​UNIVERSIDAD DE LA SERENA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

Evaluación y determinación de Oxidaciones biológicas y desechos metabólicos

Anielka Cortes, Javiera Novoa​, Michelle Rojas, Pedro Velásquez
pvelasquezi@alumnosuls.cl​, ​a​nielka.cortes@userena.cl, ​michelvalezkarp@gmail.com​ y ​javiera.gn18@gmail.com

RESUMEN

Los seres vivos requieren de un sinfín de reacciones metabólicas para sobre existir, una de las reacciones más importantes y
vitales es el mecanismo de respiración, suministro de energía y excreción de desechos tóxicos para el organismo este proceso se
lleva a cabo mediante una serie de transportes de electrones, reacciones de oxidorreducción y transporte de desechos a través de
la sangre, las reacciones ocurridas en los distintos organismos se engloban en una de carácter oxidativo biológico que ocurren
en las distintas células de los seres vivos. El objetivo principal de la investigación es Analizar y evaluar los distintos factores y
aspectos teórico-prácticos realizados en la investigación además de comprender los procesos de metabolismo oxidativo
energético y desechos metabólicos A continuación se presentan los aspectos teóricos más importantes para comprender la
investigación se detallan los objetivos generales de cada experiencia, en la segunda parte se detallan los procedimientos
realizados y los resultados observados, la tercera parte se analizan los resultados y se especula sobre lo que se debió haber
obtenido además de detallar los errores realizados en la investigación. La mayoría de los resultados fueron los esperados a
exceptuar de dos experiencias donde se cometieron pequeños errores que hicieron costar la visualización de los resultados.
Finalmente se concluye la importancia de la realización de la experiencia, lo aprendido y lo que se determinó y analizó de
acuerdo a cada observación.

PALABRAS CLAVE​: Oxidación biológica, actividad enzimática, cadena respiratoria,NAD, FAD.

en gran parte a través de la síntesis de ATP, el cual proporciona

INTRODUCCIÓN
En las células aeróbicas de los seres vivos se llevan a cabo
reacciones químicas para poder producir energía confiable y
utilizable para cada proceso que se requiere de ella y los cuales son
necesarios para la vida propia. En organismos superiores la mayor
parte de esta energía proviene de procesos de oxidación de
moléculas orgánicas presentes en los alimentos que se consumen día
a día. [1]
Las oxidaciones biológicas son todos aquellos procesos de carácter
biológico que tienen lugar en diferentes células y donde las
moléculas se transforman por reacciones de oxido-reducción además
las reacciones de oxidación se producen sin que haya un cambio
importante de temperatura y con la captura de parte de la energía
energía para el trabajo biológico. [2]
Las reacciones que describen el funcionamiento del organismo, el
conjunto de todas ellas se denomina metabolismo, el cual se
constituye por reacciones anabólicas (síntesis) y catabólicas
(degradación). Las experiencias realizadas en la investigación
contienen reacciones de tipo catabólicas.
La cadena respiratoria consiste en la captación y utilización de
oxígeno celular, en los distintos organismos vivos se diferencia
solamente en la forma de captar el O2, este oxígeno captado entra a
un complejo de distribución para el organismo el primer paso de la
cadena respiratoria es obtener los componentes que serán utilizados
a través del ciclo del ácido cítrico. El ciclo del ácido cítrico describe
una serie de reacciones bioquímicas en la que la gran cantidad de
energía química es almacenada en acetil-CoA es liberada en forma

libre en forma de energía química. La captura de energía se produce gradual. El ácido pirúvico producto de la glucólisis no ingresa
directamente en el ciclo, sino que antes pierde una molécula de CO2

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y convertirse en un compuesto de 2 átomos de carbono
(descarboxilación). El compuesto de dos carbonos se fija a la
coenzima A el complejo resultante se conoce como acetil-CoA,
durante esta reacción el ácido pirúvico también se oxida y el NAD
se reduce a NADH. El acetil-CoA ingresa al ciclo se desprende un
grupo acetilo este se combina con un compuesto de cuatro carbonos
llamado oxalacetato para formar otro compuesto de 6 carbonos
llamado ácido cítrico este paso determina todo los siguiente en el
ciclo. Las reacciones químicas del ciclo de krebs se pueden
clasificar en diversas categorías como descarboxilación y
oxidación-reducción. Si se considera el ciclo de Krebs se puede
apreciar que por cada molécula de acetil-CoA se liberan 4 molecular
de Co2 por descarboxilación, 6 moléculas de NADH y 2 moléculas
de FADH2 y dos moléculas de ATP mediante fosforilación
Se tiene en cuenta que la molécula de glucosa al oxidarse produce
dos moléculas de ácido pirúvico por lo tanto todo el proceso es
duplicado. Además. El CO2 producido se libera en la atmósfera
debido a la respiración, y los productos más importantes NADH y
FADH2 entran a la cadena transportadora de electrones que es el
paso más interesante en la respiración consiste en una serie de
reacciones transportadoras de electrones (complejo I, complejo II,
complejo III, complejo IV)que se llevan a cabo en la mitocondria
mediante estas reacciones se liberan en forma de ATP, cada
molécula de NADH libera 2.5 moléculas de ATP y cada molécula
de FADH2 libera 1.5 moléculas de ATP, cada reacción del ciclo es
catalizada por una enzima específica. [3]
Los objetivos de la primera experiencia fueron determinar la
actividad de la deshidrogenasa láctica de un extracto de músculo. Y
estudiar los factores que afectan dicha actividad. La deshidrogenasa
láctica es una enzima que actúa sobre piruvatos y lactatos con
interconversión de NAD así como su forma reducida NADH, es una
enzima que se encuentra en el citoplasma no particulado de las
células, la reacción catalizada es de forma reversible. [4]
El objetivo principal de la segunda experiencia fue determinar la
actividad de la deshidrogenasa succinato de extracto de riñón y
estudiar los factores que influyen en la actividad de la enzima. Esta
enzima es un tipo de flavoproteína ligada a la membrana interna
mitocondrial, interviene en el ciclo de Krebs y la cadena de
transporte de electrones la molécula de FAD unida a la enzima es el
aceptor final de electrones en la reducción. Esta enzima tiene como
sustrato específico el ácido succínico y puede ser inhibida por ácidos
como el málico. La reacción produce fumarato y se estudia la
presencia del inhibidor.
Los objetivos de la tercera investigación fueron estudiar el
citocromo oxidasa de un extracto de corazón y estudiar el efecto de
algunos inhibidores. El citocromo C oxidasa o complejo IV es una
enzima que forma parte del eslabón final en la cadena de transporte
de electrones de la membrana interna mitocondrial, recibe electrones
del citocromo c y los transfiere al oxígeno, aceptor electrónico final,
que se reduce formando agua. [6]
Los objetivos de la cuarta experiencia fueron determinar y demostrar
la actividad de la peroxidasa de la sangre. ​la peroxidasa es usada
como indicador de la calidad de los tratamientos térmicos. Es una
enzima que se encuentra principalmente en vegetales,
microorganismos y leche además puede encontrarse en el hígado,
útero y mucosa intestinal de animales, esta enzima controla los
niveles de peróxidos que se generan en casi todas las células vivas y
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constituye una actividad importante para las plantas ya que evita el
efecto perjudicial de los radicales libres (aceptor de hidrógenos). [7]
Los objetivos de la quinta experiencia fueron determinar la actividad
de la catalasa de la sangre y evaluar el efecto de inhibidores sobre la
reacción. La catalasa es una enzima que se encuentra distribuida en
tejidos de mamíferos, como preferencia en el riñón, hígado y
eritrocitos, además es una enzima relacionada con la destrucción del
peróxido de hidrógeno que se genera durante el metabolismo
celular, como consecuencia la catalasa interviene en la protección y
mantenimiento del balance oxidante y antioxidante del organismo.
[8]
Los objetivos de la última experiencia fueron analizar una muestra
de orina humana.
Los riñones son los principales responsables del equilibrio de
líquidos y electrolitos. Después de transformar los alimentos a
nutrientes, sus derivados se transforman en compuestos inservibles
para el cuerpo como catabolitos y desechos tóxicos
MATERIALES Y MÉTODOS
6.6 Determinación de la deshidrogenasa láctica usando azul
de metileno como aceptor final de electrones.
Para la determinación de la deshidrogenasa láctica usaremos 4
tubos de ensayos limpios y secos en los cuales en primer lugar
adiciona 1 mL de lactato de sodio al 2% en todos los tubos
exceptuando el número 3, luego procedimos a adicionar 1 mL de
KCN 0,5%, luego en los tubos 1 y 3 adicionamos 1 mL, en el
tubo número 4 adicionamos 2 mL y en el tubo 2 no adicionamos
agua destilada, para los 4 tubos de ensayo se adiciona 1 ml de
azul de metileno al 0,02% el cual es el indicador de la reacción,
en los tubos 2 y 3 agregamos 1 mL de extracto de músculo el
cual cumple una función de coenzima para esta reacción, luego
de esto en los tubos 1, 2 y 3 procedimos a añadir un caldo de
hígado el cual contenía la enzima de esta reacción, al finalizar
todas las soluciones de los distintos tubos a cada uno los
cubrimos con parafilm para pasar a agitarlos y homogeneizar las
soluciones, esta reacción ocurre constantemente si se mantiene
la solución en condiciones de aerobiosis por lo que a cada tubo
le adicionamos una pequeña cantidad de aceite, la necesaria para
formar una película por sobre la solución de cada tubo de ensayo
lo que impide que el oxígeno entre en contacto con las
soluciones y reaccione con estas, luego se dejaron incubar los
tubos a una temperatura de 37°C por 30 minutos.
6.7 Determinación de la deshidrogenasa succínica usando
azul de metileno como aceptor final de electrones
En este procedimiento Se utilizaron cuatro tubos de ensayos
limpios y secos, una gradilla de metal para que así una vez
realizadas las muestras se dejasen allí para poder observar los
respectivos cambios, así pues; al primer tubo de ensayo se le
agregaron 1 mL de succinato de potasio,1 mL de agua destilada,
1 mL de azul de metileno y 1 mL de enzima, a este tubo no se le
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agrego malonato sodio (0,1M). Al segundo tubo de ensayo se le
agregaron 1 mL de succinato de potasio, luego 1 mL de
malonato de sodio, 1 mL de azul de metileno, y 1 mL de enzima,
es importante destacar que a este tubo no se le agregó agua
destilada. Luego al tubo de ensayo tres se le adicionaron 2 mL
de agua destilada, 1 mL de azul de metileno, 1 mL de enzima, a
este tubo no se le agrego succinato de sodio(0,1M) y malonato
de sodio(0,1M). Y por último al cuarto tubo de ensayo se le
agregaron 1 mL de succinato de sodio, 1 mL de agua destilada, y
1 mL de azul de metileno, a este tubo no se le adiciono malonato
de sodio(0,1M) y enzima. Una vez preparadas las muestras en
los cuatro tubos de ensayo cada uno debía ser agitado, luego de
esto se agregaron a todos los tubos aceite, en esta última
cantidad se adiciono solo hasta cuando se formase una capa
visible sobre la muestra generada. Cada tubo en forma ordenada
debía llevarse a un baño termorregulado a (37 grados Celsius)
durante 30 minutos.
6.8 Estudio de las propiedades de la citocromo oxidasa.
Para el estudio de las propiedades de la citocromo oxidasa se
utilizaron 4 tubos de ensayo limpios y secos, en el tubo 1 se
adiciono 1 mL de KCN al 0,01%, en el tubo número 2 añadimos
1mL de Malonato al 0,1%, en el tubo 3 agregamos 1 mL de agua
destilada y en el tubo número 4 agregamos 1,5 mL de agua
destilada, en todos los tubos de ensayo se agregaron 1 mL de
P-fenilendiamina al 0,2% y por último en los tubos 1, 2 y 3 se
añadió 0,5 mL de un caldo de corazón el cual contiene la enzima
de esta reacción, luego dejamos incubar los tubos de ensayo en
un baño termorregulado a 37ºC por 15 minutos ( es importante
que el baño temperado esté destapado).
6.9 Determinación de actividad de la peroxidasa
En este procedimiento se disponen de tres tubos de ensayos, de
los cuales todos deben estar secos y limpios. Al tubo de ensayo
uno se le agregan 1 mL de reactivo de bencidina, 1 mL de agua
oxigenada al 3% y dos gotas de sangre lacada, aquí no se agregó
agua destilada. En el segundo tubo de ensayo se adicionaron 1
mL de reactivo de bencidina y 1mL de agua destilada, en este
tubo no se utilizó el agua oxigenado. Y por último al tercer tubo
de ensayo se le agregó 1mL de reactivo de bencidina, 1 mL de
agua oxigenada al 3% y aquí no se agregó sangre lacada y agua
destilada, luego cada tubo de ensayo al igual que en todos los
demás procesos se debían dejar de reaccionar un tiempo para así
observar los cambios ocurridos, es importante destacar que este
procedimiento fue el más sencillo de llevar a cabo ya que eran
pequeñas cantidades de muestras.
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6.10​ ​Estudio de la actividad catalítica de la catalasa
Se utilizaron cuatro tubos de ensayos, en cada uno de estos se
debía de asegurar que estuviesen secos y limpios, al tubo de
ensayo uno se le agregaron 5 mL de peróxido de hidrógeno al
30% y 1 mL de agua destilada, a este tubo no se le agregaron
mL de cianuro de potasio al 0,5% y cloruro de mercurio
(0,001M). En el segundo tubo de ensayo se adicionaron
inicialmente 5 mL de peróxido de hidrógeno y 1 mL de cianuro
de potasio, a este tubo de ensayo no se le agregaron mL de agua
destilada y mL de cloruro de mercurio. Al tercer tubo de ensayo
se le agregó 5 mL de peróxido de hidrógeno, 1 mL de cianuro de
mercurio y aquí por lo tanto no se agregaron ml de agua
destilada, y KCN al 0,5%. Y por último en el tubo cuatro se
agregaron solamente 6 mL de agua destilada y nada de las tres
muestras siguientes, estas fueron; cianuro de mercurio, peróxido
de hidrógeno y cloruro de mercurio. Una vez realizada todas las
muestras con las respectivas cantidades señaladas anteriormente
a todos los tubos de ensayo se les agregaron 12 mL de sangre
lacada, luego cada tubo se deja reaccionar por completo para así
poder observar los cambios ocurridos entre ellos.
6.11 Análisis de orina humana
Se utiliza de tira reactiva de auto stick y una muestra orina
humana. se sumerge la tira completamente dentro de la muestra
de orina durante dos segundos. luego se elimina el exceso de
orina con papel absorbente y se comparan los resultados
obtenidos con la tabla.
RESULTADOS
Experiencia 1
Tubos Color inicial Color después del
baño
1 café verde musgo
2 café café claro
3 café café claro
4 azul azul
Tabla 1. resultados de la experiencia de determinación de la
deshidrogenasa láctica usando azul de metileno como
aceptor final de electrones.
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Experiencia 2 Experiencia 5

Tubos Color inicial Color después del Tubos Nivel de burbujeo

baño
1 menor
1 café verdoso verde esmeralda
2 medio
2 café verdoso verde lechoso
3 mayor
3 café verdoso verde esmeralda
4 inexistente
4 azul azul
Tabla 5. Observaciones de la actividad catalítica de la
Tabla 2. Observaciones de coloración para la experiencia de catalasa .
la deshidrogenasa succínica usando azul de metileno como
aceptor final de electrones. Experiencia 6

Experiencia 3 Parámetro Valor obtenido Valor de referencia

Tubos Color inicial Color después del

baño
Glucosa Normal Normal (≤50 mg/dl)
1 ocre café claro

2 ocre café rojizo intenso Proteínas ≤15 Negativo (≤50 mg/dl)

Bilirrubina ---- Negativo
3 ocre café rojizo intenso
Urobilinógeno Normal Normal (≥1 mg/dl)
4 transparente transparente pH 8 5 (en ayuna)
Tabla 3. Observación del color de las propiedades de la Gravedad específica 1,015 1,000
citocromo oxidasa.
Sangre No hemolizada Negativo
Experiencia 4 Cuerpos cetónicos Negativo Negativo
Nitritos Negativo Negativo
Tubos Color Actividad de la
enzima Leucocitos Negativo Negativo
Tabla 6. Resultados del análisis de orina.
1 morado oscuro reacciona

2 transparente no reacciona DISCUSIÓN

3 transparente no reacciona Determinación de la deshidrogenasa láctica usando azul de

Tabla 4. Observaciones de la actividad de la peroxidasa
metileno como aceptor final de electrones.
De acuerdo con lo observado durante la primera experiencia se
puede decir que hubo tres tubos que tuvieron un color esperado,
el tubo uno presentó un color diferente a los
demás(verde-opaco) de debido a que no presentaba la coenzima
evitando así la formación del piruvato. En cuanto al tubo dos se
puede decir que este tenía todas las condiciones necesarias para
que ocurriera una actividad de la enzima formando el respectivo
producto(piruvato). Es importante destacar que en el dos
produjo el mismo color que el tubo dos, pero esto no quiere
decir que se halla formado piruvato ya que no había presencia de
sustrato, Y por último al observar el tubo cuatro se puede decir
que no hubo actividad, ya que no había presencia de enzima, y
tampoco de coenzima.

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Determinación de la de deshidrogenasa succínica usando
azul de metileno como aceptor final de electrones
Durante la experiencia 2 se logró inducir que el cambio de color
eran los correctos, puesto que el tubo que tenía enzima y sustrato
tomó una coloración distinta a los otros, deduciendo así que
hubo formación de producto, la enzima deshidrogenasa del
succinato introduce un doble enlace entre los carbonos centrales
del succinato formando el producto [9]; el tubo que tenía
inhibidor obtuvo un color verde acuoso con tonalidades blancas
(más claro en comparación con los demás) lo que evidencia que
no se formó producto y que el inhibidor ganó la competencia por
el sitio activo, ´por lo tanto el succinato de acumula y termina
reduciendo, mientras que la coenzima termina re-oxidándose En
cuanto al tubo 4,2 no ocurrió reacción ya que no estaba presente
la enzima, por lo tanto, no hubo cambio de color.
Estudio de las propiedades de la citocromo oxidasa.
Según lo observado en la experiencia 3 se logra deducir que los
cuatros tubos obtuvieron tonalidades de color esperados; el tubo
4,3 no cambió de color ya que no tenía presente la enzima, por
lo tanto, prevaleció el color transparente del indicador
(P-fenilendiamina), en el tubo 3,3 sí hubo reacción ya que no
había presencia de inhibidor por lo que adoptó un color café
rojizo muy intenso ​cumpliendo así con lo esperado, similar a lo
que ocurrió en el tubo 2,3 donde sí había presencia de inhibidor(
malonato) pero a una concentración baja. en cuanto a al tubo 1,3
su color fue un café muy claro por lo tanto se dedujo que la
presencia de cianuro de potasio inhibe la actividad enzimática.
Determinación de la actividad de peroxidasa
Con la enzima peroxidasa de la experiencia 4 se puede inferir
que el tubo 1,4 fue el que obtuvo una reacción positiva ya que
era el único que contenía en su interior peróxido de hidrógeno
junto con la respectiva enzima, con lo que se comprueba que el
indicador en presencia de agua oxigenada hace que la enzima
peroxidasa cambie de color, es por ello que los tubos 2,3 y 3,4
no ocurrió la oxidación de la bencidina ya que ambos
mantuvieron el mismo color inicial.
Estudio de la actividad catalítica de la catalasa
cuando se trabajó con la otra enzima (catalasa) obtenida en la
experiencia 4 no se obtuvieron los resultados esperados en
algunos tubos de ensayos ya que hubo un pequeño derrame de
agua oxigenada al momento de la manipulación. Es por ello que
el tubo 3, el cual no debía tener mayor burbujeo, tuvo mayor
efervescencia que los demás, sin embargo, el tubo 4 cumplió con
lo que esperaba ya que no hubo burbujeo. En cuanto al tubo 1 se
observó que tuvo una menor reacción de efervescencia y por
último en el tubo 2 se observó un menor burbujeo que en el tubo
3, puesto que tenía la presencia de un inhibidor.
Análisis de orina humana
Finalmente, al realizar el análisis de orina se observaron
resultados esperados, esto quiere decir que los parámetros se
encontraban dentro de un rango normal.
CONCLUSIÓN
El lactato deshidrogenasa, es una enzima catalizadora que se
encuentra en muchos tejidos del cuerpo, pero su presencia es
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mayor en el corazón, hígado, riñones, músculos, glóbulos rojos,
cerebro y pulmones. Corresponde a la categoría de las
oxidorreductasas, dado que cataliza una reacción redox, en
donde el piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de
NADH a NAD+. la enzima también puede catalizar la
oxidación del hidroxibutirato, ocasionalmente es conocida como
Hidroxibutirato,y participa en el metabolismo energético
anaerobio. La enzima succinato deshidrogenasa (SDH) o
también llamada succinato coenzima Q es un complejo proteico
ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en el
ciclo de Krebs y en la cadena transportadora de electrones.
A lo largo de todas experiencias realizadas se pudo observar y
deducir que el lactato se transformó en ácido pirúvico, por ende,
la reacción no fue de reducción, sino que fue un proceso de
oxidación, es importante destacar que en esta actividad se debía
agregar cianuro de potasio el cual transformó el piruvato
previamente formado por el lactato en cianhidrina y gracias a
esto el ácido no volvió a su forma anterior, puesto que tenía la
posibilidad de hacerlo ya que era reacción reversible. Cuando el
NAD oxidado se redujo, ocurrió una liberación de sus
hidrógenos los cuales fueron aceptados por el indicador (azul de
metileno), generando una decoloración, es fundamental que esta
reacción ocurriese anaeróbicamente, ya que el indicador no
podía estar en contacto con el oxígeno del aire. A partir de la
enzima deshidrogenasa succinato se concluye que la formación
de fumarato se vio afectada por la concentración de sustrato y de
enzima la cual tenía unida a ella covalentemente la coenzima
FAD, además la presencia del inhibidor (malonato) realizó una
inhibición competitiva con el succinato ya que tiene una
estructura similar a la del succinato, por lo tanto, el final de la
reacción iba a depender de la concentración de inhibidor
presente; un factor que ayuda a que la reacción se lleve a cabo
de manera positiva es el indicador (azul de metileno) el cual se
encuentra inicialmente en un estado oxidado y es éste el que
capta los hidrógenos del FAD liberado y este se reduce. En la
experiencia tres acerca de la citocromo oxidasa se adquiere
como aprendizaje que el sustrato inicialmente reducido perdió
sus hidrógenos y de esa manera se utilizó para la formación de
agua metabólica gracias a la presencia de oxígeno el cual aceptó
aquellos hidrógeno. En la experiencia sobre la determinación de
peroxidasa se observó un cambio de la tonalidad de la
decoloración ya que el único tubo que reaccionó fue el que se le
adiciona peróxido de hidrógeno junto con la enzima. Con ello se
puede decir que la reacción catalizada por la enzima es utilizar
peróxido de hidrógeno junto con otro sustrato para detoxificarse
en agua metabólica. Sobre la determinación de la actividad
catalítica sobre la sangre la enzima transforma el peróxido de
hidrógeno en oxígeno y esa liberación de O2 molecular se ve
evidenciada por la presencia de burbujas. Y por último en la
actividad sobre el análisis de la muestra de orina humana el test
detecta inicialmente la presencia de glucosa lo cual no debiese
pasar en una persona que se encuentra en un estado óptimo de
salud, así pues, efectivamente se cumplió con el objetivo a
analizar ya que la orina utilizada tenía rangos normales de
glucosa.
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REFERENCIAS

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oxidaciones biologicas.​ Universidad catolica agropecuaria del
tropico seco . Ingenieria agropecuaria pág 2.

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Introduccion a la microbiologia (9° ed.), Buenos aires: Medica
panamericana (2007), pág 129.
[3]Tortola J. Gerlad, Berdell R. Funke, Christine L. Cast,
Introduccion a la microbiologia (9° ed.), Buenos aires: Medica
panamericana (2007), pág 129.
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[8] Céspedes Miranda, Ela M, Hernández Lantigua, Ingrid, &

Llópiz Janer, Niurka. (1996). Enzimas que participan como
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Catalasa. ​Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas​, ​15​(2)
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[9] Melo, V., Ruiz, V.M., & Cuamatzi, O. (2007). ​Bioquímica

de los procesos metabólicos.​ Reverté.

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