Вы находитесь на странице: 1из 4

БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2005, том 31, № 5, с.

380–383

УДК 582.52:615.322:612.396.11 ФАРМАКОЛОГИЯ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ


НИЗКОЭТЕРИФИЦИРОВАННОГО ПЕКТИНА ИЗ МОРСКОЙ ТРАВЫ
ZOSTERA MARINA И ПРЕПАРАТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ IN VITRO1
© 2005 г. Е. А. Коленченко1, Л. Н. Сонина2, Ю. С. Хотимченко1, 2
1
Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток 690041;
2
Владивостокский государственный медицинский университет, Владивосток 690990
e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru
Статья принята к печати 4.05.2005 г.

С помощью двух методов in vitro, позволяющих оценить восстанавливающую активность веществ (метод
FRAD) и их способность тормозить железо-аскорбатиндуцированное окисление твина 80 до малонового диальде-
гида, проведены сравнительные исследования антиоксидантных свойств низкоэтерифицированного пектина, вы-
деленного из морской травы Zostera marina, и лекарственных препаратов-антиоксидантов: милдроната и эмокси-
пина. Установлено, что пектин обладает более высокой восстанавливающей активностью по сравнению
с милдронатом и эмоксипином. Способность пектина ингибировать окисление твина 80 до малонового альдегида
выше, чем у эмоксипина.
Ключевые слова: антиоксиданты, антиоксидантная активность, пектин, зостерин, Zostera marina, метод
FRAD.

A comparative evaluation of antioxidant activity of low-esterified pectin from the seagrass Zostera marina
and antioxidative drugs in vitro. E. A. Kolenchenko1, L. N. Sonina2, Yu. S. Khotimchenko1, 2 (1Institute of Marine Biol-
ogy, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041; 2Vladivostok State Medical University,
Vladivostok 690990)
A comparative study of the antioxidant power of low-esterified pectin extracted from the seagrass Zostera marina
and antioxidative medicinal drugs, mildronat and emoxypin, was performed. The reducing activity of the compounds
(FRAD assay), as well as their ability to inhibit iron and ascorbate induced oxidation of tween 80 to malondialdehyde
were assessed. The pectin zosterine exhibited a higher reducing activity, compared to medicines. Inhibitory capacity of
zosterine was lower than that of mildronat. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2005, vol. 31, no. 5, pp. 380–383).
Key words: antioxidants, antioxidant activity, pectin, zosterine, Zostera marina, FRAP assay.

Проблемы химической регуляции окислительного лисахарид зостерин, получивший свое название по источнику
стресса и поиск биологически активных веществ, обладаю- его выделения – морской травы Zostera marina семейства
щих антиоксидантной активностью, находятся в центре вни- Zosteraceae. Зостерин является пектином с крайне низкой сте-
мания исследователей по различным направлениям экспери- пенью этерификации (Ovodov et al., 1975). Эксперименталь-
ментальной биологии и биомедицины (Halvorsen et al., 2002; ные исследования с пектином-зостерином выявили у него та-
Matthaus, 2002; Ladas et al., 2004). В физиологических услови- кие фармакологические эффекты, как гипохолестеринемиче-
ях окислительно-восстановительные процессы, обеспечи- ский, энтеросорбционный, антибактериальный, противови-
вающие энергетические потребности клеток и утилизацию русный, противоопухолевый, противоязвенный и иммуномо-
кислорода в тканях, контролируются регуляторными систе- дулирующий (Лоенко и др., 1997). Некоторые из перечислен-
мами, поддерживающими сбалансированное взаимодействие ных эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов
реакции образования продуктов оксидации и антиокисли- перекисного окисления липидов и нормализацией показате-
тельных факторов. Нарушение этого взаимодействия, сопро- лей эндогенной антиоксидантной системы в крови и печени
вождаемого активацией свободно-радикальных процессов и экспериментальных животных (Иванова, Янькова, 1998; Ха-
накоплением продуктов перекисного окисления липидов, рас- сина и др., 2003). Эти данные предполагают наличие у иссле-
сматривается в качестве универсального механизма повреж- дуемого полисахарида антиоксидантного эффекта.
дения биологических мембран (Halliwell, 2001; Vertuani et al.,
2004), лежащего в основе ряда патологических процессов Ингибирование Fe2+-аскорбатиндуцированного окисления
(Kaul et al., 2001; Gaetke, Chow, 2003). твина 80 до малонового диальдегида зостерином, милдрона-
Исследование связи окислительного стресса с развити- том и эмоксипином in vitro
ем многих заболеваний показало, что эндогенная антиокси-
дантная система не обеспечивает в достаточной степени за- Степень ингибирования, %
Исследуемое
щиту клеток и тканей от повреждающего действия свободных
вещество 1% раствор 0.5% раствор 0.1% раствор
радикалов. Поэтому вполне оправдан поиск новых средств
подавления прооксидантных процессов и активации реакций
Милдронат 23.4±0.5 16.3±0.5 8.6±0.6
антиоксидации (Fang et al., 2002; Violi et al., 2004).
Среди природных соединений, обладающих высокой Зостерин 10.9±0.6 5.3±0.4 1.7±0.3
биологической активностью, обращает на себя внимание по- Эмоксипин 6.5±0.4 6.5±0.4 2.0±0.3

1
Работа поддержана грантом Президиума ДВО РАН и Президиума СО РАМН № 05-II-СМ-05-006.

380
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА 381

Рис. 1. Динамика восстановления трехвалентного железа низкоэтерифицированным пектином из морской травы Zostera marina in vitro.
1 − 1% раствор, 2 − 0.5% раствор, 3 − 0.1% раствор.

Цель настоящей работы – установление антиоксидант- рида были следующими: содержание галактуроновой кисло-
ной активности низкоэтерифицированного пектина из мор- ты – 70.0%, степень этерификации – 7.9%, характеристиче-
ской травы Z. marina и сравнение этой активности с таковой ская вязкость – 620 мл/г галактуронана.
лекарственных препаратов, применяемых в медицине в каче- В работе исследованы следующие лекарственные пре-
стве антиоксидантных средств. параты-антиоксиданты: милдронат – 10% раствор (ПАО
Материал и методика. Морскую траву Zostera marina "Гриндекс", Латвия) и эмоксипин – 1% раствор (ФГУП "Мос-
собирали в чистых акваториях зал. Петра Великого Японско- ковский эндокринный завод", Москва).
го моря. Выделение пектина проводили по методике, вклю- Антиоксидантную активность тестируемых веществ
чающей кислотный гидролиз сырья, экстракцию оксалатом изучали с помощью двух методов in vitro. В первом методе
аммония и осаждение пектина этанолом (Ovodova et al., 1968). оценивали восстанавливающую активность исследуемых ве-
Содержание галактуроновой кислоты в пектине определяли ществ (метод FRAP). К 0.3 мл инкубационной смеси, содер-
колориметрическим гидроксидифениловым методом (Blumen- жащей 0.5 мкМ раствор FeCl3, 0.25 мкМ раствор 2,4,6-трипи-
krantz, Asboe-Haunsen, 1973). Степень этерификации устанав- ридил-S-триазина в 1 мкМ HCl и 75 мкМ ацетатный буфер
ливали титриметрическим методом (Афанасьев и др., 1984). (рН 3.6), добавляли 0.04 мл 0.1, 0.5 или 1% раствора препара-
Характеристическую вязкость определяли в смеси 0.05 М тов. Восстанавливающую активность определяли спектрофо-
раствора хлористого натрия и 0.005 М раствора оксалата на- тометрически по количеству образовавшегося в течение
трия при температуре 25.0°С и рН 6.0, используя вискозиметр 60 мин окрашенного комплекса Fe2+ с 2,4,6-трипиридил-S-
Уббелода (Kravtchenko, Pilnic, 1990). Физико-химические ха- триазином при длине волны 593 нм и выражали в мкМ Fe2+
рактеристики тестируемого образца полученного полисаха- (Benzie, Strain, 1996; Ruperez et al., 2002).

Рис. 2. Динамика восстановления трехвалентного железа эмоксипином in vitro. 1 − 1% раствор, 2 − 0.5% раствор, 3 − 0.1% раствор.

БИОЛОГИЯ МОРЯ том 31 № 5 2005


382 КОЛЕНЧЕНКО И ДР.

Рис. 3. Динамика восстановления трехвалентного железа милдронатом in vitro. 1 − 1% раствор, 2 − 0.5% раствор, 3 − 0.1% раствор.

Во втором методе об антиоксидантной активности су- 13.6 ± 0.5 мкМ Fe2+ (рис. 3). Увеличение концентрации пек-
дили по ингибированию Fe2+-аскорбатиндуцированного окис- тина в 10 раз (от 0.1 до 1%) приводило к увеличению содер-
ления твина 80 (сорбитанмоноолеата) до малонового диальде- жания восстановленного железа, полученного через 60 мин
гида. Для этого к 2.4 мл инкубационной среды, содержащей после начала инкубации, в среднем в 4.1 раза, а эмоксипина и
0.8% твина 80, 0.08 мМ сернокислого железа и 0.8 мМ аскор- милдроната в среднем в 1.9 раза.
Во второй серии опытов максимальной способностью
биновой кислоты, добавляли 0.2 мл 0.1, 0.5 или 1% раствора
подавлять Fe2+-аскорбатиндуцированное окисление твина 80
препаратов. Полученную смесь инкубировали в течение 48 ч
(сорбитанмоноолеата) до малонового диальдегида обладал
при температуре 37°С, затем к 2.0 мл смеси приливали 1.0 мл милдронат (см. таблицу). Ингибирующая активность 1% рас-
40% раствора трихлоруксусной кислоты и через 60 мин цен- твора пектина и эмоксипина была соответственно на 53.4 и
трифугировали при 8000 об/мин 15 мин. После этого к 1 мл 72.2%, 0.5% раствора – на 67.5 и 60.1%, а 0.1% раствора – на
надосадочной жидкости добавляли 2 мл 0.25% раствора тио- 80.2 и 76.7% ниже, чем милдроната.
барбитуровой кислоты и кипятили в водяной бане в течение Таким образом, в условиях in vitro, низкоэтерифициро-
15 мин. Об антиоксидантной активности препаратов судили ванный пектин из морской травы зостеры обладает более вы-
по степени ингибирования ими окисления твина 80 до мало- раженными восстановительными свойствами, чем лекарст-
нового диальдегида и выражали в процентах (Галактионова и венные препараты антиоксидантного действия – милдронат и
др., 1998). эмоксипин. Ингибирующее действие пектина на Fe2+-аскор-
Статистическую обработку результатов проводили с батиндуцированное окисление твина 80 до малонового диаль-
вычислением средней арифметической и ее стандартной дегида менее выражено, чем милдроната, и не уступает тако-
ошибки по данным шести экспериментов, используя пакет вому эмоксипина.
статистических программ Statistica for Windows r. 5.1 b Ранее нами было показано, что введение белым мышам-
самцам прооксидантных веществ, таких как ацетат свинца,
(StatSoft Inc.).
нитрит натрия, тетрахлорметан и совол, приводит к значи-
Результаты и обсуждение. В первой серии опытов
тельному повышению в печени продуктов перекисного окис-
сравнивали восстанавливающую активность низкоэтерифи-
ления липидов и к снижению активности глутатионперокси-
цированного пектина из морской травы Zostera marina, изме-
дазы и глутатионредуктазы (Хасина и др., 2003). На этом фо-
ренную по восстановлению трехвалентного железа в условиях
не низкоэтерифицированные пектины из лаймы и зостеры
in vitro, с таковой антиоксидантных средств (рис. 1–3). Уста-
способствуют нормализации всех показателей (Хасина и др.,
новлено, что максимальной восстановительной способностью
2003; Khotimchenko et al., 2004). Полученные данные позво-
обладал пектин. Количество образовавшегося восстановлен-
ляют считать, что этот эффект, по крайней мере частично,
ного железа в реакции с 1% раствором пектина через 60 мин
обусловлен восстанавливающими свойствами пектинов и
инкубации составляло 740.5 ± 18.8 мкМ Fe2+, с 0.5% раство-
непосредственно подавлением механизма образования про-
ром – 415.3 ± 10.1 мкМ Fe2+ и с 0.1% раствором – 101.2 ±
дуктов перекисного окисления липидов из ненасыщенных
± 3.7 мкМ Fe2+ (рис. 1). Эмоксипин и милдронат обладали бо-
жирных кислот. Вместе с тем в антиоксидантный эффект
лее низкой восстановительной способностью по сравнению с
пектинов могут быть вовлечены и другие механизмы, на-
пектином. Причем восстанавливающая активность эмоксипи-
пример, связывание ионов тяжелых металлов, в том числе
на была выше, чем милдроната. Количество образовавшегося
железа, но эти предположения нуждаются в эксперимен-
восстановленного железа в реакции с 1% раствором эмокси-
тальной проверке.
пина через 60 мин инкубации составляло 49.1 ± 1.0 мкМ Fe2+,
с 0.5% раствором – 38.1 ± 0.9 мкМ Fe2+, с 0.1% раствором – СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
25.8 ± 0.6 мкМ Fe2+ (рис. 2). Количество образовавшегося
восстановленного железа в реакции с 1% раствором милдро- Афанасьев С.П., Чирва В.Ю., Кацева Г.Н. и др. Модификация
ната через 60 мин инкубации составляло 26.2 ± 0.7 мкМ Fe2+, титриметрического метода анализа пектиновых ве-
с 0.5% раствором – 21.9 ± 0.7 мкМ Fe2+ и с 0.1% раствором – ществ // Химия природ. соедин. 1984. № 4. С. 428–431.

БИОЛОГИЯ МОРЯ том 31 № 5 2005


СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА 383

Галактионова Л.П., Молчанов А.В., Ельчанинова С.А., Вар- Kaul N., Devaraj S., Jialal I. alpha-Tocopherol and atherosclero-
шавский Б.Я. Состояние перекисного окисления у sis // Exp. Biol. Med. 2001. Vol. 226, no. 1. P. 5–12.
больных с язвенной болезнью желудка и двенадцати- Khotimchenko Yu.S., Kolenchenko E.A., Khotimchenko M.Y., Ko-
перстной кишки // Клин. лаб. диагностика. 1998. № 6. valev V.V. Healing and preventive effects of low-esterified
С. 10–14. pectin on liver injury induced by carbon tetrachloride in rats //
Иванова И.Л., Янькова В.И. Влияние пектина морского про- Orien. Pharm. Exp. Med. 2004. Vol. 4, no. 1. P. 28–36.
исхождения в комплексе с минеральными водами на ан- Kravtchenko T.P., Pilnic A. A simplified method for the determi-
тиоксидантную систему крови при экспериментальной nation of the intrinsic viscosity of pectin solution by classi-
гиперлипидемии // Вопр. питания. 1998. № 4. С. 36–38. cal viscosimetry // Gums and stаbilizers in the food indus-
Лоенко Ю.Н., Артюков А.А., Козловская Э.П. и др. Зостерин. try. Oxford: IRL Press. 1990. Vol. 5. P. 281–285.
Владивосток: Дальнаука. 1997. 212 с. Ladas E.J., Jacobson J.S., Kennedy D.D. et al. Antioxidants and
Хасина Э.И., Коленченко Е.А., Сгребнева М.Н. и др. Антиок- cancer therapy: a systematic review // J. Clin. Oncol. 2004.
сидантная активность низкоэтерифицированного пек- Vol. 22, no. 3. P. 517–528.
тина из морской травы Zostera marina // Биол. моря. Matthaus B. Antioxidant activity of extracts obtained from resi-
2003. Т. 29, № 4. С. 291–293. dues of different oilseeds // J. Agr. Food Chem. 2002.
Benzie I.F.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma Vol. 50, no. 12. P. 3444–3452.
(FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP as- Ovodov Yu.S., Ovodova R.G., Shibaeva V.I., Mikheyskaya L.V.
say // Anal. Biochem. 1996. Vol. 239, no. 1. P. 70–76. Further structural studies of zosterine // Carbohydr. Res.
Blumenkrantz S., Asboe-Haunsen G. New method for quantitative 1975. Vol. 42, no. 1. P. 197–199.
determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. Ovodova R.G., Vaskovsky V.E., Ovodov Yu.S. The pectic sub-
Vol. 54, no. 2. P. 484–489. stances of Zosteraceae // Carbohydr. Res. 1968. Vol. 6, no.
Fang Y.Z., Yang S., Wu G.Y. Free radicals, antioxidants, and nu- 2. P. 328–332.
trition // Nutrition. 2002. Vol. 18, no. 10. P. 872–879. Ruperez P., Ahrazem O., Leal J.A. Potential antioxidant capacity
Gaetke L.M., Chow C.K. Copper toxicity, oxidative stress, and of sulfates from the edible marine brown seaweed Fucus
antioxidant nutrients // Toxicology. 2003. Vol. 189, no. 1–2. vesiculosus // J. Agr. Food Chem. 2002. Vol. 50, no. 4.
P. 147–163. P. 840–845.
Halliwell B. Role of free radicals in the neurodegenerative dis- Vertuani S., Angusti A., Manfredini S. The antioxidants and pro-
eases – therapeutic implications for antioxidant treatment // antioxidants network: an overview // Curr. Pharm. Design.
Drug Aging. 2001. Vol. 18, no. 9. P. 685–716. 2004. Vol. 10, no. 14. P. 1677–1694.
Halvorsen B.L., Holte K., Myhrstad M.C.W. et al. A systematic Violi F., Loffredo L., Musella L., Marcoccia A. Should antioxidant
screening of total antioxidants in dietary plants // J. Nutr. status be considered in interventional trials with antioxi-
2002. Vol. 132, no. 3. P. 461–471. dants? // Heart. 2004. Vol. 90, no. 6. P. 598–602.

БИОЛОГИЯ МОРЯ том 31 № 5 2005