b y 5 , y
S1 a la figura), la inhibición de las anteras dehiscencia ( Figura 1c ), la reducción del crecimiento hyponastic
de pecíolos ( Figura 4 ), la germinación tardía ( Figura 3 ) y tardías ( Figura 5 ). Estos defectos GA-asociadas
fueron en general menos pronunciada en OxSUB1C plantas transgénicas. Además, hemos encontrado que la
aplicación exógena GA parcialmente rescatado germinación, el crecimiento y hyponastic iniciación floral,
pero no la inhibición de las anteras. Es importante destacar que el hallazgo de
que OxSUB1A y OxSUB1C semillas eran hipersensibles a la PAC y la ABA y la menos sensible a la anestesia
general durante la germinación ( Figura 3 ) es coherente con la función de SUB1A del arroz ( Fukao y Bailey-
Serres, 2008 ; Fukao . et al , 2011 ).

Hemos demostrado anteriormente que SUB1A actúa como un inhibidor de la retroalimentación negativa de

etileno de señalización durante la inmersión del arroz ( Fukao et al. , 2006 ; Fukao y Bailey-Serres, 2008 ). La
respuesta limitada hyponasty peciolo de OxSUB1Ay OxSUB1C plantas transgénicas indica que la interrupción
del crecimiento de alargamiento peciolo opera cuando estos genes se expresan en
Arabidopsis. OxSUB1A y OxSUB1C plantas tenían una respuesta de crecimiento humedecido hyponastic al
etileno ( Figura 4b, c y S4 Figura). El aumento en el ángulo hyponastic en respuesta a la luz de baja y alta
temperatura también se vio afectada ( Figura 4f, g, j, k y S4 Figura), aunque la respuesta al calor era distinta
en los dos OxSUB1C plantas transgénicas. Los tres estímulos (luz baja, alta temperatura y de etileno) se
basan en la señalización GA / biosíntesis de llevar a cabo el cambio en el ángulo de la hoja de Rumex
palustris ( Cox et al. , 2004 ; van Zanten . et al , 2010 ). En este caso, la aplicación exógena de GA restablecido
en gran medida la respuesta ángulo de hyponastic, proporcionando una prueba más de la alteración de la
capacidad de respuesta debido a la GA SUB1sobre-expresión de genes en la Arabidopsis. Además, estos
resultados ponen de manifiesto el papel clave de GA en el control de la posición foliar y movimiento de las
hojas hyponastic inducida por el etileno, el calor y la luz baja en Arabidopsis.

 SUB1A inhibe la floración en Arabidopsis y el arroz

La sobreexpresión de la SUB1A en Arabidopsis llevó a la conclusión de que la inducción floral se regula

durante la inmersión en el arroz.Se observó un fenotipo de floración tardía de OxSUB1A plantas, incluso bajo
un fotoperíodo de floración-inductivo LD. Esto se correlaciona con la baja regulación de codificación de las
transcripciones de dos reguladores clave positivos de floración, CO y FT (Figura 6a, b ). Evaluación de la
dinámica de acumulación diurna de las transcripciones orthologous en el arroz reveló que la inmersión
aumentó la acumulación de Hd1 ARNm durante la noche y continua supresión de los niveles
de Hd3a ARNm. Hubo diferencias en la acumulación de ambos expedientes en la noche en el M202 ( Sub1 )
en comparación con M202. Hemos informado anteriormente de queUBI: SUB1A las plantas de arroz
mostraron un retraso considerable floración ( Fukao y Bailey-Serres, 2008 ), y demostrar aquí que
ectópico SUB1A expresión de los límites de la acumulación de ambos Hd1 y Hd3a ARNm, que se parece
mucho el efecto de SUB1Asobre-expresión en CO y FT ARNm en Arabidopsis. En conjunto, estos datos
proporcionan una fuerte evidencia de que la expresión ectópica de SUB1A en el arroz y los límites de
Arabidopsis la expresión de genes clave relacionados con la inducción floral.

La transición a la etapa reproductiva y la floración son energéticamente costoso ( Obeso, 2002 ; temprano et

al. , 2009 ). A la luz de los datos de acumulación de transcripción que se presentan aquí, se puede suponer
que la represión de la floración es un medio para limitar el gasto energético. Por lo tanto, el SUB1A la
represión mediada por la floración podría ser considerada como parte de los LOQS, agregando otro
componente de este conjunto de rasgos. Consistente con esto, Singh et al. (2009) informó de que la
floración en 30 días de edad SUB1A-1 que contienen (tolerante) las plantas que fueron totalmente
sumergido durante 12 y 17 días en el campo se retrasó por 17 y 27 días, respectivamente .  Las líneas
parentales que carecen SUB1A-1 (intolerante) que sobrevivieron inundación por 12 y 17 días mostró un
retraso en la floración considerablemente más largo (24 y 37 días, respectivamente).  Por lo tanto, SUB1A es
responsable de un hiato en la inducción floral que sólo supera ligeramente la duración del evento de
inundación real ( Singh et al. , 2009 ).Proponemos que la represión transitoria de la inducción floral durante
la inmersión en SUB1A-1 es seguida por las líneas de la recuperación efectiva de la capacidad para inducir la
floración en de-inmersión.

 SUB1A los niveles de mRNA oscilan en inmersión-tensado de arroz

Como líneas de Arabidopsis y el arroz que expresan SUB1A muestra la capacidad de alterar la expresión de la

regulada por el ciclo circadiano de CO y FT ARNm, la posible acumulación oscilatorio de SUB1A ARNm fue
explorada en el arroz. Una oscilación aproximadamente cada 12 h se encontró en condiciones sumergidas y
no sumergido ( Figura 6c ). Este ciclo de ultradiano es poco común en las plantas ( Baskin, 2007 ), pero
podría reflejar SUB1A regulación en respuesta a diferentes estímulos. El etileno producido bajo el control del
ciclo circadiano podría conducir a la acumulación de transcripción del pico del mediodía de SUB1A , como se
muestra para el sorgo y dos de Poa las especies ( Finlayson et al. , 1998 ; Fiorani . et al , 2002 ), como el
etileno regula positivamente SUB1A nivel de ARNm ( Fukao et al. , 2006 ). El aumento en SUB1A ARNm en el
pico de medianoche podría ser debido a los niveles limitados de hidratos de carbono en este punto en el
ciclo circadiano ( Graf et al. , 2010 ). Curiosamente, la elongación del pecíolo y la acumulación de mRNA
expansina impulsado por etileno en sumergidas palustris Rumex son principalmente una respuesta durante
el día ( Vreeburg et al. , 2005 ). Tenemos la intención de examinar si la disminución de la SUB1A mRNA
después del pico durante el día es el resultado de la regulación negativa de la evolución de etileno por
SUB1A, y si la disminución durante la noche refleja SUB1A - mediada por la gestión de la homeostasis
energética.

 SUB1A SUB1C y promover alteraciones en la superposición de las plántulas transcriptoma en

Arabidopsis

Factores de respuesta de etileno reconocer un motivo central GCCGCC en promotores de destino, y se sabe
que modulan el desarrollo y el medio ambiente regulada procesos ( Ohta et al. , 2001 ; Nakano . et al ,
2006 ). Varios estudios han utilizado la expresión heteróloga FER para mejorar la tolerancia al estrés en el
modelo de las especies y de los cultivos ( Karaba et al. , 2007 ; Quan et al. , 2010 ; Zhang . et al , 2010 ), pero
la tolerancia fue acompañado a menudo por anormalidades en el desarrollo. Aquí, encontramos que el
efecto de la heteróloga SUB1A y SUB1C expresión de la acumulación de mRNA en estado estacionario en
plántulas de Arabidopsis se superponen parcialmente (Tabla S1D) con ajustes más amplios en
transcriptomic OxSUB1A plántulas acompañado de fenotipos pleiotrópicos más graves. De los genes
expresados diferencialmente en tanto OsSUB1A y OxSUB1C plántulas, sólo ADH1 también fue regulada hasta
en plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente la relacionada con el grupo VII FER
gen HRE1 . Hay varios factores que podrían contribuir a los ajustes transcriptomic características del
individuo ERFs grupo VII. Por ejemplo, la acumulación de FER puede ser claramente regulado de manera
condicional o de desarrollo en particular, las interacciones pueden ocurrir entre las FER y específicos de co-
factores, o ERFs individuales pueden obligar a motivos distintos de unión al ADN.

Hemos observado grandes cambios en el transcriptoma de plántulas en OxSUB1A plantas. Estos incluyeron

un número de mRNAs asociados con las respuestas al estrés biótico en Arabidopsis, posiblemente reflejando
el papel de FERs varios como transductores de etileno de señalización en respuesta a patógenos
( Chakravarthy et al. , 2003 ; Lorenzo . et al , 2003 ). Por ello, la sumersión hasta reguladas transcripciones
asociadas con respuestas de patógenos en el M202 ( Sub1 ) arroz ( Jung et al. , 2010 ). OxSUB1A plantas
transgénicas también mostraron mayores niveles de transcripciones relacionadas con los lípidos y las
reservas de proteína (Figura S5), lo que sugiere que la reserva de nutrientes de almacenamiento o de
gestión es modulada por heteróloga SUB1A expresión. A pesar de fenotipos indicativos de alteración de la
capacidad de respuesta GA, la transcriptomes de plántulas no reveló diferencias asociadas con la biosíntesis
de GA conocido o de los componentes de señalización. RT-PCR cuantitativa de medición de los ARNm que
participan en la biosíntesis de GA y la percepción ( GA20Ox1 , At4g25420; GA20Ox2 , At5g51810; GA2Ox1 ,
At1g78440; GID1 , At3g05120) no reveló diferencias entre los genotipos (datos no mostrados). Como los
genes de la biosíntesis de la modulación de GA y la respuesta es muy redundante, y sus ARNm se regulan de
una manera espacial y temporal ( Rieu et al. , 2008 ), el análisis del transcriptoma de todo el plántulas
pueden no contener el reglamento sutil de los genes responsables de estas u otras para los fenotipos GA-
asociadas. Sin embargo, OxSUB1A plántulas tenían niveles más altos de una serie de ARNm que se
incrementan en los mutantes ABA-hipersensiblesahg1-1 y ahg3 1 (Tabla S1D), lo que indica un efecto
conservada de SUB1A en la respuesta de la ABA en la Arabidopsis, como en el arroz ( Fukao et al. , 2011 ).

Aunque la heteróloga cerca-expresión constitutiva del arroz grupo VII FER factores de
transcripción SUB1A y SUB1C en Arabidopsis no mejoró la supervivencia sumersión, permitió el
descubrimiento de que la inhibición de floración es una parte integral de la estrategia de respuesta
quiescencia mediada por inmersión inducida por la expresión de SUB1A -1 en el arroz. Curiosamente, se
observó un solapamiento significativo en los efectos pleiotrópicos de SUB1A y SUB1C sobre-expresión en la
posición de la hoja de desarrollo, el movimiento ambiental regulada de la hoja, las respuestas a GA y ABA, y
la planta de semillero de Arabidopsis. Sin embargo, su función en el arroz es distinto ( Fukao et al. ,
2006 ; Fukao y Bailey-Serres, 2008 ), probablemente debido a diferencias en la regulación de la expresión,
interacción con las co-factores y / o distinciones en los genes diana. En conjunto, los resultados de este
estudio demuestran que el grupo VII ERFs acto en las redes conservadas evolutivamente que se integran las
respuestas al estrés abiótico con el desarrollo.

Los procedimientos experimentales

 Planta de material genético

Arabidopsis thaliana genotipos incluidos Col-0 ecotipo y prt6 1 ( Holman et al. , 2009 ). Oryza

sativa L. ssp. japonica genotipos incluidos M202 y M202 ( Sub1 ), que son líneas casi isogénicas que difieren
en el SUB1 locus ( Fukao et al. , 2006 ), la línea transgénica homocigota UBI: SUB1A-3 cv. Liaogeng (LG), que
sobre-expresa SUB1A-1 ( Xu et al. , 2006 ; Fukao y Bailey-Serres, 2008 )., y LG como el control SUB1A
1- y SUB1C-1 codificación de las regiones fueron amplificados de M202 ( Sub1 ) ARNm ( Fukao et al. , 2006 ),
clonado en el vector p35S compatibles pasarela: HF-GATA, que incluye el promotor CaMV 35S y un N-
terminal de su 6 -FLAG etiqueta, y se transforma en Col-0, como se describe en el Apéndice
S1. T 4 homocigotos se caracterizaron más.

 Condiciones de crecimiento de plantas

A menos que se indique lo contrario, para el crecimiento en el suelo, las semillas de Arabidopsis se
esterilizaron y estratificado en el agua durante 3 días a 4 ° C, germinó el 1 × Murashige y Skoog (MS) un
medio de agar (0,43% p / v de sales MS, pH 5,75), además, que contiene 1% w / v de sacarosa, en placas
orientadas verticalmente en una cámara de crecimiento (23 ° C, 16 h luz / 8 h oscuridad, 125 μE m  -2  seg -
1 radiación fotosintéticamente activa), y después de 7 días de crecimiento transferido a suelo esterilizado
(Metro Mix 200, 2% Osmocote w / w, w 1% / Maratón W; Sungro,  http://www.sungro.com/ ) en una cámara
de crecimiento (21 ± 1 ° C) bajo de día corto ( SD) las condiciones (9 h light/15 h oscuridad, 175 μE m -2  s -1 )
o de día largo (LD) las condiciones (16 h luz / 8 h oscuridad; 175 μE m -2  s-1 ). El arroz se cultiva en el suelo
como se describe en Fukao et al. (2006) , pero en una cámara de crecimiento bajo condiciones de SD (10
horas de luz, 28 º C/14 h oscuridad, 24 ° C, 500 μE m -2  seg). Los genotipos fueron arreglados para
minimizar el ruido experimental, debido a la posición en la cámara de crecimiento.

 El tratamiento hormonal, condiciones de estrés y la caracterización fenotípica

Tiempo de floración y tratamientos GA.  hojas ( n  = 18) se rociaron dos veces con solución de GA (100
μ m en v / v de etanol 0,5%) cada 3 días después de la transferencia de las plantas al suelo cuando eran 7
días de edad. Mock plantas tratadas se rociaron con v / v de etanol 0,5%. El número de hojas fue contado,
cuando el botón floral fue visible (el tiempo de floración). Las plantas o silicuas se anotó como fértil cuando
una o más semillas fueron producidas por silicua.

Pecíolo, tallo y longitud de los entrenudos inflorescencia.  Las plantas fueron cultivadas en el suelo bajo
condiciones LD hasta los 23 días de edad ( n  = 12). Longitud del peciolo se midió desde la base hasta la
unión peciolo / lámina. Elongación del tallo se midió desde la base de roseta para el meristemo floral, desde
el momento en el brote apareció por primera vez hasta que se detuvo la producción de flores (  n  = 14-
18). La longitud del tallo vegetativo se midió como la distancia entre la base de roseta y la primera
flor. Inflorescencia longitud de los entrenudos se midió como la distancia entre silicuas. Los últimos dos
fenotipos se midieron cuando se detuvo la producción de flores ( n  = 5).

Germinación de las semillas.  Las semillas se cosecharon y se secó al mismo tiempo para todos los
genotipos. Semillas ( n  = 30 para cada tratamiento) se cultivaron sobre agar MS con w / v 1% de sacarosa
como se describe, por encima de la excepción de que ABA, GA o carbón activado en polvo
(Sigma, http://www.sigmaaldrich.com/ v) en 0,1% / v disolvente se añade al medio caliente después de
tratamiento en autoclave. Mock tratados con placas contenía 0,1% v / v de etanol (para comparación con
ABA y GA) o 0,1% v / v de metanol (para comparación con PAC). La germinación se registró como el tiempo
de protrusión del radical.

Tratamiento de carbón activado en polvo en el suelo.  Col-0 plantas cultivadas en condiciones de SD se

regaron por inmersión del suelo cada 5 días, utilizando una solución de carbón activado en polvo en
concentraciones designadas. Ángulo de la hoja y las mediciones de crecimiento hyponastic  Las plantas
fueron cultivadas en una mezcla de tierra / perlita (2:1) en una cámara de crecimiento a 20 ° C, el 70% de
humedad relativa, 9 h SD fotoperíodo (200 μE m -2  s -1 ; Millenaar et al. , 2005 ).Espectral luz neutra baja
(15 μE m -2  s -1 radiación fotosintéticamente activa) y los tratamientos de etileno (5 l l -1 ) se realizaron
según lo descrito por Millenaar et al. (2009) , y el tratamiento térmico (38 ° C) se realizó como se describe
por Van Zanten et al. (2009) . Para el tratamiento GA, las plantas se pulverizaron con 50 μ m GA en 17, 31 y
55 h antes de las mediciones. Ángulos de la hoja y el crecimiento hyponastic se midieron en los vegetales de
aproximadamente etapa 3,9 ( Boyes et al. , 2001 ) utilizando dos peciolos por planta (longitud 0.7-1 cm, n  =
10-32). Las mediciones se realizaron utilizando un sistema automatizado de lapso de tiempo la cámara como
se describe en Millenaar et al. (2005, 2009) y en el Apéndice S1.

 Sumersión el estrés y las medidas de supervivencia

Tratamientos de sumersión de estrés y la determinación del tiempo letal media (LT 50 ) y coeficiente de
riesgo se realizó como se describió previamente ( Vashisht et al. , 2011 ) y en el Apéndice S1.
  Inmersión de tratamiento y toma de muestras ciclo diurno para el arroz

Las plantas de arroz fueron cultivadas a partir de semillas en el suelo como se ha descrito anteriormente,
durante 33 días, excepto para el genotipo IBU: SUB1A-3 que se cultivó durante 47 días para que coincida con
el desarrollo de las otras plantas. En este momento, LG yUBI: SUB1A-3 de tejido foliar fue cosechada a ZT3, y
luego cada 3 h durante 24 h. M202 y M202 ( Sub1 ) se sumergieron por completo en los tanques como se
describe en Fukao et al. (2006) por 2 días, a continuación, tejido foliar fue cosechada a ZT3 el día 3, y luego
cada 3 h durante 24 h. El tejido de las plantas de control sin estrés se recogió en los mismos momentos.

 Análisis de transcriptoma

Siete días de edad plántulas de Arabidopsis se cultivaron en 1 x medio MS agar como se ha descrito
anteriormente, y se recogieron a mediodía. La extracción de RNA se realizó como se describe
por Mustroph et al. (2010) . La hibridación a ATH1 GeneChips se realizó de acuerdo con el método del
fabricante (Affymetrix, http://www.affymetrix.com/ ), con muestras duplicadas experimentalmente
independientes. Los datos fueron analizados utilizando Robin (modelo RMA, Lohse et al. , 2010 ). Genes
regulados diferencialmente (SLR ≥ | 1 |, ajustado P <0.05) fueron clasificados en grupos funcionales
utilizando GO ( Horan et al. , 2008 ; Mustroph et al. , 2010 ). CEL archivos de los datos publicados se
obtuvieron de la Expresión Génica Omnibus [ GES17099 ( Licausi et al. , 2010 ) y GSE6638 (Nishimura et al. ,
2007 )] ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) y tratadas de la misma manera. Los datos de microarrays
generados en este estudio son accesibles desde la base de datos Gene Expression Omnibus bajo el número
de GSE27669 .

 Proteína inmunopurificación y detección

Trece días de edad plántulas (3 g) cultivadas en MS sólido como se ha descrito anteriormente fueron
cosechadas a mediodía y se sumergieron en 12 ml de una solución que contiene 100 μ m de MG132
(Peptides International, http://pepnet.com/ ) en 1 % v / v de DMSO.Después de 4 h de balanceo, las
plántulas se lavaron tres veces durante 1 minuto. La inmunoprecipitación e inmunodetección se realizó
como se describió previamente ( Zanetti y col. , 2005 ).

 La medición de la abundancia de transcripción por RT-PCR cuantitativa

Para los tejidos de arroz y Arabidopsis, se extrajo el ARN como se describió previamente (  Mustroph et al. ,
2010 ), y cDNA fue sintetizado a partir de 2,5 microgramos de ARN total usando superíndice II transcriptasa
inversa (Invitrogen, http://www.invitrogen.com/ ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. PCR
cuantitativa se realizó mediante un mol l cDNA, 10 de cada cebador y 10 l de IQ SYBR Green Supermix (Bio-
Rad, http://www.bio-rad.com/ ) con un IQ5 máquina en tiempo real PCR. Los cebadores utilizados para
detectar la transcripción y UBQ (LOC_Os03g13170) se proporcionan en el Apéndice S1. Los datos fueron
analizados utilizando el comparativo C tmétodo ( Schmittgen y Livak, 2008 ).

Información de apoyo

Figura S1. (a) La alteración de la morfología de roseta homocigotos y hemicigotos SUB1A líneas de

sobreexpresión. OxSUB1A-5homocigotos tienen hojas anchas y cortas hemizygotes tienen grandes hojas
anchas. Hemizygotes son la progenie de OxSUB1A-5 × Col-0. Las plantas fotografiadas después de 23 días de
crecimiento en el suelo bajo un fotoperíodo de día largo. (B) Digitalización de imágenes de microscopía
electrónica de 25 días de edad del suelo cultivado en Col-0, OxSUB1A L12- y OxSUB1C-L10 plantas. Los
paneles de la hoja muestran la región central de la hoja más completamente expandida. Madre son
imágenes de la sección media del tallo inflorescencia primero. La barra de color negro representa a 300
micras. Las imágenes son representativas de los genotipos.

Figura S2. defectos de producción de semilla de SUB1 transgénicos. (A) Representante disecados silicuas

maduras de las plantas cultivadas en el suelo bajo un fotoperíodo de día largo. Silicuas de los
fuertes OxSUB1A-L12 y más débiles OxSUB1A-L5 sobreexpresión se muestran. Los primeros 10 a 20 yemas
florales de OxSUB1A-L5 son estériles, pero los brotes posteriores eran fértiles. OxSUB1C-10estaba casi
completamente estéril. La aplicación tópica de 100 mM GA una vez cada 3 días y hojas en roseta de la época
de floración de esterilidad aumentó en todos los genotipos y fue concomitante con el crecimiento
partenocárpicos de los ovarios. Tenga en cuenta la curvatura y la esterilidad en las silicuas de GA-tratados
Col-0 plantas. (B) la fertilidad de OxSUB1A y silicuas Col-0 mide como el porcentaje de silicuas en el
meristemo floral principal que contiene al menos una semilla ( n = 5; ± DE). Las letras indican diferencias
significativas entre genotipos ( P <0,05, Student t -test). OxSUB1A-L12 fue completamente estéril hasta que
las plantas tenían seis meses de edad, momento en el que la inflorescencia meristemos secundarios
produjeron semillas.

Figura S3. Oscuro fenotipos inducidos por la senescencia de Col-0, OxSUB1A y OxSUB1C plantas. Rosetas de

25-días de edad, las plantas cultivadas en el suelo bajo un fotoperíodo de día largo fueron disecados en la
base del peciolo y se dejaron en la oscuridad durante 3 días en papel de filtro húmedo.  Dos experimentos
independientes replicadas se muestran.

Figura S4. Hyponastic cinética de crecimiento de Col-0, OxSUB1A y OxSUB1C plantas. Los datos mostrados

aquí son los mismos que para la Figura 4, excepto que dos transgénicos independientes fueron evaluados
para cada transgén. El tratamiento con etileno (5 L l -1 ), tratamiento con luz baja (200 a 15 μE m -2 s -1 ), y
el tratamiento a alta temperatura (38 ° C) se llevaron a cabo en las plantas que no fueron tratadas con GA o
pre-tratados con el hormona. Los datos son la media ± SE ( n > 10). Ángulos representados son pares resta y
normalizado a 0 ° (Benschop et al. , 2007).

Figura S5. oleosina ARNm y la acumulación de lípidos en el cuerpo Col-0, OxSUB1A y OxSUB1C plántulas. (A,

b) QRT-PCR medición deOLE1 y OLE2 mRNAs en siete días de edad plántulas crecidas en virtud de un largo
día (LD), el fotoperiodo y la cosecha al mediodía. El asterisco representa una diferencia significativa de Col-0
( P <0,05, Student t -test). (C-j) Las imágenes de microscopio confocal del Nilo teñidas de rojo hipocotilos de
la epidermis de 3 días de edad, Col-0, OxSUB1A , OxSUB1C y prt6-1 plántulas crecidas en LD el 1 × medio MS
sin sacarosa. (C, d) máximo y mínimo la acumulación de los cuerpos de petróleo observados en Col-0,
respectivamente. (E, f)OxSUB1A-L5 y L12-OxSUB1A . (G, h) OxSUB1C-L6 y L10-OxSUBb1C . (I, j) prt6-1 . Las
imágenes son representativas de dos evaluaciones independientes.

Tabla S1. Significativamente arriba y hacia abajo-regulados mRNAs en los 7 días de edad OxSUB1A - L12 y

Ox -L10 SUB1C plántulas, GO análisis y comparaciones con otros conjuntos de datos transcriptome.  (A)
Información general y r 2 para el análisis de OxSUB1A yOxSUB1C conjunto de datos (conjunto de datos
1). (B) Análisis de las diferencias en la acumulación de mRNA en estado estacionario en
el OxSUB1A y OxSUB1C transgénicos en comparación con el Col-0. (C) Análisis de los
GO OxSUB1A y OxSUB1C DEGs. (D) SUB1 , educación en derechos humanos y la ABA mutante comparación
hipersensible.

Apéndice S1. Suplementarios procedimientos experimentales.