PRÁCTICA 13 LABORATORIO BIOQUÍMICA

ACIDOS NUCLEICOS
Mónica Lucia Suarez Gutiérrez 1*, Jhon Erick Aceros Ramírez 1, William Antonio
Martínez Jiménez 1
1 Estudiantes del programa Química y Farmacia, 3cer semestre. Universidad del Atlántico.
Puerto Colombia (Atlántico). Colombia.
*Autor para correspondencia. E-mail: mluciasuarez@mail.uniatlantico.edu.co
Profesor: José Rafael Arrieta Madrid 2020-1
Laboratorio de Bioquímica

Resumen
El presente informe contiene una breve descripción sobre los ácidos nucleicos y el ADN
como el ARN, se realiza una práctica sencilla, de bajos costos y muy breve, en esto se busca
lograr la separación o aislamiento de ácidos nucleicos en una fruta, en este caso se emplea la
mora, esto se hace con el fin de complementar las bases teóricas con un fundamento práctico
a través de la experiencia que puede realizarse con implementos que se pueden encontrar en
los hogares.

Palabras claves: ADN, ARN, Ácidos nucleicos, Aislamiento de ácidos nucleicos.

Abstract

This report contains a brief description about nucleic acids and ADN as RNA, a simple, low-
cost and very brief practice is carried out, in this it seeks to achieve the separation or isolation
of nucleic acids in a fruit, in this case The blackberry is used, this is done in order to
complement the theoretical bases with a practical foundation through the experience that can
be carried out with implements that can be found in homes.

Key words: ADN, Nucleic acids, RNA, Separation of nucleic acids.

1. INTRODUCCIÓN pueden dividir en los ácidos ribonucleicos

El primer concepto que se trata es el de los
ácidos nucleicos, aquellos constituyen a un
grupo de biomoléculas que su estructura se
compone por polímeros, aquellos son los
protagonistas de la biología molecular y de la
vida en sí misma. si se ve desde un punto de
vista químico, los ácidos nucleicos son
polímeros lineales de nucleótidos, que están
formados por un grupo fosfato, azúcar de tipo
pentosa (ribosa o desoxirribosa) y una base
nitrogenada que puede ser derivada de la
pirimidina o de la purina. Una de las formas
de diferenciar los ácidos nucleicos es a partir
del tipo de azúcar que los componen, se
(ARN) o ácidos desoxirribonucleicos (ADN)
conformando biomoléculas están presentes
en todas las células ya sean animales,
vegetales, Bacterias, protozoos o incluso en
los virus que solamente contienen ADN o
ARN.
La principal utilidad que tienen los ácidos
nucleicos es la de almacenar y transmitir la
información genética, ellos son responsables
la identidad de las especies biológicas,
permiten la variación que existe entre
diversos individuos, de la misma manera
participan en su evolución a partir de
mutaciones de diversas especies, Asimismo
hacen posible la diferenciación de los tejidos
y de las células, estos adquieren formas,
estructuras y funciones características y
necesarias para el desarrollo de diversas
actividades, igualmente, la información que
está contenida en los ácidos nucleicos es muy
útil para la vida en general, en procesos
biológicos sencillos como la síntesis de
proteínas, ya que estos biopolímeros
contienen información sobre las secuencias
proteicas que constituyen la maquinaria
molecular que al mismo tiempo es tan
necesaria para gran diversidad de procesos
que se desarrollan dentro de la célula, estas
son algunas de sus funciones a nivel general
sin embargo existen múltiples formas de
desenvolverse que podrían ser descritas
detalladamente.
Los ácidos nucleicos están compuestos por
bases nitrogenadas. que son moléculas
heterocíclicas que poseen anillos moleculares
que pueden derivar de las purinas (guanina y
adenina) y pirimidinas (uracilo, timina y
citosina). También las compone una azúcar
de cinco carbonos y al menos un fosfato.
ARN
Es el ácido nucleico que más se presenta en
la célula, existen varios tipos principales de
ARN que se caracterizan por tener distintas
masas moleculares, funciones y localización.
El ARN generalmente está formado por una
sola cadena de nucleótidos a diferencia del
ADN que cuenta con dos cadenas
complementarias.
TIPOS DE ARN:
El ARN heterogéneo nuclear se halla en el
núcleo y tiene una gran masa molecular, a
este se le considera el precursor de los
restantes tipos de ADN que se forman en
procesos específicos.
El ARN ribosomal es uno de los
constituyentes del ribosoma, este orgánulo
tiene una gran importancia en la síntesis de
proteínas. Se dice que el 80% de la ARN de
las células es ARN ribosomal,
El ARN de transferencia consta de 85
nucleótidos y participa en la biosíntesis de
proteínas, este contribuye con la unión de los
aminoácidos que se van incorporando a la
cadena peptídica en crecimiento, esto es
porque antes de unirse a dicha cadena deben
unirse al ARNt que les corresponda.
En ARN mensajero es aquel que transporta
desde el núcleo de la célula hasta el
citoplasma un mensaje con las instrucciones
para la síntesis de las proteínas, tiene una vida
más corta que los demás porque se destruye
tan pronto ha cumplido con su labor.
ADN
Se encuentra en el núcleo de las células y
tiene una masa molecular muy elevada, se
puede encontrar estructuralmente de varias
formas, por ejemplo, sufre un enrollamiento
hasta formar los conocidos como
cromosomas, cada uno de ellos contiene una
sola molécula larguísima de ADN que se
empaqueta gracias a proteínas específicas
como las histonas, la secuencia de
nucleótidos que conforman al ADN, contiene
toda la información genética de un ser vivo.
Un proceso importante a tener en cuenta es
que a partir del ADN se pueden obtener
diversos tipos de ARN y estos a su vez darían
lugar a gran variedad de proteínas.
La estructura del ADN consta de dos cadenas
de polinucleótidos que cuentan con bases
nitrogenadas emparejadas de forma ordenada
en sentido antiparalelo y complementario (A-
T y G-C), además, si una cadena tiene su
carbono 3' -OH libre en un extremo, la otra lo
tiene en el extremo contrario.
La estructura del ADN fue conocida gracias
a Watson y Crick en el año 1953, esta
consiste en una doble hélice. Las dos cadenas
son complementarias, por ejemplo, si una
cadena es: (5')-G-A-A-T-C- (3') la
complementaria sería: (5')-C-T-T-A-G- (3') y
ambas quedan emparejadas. Esto es muy útil,
puesto que, al desdoblarse la cadena que
conforma la doble hélice, puede servir cómo
molde de una nueva, a esto se le conoce como
proceso de replicación, gracias a aquello se
les conoce como semiconservativas.
Un aspecto muy relevante que no puede ser
ignorado es que los ácidos nucleicos como el
ADN y ARN tienen un papel indispensable
como portadores de la herencia y son
determinantes para los caracteres genéticos
de todos los individuos vivos, sus procesos
biológicos y su supervivencia como especies
e individuos, por tal razón es muy relevante
su estudio en áreas como la bioquímica que
tiene estrecha relación con la biología
molecular que se desempeña profundamente
en estudio de estos temas.
2. OBJETIVOS
● GENERAL
Establecer los fundamentos
teóricos/prácticos para los procesos
de determinación de ADN en una
muestra de fruta.
● ESPECÍFICOS
o Determinar la presencia de ADN
en la pulpa mediante la extracción
con alcohol.
o Interpretar los resultados con base
a las reacciones realizadas.
3. MATERIALES
Reactivos:
● 20 mL de Alcohol etílico.
● 5 mL de Shampoo.
● Sal de cocina.
Instrumentos de laboratorio
● Beaker.
● Mortero.
● Micropipeta.
● Agitador de vidrio.
Otros materiales
● 25 mL de agua destilada.
● Mora.
4. PROCEDIMIENTO
1. Utilizando un cuchillo plástico pelar
la fruta (kwi, fresa u otro) o cortar en
pequeños trozos.
2. Se pasa a un mortero y macere sobre
las paredes de este mismo y luego filtre
(gorro).
3. Luego la solución que contiene la
mora, adiciónese al beaker que contiene
la solución.
4. Prepare la solución.
5. En un beaker adiciones una
cucharadita de shampoo (5 onza), dos
pizcas de sal, 25 mL de agua destilada
para un volumen total de 30 ml
(solución).
6. Con un agitador disuelva suavemente
la sal y el shampoo evitando formar
espuma (solución).
7. Déjela durante 5 minutos cubriendo el
recipiente.
LIMPIAR EL ADN DE PROTEÍNAS:
8. Enfríe el alcohol etílico lo máximo
que sea posible en un recipiente que
contenga hielo
9. Adicione el alcohol frío (10-20 mL.)
al extracto de la fruta que se encuentre en
el beaker
10. Mantenga el beaker en reposo durante
2 ó 3 minutos
11. Se obtiene al final el ADN de color
blanquecino mucoso en el alcohol en la
superficie
12. Luego con una micropipeta muy
cuidadosa se extrae el sobrenadante
mucoso y se pasa a un tubo de ensayos
para luego hacer pruebas de solubilidad
con agua destilada fría a caliente.
 5. RESULTADOS Y ANÁLISIS
Figura 1. recipientes utilizados para extraer el
ADN mucoso de la mora, en la cual en el recipiente
1 se encuentra la solución de Shampoo con agua y
sal, recipiente 2 extracto de mora, recipiente 3
alcohol etílico
Figura 2. Formación del ADN mucosa al añadir
alcohol en la solución de shampoo, agua sal y
extracto de mora
Figura 3. ADN mucoso de la Mora
Para explicar los resultados obtenidos en la
práctica cabe resaltar que no todos los seres
vivientes presentan células diploides como
los seres humanos, algunas frutas y animales
pueden ser haploides, diploides, triploides y
poliploides, se menciona esto porque de
acuerdo al número de cromosomas que tenga
un organismo la cantidad de ADN va a variar,
pues cabe resaltar que este ácido nucleico se
encuentra dentro de estas estructuras. El
género Rubus, pertenecientes a la familia de
las rosáceas, forman el conjunto de las
zarzamoras existentes, existen
aproximadamente 20 especies diferentes
dentro de este género; en cada uno de estos el
número de cromosomas y el tipo de célula
varía desde haploides a poliploides y con un
número de cromosomas que alcanza hasta las
90 unidades. Lo anterior es mencionado
porque con base a lo anterior la cantidad de
ADN extraído va a variar de acuerdo al
número de cromosomas presente en cada
fruta, por lo que en un caso hipotético donde
una fruta “x” presenta un juego de 2 pares de
15 cromosomas (células diploides; 30
cromosomas en total) y una fruta “y” que
presenta 4 pares de 20 cromosomas (células
tetraploides; 80 cromosomas) va haber una
mayor cantidad de ADN extraído de la fruta
“y” considerando que se maneja una igual
cantidad de volumen. Ahora bien en este
proceso de extracción de ADN cada uno los
materiales y métodos utilizados dentro de
esta práctica cumplen una función específica
dentro del proceso en la extracción de ADN,
en el primer paso dentro de la práctica (la
maceración) las células se separan y filtran, la
solución utilizada de shampoo y sal tiene una
función específica, el shampoo, destruye lo
que corresponde a la membrana celular,
nuclear y mitocondrial, pues estas son
estructuras lipídicas que se rompen por
acción de dicho compuesto, la sal de cocina
por otra parte separa algunas de las proteínas
que se encuentran unidas al ADN al igual que
los iones Na+ neutralizan la carga negativa de
dicho ácido, finalmente una vez se adiciona
el etanol frío, el ADN se separa del agua y se
precipita, liberando así las cadenas de ADN,
las cuales se agrupan formando la masa
gelatinosa que se ve en la superficie de la
solución.
6. CONCLUSIÓN
Se logró complementar los conocimientos a
partir de una conexión teórico-práctica, esto
se hace posible al utilizar implementos que
están en los hogares de quienes han
desarrollado la práctica, los resultados
positivos se evidencian en la formación de
una capa blanquecina en la muestra que se
evalúa, esto ha sido posible al seguir las
indicaciones que se exponen en la guía de la
práctica y acatando los pasos bien
estructurados se llega a la conclusión de que
ha sido satisfactoria al obtener los resultados
deseados.
7. GUIA DE ESTUDIO
1. Investigue otro método u que otras
reacciones se pueden usar para investigar
componentes del ADN.
Métodos generales de aislamiento y
purificación del ADN.
En el libro de bioquímica de los ácidos
nucleicos de Davidson se puede encontrar
con técnicas generales del aislamiento de
ácidos nucleicos, se puede al mismo tiempo
encontrar un bosquejo general sobre los
métodos de laboratorio empleados para el
aislamiento y purificación de dichos ácidos
nucleicos de diversas fuentes.
1. Rotura de Células
El primer paso de aislamiento de un ácido
nucleico consiste en la separación del mismo
en dos componentes celulares y de las
proteínas asociadas. Existen gran variedad de
métodos para la rotulación de tejido animal,
entre los procesos más general incluye la
congelación y descongelación, y
posteriormente se realiza la digestión y lisis
del tejido con reactivos adecuados (por
ejemplo, empleando proteinasa k). También
podemos encontrar otro tipo de métodos,
como es el caso de los métodos mecánicos,
entre los que encontramos el pulverizado en
mortero con arena, aluminia o cuentas de
vidrio finas, o en su defecto el
homogeneizador de pistón, cuyo
funcionamiento principal permite romper las
células sin dañar los orgánulos subcelulares.
Además, instrumentos tales como la batidora,
pueden romper los orgánulos. la exposición a
vibraciones sónicas o ultrasónica resulta útil
para pequeñas porciones de material (R. L. P.
Adams et al.,1980).
En cuanto a las bacterias estas pueden ser
lisadas con agentes tensoactivos como el
lauril sulfato de sodio o lisozima, depende del
caso. En cuanto al pulverizado con cuentas de
vidrio o alúmina es un método muy frecuente.
 2. Purificación
La purificación de ADN de muestras de
sangre es difícil porque la sangre es una
mezcla compleja que contiene células,
proteínas, metabolitos, etc. Más del 99% de
las células de la sangre son eritrocitos, que no
tienen núcleo, por lo tanto, carecen de ADN.
El ADN de la sangre debe aislarse de los
leucocitos (0,3% del total de las células
sanguíneas) y debe estar libre de
contaminantes que interfieran en modelos
posteriores. Las muestras de sangre se
recogen en tubos con EDTA como
anticoagulante y generalmente, deben
procesarse inmediatamente (aunque en
algunos casos puede almacenar a 4°C). La
separación de los eritrocitos respecto de los
leucocitos se realiza vía lisis preferencial de
los eritrocitos. Después se lisan los glóbulos
blancos con un detergente aniónico fuerte,
para proseguir con un proceso general de
aislamiento de ADN (Roca, P et al., 2004).
El gran tamaño del ADN procedente de
células de mamíferos dificulta su aislamiento
y purificación. La elección del método de
extracción de ADN debe estar determinada
por el uso que se hará de la muestra, ya que
el tamaño final del material purificado
diferirá según el método. De esta forma, los
métodos muy drásticos tienden a romper el
ADN en moléculas de bajo peso molecular
(<50 kpb) y, si bien pueden ser útiles para
realizar la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y, en algunos casos, para
su aplicación en la técnica de southern blot.
Se utilizarán métodos más suaves para
obtener fragmentos de ADN superiores a 200
kpb, que son apropiados para otros
propósitos, en general, para la purificación
del ADN de células de mamíferos (Roca, P et
al., 2004).
La separación de moléculas de ácido nucleico
por el tamaño, puede realizarse por filtración
en gel sobre columnas de derivados de
dextrano, donde las moléculas menores
penetran las partículas del gen con una
extensión variable, mientras que las
moléculas mayores no quedan retenidas y
atraviesan fácilmente. Por lo tanto, las
moléculas son eluidas desde una columna en
orden decreciente respecto al tamaño
molecular (R. L. P. Adams et al.,1980).
Los métodos de centrifugado también suelen
usarse frecuentemente, entre los que
encontramos la lisis celular de E. Coli con
SDS, que posteriormente son sometidas a
centrifugado en equilibrio en gradiente de
cloruro de cesio, con el fin de separar el ADN
de todos los demás componentes celulares
formando una banda discreta (R. L. P. Adams
et al.,1980).
La purificación de los ácidos nucleicos puede
conseguirse en base a la estructura secundaria
mediante columnas de albúmina metilada
sobre tierra de diatomeas, en donde el ADN
monocatenario se liga más firmemente que el
bicatenario, o bien en columnas de
hidroxiapatita, las cuales retienen el ADN de
doble cadena mientras que permiten el paso
de cadenas simples (R. L. P. Adams et
al.,1980).
Finalmente, la purificación puede efectuarse
atendiendo a las diferencias en la
composición de bases. Un ejemplo de este
proceso es el caso del ARN de transferencia
los cuales varían en proporción de las bases,
las cuales pueden separarse por distribución
contracorriente, en tanto que los ADN de
distinta composición de bases poseen
diferentes densidades de flotación y pueden
ser resultas por centrifugación de equilibrio
en gradientes de densidad de CsCl (R. L. P.
Adams et al.,1980).
3. Aislamiento de ADN
El proceso de extracción con
fenol:cloroformo se basa en la capacidad que
tienen los disolventes orgánicos de
desnaturalizar y precipitar las proteínas en
disolución, mientras que no afectan en este
sentido a los ácidos nucleicos. Se ha
desarrollado un gran número de procesos
basados en la utilización de fenol, así como
varios aditivos que aumentan la inhibición de
la actividad nucleasa o sirven para reforzar
una desproteinización más eficaz por parte
del fenol (por ejemplo, el cloroformo). La
mayoría de métodos lleva acoplado un
proceso de lisis celular utilizando un
detergente, que además permiten la
disociación de los complejos proteína-
nucleótidos.
El aislamiento y la concentración de ADN y
ARN en disoluciones acuosas se realizan
primero eliminando los lípidos de la muestra
mediante una extracción con
fenol:cloroformo (50:50), seguida de la
precipitación con etanol de los ácidos
nucleicos , que se encuentran en la fase
acuosa. En el proceso de extracción con
disolventes orgánicos, las proteínas son
desnaturalizadas y se reparten en la fase
orgánica/acuosa. Durante la precipitación
con etanol, en presencia de sales, el fenol y el
cloroformo residual se mantienen en
disolución, mientras que los ácidos nucleicos,
en forma de sal, forman un precipitado blanco
que pueden recogerse fácilmente por
centrifugación (Roca, P et al., 2004).
Con este procedimiento se pueden precipitar
eficazmente fragmentos de ácidos nucleicos
y oligonucleótidos mayores de 15
nucleótidos. La concentración de ácidos
nucleicos debe ser al menos de 10 ug/ml;
puedes precipitarse en presencia de
contracciones más bajas, pero el proceso en
tal caso no es cuantitativo. Para precipitar
bajas concentraciones de ácidos nucleicos se
deben incubar las muestras, una vez añadido
el etanol (u otro alcohol usado para la
precipitación), a -20°C (o en hielo seco)
durante 4 horas o durante toda la noche y
centrifugar a continuación durante 30
minutos para recoger el precipitado. Para
separar el ADN del ARN contaminante, se
trata con RNasas, enzimas que degradan
específicamente el ARN, obteniendo así una
muestra pura de ADN (Roca, P et al., 2004).
Métodos generales de cuantificación de
ácidos nucleicos
● Determinación por
espectrofotometría
El ADN o el ARN pueden ser cuantificados
mediante la medición en un
espectrofotómetro de su absorbancia de luz
ultravioleta a 260 nm. En este método tiene
que hacerse uso de cubetas de cuarzo, puesto
las cubetas de plástico absorben luz en la
región UV del espectro a la que se realiza la
medición de absorbancia de ácido nucleico.
Para calcular la concentración se tiene en
cuenta la procedencia de la muestra, en la
cual se multiplica la absorbancia medida a
260 nm por diferentes factores según se trate
del ADN, de ARN o de un oligonucleótido:

● Método de tinción con bromuro de
etidio
El bromuro de etidio es un compuesto
fluorescente que se intercala entre las bases
del ADN. Cuando se produce la unión se
genera un cambio en las propiedades de
fluorescencia del bromuro de etidio,
aumentándose de forma importante su
fluorescencia en presencia de ADN. También
hay que tener en cuenta que este método es
poco sensible y, además no es específico del
ADN, debido a que el ARN también puede
interaccionar con el compuesto, esta
interferencia puede eliminarse tratando la
muestra con ARNasa.
● Método del ácido diamino benzoico
(DABA) para la determinación de
ADN
En este proceso se provoca la hidrólisis de los
desoxirribonucleicos, y las desoxirribosas
libres reaccionan con el DABA produciendo
compuestos fluorescentes, de forma que la
fluorescencia producida es proporcional a la
concentración de ADN presente en la muestra
(Roca, P et al., 2004).
Métodos de determinación de ácidos
nucleicos individuales
● Separación electroforética de los
ácidos nucleicos
Luego de que ya se hayan aislado los ácidos
nucleicos de otras biomoléculas que pueden
acompañarlos en las muestras biológicas de
estudio, lo que se debe hacer es determinar
cada uno individualmente. Al ser moléculas
que están cargadas y con tamaños
significativos se pueden separar por
electroforesis. Cuando se trata de cadenas
largas de ADN se hace necesario realizar
previamente una ruptura en fragmentos. Este
proceso se puede realizar con métodos
químicos, sin embargo, el conocimiento
sobre el funcionamiento de las enzimas de
restricción como las nucleasas que digieren al
ADN después de reconocer las secuencias
específicas de nucleótidos es así que podrían
ser utilizados para esta técnica, en
consecuencia, han ganado relevancia y a su
vez se ha provocado una sustitución en el uso
de los reactivos químicos a los enzimáticos.
Cabe resaltar que el tamaño de los
fragmentos de ADN y ARN es grande, por
dicha razón normalmente se utiliza como
base la electroforesis de ácidos nucleicos la
agarosa, aquella permite la separación de
moléculas por cribado molecular puesto que
mantienen una relación carga y masa que es
constante. Los ácidos nucleicos se pueden
visualizar cuando se tienen geles que tienen
diferentes colorantes y los tiñen, cómo
podrían ser: el bromuro de etidio, Sybr Gold,
Sybr green, etc.
8. REFERENCIAS
1. Bautista, G. R. (16 de Agosto de 2018).
Poliploidía en zarzamoras silvestres.
Obtenido de PDF:
http://www.scielo.org.mx/pdf/ns/v10n21/
2007-0705-ns-10-21-1.pdf
2. Macarulla, J. and Goñi, F., 2003.
Bioquímica Humana. 2da ed. Barcelona:
Reverté, pp.123-138.
3. R. L. P. Adams, R. H. Burdon, A. M.
Campbell, & R. M. S. Smellie. (1980).
Bioquímica de los ácidos nucleicos de
Davidson. Barcelona: Reverte.
4. Roca, P., Oliver, J., & Rodríguez, A. M.
(2004). Bioquímica: técnicas y métodos.
Helice.
5. Zita, A. (16 de Agosto de 2020).
Extracción de ADN (experimento casero).
Obtenido de Sitio Web:
https://www.todamateria.com/extraccion-
adn-experimento/