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Instituto de Medicina del Deporte, Laboratorio Antidoping, Departamento Analítico, Calle 100 y Aldabó, Ciudad de La
Habana, Código Postal 10800, Cuba. Correo electrónico: antidop@inder.cu
Palabras clave: esteroides anabólicos, control del dopaje, control de la calidad, extracción en fase sólida.
Key words: anabolic steroids, antidoping control, quality control, solid phase extraction.
glucurónidos en la orina entre otros torio imponen una gran responsabi- nas de extracción en fase sólida
metabolitos de esta hormona. Otra lidad debido a las implicaciones que DetectabuseTM (Biochemical Diag-
observación de gran importancia fue ellos traen aparejadas. Por ello, esos nostics, EE. UU.).
que la epitestosterona, hormona sin resultados deben ser muy confia- En cada lote analítico (25 mues-
valor androgénico y que se excreta bles, luego si se tiene en cuenta que tras), se utilizan dos controles posi-
de manera fisiológica en una rela- los análisis están sometidos a múlti- tivos. El primero lo constituye un
ción aproximada de 1 : 1 con respec- ples fuentes de error (tanto evitables blanco de orina contaminado con los
to a la testosterona, se mantiene como inevitables), entonces, no bas- compuestos que se excretan en baja
inalterable luego de una administra- ta con trabajar con máximo cuidado, concentración y que el AMA exige
ción de esta última. Es por ello que en sino que cada laboratorio necesita su detección hasta 2 ng/mL (metabo-
1982, la Comisión Médica del COI (y un sistema bien establecido y orga- lito 1 nandrolona, el metabolito 2 de
actualmente la Agencia Mundial nizado para controlar permanente- la metiltestosterona, el metabolito 1
Antidopaje, AMA) decide que una re- mente la precisión y exactitud de sus del stanozolol, clenbuterol y el
lación testosterona/epitestosterona análisis de manera objetiva.8 metabolito 3 de la metandienona). El
mayor de 6 : 1 sería considerada una El presente trabajo describe el segundo, es un blanco de orina con-
violación de las reglas del olimpismo.1-7 montaje de la técnica analítica taminado con 29 compuestos que ga-
Estudios posteriores demostra- implementada en el Laboratorio rantizan el control de la retención
ron la influencia que ejercen, sobre Antidoping de La Habana para la de- relativa de los compuestos en gene-
el perfil de esteroides endógenos tección e identificación de esteroides ral, a detectar (Tabla 1). Los contro-
urinarios, la administración de los anabólicos endógenos, exógenos, ß2- les negativos utilizados durante el
esteroides anabólicos sintéticos. La agonistas, estimulantes y narcóticos, proceso de pesquizaje son: un blan-
administración de estos compuestos mediante una extracción en fase só- co del reactivo empleado para la for-
(vía oral, parenteral, tópica o cual- lida seguida de una hidrólisis enzimá- mación de derivados y un blanco de
quier otra) provoca una depresión de tica y una extracción líquido-líquido. orina previamente verificado en el
las concentraciones de los esteroides Los derivados trimetilsilil de estos que no se encontraron interferencias
endógenos urinarios debido a su ac- compuestos fueron analizados por a los tiempos de retención de los
ción sobre la homeostasis de la CG-EM. 9-18 Se presenta además, cómo compuestos a identificar en el proce-
biosíntesis de esteroides y su meta- se realiza el control interno de la cali- so de pesquizaje y dotado de esteroi-
bolismo en el organismo humano. Se dad de todo el proceso analítico. des endógenos en concentraciones
conoce que luego de una administra- bien establecidas. La muestra cali-
ción a largo plazo de esteroides sin- MATERIALES Y MÉTODOS bradora empleada contiene 20 es-
téticos, las concentraciones de los Reactivos teroides endógenos en concentraciones
compuestos endógenos urinarios β-Glucuronidasa/tipo K12 E. coli conocidas y con ayuda del programa
regresan a su nivel basal en un tiem- (Roche, Alemania); metanol, pureza empleado es posible calcular mediante
po superior al de la eliminación del 99,93 % (SIGMA, Alemania); tert- factores de respuesta, sus concentra-
esteroide administrado. Este hecho butilmetileter, pureza 99,8 % (SIGMA, ciones en cada una de las muestras
hace de la evaluación del perfil de Alemania); N-metil-N-trimetilsililtri- analizadas. El patrón interno (PI) uti-
esteroides urinarios una herramien- fluoro-acetamida para CG (MSTFA), lizado en esta técnica consiste en
ta útil en el diagnóstico del consu- (SIGMA, Alemania); ioduro de una mezcla de 17α-metiltestosterona
mo de esteroides anabólicos.6-7 amonio, pureza 100,7 % (SIGMA (50 µg/mL) y (16,16,17-d3)-testostero-
Los resultados de la aplicación de Chemical, Alemania); 2-mercap- na (5 µg/mL). Este último, se incor-
los métodos analíticos en el labora- toetanol (Merck, Alemania); colum- pora con el objetivo de realizar la
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cuantificación de la testosterona y 3°C/min; incrementar hasta 310 °C cia del ión m/z 446 correspondiente
epitestosterona en cada muestra, así con una rampa de 40 °C/min . Tiem- a la 17α-metiltestosterona (PI).
como de otros compuestos endóge- po final de 3 min . Tiempo total de Hidrólisis enzimática
nos que se encuentren en concentra- corrida: 23,21 min . El espectrómetro La hidrólisis enzimática es uno
ciones similares. de masas fue operado en el modo de de los pasos más importantes den-
Cada uno de los controles descri- monitoreo selectivo de iones (SIM) tro del proceso de preparación de la
tos anteriormente es procesado en con un voltaje de ionización de 70 eV; muestra debido a que los esteroides
conjunto con las muestras en cada fuente iónica a 230 °C; interface a anabólicos, ya sean endógenos o
lote analítico. 280°C y cuadrupolo a 150 °C . exógenos, se excretan en forma de
El método de extracción consis- conjugados (glucurónidos en su
te en pasar la muestra por una co- RESULTADOS Y DISCUSIÓN mayoría). Por tanto, se hace necesa-
lumna de extracción en fase sólida Con la utilización de esta técnica ria la separación del grupo glucuró-
DetectabuseTM previamente activa- es posible detectar en una sola co- nido de la molécula mediante una
da con 2 mL de metanol y 2 mL de rrida cromatográfica 76 compuestos hidrólisis al nivel de la posición β de
agua desionizada. Después de adi- en su forma de derivados trimetil- los carbonos 3 y 17 para su análisis
cionada la muestra se realiza un la- silil. La Tabla 2 muestra los com- instrumental. El control interno de
vado con 2 mL de agua desionizada puestos objeto de análisis, así como este paso se realiza mediante la utili-
y los compuestos adsorbidos en la sus iones diagnóstico en orden decre- zación de cartas simples de control.
columna son eluidos con 2 mL de ciente de intensidad y la retención re- Reacción de formación de deri-
metanol. Posteriormente, el metanol lativa de cada uno de ellos. El empleo vados
es evaporado a sequedad y el extrac- del modo de adquisición monitoreo Como toda reacción química su
to es reconstituido con 1 mL de diso- selectivo de iones en la técnica de CG- rendimiento es afectado por múlti-
lución reguladora de fosfato pH = 7,0. EM permite aumentar la sensibilidad ples factores como son: tiempo, tem-
La hidrólisis se realiza con β y la posibilidad de pesquisar un gran peratura de reacción y humedad,
-glucuronidasa (E. coli), 25 unidades número de compuestos basándose en fundamentalmente. El control de
/muestra, a 55 °C durante 1 h . Des- la verificación de iones característi- esta reacción se realiza a través de
pués de alcanzar la temperatura cos, en una sola corrida. la verificación del monoderivado- O-
ambiente, se realiza una extracción TMS de la androsterona. El área para
líquido-líquido con tert-butilmetil- Control interno de la calidad del el ión m/z 272 correspondiente al
éter luego de realizar un ajuste de pH proceso derivado mono-O-TMS de este com-
con 250 µL de K2CO3 (5 %). Se separa En el control interno de la cali- puesto no debe exceder del 5 % del
la fase orgánica y se evapora com- dad se tienen en cuenta los factores área correspondiente al ión m/z 434
pletamente. La reacción para la for- que influyen en el proceso y que de la androsterona bis-O-TMS.
mación de derivados trimetilsilil pueden alterar los resultados. Las En la orina se encuentran una
(TMS) se realiza con una mezcla de condiciones del espectrómetro de gran cantidad de bacterias propias
MSTFA-NH4I- 2-mercaptoetanol (v masas se verifican mediante la de la flora. Cuando la muestra no es
/m/v) (1 000 : 2 : 6). Los compuestos autocalibración, la cual es realizada conservada en condiciones apropia-
bis-O-TMS, tris-O-TMS y Tetrakis-O- con perfluorotributilamina. Los das se favorece el crecimiento de
TMS son formados en dependencia iones utilizados son m/z 69, 219 y 502 ellas, tomando como sustrato los
del número de grupos funcionales para la calibración en las zonas de propios esteroides endógenos que se
que presenta cada compuesto, capa- masas pequeña, media y elevada res- encuentran en el medio. Esto trae
ces de reaccionar con el grupo TMS. pectivamente. Los parámetros veri- como consecuencia una alteración
ficados son: ancho de los picos del perfil que puede llevar a pen-
Equipos cromatográficos de cada uno de los sar en un resultado analítico ad-
Vortex mixer M-63210-33 (Ther- iones, número de picos en el espec- verso. Para descartar una posible
molyne, EE. UU.); zaranda 260300F tro, voltajes del multiplicador y del contaminación por estas bacterias
(Boekel, EE. UU.); centrífuga (Fisher dispositivo repeledor, la abundancia es verificada la presencia de 5α- y
Scientific, EE. UU.); bomba de vacío del pico base (m/z 69), así como la re- 5β-androstandiona. La presencia de
400-1901 (Barnant, EE. UU.); termos- lación con los iones a m/z 219 y 502. ambos compuestos en la muestra de
tato seco de 36 plazas (Pierce, EE. Estos parámetros en su conjunto ex- orina lleva a pensar en una posible
UU.); baño con termostato GP-100 presan las condiciones en que se en- contaminación bacteriana, mientras
(Neslab, EE. UU.); procesador de ex- cuentra el equipo para la realización que la existencia de la 5α-andros-
tracción sólido–líquido (Supelco, EE. del análisis instrumental. tandiona solamente, puede llevar a
UU.); cromatógrafo de gases HP 6890 Condiciones de la columna pensar en un consumo de este pre-
acoplado a espectrómetro de masas cromatográfica cursor de la testosterona.
cuadrupolar HP 5973 con inyector Para la verificación del estado de
automático serie 7683 y computado- la columna capilar se toman como CONCLUSIONES
ra HP Vectra VL (Hewlet Packard, referencia la altura de los picos Esta metodología analítica imple-
EE. UU.). Condiciones cromatográfi- cromatográficos, en el control posi- mentada permite la detección de
cas: columna capilar HP-1 (metilsilo- tivo, de cuatro compuestos cuyas 76 compuestos en una sola corrida
xano; 17 m; diámetro interior 0,20 mm; propiedades cromatográficas son cromatográfica. El uso de controles
grosor de la fase estacionaria 0,11 µm); pobres (3’ hidroxistanozolol, oxandro- positivos y negativos garantiza la
inyector a 280 °C; modo de inyección: lona, fluoximesterona y triamtereno). detección de los compuestos anali-
split (relación 10 : 1); volumen de Para la verificación del proceso de zados. El sistema de control de cada
inyección: 2 µL; gas portador: helio extración en el lote analítico es eva- uno de los pasos establecidos en el
(0,9 mL/min . Flujo constante); pro- luado el control positivo que presenta procedimiento analítico permite que
grama de temperatura: 180 °C; incre- a los compuestos en pequeñas con- los resultados obtenidos tengan un
mentar a 235 °C con una rampa de centraciones (2 ng/mL) y la abundan- alto grado de confiabilidad.
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Tabla 2. Compuestos en forma de derivados trimetilsilil, sus iones característicos y su retención relativa con respecto al
patrón interno (17α-metiltestosterona).
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Compuestos que se excretan fisiológicamente en la orina. En el análisis instrumental se estiman las concentraciones de cada
uno de los compuestos para cada muestra. PI Patrón interno. RR Retención relativa.
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