T.A.S.S.

2BIOPHY 26/02/2016

DST 2
Techniques Spectrales et Séparatives
(1h00)

Documents non autorisés - Calculatrice autorisée

Justifier les calculs
Séparer calcul littéral et numérique

Exercice 1 : (10 points)

Dans le cadre du dosage du L-aspartate par voie enzymatique, nous désirons déterminer le
poids moléculaire de l'Aspartate Amino Transférase (ASAT) par chromatographie d'exclusion
diffusion.
Pour cela, nous montons en série 5 colonnes de 25 cm de long chacune. Le débit de la phase
mobile (tétrahydrofurane) est de 1 mL.min-1. La détection utilisée est la spectrophotométrie.
On utilise des étalons de poids moléculaire différents. Les résultats obtenus sont donnés par
le tableau n° 1 ci-après.

Tableau n° 1 : Résultats de la chromatographie d'exclusion-diffusion.

M (g.mol-1) tr (min)
2 000 000 26,5
1 040 000 26,9
390 000 28,8
110 000 31,3
10 200 36,4
3 100 39,3
680 42,8

1/ Expliquer le principe de la chromatographie d'exclusion diffusion.

2/ Aux vues des conditions opératoires, quel type de chromatographie d’exclusion diffusion
utilisons-nous ? Justifier.

3/ Pour faire le dépôt de 1 mL d' ASAT en tête de colonne, nous disposons :

♦ d'une pipette graduée en verre d’1 mL, de tolérance ± 0,007 mL,

♦ d'une pipette automatique (de type Pipetman P1000) présentant une erreur relative de ±
0,8% pour des prélèvements de 1 000 µL.

Quelle pipette faut-il alors utiliser pour faire le moins d'erreur sur le prélèvement ?

4/ À quelle longueur d'onde faut-il travailler pour détecter la présence de protéine(s) ?

Quel(s) type(s) de cuve peut-on alors utiliser pour vérifier la longueur d’onde de travail ?

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5/ Faire un gaphe conforme de la courbe d'étalonnage nécessaire à la détermination du poids

moléculaire sur papier millimétré.

6/ Déterminer, en expliquant la méthode utilisée, le poids moléculaire de l'ASAT sachant que

son temps de rétention est de 31 minutes.

Exercice 2 : (10 points)

1/ Donner la définition du phénomène de fluorescence.

2/ On représente ci-dessous le diagramme énergétique d'une molécule fluorescente :

À quoi correspond la flèche montante de couleur violette ?

Même question pour la fléche descendante, en pointillée, de couleur violette, ainsi que pour la
flèche descendante de couleur rouge.

3) On représente ci-dessous le synoptique d'un spectrofluorimètre :

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Répondre aux questions suivantes :

3-1/ Indiquer le nom du monochromateur 1, ainsi que son utilité.

3-2/ Indiquer le nom du monochromateur 2, ainsi que son utilité.

4) On effectue l'analyse fluorimétrique d'un carbostiryl dans l'eau, dont la structure chimique
est donnée ci-dessous :

Données : C = 1.10-6 mol.L-1 ; Chemin optique : 10 mm.

Répondre aux questions suivantes :

4-1/ Pourquoi le carbostiryl est-il fluorescent ?

4-2/ Identifier le spectre d'émission, le spectre d'excitation, en justifiant votre réponse.

Identifier les axes et leurs unités.

4-3/ Déterminer la longueur d'onde d'excitation λexc et la longueur d'onde d'émission

λem.

4-4/ Quel type de cuve doit-on utiliser pour réaliser ces spectres ?

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5) Le solvant, ici l'eau peut avoir un impact sur les mesures quantitatives de la molécule
fluorescente.

5-1/ Définir la diffusion Rayleigh.

5-2/ Définir la diffusion Raman.

5-3/ Comparez les deux types de diffusion.

Vérifier la relation suivante :
! !
!!"#$%&'!
  −   !   ≈   3380 cm-1 ?
!"#"$

FIN DE L'ÉPREUVE

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