Jefe de redacción, Gilles Lefebvre

Editor científico, Vinnie Della Speranza,

Vol. XL, no 2 Diciembre de 2007 MS, HTL (ASCP) HT, MT

Tinción del Nilo Rojo como pantalla centinela para Introducción

fosfolípidos El rojo nilo, un tinte hidrofóbico fluorescente, se eligió

para demostrar la presencia de fosfolípidos en
secciones congeladas de pulmones de ratas tratadas
Diane L. Pecht, Deborah A. Litz, Carla L. Bregman, Stephen K.
con fármacos utilizadas en un estudio de toxicología de
Durham, Mark G. Mense
2 semanas. La microscopía electrónica realizada en
Departamentos de Patología y Evaluación de Seguridad de Drogas
tejido pulmonar de rata recolectado durante el estudio
Bristol-Myers Squibb Company Syracuse, NY
mostró la presencia de cuerpos membranosos
lamelares (multilamelares) o mielinoides, compatibles
con los observados con fosfolipidosis. Con base en
diane.pecht@bms.com estos hallazgos, la tinción con rojo del Nilo se puede
usar como una detección de fosfolípidos simple, rápida
y económica.

Materiales y métodos

Se administró diariamente una sustancia de prueba por sonda

a las ratas Sprague-Dawley durante 2 semanas. Al final de la
dosificación, los tejidos seleccionados se recogieron en la
necropsia y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%.

EN ESTE ASUNTO
Tinción del Nilo Rojo como pantalla centinela para
fosfolípidos. . . . . . . . 25

Controles de microarrays de tejidos para demostrar

los componentes del tejido conectivo. . . . . . . . . . . . . .
28

Metodología técnica en el procesamiento de

lesiones melanocíticas en el laboratorio de
Mohs. . . . . . . . . . . . . . . . 32

Recuperación de antígeno de baño de agua a alta

temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . 35

Los nuevos requisitos de fijación para muestras de

tejido mamario alterarán las prácticas de fijación en
los laboratorios de patología quirúrgica en 2008. . 38

Fig. 1. Sección congelada fijada en formalina de tejido pulmonar de rata teñida con rojo Nilo. El tejido pulmonar provenía de ratas que recibieron
altas dosis de una sustancia de prueba. Los fosfolípidos aparecen como puntos calientes brillantes, de color rojo anaranjado. 400 X
Marca tu calendario . . . . . . . . . . . . . . . 41

HISTO LÓGICA, Vol. XL, no 2 25


Fig. 2. Examen microscópico de una sección de pulmón teñida con H y E de una rata de dosis alta. El pulmón embebido en
parafina y con formalina reveló un mayor número de macrófagos altamente vacuolados en los alvéolos pulmonares. 100 X
Durante la evaluación microscópica ligera de secciones
de pulmón embebidas en parafina teñidas con
hematoxilina y eosina (H&E), se observó un mayor
número de macrófagos altamente vacuolados en los
alvéolos pulmonares de animales tratados con drogas.
Se usaron tinciones adicionales tales como O rojo aceite y
rojo Nilo para caracterizar aún más el contenido vacuolar
de los macrófagos en los pulmones de las ratas de alta
dosis. Las secciones de pulmón de ratas tratadas con
vehículo sirvieron como controles. Para el procedimiento
de tinción con rojo del Nilo, se insertaron secciones de
pulmones fijadas con formalina en Tissue-Tek ® Compuesto
OCT (temperatura de corte óptima) (Sakura Finetek,
Torrance, CA), seccionado a 4-5 µm en un criostato, y
teñido bajo condiciones oscuras con una solución de rojo
Nilo. Luego se examinaron las secciones con un
microscopio fluorescente Nikon usando un filtro de
rodamina (longitud de onda ~ 540 nm).
26
El hallazgo de fosfolípidos se confirmó aún más por
microscopía electrónica de macrófagos pulmonares
altamente vacuolados. Se observaron laminillas
membranosas (cuerpos mielinoides), que fueron
consistentes con la fosfolipidosis.
Tinción
Rojo Nilo (9-dietilamino-5H-benzo [ una]-
phenoxazine-5-one) es un colorante de fenoxazona
que fluoresce intensamente, y en una gama de colores,
cuando está en contacto con solventes orgánicos y
lípidos hidrofóbicos. 1 El tinte se ha utilizado para
distinguir entre células normales y células que
contienen acumulaciones lisosomales de fosfolípidos.
El color de la fluorescencia observada depende
directamente de la hidrofobicidad del entorno
circundante. Esta propiedad única del rojo Nilo permite
la tinción tanto de lípidos neutros (color amarillo
dorado) como de fosfolípidos (color rojo anaranjado),
cuando se utiliza un paquete de filtro apropiado. 2
HISTO LÓGICA, Vol. XL, no 2
Se preparó una solución madre de rojo Nilo (500 . En este estudio, la microscopía electrónica demostró
µg / ml) en acetona y se diluyó con glicerol cuerpos mielinoides consistentes con una degradación
acuoso al 75% a una concentración de 2,5 µg / incompleta de fosfolípidos derivados de células (el sello
ml. 3
distintivo de la fosfolipidosis) en secciones de pulmón
fijadas en formalina de animales tratados con drogas. La
El siguiente procedimiento se usó para teñir
tinción con rojo nilo de secciones pulmonares congeladas
secciones de pulmón congeladas para demostrar
de los mismos animales también demostró fosfolípidos
fosfolípidos:
fagocitados en macrófagos alveolares espumosos, pero en
1. Corte el tejido congelado a 4-5 micras.
un tiempo más corto y con menos gasto que el requerido
2. Enjuague las secciones en agua desionizada durante 1-2 con microscopía electrónica. El método de tinción con rojo
minutos. del Nilo utilizado en este estudio demostró claramente la
presencia de fosfolípidos. Este método demostró ser un
3. Coloque 1 gota de solución de tinción de Nilo rojo
procedimiento simple, rápido y económico que se puede
/ glicerol sobre el tejido y el cubreobjetos.
usar como una detección centinela de fosfolípidos en
Nota: Maneje las soluciones rojas del Nilo y futuros estudios en los que se sospeche fosfolipidosis
realice la tinción con iluminación tenue. inducida por fármacos. Luego se puede solicitar
microscopía electrónica y otras manchas especiales para
confirmar aún más este hallazgo.
4. Teñir durante 5 minutos y examinar los portaobjetos
con un microscopio fluorescente.
Resultados
El aspecto microscópico claro de la histiocitosis
pulmonar, caracterizada por la presencia de
Referencias
macrófagos vacuolados dentro de los alvéolos, se
presenta en la Figura 2. La Figura 1 muestra una 1. Kao YC, Lichtenberger LM. Organelos que contienen lípidos fosfolídicos y
tinción roja del Nilo positiva para los histiocitos neutros de células mucosas gastroduodenales de rata: posible origen del
revestimiento de la mucosa hidrofóbica.
pulmonares, lo que indica que la fosfolipidosis es el Gastroenterología 1991; 101 (1): 7-21.
mecanismo subyacente para la histiocitosis. El 2. Brown WJ, Sullivan TR, Greenspan P. Tinción con rojo Nilo de inclusiones
diagnóstico de fosfolipidosis se confirma por la de fosfolípidos lisosomales. Histoquímica
1992; 97 (4): 349-354.
evidencia microscópica de transmisión electrónica de
3. Fowler SD, Greenspan P. Aplicación de Nile red, una sonda hidrofóbica
la acumulación de cuerpos multilamelares dentro de fluorescente, para la detección de depósitos de lípidos neutros en secciones de
los histiocitos (Fig. 3). tejido: comparación con aceite rojo O.
J Histochem Cytochem. 1985; 33 (8): 833-836.
Conclusión
La fosfolipidosis es un trastorno de almacenamiento
de lípidos en el cual el exceso de fosfolípidos se
acumula dentro de las células. Se sabe que algunos
fármacos anfifílicos catiónicos tienen el potencial de
inducir la producción de fosfolípidos. Esta condición
de fosfolipidosis se caracteriza por una acumulación
Fig. 3. Pulmones de rata tratados con fármacos en dosis altas fijados con formalina. Los macrófagos alveolares están llenos de cuerpos
intracelular de fosfolípidos y el desarrollo concurrente
multilamelares (flechas rojas) y ocasionalmente una gota de lípidos (L). La estrella blanca denota un núcleo de un neumocito.
de cuerpos lamelares. El mecanismo principal
responsable del desarrollo de la fosfolipidosis es una
inhibición de la actividad de la fosfolipasa lisosómica
por el fármaco.
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