Вы находитесь на странице: 1из 245

т ОТЕХНОЛОГИЯ

ИКРООРГАНИЗМОБ
$С л u P i £C> <7)7 %
i

6 28 612714
A51 Алмагамбетов К. X.
Биотехнология микроорганизмов
2008 800.00

rJP4o\
* «Lс
Й54

АЛМАГАМБЕ ГОВ К.Х.

БИОТЕХНОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМ ОВ

Астана - 2008
2

БКК 30.16
А 51

ISBN 9968-31-240-0

Рецензенты: д.б.н., проф. А.А. Жубанова


д.б.н., проф. С.А. Абиев

А 5 1 Алмагамбетов К.Х. Биотехнология микроорганизмов. - Астана,


2008 - 244 с.

В книге изложены материалы о применении микроорганизмов и их мета­


болитов в различных отраслях промышленности.
Для бакалавров, магистрантов и молодых специалистов в области
биотехнологии микроорганизмов.

С.Торайгыров
V*• ( Vkuni M^wat
атындагы ПМУ-д1н |
|демик С.Бейсембаег I
агындагы рылыми

ISBN 9968-31-240-0 ББК 30.16

© Алмагамбетов К.Х., 2008


С Евразийский национальный университет им. Л. Гумилева, 2008
3

ОГЛАВЛЕНИЕ

ЧАСТЫ

Глава I. Микробиолог на основа биотехнолог ии микроор! анизмои....7


Микроорганизмы определяю! биотехнологический процесс 16

Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии............... 11


2.1. Бактерии........— ........ ---------- ------------------ ........ - 19
2.2. Актиномицеты.................. ......................................... .... 23
2.3. Дрожжи.................................... ........................— ........ 24
2.4. Грибы.......— .................................... .............—— .....27
2.5. Рост и размножение.................. .......... ......................— 30
2.6. Требования, предъявляемые к промышленным
микроорганизмам................... .......................................35
2.7. Мутагенез и селекция........... ........ ..... .......................... 38
2.8. Технология рекомбинантных ДНК................................ 45

Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью ... 55


3.1. Живые микроорганизмы, микробная биомасса..............56
3.2. Иммобилизованные и генетически модифицированные
микроорганизмы ................. —.......................................63
3.3. Микробные метаболиты....... ............ ............................66
3.4. Биотрансформация......... ........ ..............—....................70

Глава 4. Ферментационная технология.......... .— ..... .......................... 72


4.1. Субстраты ферментации-----.................. ................ ......74
4.2. Ферментация........... ............ ................................... — 79
4.3. Биореакторы...................................................................84
4.4. Эффективность ферментации .....— .—................ .......87
4.5. Выделение продуктов микробного синтеза....... —....— 89
4.6. Стабилизация и хранение целевого продукта................ 95

ЧАСТЬ II

Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии.................. 100


3.1. Микробная биомасса в качестве пищевой
и кормовой добавки ........................................... .....— 100
5.2. Микроорганизмы в качестве вакцин......... .................. 107
5.3. Пробиотики........ .... ......-----------------------------------112
5.4. Микроорганизмы стимулируют рост растений.............115
5.5. Микроорганизмы и биоремедиация................................ 123
5.6. Микробные биопестициды.............................................. 126
5.7. Бактерии выщелачивают металлы из р у д .......................129
5.8. Очистка сточных вод активным илом............................. 131

Глава б. Брожение........................................................................................137
6.1. Спиртовое брожение.........................................................140
6.2. Молочнокислое брожение............................................... 148
6.3. Органические кислоты.......................................................153

Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая


продукция.....................................................................................
7.1. Ферменты.............................................................................^ 0
7.2. Антибиотики...................................................................... *
I по
7.3. Витамины.............................................................................1
207
7.4. Полисахариды.................................................................... ”
7.5. Аминокислоты................................................... ..............
7.6. Микроорганизмы синтезируют человеческие белки..... 225

Г л ава 8. Микробиологическая трансформация органических ^


соединений ...........................................................................
......................... 238
Указатель микроорганизмов....................................................
5

Рис. I. И м б ^ и м м к б ш п ч ш и и т ш г а ирммвса т р а с с р м м м м
ш г ш т т t ip n ta M
О пш mv ф цраикгм м Ьыт п м г ш ш т • ^ а м ж ш , « и м * л и и ш г я у ш w
N M M l U H i l l M i и « ^у м ц и и» ' на р л у шпм и м Ыфк »*фс и» «шттсинЛ грабшады V Я Ш А
1Л1ирм*мой 2460 г • *» Э м Ц м м ф « м я т а « И к • п а н а И ммммммвм и) м f * »
см ваМ ии
(««fee м га м или ш—щ - ^ ш т м у н р м т ш т « М в ) В щтятт разу нгпт ) шт
ш и — uNyi l ryylar» ммтт в ми» « п я т v m —мм нум д/м ^ р к г м и ■ млммимим
Ф т урм н n i y t и н т м и аам м ч т и • я т т и м иивш р п м и й ферм* Гибели
я т м м м м м M M ve им4м» • я м Пмр* вм1рм м * мрммямв мм: <ммй M i •
м м м M M *i yn i I ямш, t spyreft гмм м «дра I мнимм ршду м * м м м м 1
И |м и м < чан. сгомммА м явмггмм, мммммв я смруммгм • м м мфемг> Посте 1р м м •

MMI, мяум'1 М М М П ПНММА И «СТМИМВТ м «(МММ П


лил бютсумра f M i M . M R M M tt « —шум м имг%у фр*гмм ■ м м ^ м м ^ wpm . ммммг ■
®ММ§ «МММ ММММьМММ МММ ИШ МММ МКММ ДрМКМ ДМММ ммммры ммммммм м м и ^
М> M ftM М М , M M f M М9 KMV «MNMMMM'I фмиимм. ошшршлят. м р м т м . т \7% спирта
(А Дм » М>. Н Сm im im . 1«М*
Период физиологии микроорганизмов
1857 г. Процесс брожения.
1860 г. Самопроизвольное зарождение.
1865 г. Болезни вина и пива.
1868 г. Болезни шелковичных червей.
1881 г. Инфекция и вакцина.
1885 г. Предохранение от бешенства.
Метод чистых культур (Р. Кох, 1843-1910)
Внедрение чистых культур в промышленные техно­
логии (Э. Гансен).

Л. Пастер Период ферментационных технологий


(1 8 2 2 -1 8 9 5 ) производство:
1896 г. Нитрагин
1914 г. Микроорганизмы активного ила
1939 г. Пенициллин
1938 г. Микробные инсектициды
1945 г. Стрептомицин
технологии:
1913-50 гг. - Теоретические основы кинетики
ферментационных процессов (Моно, Михаэлис-
Ментен),
1941 г.-Глубинная ферментация
1957 г. —Непрерывная ферментационная техно-

Молекулярно -генетический период


Мутагенез и селекция:
1943 г. Мутагенез бактерий (С. Лурия, М. Дельбрюк)
1944 г. Трансформация бактерий in vitro (О. Эвери,
К. Мак-Леод, Мак-Карти)
1946 г. Конъюгация микроорганизмов (Дж. Ледер-
берг, Э. Тейтем)
1952 г. Трансдукция микроорганизмов (Н. Цендер,
Дж. Ледерберг)

Технология рекомбинантной ДН К:
1953 г. Структура ДНК (Дж. Уотсон, Ф. Крик)
1972 г. Синтез рекомбинантной ДНК (П.Бэрг и
сотр.)
1973-1977 гг. Плазмидные векторы (С. Коэн,
Д. Хелински, Ф. Боливар и Р. Родригес)
1979-1982 гг. Экспрессия генов соматотропнна,
инсулина, интерферонов в прокаритах
1983 г. Амплификация ДНК, ПЦР (К. Мюллис)
7

ЧАСТЬ I
ГЛАВА 1. М икробиология - основа био гкхнаю гии
МИКРСЮР1АНИJMOB

Микробиолог ня наука о бножм ичсских свойствах, генетике,


'экологии микроорганизмов, их роли в жизни природы, человека,
животных и растений. Термин микробиолог ия (micros, bios, logos)
предложил ученик JI. Пастера >миль Дюкло. Кстати и название
ферментов в 189Х году предложено им же. а именно по веществу,
на которое фермент действует с добавлением окончания магам
(на крахмал амилаза, на липиды - липаза, на протеин протееia
и т.д.).
Излагая историю микробиологии ее общепринято начинать с
А. Левенгука, описавшего мельчайшие живые существа («ан и маль­
ку л и» - зверюшки) в капле дождевой воды, слитие, гнойном
Отделяемом и др. Эго описательный, морфологический период
анализа внешней формы мельчайших существ (кокки, палочки,
извитые формы).
Второй период развития микробиологии, физиологический или
жолого-фи шологический знаменателен изучением биологических
свойств микроорганизмов, определением их значения в развитии
инфекционных болезней (медицинская и ветеринарная микробио­
логия), роли почвенных микроорганизмов в минерализации орга­
нических веществ, нитрификации и азотфиксации, организацией
их сообществ а различные биоценозы, познанием симбиотических
взаимоотнош ений рнзосферной микрофлоры с бобовыми
растениями (сельскохозяйственная микробиология).
Начинается этот период с исследований Л. Пастера, доказав­
шего, что брожение вина и пива отнюдь не химический процесс,
что оно обусловено размножением микроорганизмов (масляно-
кислое, спиртовое, молочно-кислое брожение и др.). Им открыт
способ получения живых вакцин путем целенаправленного
ослабления (аттенуации) вирулентности возбудителей сибирской
язвы, бешенства.
8 Глава 1. Микробиология - основа биотехнологии микроорганизмов

Методом пастеризации, стерилизации были побеждены


болезни вина и пива, порча молочно-кислых продуктов. Это было
подавление брожения, это был успех микробиологии, но и начало
ферментационной биотехнологии, начало последующей
разработки технологий стимуляции, регуляции и использования
брожения в производственных условиях.
По вопросам бродильного производства - виноделию, пиво­
варению и получению уксуса Л. Пастером опубликованы 3 моно­
графии, в которых излагаются также пути улучшения технологии
этих процессов.
Живая сибиреязвенная вакцина предупреждала развитие
сибирской язвы, вакцина против бешенства спасла тысячи жизней
больных, заразившихся этой грозной инфекцией. Это триумф
микробиологии, но и начало разработки технологий вакцинных
препаратов.
Кстати, чуть позже, подтвердив роль дрожжевых клеток в
спиртовом брожении, Э. Бюхнер показал, что брожение может
быть вызвано просто экстрактом дрожжевых клеток, т.е. фермен­
тами микроорганизмов. Биохимия микроорганизмов берет свое
начало с подобных исследований.
Безусловно, и для микробиологии и для биотехнологии фунда­
ментальна разработка Р. Кохом и его ученика Хессе (использо­
вание агар-агара при приготовлении питательных сред) техно­
логии выделения чистой культуры микроорганизмов. Непременное
условие для научных исследований в области микробиологии, для
биотехнологического производства - работа с монокультурой.
Говоря о чистой культуре микроорганизмов, нельзя не сказать
о микробиологе из Пастеровского института в Париже Ж. Моно
(удостоенного Нобелевской премии за открытие вместе с Ф. Жакобом
роли ДНК и РНК в синтезе белка), который показал динамику и
основные стадии (логарифмическая, экспоненциальная, стацио­
нарная и отмирания) размножения микроорганизмов в жидкой
питательной среде, составил уравнение математического расчета
кинетики размножения (уравнение Моно) и сегодня используемое
в ферментационной технологии.
Пожалуй, один из примеров быстрого применения достижений
почвенной микробиологии в агротехнологии следующий. В 1888 году
голландский ученый М. Бейеринк выделил из ризосферы растений
Глава I. ЫыцриЬыч ю,'ия - м м ш Immmiiimmmi wmrjrwy ы'гм■ы п

в чистой культуре клубеньковые бактерии, Б. Франк дал им


название R hizohium (эти бактерии в сим биозе с бобовы ми
растениями фиксируют молекулярный, атмосферный азот). А в
1896 году ь Германии Ф. Ноббе и Л. Гильтнер разработали на
основе клубеньковых бактерий биопрепарат нитрагин в качестве
биоудобрения. К.А. Тимирязев (1998 г.) писал по этому поводу:
«Едва ли в истории найдется много подобных открытий, которые
были бы таким благодеянием для человечества, как включение
клевера и вообше бобовых растений в севооборот, так параш»
телыш увеличивших производительность труда земледельца».
Биотехнология микроорганизмов довольно продолжительное
время была в состоянии «брожения» (промышленная ферментация
антибиотиков, аминокислот; получение этанола, o p iанических
кислот). Особо значима в раимиии промышленной биотехнологии
роль антибиотиков.
В 1928 i оду А Флемиш открыл пенициллин, в 1934 i оду
1 . Флори и J. Чейн получили стабильную форму антибиотика, в
1941 году начат промышленный выпуск пенициллина.
В 1943 году почвенный микробиоло! 3 Ваксман выделил
стрептомицин, в 1945 ю ду 1 . Ьрогц цефалоепорин С и т.д.
'Jpa антибиотиков рождена микроор!аниш ами, среди сотен
биопродуцентов особо выделянлся мицелиальные i рибы Рет-
ciUium chrysogenum (пенициллин), t ephalonponnum acrt-monium
(цефалоепорин С), актиномицеш Strepwmycc.\ хрр (стрептомицин
н др.), балерин Bacillus */»/» (полимиксин, 1'рамицилин и др.).
С елекционированны е прои 1 водс i венные штаммы и их
микрооргаии шов продуцирую! в сошн pai больше ашибиотиков,
нежели исходные штаммы дикою типа.
Во второй период развития микробиологии было открыто и
описано множество микроор!анитмов. выделенных hi почвы,
воды, кишечника человека и животных, ри««сферы растений и др
Среди них была и кишечная палочка, выделенная из фекалий
щорового ребенка в 1885 году немецким педиатром Теодором
Эшерихом (палочка обыкновенная Вас leria communis, так cl
наи<ал ученый). В последующем ей было дано таксономическое
название Escherichia coli. Она хорошо знакома в микробиологии
как представитель нормальной микрофлоры кишечника человека
и животных, участвует в пищеварительном процессе, синтезе
10 Глава I. Микробиология - основа биотехнологии микроорганизмов

витаминов группы В, некоторые её


подвиды, серологические варианты
вызывают кишечные инфекции.
В 1888 году ф ранцузский врач
Е. Масе предложил считать Е. coli
показателем фекального загрязнения
сточных вод. С тех пор в санитарной
микробиологии Е. coli один из самых
основных санитарно-показательных
микроорганизмов. Ну, а так в целом
она в микробиологии рядовой микроб
(рис. 2).
Но в биотехнологии, молекулярной
Рис. 2. Электронная биологии, генетической инженерии,
микрофотография технологии рекомбинантны х ДНК
Escherichia coli. кишечная палочка совсем не простой
микроб, а великий труженник.
В 1946 году Дж. Ледерберг и Э. Тейтем впервые описали конъю­
гацию - один из путей рекомбинации, перенос генетического
материала из одной клетки в другую при помощи плазмид у
Е. coli. Это один из основных механизмов передачи антибиотико-
резистентности между микроорганизмами.
В 1952 году Н. Циндер и Дж. Ледерберг описали явление
трансдукции - проникновение умеренных фагов, в клетки Е. coli.
Явление трансформации фрагментов ДНК в клетку - реципиент
было изучено на пневмококках (Гриффитс 1928 год in vivo,
О. Эйвери, К. Мак - Леод и М. Мак-Карти 1944 год in vitro).
Описание механизмов конъюгации, трансдукции и трансформации
генетического материала уже тогда обозначило будущую роль
плазмид и бактериофагов в качестве векторов в технологии
рекомбинантных ДНК.
В 50-е годы прошедшего столетия был разработан один из
первых биопрепаратов - пробиотик колибактерин на основе
Е. coli штамм M l7 .
В 1961 году Ф. Жакоб и Ж. Моно на основе исследования гене­
тики и биохимии механизма усвоения лактозы клетками Е. coli
К 12 предложили гипотезу о регуляции активности генов у
Глава I. Микробиология - встала б ш /т п ш ш и ш никрооргини'^мов II

бактерий, получившую широкую известность и всеобщее приз­


нание, как «модель оперона». Согласно этой модели на бакте­
риальной хромосоме имеется, но крайней мере - 4 компонента
системы регуляции транскрипции: структурный ген (или гены,
контролирующие взаимосвязанные биохимические функции), ген
регулйтор, оператор и промотор, которые вместе составляют
оперой. Гей регулятор определяет структуру белка - репрессора.
В 1972 году II. Бергом с соавторами получена т vitro первая
рекомбинантная молекула ДНК (путем соединения ДНК фага
лямбда Е. coli и кольцевой ДНК обезьянего вируса SV 40).
В 1972 году И.Е. Мери и Р.В. Дэвис выделили из E.coli фермент
рестриктазу EeoR 1 (это «хирургические ножницы» в i енетической
инженерии).
В конце 1970-х - начале 1980-х годов получен лейкоцитарный
интерферон человека, синтезированный в E.coli
Действительно, кишечная палочка была и остается одним из
основных объектов генетических исследований, она среди немно­
гих микроорганизмов, у которых полностью расшифрован геном.
Вместе, с тем E.coli не стала микроорганизмом сверхпро­
дуцентом. Причинами этого являются не способность кишечной
палочки активно вы делягь белок в среду культивирования,
метаболиты накапливаются внутри клетки; наличие в клеточной
стенке липополисахаридного комплекса, обладающего пироген*
ностью, большое число эшерихиозных вирулентных фагов. Она
хороша в лабораторных экспериментах, но не на производст­
венной площадке.
Не будет преувеличением, если сказать что Е coli явилась
коньюгационным мостиком между вторым и третьим периодом
развития биотехнологии микроорганизмов.
Успехи развития третьего периода, периода молекулярно -
генетических исследований, генно-инж енерных технологий
немыслимы без участия Е. colt, Saccharomvces cerevisiae, Bacillus
subtilis и др.
Зарождение, а впослсдствие и развитие генетической инже­
нерии начинается с 1943 года, когда С.Э, Лурия и М. Дельбрук
определили наличие мутантов и мутаций среди бактерий.
Описывая историю бактериальной генетики в 1969 году,
С.Э. Лурия писал: «194V46 гг каменный век. 1946-53 гг.- брон-
12 Глава 1. Микробиология - основа биотехнологии микроорганизмов

зовый век, 1953-61 гг. - золотой век и настоящее ужасное время -


огромное количество сообщений о плазмидах, меняющих фено­
тип, роль транспозонов, JS-элементов ... как они себя ведут при и
после рекомбинации ...».
Безусловно технологии рекомбинантной ДНК не было бы
вообще без выяснения молекулярной структуры ДНК (Дж. Уотсон
и Ф. Крик, 1953).
Генно-инженерные работы связаны с разрезанием и сшиванием
фрагментов ДНК при помощи рестриктаз (1970 г.) и лигаз (1967 г.).
Рестриктазы или рестрикционные нуклеазы —это ферменты спо­
собные узнавать специфическую последовательность ДНК и
расщеплять его в строго определенных местах. До выделения и
изучения свойств этих ферментов, ещё 1953 году С.Э. Лурия,
Г. Бертани и Дж. Уэйгл писали о наличии ферментной системы
рестрикции и модификации ДНК. Позже, в 1960-х годах швей­
царский биохимик В. Арбер описал некоторые свойства рестрик­
таз. В начале 1970-х годов Герберт и Бойер установили сайт -
специфичность рестриктаз.
Помимо ферментной системы в генетической инженерии нужна
система переноса и экспрессии чужеродный ДНК в реципиентной
клетке, т.е. вектор. Первый плазмидный вектор pSC 101 разра­
ботан в 1973 году С. Коэн, в 1974 году Д. Хелински - другой
плазмидный вектор Col El, которые имели по 1 сайту узнавания
рестриктазы Eco R1. Сегодня в генно-инженерных исследованиях
более широко используется вектор pBR 322. Вектор создан в
1977 году на основе плазмы E.coli Ф.Боливаром и Р. Родригесом
(р-плазмида, В-Боливар, R-Родригес, 322-номер протокола экспе­
риментов). В нем сохранены от плазмиды Col El мультикопий-
ность и способность к амплификации в присутствии хлорамфе-
никола, от плазмиды pSC 101 ему передана устойчивость к
тетрациклину, от других плазмид - устойчивость к ампициллину;
эта полирезистентность к антибиотикам нужна при селекции
рекомбинантного штамма и для его маркировки.
В 1977 году Г. Бойер с соавторами при помощи лактозного
промотора впервые осуществили экспрессию эукариотного гена
гормона соматостатина в бактериальной клетке.
Наряду с мутагенезом и селекцией для улучшения продуци­
рующей способности промышленных микроорганизмов, раз-
I t ив и I. М икробио.ю гип - основа биот ехнологии и икроорган ионов IS

работайы генно-инж енерны е технологии, нацеленные на увели­


чение числа копий, усиление ам плификации генов, детерм ини­
рующих синтез целевого продукта.
Классический путь получения сверхпродуцента заключается в
п оэтапном м у таген езе с пом ощ ью ком бинации ф изи чески х и
химических мутагенов с последующей селекцией штамма. 1 енно-
и нж енерная техн ология позволяет кон струи ровать ш там м ы -
продуценты с новыми биологическими свойствами.
Так, в 1974 году был успеш но клонирован тригпоф ановы й
оперой E .c o li в с о с т а в е п л азм и д ы , б л а го д а р я этому си н тез
ферментов тригпофанового оперона в клетках зшерихнй, содер­
жащих гибридную плазмиду резко возрастал. Если дикие штаммы
могут содержать I -30 копий генетического материала, то г енно-
инженсриые технологии позволяют увеличить их число до 3000
и более.
П оследую щ ее знаменательное собы тие а генно-инж енерной
технологии это разработка способа амплификации фрагментов
ДНК ш vitro, полимеразная цепная реакция (К. Мюллис. 1983).
Р а с ш и ф р о в к е i е н о м а ч е л о в е к а п р е д ш е с т в о в а л и р аб о ты
Б. Кораны, в конце 1960-х i одов определившие обшие принципы
синтеза двунитевых фрат ментов ДНК; исследования Ф. Сэнтера
(1975 г., ферментативный синтез Д Н К ) и А. М аксама с У. Гил­
бертом (1977 г., химический синтез ДНК). Ли технологии позво­
ляют анализировать первичную структуру ДНК или последователь­
ность нуклеотидов, образующих фрагмент ДНК.
Конструирование синтезаторов (1980 г.) и секвенаторов (1982 г.)
ген о в , п о зво л и л и в а в то м а ти ч ес к о м р еж и м е с и н т е зи р о в а т ь
н еб о л ь ш и е ф р агм ен i ы Д Н К и о п р е д е л я т ь н у кл еоти д н ую
последовательность в искомой молекуле ДНК
В своей статье «Молекулярная биология в 2000 году» Ф.Крик
(1970 г.) писал о весьма вероятной возможности развития живой
природы с участием особых специфических механизмов ускорения
темпов эволюции, имея в виду технологии генетической реком­
бинации, модификации и реконструкции ДНК
История интенсивного развития биотехнологии микроорганиз­
мов наряду с фундаментальными исследованиями в микробио­
логии, генетике и биохимии отождествляется с созданием новых
приборов и аппаратов, ра зработкой современных технологических
14 Глава 1. Микробиология - основа биотехнологии микроорганизмов

линий, совершенствованием инженерно-конструкторских реше­


ний в работе с биообъектами.
Задача инженерной технологии заключается в обеспечении
непрерывного процесса от культивирования микроорганизмов до
выделения, очистки и стабилизации конечного продукта комп­
лексом оборудования, в первую очередь ферментерами, сепара­
торами и сушильными агрегатами. Становление микробиологичес­
кого производства в 1960-80-х годах ассоциируется с фер­
ментационной технологией, с огромными промышленными
ферментерами, объёмами в десятками и сотни тысяч литров,
стоящие под открытом небом, работающие в непрерывном
режиме в течение нескольких суток и недель.
Теоретические основы культивирования бактерий в непре­
рывной культуре, в хемостатных условиях были заложены в
работах Моно, Новика и Сциларда, опубликованных в 1950 году.
В 1957 году был разработан способ непрерывного культиви­
рования дрожжей с использованием нескольких, последовательно
размещенных биореакторов, в которых поддерживались различ­
ные показатели физико-химических параметров (pH, t°C, рО, и
др.), существовала некоторая разница в концентрации субстратных
ингредиентов.
Затем была реализована система проточной, беспрерывной
подачи субстрата и выемки культуральной массы из ферментера;
совершенствовались биореакторы периодического и непрерыв­
ного действия (сама конструкция аппарата, системы аэрации,
стерилизации и регулирования температурного режима,
контрольно-измерительные датчики и др.). Предваряло созданию
аппарата логико-математическое моделирование процесса микро­
биологического синтеза; совершенствовались математические
формулы и уравнения зависимости скорости биосинтеза конеч­
ного продукта от субстрата и от активности фермента (Моно,
Михаэлиса-Ментен и др.), необходимые для моделирования
реальной динамики, кинетики роста микробной массы, для
изначально более правильного масштабирования биотехнологи­
ческого процесса.
В ранний период микробиологического производства суще­
ствовала практика монтажа аппаратно-технологических схем из
Глава I. Микробиология м ш м бинте кыаюгии мипроори а ни шов 15

о тд ельн ы х един и ц о б о р у д о в ан и я, к он трол ьн о -и зм ер и тел ьн ы х


приборов, трубопроводов, что создавало определенные трудности
при их комплектации в единую 1ехнологическую линию , задер­
живало своевременный и полномасштабный запуск производства.
Сейчас выпускаются готовые технолог ические линии, укомплек­
тованные взаимно адаптированной основной и вспомогательной
аппаратурой.
О тправны м пунктом запуска в в о д о в м и кроби ологического
Производства были разработанны е принципы масш табирования
технологического процесса, принципы стерилизации и поддер­
ж ания асеп ти чески х условий, методы пен о гаш ения, внедрены
дифференцированные режимы ферментации, когда разные >тапы
р оста б и ом ассы ц ел есооб разн о о су щ еств л ять при р азли ч н ы х
т е м п е р а т у р н ы х р е ж и м а х , pH , к о н ц е н т р а ц и и с у б стр а тн ы х
иш редиентов, внесения метаболит ов-предш ес гней н и ков и др
Вместе с тем продолжается соверш енствование технологичес­
ких условий рентабельного ф ункционирования метаболической
системы живой клетки, включая гомогенизацию среды культ иви-
рования, концентрации растворенного кислорода и углекислоты,
метаболитов и субстрат ных компонентов. В целом же конструкция
и принцип работы биореакд ора достаточно консервативны, как и
приборы для грубой очистки и сушки биопродукта (к примеру,
п рибор для ц е н т р о б е ж н о ю раздел ен и я твердой би ом ассы от
к у л ьту рал ьн ой ж идкости сеп ар ато р и зобретен Густавом де
Л аваль ещ ё в 1896 г. и до сих пор успеш но прим еняется). Но
ап п ар атура, техн ологи я тонкой очистки кон ечн ого продукта,
особенно предназначенного для медицинских целей, постоянно
соверш енствуется, разнообразна и высокотехнологична.
Т ех н о л о ги я р е к о м б и н а н т н о й Д Н К тр еб у ет и н ж е н ер н о го
обеспечения процесса переноса и экспрессии чужеродной ДНК в
реципиентной клетке. Высокотехнологичное оборудование (ПЦР
анали з, а м оди ф и катор, электроф оре™ ые кам еры , ееквенатор,
синтезатор и др.) обы чно лабораторного масш таба, оснащ енное
современными компьютерными программами обязательно допол­
няется биологическими инструментами высокоспецифическими
ф ерментными системами, обеспечиваю щ ими тончайш ие вмеш а­
тельства в молекулу ДНК (рестрикташ , лигазы. полимеразы, в том
числе термостабильные, щелочная фосфата за и др.).
16 Глава I. Микробиология - основа биотехнологии микроорганизмов

Микроорганизмы определяют биотехнологический


процесс
Биотехнологическая система, состоящая из биообъекта, сырья
(субстрата), и технологических условий, оборудования создается
для производства определенного продукта. Образуется продукт
в результате процессов брожения, биосинтеза или биотранс­
формации. Среди биологических объектов в первую очередь
следует назвать микроорганизмы, на биопродуцирующей
активности которых построено большинство функционирующих
крупномасштабных биотехнологических производств.
В биотехнологической системе микроорганизмы являются
центральным звеном, а аппаратурное обеспечение технологи­
ческого процесса, выбор субстрата определяются с учётом
особенностей их биологических свойств, их ферментации.
Микробная клетка эволюционно сложилась как биологическая
система, всецело функционирующая с целью выживания,
воспроизводства, сохранения вида, популяции. Плесневые грибы
и дрожжи, бактерии и актиномицеты, находящиеся в постоянном
взаимодействии с биотическими и абиотическими факторами
окружающей среды, под влиянием естественного отбора наиболее
рационально адаптировались к условиям своего существования и
к конкуренции, симбиозу с другими видами, но никак не к
сверхпродукции какого-то одного метаболита.
Для того чтобы приспособить, перестроить, обменные про­
цессы в микробной клетке на сверхсинтез какого-то метаболита
необходимы глубокие знания генетики, биохимии и физиологии
микроорганизмов.
В микробиологии традиционно, со времени её зарождения
постоянно и всесторонне исследуются физиологические и
биохимические аспекты взаимодействия микроорганизмов между
собой, с организмом человека, животных и растений, влияние
факторов окружающей среды. Одновременно совершенствуется
техника выделения и культивирования микроорганизмов,
создаются специальные и элективные питательные среды с учетом
особенностей метаболизма, питания и дыхания микробной клетки,
улучшаются условия поддержания чистоты выделенной культуры.
Глава I. Микробиологии - m w m ouomex«ш л и микроор.-ими imou 17

Методические и методологические основы, которые заложены


в микробиолш ии, а именно - особое внимание к исследованию
биологических свойств микроор! анизмов, создание надлежащих
условий культивирования /л w /ro, тщательный анализ влияния
состава питательных сред, температурного режима, pH и т.п. на
рост и размножение, сохранение стабильности видовых признаков
в полной мере востребованы в биотехнолог ии микроорганизмов.
Вместе с тем в биотехнологии микроорганизмов доминирует
особая зад ач а, закл ю чаю щ аяся в усилении, м н огократн ом
увеличении природной способности микробных клеток синте­
зи р о вать тот или иной м етаб о л и т, б и оло ги ч еск и акти вн ое
соединение, востребованное в человеческой деятельности. более
того, путем генно-инженерных технологий получать особо ценные
эукариотные белки, используя прокариотную метаболическую
систему.
П реим ущ ественное использование в качестве биообъект а
микроорганизмов основано на следующих критериях быстрый
рост и размножение микроорганизмов, многообразие метаболи­
ческих путей биосинтеза, благодаря высокой ферментативной
активности способность расщ еплять различные opi аннческие
вещества, ксенобиотики, и, наоборот, синтезировать из неорга­
нических веществ органические соединения, как в аэробных, так
и в анаэробных условиях; вездесущ есть микроорганизмов, их
адаптнрованность к экстремальным условиям (высокой темпе­
ратуре, низкой pH, осмотическому градиенту и др ). большая
технологическая доступность микробной клетки в сравнении с
высшими организмами для генно-инженерных манипуляций
Поэтому число видов и штаммов микроорганизмов, приме­
няемы х в б и отехн ол оги и будет п остоян н о у вели ч и ваться,
y

расширяться и углубляться спектр их полезной деятельности как


следствие более совершенного «мания механизмов регуляции мета­
болизма и умения ими управлять, более тонких и адаптированных
генно-ннженерных манипуляций, а также разработки и внедрения
-f

новых инженерных технологий и приборов в биопроизводство.


<0

С.Торайгыров
атындагы ПМУ-д1н
академик С. Бейсембао
атында* ы «ылыми
К1ТАПХАНАСН1
ГЛАВА 2 . М и к р о о р г а н и з м ы , и с п о л ь з у е м ы е
В БИОТЕХНОЛОГИИ

Биологическая наука о микроорганизмах - микробиология в


качестве объекта исследования охватывает: бактерии и актино-
мицеты (бактериология), мицелиальные грибы и дрожжи
(микология), микроводоросли (альгология), вирусы (вирусология),
простейшие (протозоология).
Биотехнология как раздел биологической науки в качестве
биообъекта использует те же таксономические группы микро­
организмов. И с каждым новым этапом развития этого научного
направления в биотехнологический процесс вовлекаются все
новые и новые группы микроорганизмов, в том числе генетически
модифицированные.
Первое, какого либо распределения групп микроорганизмов по
отраслям их применения (в медицинской биотехнологии одна
группа, в пищевой биотехнологии следущая, в сельскохозяйст­
венной биотехнологии третья и т.д.) не существует. Более того,
один и тот же микробный метаболит (аминокислота, органическая
кислота, антибиотик, витамин и др.) могут продуцировать микро­
организмы различных таксономических групп (дрожжи и бакте­
рии, мицелиальные грибы и актиномицеты и т.д.); применяется
один и тот же метаболит в различных отраслях.
Второе, требования, предъявляемые к микроорганизмам,
используемым в качестве биообъекта в различных отраслях суще­
ственно отличаются. Требования, предъявляемые к продуценту
антибиотика одни, к штамму используемому в качестве вакцины
иные, а к пробиотическому микроорганизму третьи и т.д.
Третье, степень участия, роль и значимость биообъекта в
различных сферах биотехнологии также совершенно различна.
Термин «промышленные микроорганизмы» возник из технической,
промышленной микробиологии, когда микроорганизм адапти­
руется к технологическим условиям, к масштабированию произ­
водства и функционирует в искусственно созданных условиях
жизнеобеспечения (в биореакторе). Объем и качество продукта в
основном зависят от активности биообъекта. В то же время
I липа J. MuKfJoopsaHii /мы. исполь J k a tf t » м м м и и ш м 19

микроорганизмы, используемые ы качестве биообъекта при


биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами,
особенно если они были выделены из этой же почвы, функцио­
нируют в условиях, приближенных к естественным, не в
монокультуре, а в окружении разнообразных почвенных
микробов,в малоконтролируемых условиях.
И четвертое, в зависимости от технологических задач био­
объект может быть использован в монокультуре (продуценты
антибиотиков, витаминов, аминокислот, вакцинные штаммы и др.),
либо вообще сложно учесть таксономические группы в сообще­
стве (активный ил при очистке сточных вод).
Но в целом понятие «биообъект» объединяет различные группы
микроорганизмов, используемых в самых разных сферах
биотехнологии.
2.1. Бактерии
Многообразный мир бактерий, включающий многие таксоно­
мические группы но классификации Ьерджи подразделяют на 4
отделе;
1 ранили куш (Gracilicutes, graolus тонкий, cutes - конец)
бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамогрицательные; это
фото - и хемотрофы, ли го и гетеро грофы, аэробы и анаэробы.
фирмикуты (Firmicutes, firmuc крепкий) бактерии с толстой
клеточной стенкой, грам положит ел ьные, авто- и i етеротрофы,
аэробы и анаэробы;
- тенерекуты ( Tenericutes), i рамотрицательные, не имеют
ригидной, содержащей петидогликан клеточной стенки;
представлены микоплазмами;
мендозикугы (Mendosicutes), представлены архебактериями,
авготрофы, отличающиеся особенностями клеточной стенки,
строения рибосомальныч мембран и рибосомальными РНК.
В 1977 г. Везе и Фокс путем анализа неполных последова­
тельностей 16S и IKS - рРНК предложили разделить прокариоты
на царство бактерий и царство архен или эубактерии и архе­
бакт ери и
Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

Система классификации, установленная в настоящее время для


разграничения таксонов прокариот, основана на анализе молекул
ДНК и белка в сочетании с фенотипическими характеристиками.
Благодаря удивительному разнообразию путей метаболизма,
и в особенности анаэробных реакций, доставляющих энергию (это
резко контрастирует с повсеместной монополизацией гликолиза
в эукариотной клетке), способность к фиксации азота, метано-
образованию и другим реакциям бактерии широко используются
в биотехнологии. Клетки многоклеточных, эукариотных орга­
низмов отличаются друг от друга не столь сильно, как разные
формы бактерий разнятся между собой с точки зрения биохи­
мических процессов.
Прокариоты промышленного значения растут на органическом
субстрате, который служит источником как углерода, так и энер­
гии. Они обычно синтезируют все клеточные компоненты только
из одного органического вещества и какого-либо источника азота.
Анаэробные бактерии по своим пищевым потребностям можно
подразделить:
1. гидролитические бактерии или ацидогенные, они обеспе­
чивают начальный гидролиз субстрата до низкомолекулярных
соединений;
2. гетероацетатные, продуцирующие уксусную кислоту;
3. метаногенные, образующие метан, они делятся на потре­
бителей водорода —литотрофы и на потребителей уксусной
кислоты - ацетотрофы;
4. сульфатредуцирующие и денитрифицирующие микроорга­
низмы, утилизирующие серу и азот как субстраты.
Отдел Gracilicutes представлен следующими родами аэробных,
грамотрицательных бактерий (палочки и кокки), в той или иной
степени, используемых в биотехнологии:
- род Pseudomonas, встречается в почве, воде, сточных водах,
органических и растительных остатках; хемоорганотрофы, могут
использовать в качестве субстрата разнообразные органические
вещества —белки, жиры, углеводы, а также гумусные вещества;
- род Azotobacter, палочки, подвижные, фиксируют атмос­
ферный азот, широко распространены в почвах;
2 / Ьактерии 21

род R hizobium , клубеньковы е бактерии , осущ ествляю т


симбиотическую фиксацию атмосферного азота;
род Agrobacterium, фитопатогены, источник получения Ti-
шшмиды;
роды Methylococcus и Methylomonas, подвижные и непод­
вижные кокки и палочки. Хемоорганотрофы. Единственный
источник углерода и энергии для них метан и метиловый спирт;
- роды Acetobacter и Gluconobacter, окисляют этиловый спирт
до уксусной кислоты;
род Thiobacillus, хемолиюзрофы, метаболизируют серу и ее
соединения. Маленькие палочковидные клетки, спор не образуют,
облигатные анаэробы. 'Энергию получают та счет окисления
серосодерж ащ их соединений, источником углерода служи г
диоксид углерода. Могут размножаться н сильно кислой среде.
Встречаются в почве, водоемах, сточных водах, серных ключах.
К отделу I ранил и ку гон относят и цианобактерии (синезеленые
водоросли). Это грамотрицательиые прокариотные организмы,
имеющие ригидную многослойную клеточную стейку с
внутренним пелтидог Ливановым слоем. В клетках цианобактерий
имеется развитая система вну фииитоплазмагических мембран
(тилакоидов), где происходи! фотосинтез. Характерны фото*
пигменты.
Отдел Firmicutes включает толстые i рамотрицательи ые палочки
и кокки, а также актиномицеты, схожие с ними кориисбвктерии и
микобактерии.
Плотность клеточной стенки обусловлена наличием пептидо-
I л и ка на, состоящего из параллельно расположенных молекул
шикана, из остатков N ацетилглюкозамииа и N ацетил Мура­
товой кислот, соединенных гликозидной связью I ликаиовые
молекулы связаны поперечной пептидной свазью. Отсюда и
нашанис лого полимера пенгидогликан. У грамположительных
бактерий в сухой массе клеточной стенки содержится 40-90" о. у
I рамогрицатсльных - 5-10°о пептидогликана.
Ьиологическими объектами, используемыми в тех или иных
биотехнологических производствах являются бактерии следую­
щих родов данного отдела:
Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

- роды Streptomyces, Leuconostoc, Pediococcus, грамположи-


тельные кокки, хемоорганотрофы, факультативные анаэробы,
сбраж иваю т углеводы с образованием молочной, уксусной,
муравьиной кислот, этанола и углекислого газа. Ш ироко рас­
пространены в почвах, на поверхности растений, в молоке и
молочных продуктах;
- род Bacillus, грамположительные, споровые палочки, аэробы.
Раньше все палочковидные формы бактерии называли бациллами
(bacillus - маленькая палочка). После 1875 года, когда немецкий
ботаник Ф. Кон открыл существование спор у сенной палочки,
палочковидные формы бактерии, обладающие спорами, стали
именовать бациллами, а не образующие споры - бактериями.
Бациллы населяют почву, воду, кишечник человека и животных,
растения. Встречаются болезнетворные формы, вызывающие
инфекции у человека, животных, растений и насекомых;

Рис. 3. Клетки бактерий Zymomonas Рис. 4. Молочнокислые бактерии


mobilis, выращенные глубинным Lactobacillus plantarum.
способом на мелассной среде, х 19 ООО (фото В.П. Осе)
х 65 ООО (фото Э.Ю. Вентиня)

- род Lactobacillus, грамположительные палочки, анаэробы и


факультативные анаэробы, гомо- и гетероферментативные;
- род Corynebacterium, грамположительные, булавовидные
(согупе - булава) палочки, аэробы и факультативные анаэробы.
Хемоорганотрофы, кислотоустойчивы;
- род Arthrobacter, грамположительные аэробы, хемоорга­
нотрофы, сапрофиты, разлагают гумусные органические вещества;
/ / . Бактерии 2.2. Актиномицеты 23

род Hntpionibactenum, ветвящиеся или правильной формы


палочки, булавовидные или нитевидные, i рам положительны,
факультативные и строгие анаэробы, хемоорганотрофы. При
сбраживании углеводов образуют иропионовую и уксусную
кислоты, углекислый газ. Встречаются в молочных продуктах,
твердых сырах, на коже, в желудочно-кишечном тракте
Отдел Mendosicutes представлен 5 группами архебактерий
метанообразующие, Methanomonas, Methanophilus и др.;
аэробные сероокисляюшие, Sulfolobus;
анаэробные, восстанавливаю щ ие серу в сероводород,
Thermophilus, Desulfococcus;
- галобактерии, устойчивые к 20-25% поваренной соли,
Halo coccus, Halobacterium;
- термоацидофильные, хемоорт аноiрофы, размножаются при
60°С и pH 1-2, аэробы, Thermoplasma.

2.2. А ктином ицеты

Актиномицеты о iносится к отделу Firmicutes (по Берджи), с


толстой клеточной стенкой, грамположительные ветвящиеся
бактерии (actis луч, myces -гриб).
Актиномицеты прокариоты, в составе клеточной стенки
пептидогликан, но они многоклеточны, со сложным циклом
развития, образуюi спороносны, споры. Большое количество
родов и видов, преимущественно аэробы, есть анаэробные и
факультативно анаэробные представители, нетребовательны к
питательному субстрату, при росте на плотных средах образуют
субстратный и воздушный мицелий, размножаются вегетативным
способом.
Род Streptomyces насчитывает около 500 видов, образует
субстратный и воздушный мицелий Актиномииеты этого рода
делятся путем фрагментации мицелия на палочковидные или
сферические клетки. На концах воздушных тиф образуют конидие­
споры. необходимые для размножения. Споры актиномицет
обычно не термостабильны.
Актиномицеты рода Mi с гот о nos рога не имеют воздушного
мицелия, образуют единичные споры непосредственно на
24 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

субстратном мицелии, также как и стрептомицеты известны


антибиотикопродукцией.
Род F rankia - эти актиномицеты образуют клубеньки у небо­
бовых двудольных растений (ольха, лох, облепиха и др.). В клет­
ках клубенька, заполненных массой гиф, образуют сферические
или булавовидные вздутия. Являются симбионтами растений и
могут фиксировать в клубеньках атмосферный азот. Микро-
аэрофилы.
Общую филогенетическую ветвь с актиномицетами образуют
так называемые нокардиоподобные актиномицеты - палочко­
видные, неправильной формы бактерии. Представители некото­
рых родов образуют ветвящиеся формы - это C orynebacterium ,
M ycobacterium , N ocardia и др. Нокардиоподобные актиномицеты
отличаются наличием в клеточной стенке арабинозы и галактозы,
а также миколовых и больших количеств жирных кислот.
В целом актиномицеты принимают участие в почвообразо­
вательных процессах, образуя вещество геосмин, придающий
почве характерный запах. Существуют патогенные виды актино-
мицет, вызывающие актиномикоз, нокардий - нокардиоз,
микобактерий - туберкулез, коринебактерий —дифтерию.
2.3. Дрожжи
Относятся к одноклеточным гуибам, делятся на 3 класса:
A scom ycetes, B asidiom ycetes, D eiterom ycetes.
- Аскомицет ы , не образуют мицелий, овальной формы клетки,
1иаметром 3-15 мкм, размножаются почкованием, бинарным
делением или половым путем с образованием аскоспор (споры
образуются внутри специальных клеток - сумок, или асков).
При почковании на поверхности зрелой клетки образуются
один или несколько бугорков (почек), в которые переходит часть
цитоплазмы и ядра. Перетяжка (место сужения) между мате­
ринской и дочерними клетками постепенно уменьшается, и затем,
наступает такой момент, когда дочерняя клетка отделяется. На
теле материнской клетки остается шрам, округлое выпячивание с
приподнятым ободком по периферии. Почкование характерно для
рода Saccharom yces (рис. 5).
J .i Дриж ж м 25

Рис, 5. Дрожжи Cuccharomvce> • i'ri- и н л ’ выращенные на мс iact ной среде


м 7 ОСЮ

A B C
Рис. 6. ikfirrgtiiud Mger
А и В двухяруейые спороносные структуры х 4W)
С шероховатые, имроыииьк. темноокрашенные камеди х 920
26 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

Размножение путем деления, когда посередине клетки


образуется двустенная перегородка и затем расщепляется на двое
(род Schizosaccharomyces).
При половом размножении - слиянии (копуляции) двух
дрожжевых клеток оболочка между ними растворяется.
Оплодотворенное ядро делится 2 или 3 раза и образуются 4 или 8
аскоспор. Аскоспоры представляют собой клетки с толстой
оболочкой, устойчивой к неблагоприятным факторам среды. После
прорастания споры начинают размножаться бесполым путем.
В биотехнологии, генно-инженерных исследованиях широко
используются пекарские дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Их
способность к превращению сахара в этанол и СО, издавна исполь­
зовалась при изготовлении алкогольных напитков. У S. cerevisiae
хорошо изучена биохимия, физиология, определена полная
нуклеотидная последовательность всего набора хромосом, она
легко культивируется в лабораторных и производственных
условиях, нетребовательна к питательному субстрату, имеет
сильные промоторы, есть посттрансляционная модификация,
внесена в список GRAS-«generally recognized as safe» -
«организмы, признанные безопасными». Saccharomyces lipolytica
используется для получения биомассы, богатой белком.
Некоторые представители аскомицетов - спорынья (Claviceps
purpurea) поражает злаковые, Nadsonia обусловливает порчу
пищевых продуктов.
- Базидиомицеты представлены дрожжами, образующими
половые структуры базидиального типа (базидиоспоры). Это
красные дрожжи рода Rhodosporidium и розовые — рода
Sporobolomyces. Среди базидиомицет нет промышленных
штаммов.
- Дейт ером ицеты, дрожжеподобные грибы, размножаются
почкованием, образуют псевдомицелий (почкующиеся клетки из
ростковой трубочки вытягиваются в нить), на концах которого
находятся хламидоспоры. Истинные дрожжи (аскомицеты)
образуют аскоспоры, не имеют псевдомицелия и хламидоспор.
Candida utilis, С. arborea - используются в биотехнологии, при
получении белковой биомассы и др.; Torula spp. - молочнокислом
брожении; Rhodotorula вызывает порчу пищевых продуктов;
2. .} Дрожжи ■I 4 Грибы 17

Trichoderma cutaneum при очистке сточных вод; С. albicans


возбудитель кандидоэа у человека.
Дрожжи рода Candida растут на сульфитных сточных водах,
формирующихся на кожевенных заводах, предприятиях бумажно*
ц еллю лозн ой п ром ы ш лен н ости С реди них есть ш таммы
окисляющие токсины, фенолы Среди дрожжей известны также
продуценты каротиноидов (провитам ин А), которые придают
мякоти фарша форели и лосося розовый или оранжевый цвет

2.4. Грибы
М иц елиальн ы е грибы или п лесени вм есте с дрож ж ам и
относятся к отделу М усою . В типичном случае грибы имеют
жесткую клеточную стенку, состоящую из сватанных полимеров
глюкозы (глю каны), глюкозамииа (х и т з а н а ) - N - ацетил гл ю-
котамииа (хитина). Иногда клеточная стенка полностью состоит
из хитина. М ицелий образуется h i септнрованиы х (имею щ их
перегородки) и иесептированиы х (образующ их многоядерные
клетки) гиф.
Микромицеты зто мицелиальные, многоклеточные зукарноты
Если дрожжевых насчитывается несколько сотен, то мицелнальных
грибов более ста тысяч видов Они широко распространены в
природе, встречаю тся в почве, на растительны х и животных
о стан к ах , продуктах питания и лр. В почве они разлагаю т
различны е органические вещ ества, в том числе целлю лозу и
лигнин. С реди 6 классов м и кром н ц ет истинны х грибов
встречаются патогенные для человека, животных и растений виды.
Большинство грибов гетеротрофный не требовательны к пита­
тельному субстрату, аэробы, некоторые представители растут при
ниткой температуре, даже в холодильной камере (0-4°С).
Грибы могут размнож аться спорами половым и бесполы м
способом, а также вегетативно (почкованием или фрагментацией
гиф). Бесполое размножение осуществляется у низших грибов с
помощью эндогенных спор, созревающих внутри спорангия и
экзоген н ы х спор конидий, ф орм ирую щ ихся на кончиках
плодоносящих гиф Репродуктивные структуры появляются при
благоприятны х условиях. При выращ ивании в искусственных
условиях ни половые, ни вегетативные споры не развиваются.
28 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

А скомицеты - самый обш ирный класс, объединяет группу


грибов, имеющих разветвленный септированный мицелий, спо­
собных к половому размножению. Аскомицеты представлены раз­
личными родами, в том числе Aspergillus, Penicillium и др. (рис. 7,8,9).
Aspergillus niger имеет разветвленный мицелий, гифы септиро-
ваны. От мицелия отходит одноклеточный конидиеносец с утол­
щ ением на конце. На головке
конидиеносца веерообразно рас­
полож ены коротки е стери гм ы ,
напоминающие шипы, от которых
отш нуровы ваю тся конидии, или
экзоспоры. Конидии черного цвета
(у б ольш и н ства асп ерги л л они
розовые). Aspergillus niger - про­
дуцент л и м он н ой , щ авелевой
кислот. Среди аспергилл есть воз­
будители инфекций - аспергиллеза.
Penicillium chrysogenum — про­
Рис. 7. Высушенные конидиеспоры дуцент пенициллина, плесневый
.4sr. niger. х 11 ООО гри б, эу кар и о т, и м еет ядро,
митохондрии, клеточную стенку из
хитина, многоклеточный организм,
цикл разви тия 6-7 суток, как и
д ругих м и ц елиальн ы х грибов.
В стреч ается в п очве, корм ах,
молочных продуктах, фруктах, в
сырых помещениях.
Класс дейтеромицет - несовер­
ш енны е грибы , разм нож аю тся
Рис. 8. Споры и гифы микромицета
бесполы м путем , при котором
Penicillium sp., выращенного на
хлопчатобумажной ткани, х 2 ООО образование конидий происходит
на изолирован н ы х или р ас п о ­
лож енны х группам и кон и ди ен осц ах; представлен ы родами
Alternaria, Fusarium, Trichoderma и др.
Грибы рода фузариум ведут сапрофитический и паразити­
ческий образ жизни. Поражая растения, они вызывают болезнь
фузариоз. Если такие грибы встречаю тся на перезимовавш ем
1.4 I риЛы 29

а 1 Ши

'Ш Ш а

1 А

Рис. 9. Р еян t/hum grmagenum


А и Н гре&ярусмые висточка
и камеди к 920
С - двойные неправильные
цепочкикамеди к 920

хлебе, они могут вызывать кар м си о и то сси к о } <ф> <ариоток


сикоз) - «пьяный хлеб». Некоторые виды фумрий используются
в биотехнологии, как микробная белковая масса.
Грибы класса зигомнцет характеризуются несетированны м
мицелием, рашножаются половым и бесполым способом, пред­
ставители роды Мисог и Rhnopus применяются а биотехнологии
Грибы классов хидридиеминегы, оомицеты и базидиомицегы
представлены сапрофитами и паразитами, в биотехиодогии не
используются.
Грибы - источники получения амилаз, протеаз, пектиназ.
органических кислот (лимонной, молочной), антибиотиков,
используются при производстве некоторых сыров (кемамбер.
рокфор).
30 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

2.5. Рост и размножение


Успешное использование микроорганизмов в биотехно­
логическом производстве зависит от адекватности условий,
созданных для их роста и размножения в биореакторе, зависит
от субстратной обеспеченности, физико-химических факторов
(pH, температура, аэрация, перемешивание и т.д.), от эффектив­
ности управления фазами развития микробной культуры
(первичные метаболиты, сами живые клетки микроорганизмов
рационально извлекать в экспоненциальной фазе развития, а для
антибиотиков, ферментов более продуктивна стационарная фаза
развития).
Рост - это координированное увеличение размеров и веса
клеток; сбалансированный рост - пропорционально числу клеток
увеличивается их масса и количество всех компонентов (белок,
РНК, ДНК).
Развитие - это совершенствование во времени структуры и
функций клеток унаследованных от родительских форм.
Для различных групп микроорганизмов характерна обще­
биологическая закономерность - развитие в течение роста, то есть
совершенствование, дифференцирование внутри клеточных
структурных компонентов (рибосом, нуклеоида, клеточной
стенки, внутриклеточных мембран и др.).
Размножение - это увеличение во времени числа клеток
микроорганизмов. Размножение бактерий, актиномицетов,
дрожжей и грибов существенно различается, что учитывается при
реализации биотехнологического процесса. К примеру, бактерии,
размножаясь делением, образуют суспензию клеток, которая
хорошо аэрируется, перемешивается в условиях глубинной
ферментации, а грибы, наоборот, образуя разветвленный мицелий,
разрастаются по поверхности среды культивирования. Поэтому
к ним приемлема технология поверхностного культивирования и
т.д. Оптимальное управление фазами развития культуры -
продуцента является наиболее существенной задачей организации
биотехнологического производства.
Размножение бактерий осуществляется бинарным делением,
причем дочерние клетки идентичны и каждая из них повторяет
цикл развития материнской.
2.5. Рост и ра умножение

Дрожжи разм нож аю тся почкованием На поверхности


клеточной стенки образуется почка, которая растет до тех пор,
пока не достигнет разм ера материнской клетки и затем
отделяется. На материнской клетке образуется рубец Возраст
индивидуальной клетки при таком типе размножения можно
определить по числу рубцов на материнской клетке.
Исключение составляют дрожжи, которые размножаются за
счет разделения клеток или благодаря образованию гифов, причем
материнские и дочерние клетки отличаются
Больш инегво пивных и хлебопекарны х дрожжей рода
Saccharom yces являю тся гетерозиготны м и диплондами,
состоящими из (+) мужской и (•) женской гаплоидов
При ограничении азотного питания в азробной культуре клетки
Saccharomyces cerevixia приобретают удлиненную, вытянутую
форму, а клетки Candida albicans при ограничении доступа
кислорода и глю ком образуют больше псеадомицелия У кандид
существенно изменяется химический состав клеточной стенки, с
возрастом в них в 1,5-2,0 ра та увеличивается содержание хитина.
Микроскопические грибы и актиномицеты растут в виде i иф,
которые удлиняю тся, разветвляю тся и образую т сложный,
переплетенный мицелий Растут не все клетки н и к микро­
организмов, а лишь верхушечные. Поэтому при росте грибоя и
актиномицетов концентрация биомассы возрастает не экспо­
ненциально, как у бактерий и дрожжей, а линейно (в случае роста
неветвяшихся i иф) или по более сложному механизму (при росте
ветвашихся гиф).
Мицелиальные микроорганизмы нередко образуют в процессе
роста довольно плотные пленки (при роста на поверхности среды)
или глобулы (при глубинном росте), что приводит к замедлению
транспорта питательных веществ к клеткам мицелия и отводу
метаболитов от них
У грибов, вырастающих в форме колоний на поверхности
срелы. периферическая зона состоит из более молодых нитей
мицелия, центральная зона из более старых, рост которых
заметно ограничен. В зависимости от физико-химических условий
мицелий может быть длинным и объемным, коротким и сильно
разветвленным
32 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

У актиномицет рост биомассы осуществляется без размно­


жения - из одной споры вырастает многоядерный, несепти-
рованный, не разделенный на отдельные клетки мицелий.
Наоборот, при фрагментации мицелия тех же актиномицет на
споры происходит размножение клеток без роста.
Микроорганизмы - биопродуценты в большинстве случаев
приспосабливаются к условиям биотехнологического процесса,
к среде ферментации. К примеру, Е. coli может расти и разви­
ваться в средах, содержащих в качестве источника углерода
глюкозу, глицерин, уксусную кислоту, этанол; в качестве источника
азот - разные аминокислоты, аммиак, пурин и пиримидины и др.
Если в среде культивирования будет содержаться смесь таких
веществ, то эшерихии будут использовать, прежде всего более
доступные, например аминокислоты, а не аммиак. Это связано с
тем, что аминокислоты могут непосредственно включаться в
обменные процессы. Синтез ферментов, катализирующих реакции
образования аминокислот из аммиака репрессируется. Подобный
механизм прослеживается и в отношении источников углерода.
Например, присутствие в среде глюкозы тормозит сбраживание
других углеводов - арабинозы, галактозы, лактозы или мальтозы,
путем репрессии соответствующих ферментов; используется в
катаболитном процессе только глюкоза.
Но при истощении запасов аминокислот либо глюкозы в
клетках микроорганизмов индуцируется активность ферментов,
катализирующих утилизацию аммиака, арабинозы и др. Это
феномен диауксии, то есть при истощении основного субстрата,
начинается катаболизм микроорганизмами другого субстрата,
менее эффективного.
В биотехнологическом производстве нередко микробную
биомассу наращивают, используя более богатую питательную
среду, более эффективные источники углерода, азота и т.д. Затем
микробную биомассу переносят в другой биореактор с бедной
питательной средой, в этих условиях клетки переходят из экспо­
ненциальной фазы развития в стационарную фазу и начинается
интенсивный синтез антибиотиков, ферментов и др.
Фазы развития бактерий хорошо исследованы в периодической
культуре, то есть в условиях определенной несменяемости
питательной среды.
/ J. Ноет и разм нож ение 33

- Лаг-фаза. Непосредственно после внесения посевной


культуры в питательный субстрат микроорганизмы адаптируются
к новым условиям. Происходит активация метаболических путей
в соответствии с составом субстрата, начинается синтез индуци-
бельних ферментов, катализирующих расщепление компонентов
субстрата, активируется синтез внутриклеточных белков.
Длительность лаг ф аш это время от внесения посевной
культуры в биореактор с субстратом до начала активного размно­
жения микроор) ани шов, роста биомассы. Чтобы сократить это
время и тем самым сократить продолжительность техноло­
гического цикла необходимо использовать посевную культуру в
фазе экспоненциальною роста, • питятельная среда, в которой
готовилась посевная культура должно быть максимально близка
по составу со средой в аппарате для ферментации
Экспоненциальная фиш роста Интенсивное размножение
микроорганизмов с определенной удельной скоростью, при
постоянном времени удвоения числа клеток Активно
метаболизируетея питательный субстрат, резко возрастает
концентрация РНК в клетках микроорганизмов, для обеспечения
процессов биосинтеза белка Лимитирует экспоненциальную фазу
концентрация субстрата, особенно недостаток метаболитов
предшественников целевого продукта, избыток продуктов обмена,
доступ кислорода, отвод углекислого газа. pH, температура и т.д.
Не всегда максимальный рост биомассы в этой фазе означает
максимальную продуктивность по целевому метаболиту, то есть
возможна ситуация, когда биомассы много, а нужного метаболита
немного. В таких случаях для достижения соответствия роста и
продукции целевого метаболита выполняются специальные
технологические исследования
У грибов и актиномицетов. растущих за счет верхушечных
клеток мицелия, экспоненциальная фаза, как таковая, отсутствует,
поскольку с увеличением концентрации биомассы удельная
скорость роста снижается
- Стационарная фаза Общее количество жизнеспособных
клеток постоянно, так как одновременно с размножением
происходит гибель, автолиз клеток. В этот период наблюдаются
активное использование внутриклеточных запасных веществ.
34 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

уменьшение числа рибосом, интенсивный синтез вторичных


метаболитов.
- Фаза отмирания. Автолиз, гибель клеток быстро нарастает.
Процессы биосинтеза прекращаются.
Таким образом, к концу лаг - фазы происходит быстрое
увеличение в клетках РНК, после чего клетки начинают делиться,
наступает фаза экспоненциального роста. Повышение скорости
роста сопровождается дальнейшим усилением белок -
синтезирующего аппарата, увеличением в клетках РНК и рибосом.
В стационарной фазе клетки содержат значительно меньше РНК
(концентрация ДНК мало меняется).
К общим причинам изменения скорости роста бактерий
относятся понижение концентрации субстрата, накопление
токсичных метаболитов, высокая плотность бактериальной
популяции, ухудшающая транспорт ингредиентов питательной
среды, газа. Несомненна роль внутриклеточной авторегуляции
процессов репликации ДНК, транскрипции РНК, биосинтеза белка,
активности ферментов в достижении максимального накопления
клеток микроорганизмов в экспоненциальную фазу, в дли­
тельности сохранения стационарной фазы и наступления времени
их отмирания.
Для оценки динамики ферментационного процесса опре­
деляется удельная скорость роста, экономический и метабо­
лический коэффициенты и др.
- Удельная скорость роста (//) понимается как увеличение
биомассы микроорганизмов в единицу времени. Это основной
показатель, характеризующий скорость роста биомассы
микроорганизмов.
d(\nm)
ц —---- -— , где n-число поколений, m-прирост биомассы,
dt
t-время.
Удельная скорость роста зависит от времени генерации,
состава питательной среды, pH, температуры, осмолярности,
наличия метаболитов-предшественников, ферментативной
активности микроорганизмов.
2.5. Рост и размножение 35
2 4 Требования, предънн.ляемые к пром ыш /енны и и икрои/к анизм ом

Время генерации или продолжительность жизни одного


I. - г
поколения g * —-— .
В результате логарифмирования приведенных формул и их
сопоставления определена связь удельной скорости роста с
продолжительностью времени генерации. Между р. и ц существует
обратно пропорциональная гависимосгь.
Экономический коэффициент (у) позволяет оценить рента­
бельность использования cy6crpaia. Исчисляется жономический
коэффициент соотношением образовавшейся биомассы к
количеству потребление!о субстрата.
(IN
у = —— где N - биомасса. S - субстрат.
dS ’
Метаболический коэффициент («/) или удельная скорость
метаболизма характеризует интенсивность потребления субстрата
растущей культурой.

2.6. Т р еб о ван и я, п р е д ъ я в л я е м ы е к п р о м ы ш л ен н ы м
микроорганизмам
Требования, которые предъявляют к микроорганизмам,
используемым в биологических технологиях, «висят от целей
использования конечного продукта. Очевидно, что есть как общие
для всех промышленных микроорганизмов критерии оценки, так
и некоторые отличительные черты.
Наиболее четко определены требования к промышленным
микроорганизмам, используемым в ферменгационных техно­
логиях, в микробиологическом производстве, когда конечным
продуктом брожения является метаболит (антибиотик, витамин,
аминокислота и др.). Эти требования складываются из характе­
ристик, которые закладываются в микробную клетку с одной
стороны исследо вател ем -сел е кц ион ером и с другой - ученым -
технологом:
Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

11 Апатогенность микроорганизмов, безвредность для человека


и окружающей среды;
2. С пособн ость синтезировать целевой продукт - главный
критерий при отборе штаммов-продуцентов;
3. Высокая скорость выхода конечного продукта (накопление
биом ассы , синтез антибиотиков, орг. кислоты; если ферменты,
то лучше внеклеточные и т.д.) ;
4. Стабильность биопродуцирующей активности в лаборатор­
ных и производственных условиях;
5. Образование побочных продуктов метаболизма должно быть
минимальным;
6. У стойчивость к литическому действию бактериофагов, к
посторонней микрофлоре. В производственных условиях нередки
п отери и з-за лизиса ш тамма-продуцента бактериофагами.
Получают устойчивые, фагорезистентные штаммы путем совмест­
ного культивирования продуцента с чувствительным фагом.
7. Желательно чтобы производственный штамм был термо- и
ацидоф ильны м , так как повышенный температурный режим
ферментации или низкие значения pH облегчают сохранение
стерильности в промышленных условиях;
8. Технологичность, то есть высокая адаптация штамма к
производственному процессу;
9. Способность хорошо расти на дешевом субстрате (отходы
м ясом олочного, кондитерского, плодово-ягодного и других
производств);
10. Образуемый продукт должен иметь экономическую цен­
ность и легко выделяться из культуральной жидкости.
Не менее важное значение имеют такие свойства продуцента,
как способность использовать разные источники углерода, мини­
мальная потребность в дополнительных факторах роста; порой
лучше продуцент с меньшей биопродуцирующей активностью, но
способный к полному усвоению субстрата, углеродсодержащих
ком понентов ферментационной среды, чем более активный
продуцент, но не использующий полностью углеродные компо­
ненты среды культивирования. В этом случае повышается
стоимость конечных продуктов, создаются дополнительные
трудности по очистке и выделению его из культуральной среды.
J .6 Требования прсО ъяалнаы ы ? я п р о м ы и ц е н н ы м ш исроор чин и м а * п

При оценке требований к штаммам, используемым в качестве


б и о и и с ек ти ц и д о в , б и о у д о б р ен и и , б и о д естр у к то р о в , наряду с
основной ф ункцией (соответственно, высокая токсичность для
н асеко м ы х-вреди тел ей , вы раж енная способн ость ф иксировать
атм осф ерны й азот и активно расш еп лязь о р ган ически е соед и ­
нения, ш ряш ию ш ис воду и почву) большое внимание уделяется
п ри сп особляем оеi и микроорганизмов к колебаниям pH, тем пе­
ратуры и влаж н ое 1 и в естеств ен н ы х усло ви ях , к разли чны м
ингредиентам почвы, окружаю щ ей микрофлоре.
Ь и о и н секти ц и ди ы й ш i амм в м е с ie с вы сокой зн том оп ато-
t снностыо должен быть бе тонасеи для человека и животных, его
токсин - стойко сохран ять свойства при хранении препарата,
препарат должен быстро действовать на насекомых; на дешевом
еубстраIс легко наращ иваться биомасса при ферментации.
При использовании микроорганизмов с целью биоремедиации
загрязненны х территорий, биодеструкции ксенобиотиков очень
важен подбор сообщ ества штаммов из ратных таксономических
групп. Последовательная, поэтапная биодеструкция ксенобиотика
тр еб у ет слаж ен н ой работы , со вм естн о го б и о к атал и ти ч еск о го
действи я различны х м и крооргани зм ов Важ но, чтобы штамм-
деструктор обладал существенным количеством плазмид деграда­
ции, детерм и н и рующи х синтез соответствующ их ферментов
Н екоторы е особенности проел ежи ва юте я при селекции клу­
бен ьк о вы х б а к т е р и й -м и к р о б р та н и зм о в , ф икси рую щ и х а т м о ­
сферный азот Естественно, требуется высокая азотфиксирующая
способность штамма, специфичность к определенному растен и то-
хозяину, конкурентоспособность в сообщ естве с ризосф ерной
микрофлорой. В то же время есть и другой подход в селекции
ш тамм ов, используем ы х в качестве биоудобрения Разрабаты ­
ваю тся м етоды « р а сш аты в а н и я » ви д о во й сп е ц и ф и ч н о с ти
микроорганизмов к определен ному растению с тем, чтобы био­
удобрение возмож но бы ло использовать не только на бобовых,
но и на других культурных растениях.
При мониторинге промыш ленных микроорганизмов, исполь­
зуемых в биотехнологии с целью вы щ елачивания металлов из
горных пород столь же важна скорость и эф ф ективность адап­
тации к и зм енен иям pH , тем п ературы окруж аю щ ей среды , к
концентрации металлов, к типу выщелачиваемого минерала.
38 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

Вакцинный штамм, особенно используемый в качестве живой


вакцины, оценивается по следующим критериям: апатогенность,
ареактогенн ость, стерильность (отсутствие посторонних
микроорганизмов), иммуногенность, антигенная специфичность,
то есть речь идет не об усилении или изменении метабо-
литического пути, не о сверхпродуцирующей способности микро­
организмов, а о антигенах (белках, полисахаридах, липополи-
сахаридах и др.), о структурных компонентах микробной клетки.
Так как свойства антигена определяют качество вакцины.
Вот далеко неполная характеристика требований, предъ­
являемых к промышленным микроорганизмам в разных сферах
биотехнологии.

2.7. Мутагенез и селекция

Сверхсинтез или способность микроорганизмов синтезировать


метаболиты в количествах, превосходящих физиологические
потребности, довольно часто встречается в микробном мире. При
этом нередко метаболиты (органическая кислота, спирт,
антибиотик и др.), выделяемые микроорганизмом в окружающую
среду являю тся токсичными для других видов и служит
продуценту как средство защиты, конкуренции или используются
как резервное питательное вещество.
Но в качестве производственного микроорганизма подобные
дикие штаммы, способные к повышенному синтезу тех или иных
метаболитов не используются. Тому ряд причин, в том числе все
же низкий уровень сверхсинтеза, не позволяющий производству
быть рентабельным, технологичность дикого штамма и при­
способляемость к оптимальному функционированию в процессе
промышленной ферментации порой далека от требуемых условий
и т.д.
Селекция - это отбор диких штаммов, обладающих сравни­
тельно высокой продуцирующей активностью нужного метаболита
и последующий поэтапный мутагенез с целью многократного
увеличения (в десятки и сотни раз) объема продукта биосинтеза.
Как проводится поиск, отбор штаммов микроорганизмов,
обладающих значимой биопродуцирующей, биодеградирующей
и иной биоактивностью. Так, углеводородокисляюшие микро­
2.7. ы селекция

организмы - в почве возле автозаправок, на территориях, загряз­


ненных нефтепродуктами; винные дрожжи - на виноградниках,
других плодово-ягодных растениях, молочнокислые микро­
организмы в молочных продуктах и т.д., т.е. там, где есть
субстрат и условия для их выживания. Часто поиск проводится в
естественных для микроорганизмов эконишах, биоценозах.
Нередко промышленно-ценные микроорганизмы отбираются
среди коллекционных культур и гто понятно. Ведь коллекции
микроорганизмов создаются и существуют многие десятилетия,
здесь в жизнеспособном состоянии хранятся сотни, л ысячи
штаммов.
Отобранные микроорганизмы выделяются в чистой культуре,
выявляются те из них, которые обладают повышенной продукцией
нужного метаболита и далее подвергаются мутагенному
воздействию.
Впервые индуцированные мутации у микроорганизмов были
получены в 1927 году при помоши действия рентгеновских лучей
Помимо рентгеновских лучей изменения в структуре ДНК могут
вызывать различные физические и химические мутагены.
Проводится последовательное, поэтапное воздействие физи­
ческих и химических мутагенов на селекционируемый штамм
микроорганизма. После каждого воздействия среди мутировавших
штаммов отбираются лучшие, стабилизируется пи о продуци­
рующая способность, оптимизируется субстратное питание и
затем следующий зтап мутагенного воздействия уже другим
мутагеном, либо их сочетанием Итак, в течение достаточно
продолжительного времени.
К примеру, выполнив 21 цикл мутагенеза и селекции,
продолжавшейся более двух десятков лет исследователи
увеличили выход пенициллина в 55 раз (рентген. УФ-лучи, иприт I.
с 60 мг до 7 г л В последующем, благодаря далее продолжавшейся
селекционной работе биопродуцирующая активность Penicillium
была доведена до 20 г'л, что в несколько сотен раз превышает
выход антибиотика, полученный в 1941 году Флори и Чейн. Столь
хороший результат, несмотря на продолжительность селек­
ционного процесса, далеко не всегда имеет место среди микро­
организмов -антибиотикопродуцентов. Причина в том. что
40 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

антибиотики являются вторичными метаболитами и не относятся


к прямым продуктам трансляции. В биосинтезе антибиотического
вещества, как правило, задействовано несколько десятков только
структурных генов, кодирующих соответствующие ферменты био­
синтеза. Поэтому мутационные воздействия должны последо­
вательно изменять, перестраивать активность генов, соответ­
ственно и ферментов биосинтеза.
Процесс создания промышленного микроорганизма из дикого
штамма состоит в изменении его генетической информации с
целью исключить нежелательные и усилить нужные свойства или
придать микроорганизму совершенно новые качества. Наиболее
простой вариант мутации представляет собой точечная мутация,
т.е. замена одной пары азотисты х оснований на другую
(например, аденин-тимин на гуанин-цитозин). В других случаях
может произойти утрата или, наоборот, вставка одной пары
оснований или небольшого участка ДНК.
Подобные изменения возможны в любой молекуле ДНК в
результате ошибок при репликации. Однако спонтанные мутации
редки. Частоту мутаций в нужном направлении можно увеличить
в сотни раз под действием ультразвука, рентгеновских и радио­
лучей или химических мутагенов, способных реагировать с
основаниями ДНК или влиять на репликацию нуклеиновой
кислоты.
И ндуцированный мутагенез приводит к определенны м
дефектам регуляции обмена веществ, обеспечивающим пре­
имущ ественны й синтез, сверхпродукцию необходимого
метаболита. Известны различные механизмы получения мутанта-
сверхпродуцента. Это подавление механизмов ретроингиби­
рования, регуляции по типу обратной связи, когда увеличение
внутриклеточной концентрации конечного метаболита ингибирует
активность ферментов его синтеза. И, наоборот, увеличение
проницаемости клеточной мембраны, обеспечивающей быстрый
выход конечного метаболита из клетки, который достигается с
помощью мутаций, либо путем уменьш ения концентрации
биотина в питательной среде или добавлением пенициллина,
детергентов Твин-40 и Твин-60, производных высших жирных
кислот - пальмитаты и стеараты; подавление способности белка-
2.7. Мутагене'! и се мкция 41

репрессора блокировать индуктор или оператор, усиление


акт ивносIи промоторов, увеличивающ их репликацию генов,
детерминирующих синтез конечного метаболита или индукция
синтеза и поддерж ания активности ф ерм ентов, нужных
метаболитных путей; отсечение побочных путей метаболизма,
шметно не влияющих на жизнедеят ель ноет ь клетки; увеличение
в клетке продукции предшественника, из которого синтезируется
конечный метаболит,
В качестве примеров, раскрывающих наиболее типичные
механизмы мутационной селекции сверхпродуцентов можно
привести следующее. К одним из незаменимых аминокислот,
которые не могут синтезировать животные клетки, относится
лизин, его недостаточно и в кормовых растениях Поэтому
налажено промы ш ленное производство згой аминокислоты
мутантными ш таммами C orynehacterium glutam tcum и
Вre vibacteri um flavum У них микроорг анизмов литии является
конечным продуктом одного из ответвлений пути биосинтеза,
общего для трех аминокислот - лишив, метионина и треонина.
Регуляция синтеза них аминокислот в количествах, обеспечи­
вающих, но не превышающих потребности бактериальной клетки,
состоит в ингибировании активности первот о фермента дан нот о
пути биосинтеза, асп артатки и аш , конечными продуктами
треонином и лизином, действующими совместно. Накопление
треонина и лизина в избыточных для клеток количествах приводит
к прекращению их синтеза путем иж ибирования активности
аспартаткииаш И наоборот, нехватка любой из этих аминокислот
увеличивает скорость их синтеза.
Сверхсинтез лизина был достигнут благодаря двум типам
мутаций. В первом случае мутация в гене фермента гомосерии-
дегидрогеназы привела к утрате ферментативной активности, в
результате чего бактерия прекратила синтез метионина и одного
из ингибиторов аспартаткиназы - треонина. Такой мутант может
расти на питательной среде лишь при наличии в ней метионина и
треонина. Если н и х аминокислот достаточно для роста клеток,
но недостаточно для того, чтобы треонин совместно с лизином
подавлял активность аспартаткиназы, то в таких условиях лизин
синтезируется без помех. М утанты, требующие для культи­
42 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

вирования факторов роста - специальных добавок в питательную


среду (в данном случае метионина и треонина), называются
ауксотрофами.
Другой тип мутаций привел к изменению самого фермента
аспартаткиназы. Фермент аспартаткиназа - аллостерический
фермент (alios - другой), имеющий кроме активного центра еще
один, так называемый аллостерический центр, который может
взаимодействовать с низкомолекулярными эффекторами, в данном
случае с лизином и треонином. При присоединении к аллосте-
рическому центру эти аминокислоты изменяют конформацию
аспартаткиназы, в результате чего активный центр становится
недоступным для субстрата, и фермент утрачивает активность.
Как следствие утрачивается взаимодействие фермента с лизином,
т.е. механизм ретроингибирования не срабатывает (рис. 11).
Регуляция биосинтеза аминокислоты треонина у Escherichia
coli осуществляется двумя механизмами - ретроингибированием
и репрессией. В начале в бактериальной клетке синтезируется
аспарагиновая кислота, а на последующих этапах на её основе -
треонин, метионин и лизин (поэтому эти аминокислоты
объединены в сем ейство аспарагиновой кислоты ). Когда
концентрация треонина превы ш ает потребности клетки,
активизируется механизм угнетения его продукции по типу
обратной связи (ретроингибирование), а именно избыток треонина
инактивирует аспартаткиназу. Если этот регуляторный механизм
оказывается недостаточным, то избыточный синтез треонина
продолжается, он в последующем превращается в изолейцин. Далее
повышение концентраций треонина и изолейцина совместно
ингибируют активность всех ферментов данного метаболического
пути (репрессия) (рис. 10).
У мутантного штамма E.coli - сверхпродуцента треонина
наруш ена регуляция синтеза по типу обратной связи, т.е.
нарушено взаимодействие треонина с аспартаткиназой, а также
ингибированы ферменты синтеза изолейцина.
В селекции дрожжевых клеток применяется вегетативная,
парасексуальная гибридизация, когда в результате скрещивания,
слияния родительских хромосом получают гибрид с требуемыми
свойствами. Так, при скрещивании производственного штамма
i. 7. MymastHtei в «ммсфиш 41

I ИШК^ШГИМИ
Гомосери н фосфаг
туиишишитш

Грсоннн
пиру Ml греониндешммназа

ИюлсАшм

Рис. 10. Метаболический путь синтеза треонина у Е roll

Рис. It. Метаболический путь синтеча личина у С gbhimtcmm


44 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

Saccharom yces ca rlsbergensis (и сп ользуется в технологии


изготовления пива), сбраживающего сахарозу и мальтозу с диким
штаммом Saccharomyces globosus, который не расщепляет эти
углеводы , получен гибрид, сбраж иваю щ ий мальтозу. Этот
гибридный штамм прим еняется в технологии получения
«бархатного» пива.
В 1983 году С. Браун и С. Оливер использовали метод селекции
для отбора мутантных штаммов дрожжей, устойчивых к высоким
концентрациям продукта (10% этанола), при культивировании их
в непрерывном режиме (650 часов). При длительном культиви­
ровании, благодаря адаптационным механизмам в результате
спонтанных мутаций был выделен штамм, сохранивший жизне­
способность и более того, успешно размножавшийся в присут­
ствии 10% этанола.
В биотехнологическом производстве органических кислот
используются селекционированные штаммы микроорганизмов,
которые продуцируют эти метаболиты в виде монопродукта и с
высокой утилизацией исходного источника углерода, исполь­
зуемого субстрата. Эти мутанты приспособлены к условиям, к
технологии производственного цикла и практически не
синтезируют побочных продуктов. Так при использовании их в
производстве органических кислот выход молочной кислоты
составляет 90%, глю коновой - 90-96% , уксусной - 90-98% ,
лимонной - 85%, итаконовой - 60%.
Получив мутант, синтезирующий конечный продукт во много
раз больше, нежели исходный штамм микроорганизма перед
исследователем становится не менее важная следующая задача.
Каждое из множества разнообразных веществ, создается в клетке
в строго необходимых для роста пропорциях в результате фермен­
тативных реакций. Координация химических превращений, обес­
печивающих экономный, рациональный метаболизм осущест­
вляется путем регуляции активности ферментов, изменением
интенсивности тех или иных метаболических путей. Мутантный
микроорганизм с направленно измененной генетикой, с усилением
одного метаболического пути в ущерб другим, нужным в жизне­
деятельности клеток становится менее конкурентоспособным. Да
и просто избыток какого-либо метаболита не рационален, не нужен
2,7. Мутагене/ и селекции 2 I Технология рекаиоиничтшш ДНК 45

Клетке. Поэтому может иметь место реверсия или обратная


мутация, когда гены-регуляторы вновь восстанавливают изна­
чальный генетический профиль, имеющийся у данного штамма

2.8. Т ехнология реком бин ан тны х ДНК


Технологию рекомбинантных ДНК можно охарактеризовать
как результат достижений в области инженерии, как технологию
объединения in vitro различных молекул ДНК, чужеродных генов,
с последующей их репликацией в организме реципиента В этом
отличие технологии рекомбинантных ДНК от традиционной
клеточной селекции, основой которой являются мутации и реком­
бинации in vivo, в живой клетке.
Второе принципиальное отличие технология рекомбинантных
ДНК это технология соединения и клонирования совершенно
разного генетического материала (к примеру, объединение генов
прокариотных и >укариотных opi анизмов), что практически невоз­
можно при традиционной селекции Технология рекомбинантных
ДНК позволила преодолеть межвидовые, межт каневые барьеры,
благодаря успехам в обласi и молекулярной биологии, химии
нуклеиновых кислот, генетической этимологии
Традиционная селекция вначале достигает определенных
результатов по получению новых шта ммо в- ri ро дуце н i о в, сорта
растении, породы животных А потом по полученным феноти­
пическим результатам исследования проводите поиск детерми­
нирующего искомый результат гена (генов). А технология
рекомбинантных ДНК вначале программирует генетические
изменения, а затем получает искомый продукт, фенотипический
результат.
Некоторые исследователи технологию рекомбинантной ДНК
называют генной микрохирургией, но хирургией химической,
осуществляемой с помощью ферментов рестриктаз и лигаз.
Вместе с тем технология рекомбинантных ДНК это про­
должение традиционной селекции, это анализ результатов практи­
ческого применения мутаций и рекомбинаций при получении
мутантных организмов. Спонтанные и индуцированные мутации,
различные методы рекомбинаций (конъюгация, трансформация),
создание рекомбинантной молекулы ДНК in vitro - все это
46 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

эволюционные достижения клеточной и молекулярной генетики,


объектом исследования которой является ген.
Технология рекомбинантных ДНК не отвергла достижений
традиционной селекции, а, наоборот, основывается на них.
Прежде чем излагать технологию получения модифици­
рованных организмов целесообразно остановиться на механизмах
хранения и передачи генетической информации в клетке, при этом
отметив разницу между про- и эукариотными организмами.
Геном бактериальной клетки расположен в единственной
хромосоме (95-98% генетического материала) и в плазмидах
(2-5%). Жизненноважная, подавляющая часть генетической инфор­
мации локализована в хромосоме, представлена суперспирали-
зованной молекулой ДНК. ДНК состоит из двух спиралей, каждая
из которых включает определенную последовательность
нуклеотидов (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Основания эти
комплементарны: аденин одной цепи образует пару с тимином
другой, а гуанин таким же образом взаимодействует с цитозином.
Многомиллионные пары оснований формируют структурные гены
(примерно тысяча пар оснований в одном структурном гене),
последние кодируют синтез белков. Непосредственно прилежащие
к структурным генам последовательности оснований осуще­
ствляют контроль экспрессии этих генов в клетке - транскрипции
синтеза матричной РНК (мРНК) и трансляции - образования белка
с использованием мРНК в качестве матрицы на рибосомах/"
Регуляция транскрипции осуществляется промотором и
терминатором. Промотор —это короткий фрагмент ДНК, обла­
дающий высоким сродством к ферменту РНК-полимеразе, он
способствует перемещению фермента вдоль ДНК-матрицы,
инициируя тем самым процесс транскрипции кодирующей цепи
ДНК в точке, расположенной перед началом структурного гена.
Другой участок ДНК - терминатор, расположен на конце
структурного гена и служит сигналом окончания транскрипции.
Между промотором и структурным геном находится еще один
участок ДНК - оператор, который в присутствии избыточных
концентраций клеточного метаболита может связываться со
специальным белком - репрессором и препятствовать процессу
транскрипции.
/ | Технология рекомбинантной ДНК 47

Контроль трансляции белков ни рибосоме осуществляю] другие


последовательное I и, транскрибируемые в процессе образования
матричной РНК. Благодаря тому, что рибосомы присоединяюiся
к специальному участку мРНК, ответственному за связывание с
рибосомой, трансляция начинается со стартового сигнала -
первого кодона структурного гена; «стоп»-сигнал на конце гена
способствует высвобождению полностью синтезированной
белковой молекулы
Изменения внутри кодирующей области, к примеру, могут
изменить аминокислотную последовательность фермента и тем
самым повлиять на его активность. Незначительное изменение
последовательноети в промоторе может увеличить вероятноеть
связывания с ним РНК-полимеразы и таким образом повысить
скорость транскрипции. Мутации в зоне оператора и в гене-регу­
ляторе могут помешать присоединению реп рессора, что снимет
тапрет с транскрипции и существенно увеличит ее эффективность.
Гены, перенесенные в другой организм, могут жспрессироваться
в том случае, если промотор и участок свя «ывания с рибосомой
близки по своей структуре.
Генетический код и основные биохимические реакции процес­
сов транскрипции и трансляции одинаковы в прокариотных и
эукариотпых клетках. Но в структурных генах эукариот между
кодирующими участками ( жзонами) расположены некодирующие
вставочные последовательности интроны Нитроны транскриби­
руются вместе с кодирующими последовательностями «зонами,
но не экспрессируются Процесс вырезания интронов и объеди­
нения экзонов в непрерывную цепь называется сплайсингом, в
результате сплайсинга образуется зрелая матричная РНК (мРНК).
с которой транслируется белок. Наличие интронов затрудняет
экспрессию рекомбинантных ДНК в прокариотных клетках:
поскольку у бактерий нет ферментов, осуществляющих сплайсинг,
природный эукариотический геи, содержащий интроны должен
быть предварительно освобожден от некодирующих последова­
тельностей для последующей экспрессии в прокариотной системе.
На мРНК с помощью фермента обратной транскриптазы
реплицируется комплементарная нить ДНК (кДНК), затем при
помощи фермента ДНК полимеразы достраивается вторая нить
48 Глава 2. М икроорганизмы, используемые в биотехнологии

ДНК. Таким образом чужеродный ген экспрессируется в клетке -


реципиенте.
Геном прокариотной клетки, вирусов незначителен в сравнении
с геномом клеток растений и животных. Поэтому при использо­
вании в генетической инженерии генов вирусов либо бактерий,
определенный ген выделить из этих микроорганизмов не сложно,
но трудности возникают при поиске и выделение нужного гена из
огромного числа генов в клетке человеческого организма. Поэтому
проще в эукариотной клетке идентифицировать мРНК, транскри­
бированную с искомого гена (генов). В клетках животных транс­
крипция мРНК на цепи ДНК осуществляется в клеточном ядре;
матричная РНК переносит генетическую информацию из ядра в
цитоплазму, где на рибосомах идет трансляция белков. В про­
кариотных клетках, не имеющих оформленного ядра, процессы
транскрипции и трансляции идут параллельно, а мРНК изначально
связано с рибосомами.
Вышеизложенные некоторые особенности транскрипции и
трансляции, механизмы реализации генетической информации
лежат в основе технологий рекомбинантной ДНК.
Технология рекомбинантной ДНК следующая: первоначально не­
обходимо из клеток-доноров выделить нативную ДНК (клонируе­
мая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), за­
тем при помощи ферментов —рестриктаз расщепить ее в опреде­
ленных сайтах и освобожденный ген (гены) соединить при помощи
ферментов-лигаз с переносчиком ДНК - вектором (клонирующий
вектор) т.е получить in vitro рекомбинантную молекулу ДНК (рис.
21, 22).
Сконструированную таким образом рекомбинантную ДНК вво­
дят в клетку - реципиент, где она экспрессируется и кодирует синтез
соответствующих белков. По конечному белковому продукту или
по идентификации в клетке искомого гена (генов) определяют ре­
зультат клонирования.
Первый этап - это выделение необходимого для переноса в
другой организм гена (генов):
а) путем его рестрикции из ДНК-донора. Рестрикция или рас­
щепление ДНК на участках, имеющих определенные последова­
тельности нуклеотидов осуществляется ферментами - рестрик-
J Й Технология рекомбинант ной ДНК 49

гируюшими эндонуклеазами. При этом двуспиральная нить ДНК


расщепляется со сдвигом рамки считывания, гак что образуется
«ступенька» - одна из нитей ДНК выступает на несколько
нуклеотидов. Образуются однонигевые (липкие) концы. Если
встречаются 2 липких фра! мента ДНК, полученных действием
одной и иной же рестрадстазы, то в силу комплемент арности кон­
цевых последовательностей они легко вступают во взаимо­
действие:

А - А - Т - О - А- С 0 - 0 - А- Т- С - О
I I I
Т - Т - А -С - Т - О- 0 - 0 т - А- О - С

А-А -Т - С - А- С С - О - А -Т -С -О
шгаза

Т- т - А - С - Т -О * 0 -С Т - A -G -С

А -А -Т -О - А -С -С -О А Т-С-G

X - т - А -С -Т - О -G -С -Т - A -G -С

Нуклеотидная последовательность с липкими концами может


быть: I) присоединена к вектору, предварительно обработанному
той же рестриктазой и 2) превращена из линейной молекулы в
кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов Но
>та процедура не сложна, если речь идет о вирусах, имеющих не­
сколько десятков генов или о бактериях, насчитывающ их
несколько тысяч генов. А из генома живот ной клетки, где несколь­
ко миллионов генов выделить искомый ген можно:
б) используя метод химического синтеза коротких одно­
цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов), путем поэтап­
ного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшив­
ки олигонуклеотндов между собой посредством ДНК-лигазы с
образованием двухцепочных полинуклеотидов;
в) выделяя из клетки ■ донора не фрагмент ДНК. а транскриби­
рованную с нее мРНК - п о наиболее часто используемый метод.
На основе мРНК при помощи фермента обратной транскриптазы
50 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

Рис. 12. Схема трансформации


и отбора рекомбинантных штаммов Streptomyces.
Трансформированные клетки обозначены темными кружками,
не трансформированные - светлыми. ПЭГ - пол штилеиг ликоль.
2.в Технология рекошшнинтнои ДНК 51

Рис. I.V Клонирование рекомбнианчной ДНК


Доиорную ДНК расщепляют ресфи цирующеГt н ю я у и п к ! и встраивают
в клонирующий вектор. Полученную констру кцию вводят в поп> ляшно клеток-
хотясв, м н пифгои руи тс клетки, которые содержат реомбинантиую ДНК,
я культивируют и\ При необходимости можно индуцировать экспрессию
клонированного гена в клетках-хозяевах и получить кодируемый им белок
(пит. по Б. Г п к и др.. 2002).
52 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

(ревертазы) синтезируется нить комплементарной ДНК (кДНК);


затем на кДНК достраивается при помощи фермента ДНК-поли-
меразы вторая нить и таким образом получают ген, необходимый
для переноса в другой организм.
Второй этап. Выделенный из клетки - донора ген содержит
информацию о конкретном структурном белке, но сам по себе не
может реализовать эту информацию в клетке - реципиенте. Для
этого необходимы дополнительные молекулы ДНК, способные пе­
ренести искомый ген в клетку-реципиент и обеспечить его репли­
кацию в новом организме. В качестве переносчиков генетической
информации (векторов) используются плазмиды, а также вирусы
животных, бактериофаги. При получении трансгенных растений
наиболее типичный вектор - Ti-плазмида, выделенная из почвен­
ной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens
симбиотически взаимодействует с растением, при этом ее Ti-плаз­
мида трансформирует растительные клетки, перенося в их геном
Т-ДНК, вызывающий корончатый галл

Рис. 14. Интеграция Т-ДНК в хромосому растений и образование опухоли


коранчатого галла (по Э.С. Пирузян).

Соединение вектора с ранее выделенным геном осуществляет­


ся in vitro в пробирке, кольцевая молекула вектора разрезается
рестриктаэой с образованием «липких» концов, к которым присо­
единяют при помощи лигазы «липкие» концы переносимого гена.
Полученная конструкция и есть рекомбинантная ДНК, которую
далее необходимо ввести в клетку - реципиент.
I I Гсмммм рекамлшиштшт ДНА 53

Наряду со способностью переносить ген мишень ■споры дол­


жны иметь генетические маркеры (чаше это устойчивость к конк­
ретному антибиотику, определяемому по результатам посева на
селективные питательные среды), содержать достаточное коли­
чество сайтов рестрикций (участков, где кольцевая молекула ДНК
вектора может быть ра зре iana специфическими рестриктазами).
К сожалению, плазмиды не все! да обладают всеми при шаками век-
гора, поэтому их («ранее конструируют по заданным свойствам.
В то же время причиной преимущественного использования в
качестве вектора плазмид явлаетсв их высокая коиыогативмость
(способность проникать в клетку-реципиент) Они относятся к ес­
тественным структурным компонентам бактериальных клеток,
расположены в цитоплазме бактериальной клетки в виде кольце­
вой молекулы ДНК, способной к аатоиомиой репликации,
благодаря наличию в их составе сайта начала репликации (ол),
принимают участие в обмене вешеств бактерии, определяют те
или иные фенотипические признаки.
Третий m an Сконструированная рекомбинантная ДНК вво­
дится в клетку- реципиент, стабильно поддерживается, т.е реп*
лицируетса и передается последующим поколениям. Успешность
трансформации зависит от компетентности к лет к и-реципиента,
от экспрессирующей активности вектора, родственной блиюсти
генетического материала донора и реципиента.
Для успешной трансформации рекомбинантной ДНК в клетку
используются протопласты, применяется тепловое воздействие на
клетку - реципиент, вводитса раствор СаС1„ усиливающий про­
ницаемость клеточной мембраны В экспериментах прослежено,
что из 1000 клеток трансформация случается в 1-2 клетках. В пос­
ледующем существенно предохранение введенной рекомбинант­
ной ДНК от воздействия рестриктаз клетки - хозяина, которые
могут деградировать, расщепить чужеродную ДНК.
После введения рекомбинантной ДНК в клетку начинается его
экспрессия (транскрипция и трансляция ). Транскрипция внесен­
ного в микробную клетку чужеродного гена возможна лишь при
наличии перед этим геном сильного промотора, распознаваемого
РНК - полимеразой клетки хозяина Последняя детерминирует
транскрипцию РНК, которая транслирует синтез на рибосомах чу-
54 Глава 2. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии

жеродного белка. Опять же синтезируемый белок не должен под­


вергаться активной деградации клеточными протеазами; необхо­
дима ингибиция последних в клонированных клетках.
Существуют определенные проблемы, методические трудно­
сти в поддержании стабильности клона модифицированного мик­
роорганизма, связанные с тем что при смене поколений в
популяции некоторые клоны теряют плазмиды, содержащие ре­
комбинантный ген. Клетки, лишившиеся плазмид обычно растут
■ размножаются быстрее тех, кто сохранил плазмиды. В итоге в
популяции начинают доминировать безплазмидные, исходные ва­
рианты микроорганизмов.
Среди различных определений сути технологии рекомбинант­
ной ДНК есть и определение ее как химической микрохирургии,
осуществляемой ферментами - микроскальпелями, которые под­
разделяют на несколько групп:
- ферменты, расщепляющие молекулу ДНК в определенных сай­
тах узнавания на более малые фрагменты. Существует 3 типа ре-
стриктирующих эндонуклеаз (1,11,III). В генетической инженерии
в основном применяют рестриктазы II типа, обладающие свой­
ством узнавать и расщеплять ДНК в строго определенных участ­
ках нуклеотидной последовательности; расщеплять с образова­
нием «липких» концов, необходимых для последующего соеди­
нения с векторной ДНК. Рестриказы специфичны по сайтам узна­
вания и расщепления, насчитывается их несколько сотен;
- фермент, синтезирующий комплентарную нить ДНК (к ДНК)
на мРНК, так называемая РНК-зависимая ДНК-полимераза или
обратная транскриптаза или ревертаза;
- ферменты, участвующие в построении второй нити к ДНК
путем удлинения цепи ДНК в направлении 5--3 - за счет присое­
динения комплементарного нуклеотида - это ДНК- полимеразы.
- ферменты, соединяющие фрагменты расщепленной ДНК в
кольцевую нить - это лигазы;
- ферменты, катализирующие реакции гидролиза нуклеино­
вых кислот, деградирующие мРНК после осуществления транс­
ляции либо чужеродные молекулы ДНК - это нуклеазы.
ГЛАВА 3 . М и к р оор ган и зм ы м о г у т и сн о л ы о в а т ь ся с
РАЗЛИЧНОЙ ЦЕЛЬЮ

1. Клетки микрооргами чмов


Жизнеспособные, биологически активные микроорганизмы
используются в медицине и ветеринарии (пробиотики), сельском
хозяйстве (биоудобрения и биоинсектициды), в пищевой
промышленности (закваски), в рсмидиации окружающей среды
(биодеструкторы) и в очистке сточных вод (сообщество микро­
организмов активного ила), в бногеотехнологии (выщелачивание
металлов), в качестве пищевою и кормовою белка (инактиви­
рованная биомасса микроорганизмов)
В вышеперечисленных отраслях используются также
микроорганизмы, иммобилизованные на носителе.
2. Метаболиты микроорганизмов
Первичные н вторичные метаболиты микроорганизмов,
образующиеся в процессе их жизнедеятельности широко
применяются в различных сферах промышленности Основные
биопродукты антибиотики, ферменты, органические кислоты,
аминокислоты, витамины и полисахариды
3. вакцины, содержащие целые микробные клетки (живые и
убитые) или компоненты клеток (субъединичные) возможно
выделить как биообъект в отдельную группу, применяемую в
качестве не биопродуктов, а антигенспецифического стимулятора
иммуного ответа.
Вакцины, осажденные на адъювантах, также можио рас­
сматривать как иммобилизованные микробные клетки. Адыоваиты -
это минеральные масла, фосфат алюминия, фосфат кальция,
адъювант Фрейнда и др. Они стабилизируют, пролонгируют и
усиливают иммуностимулирующее действие вакцин.
56 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

Таблица!. Микробиологическая продукция


Биомасса микроорганизмов Метаболиты микроорганизмов
- пищевой и кормовой белок • аминокислоты
- пробиотики и закваски - ферменты
- вакцины и диагностику мы -антибиотики
- биоудобрения и биопестициды - витамины
- органические кислоты
1 полисахариды
Живые микроорганизмы используются в качестве: Генно-инженерная продукция:
- биодеструкторов органических загрязнений и - инсулин, интерферон и др.
ксенобиотиков - антитела одноцепочечные и др.
- сообщества активного ила
- при выщелачивании металлов

3.1. Ж ивы е микроорганизмы , микробная би ом асса


Пищевой и кормовой белок
Инактивированная микробная биомасса наряду с питательной
ценностью рассматривается как функциональная добавка к пище,
придающая определенный вкус и аромат, вязкость или раство­
римость, пенообразование и др. В качестве кормовой добавки
микробные белки оцениваются по питательным свойствам.
Термин «белок одноклеточных» вошел в обиход с 1966 года
(single cell protein, SCP). В Мексике из высушенной биомассы
микроводорослей Spirulina пекутся лепешки, в Германии в период
I мировой войны дрожжи Saccharomyces cerevisiae добавляли в
супы, колбасы, во время II мировой войны в качестве пищевых
добавок использовали белки Candida spp.
При наращивании биомассы микроорганизмов в качестве белка
чаще используются дрожжи, а также микроводоросли и бактерии.
Среди дрожжей наиболее известны в биотехнологии микро­
организмы рода Saccharomyces, особенно Saccharomyces
cerevisiae, широко используемые не только в качестве белковой
массы, но, прежде всего в виноделии, пивоварении, хлебопечении.
Дрожжи апатогенны, хорошо растут на дешевом субстрате,
растут быстрее, чем грибы или актиномицеты, обладают устой­
чивостью к кислой среде. Быстро наращивается биомасса, клетки
дрожжей крупнее, чем бактериальные, поэтому легче отделяются
от культуральной жидкости при центрифугировании. Гибридные
штаммы дрожжей отличает высокая ферментативная активность,
стабильность при хранении.
I. / Живы* микробном биомасса 57

Клетки этих микроорганизмов хорошо усваиваются и


перевариваются в организме. А по содержанию лизина, треонина,
валика и лейцина значительно превосходя! многие растительные
белки.
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragitis. Candida utilis,
Candida arhorea добавляют к пищевым продуктам, добавляют к
мучным и мясным продуктам, что повышает питательную
ценность, содержание витаминов, вкусовые качества. В Англии с
1980 г. разрешено в питании людей использовать микробную
массу Aspergillus graminearum в качестве мукопротеина
В животноводстве наряду с Saccharomyces tpp и Candida spp.
как кормовая добавка используется Spirulina, а также Scenedesmm
и Chlorella. Микроводоросли синтезируют белки из диоксида
углерода, воды и минеральных веществ за счет энергии солнечного
света. Микроводоросль Spirulina platensis содержит до 70% белка,
хорошо переваривается, имеет приятный аромат, в ней мало
нуклеиновых кислот (44), много В,г микроэлементов; муко­
протеиновая оболочка хорошо переваривается в отличие от
целлюлозной клеточной стенки многих других водорослей.
Спирулина не токсична, содержащиеся в клетке липиды состоят
из ненасыщенных жирных кислот, из которых не синтезируется
холестерин.
Среди прокариотов как кормовой белок используется биомасса
почти 30 видов бактерий, в том числе из родов Мethylococcus,
Methylomonas, Pseudomonas, Acinetobacter.
Реже в качестве кормового белка используется мицелий грибов
Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma. Они содержат в
своем составе комплекс ароматических веществ, улучшающих
вкусовые качества. По сравнению с дрожжами содержат больше
серосодержащих аминокислот, но в целом у них меньше белка в
клетке и растут они медленно.
Е м у тобрсния
Микроорганизмы фиксирующие атмосферный азот не только
снабжают растение источником азота, также синтезируют
гормоны, стимулирующие рост растений, проявляют антагонизм
к фитопатогенам .
58 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

Землеудобрительные препараты, содержащие биомассу живых


клубеньковых бактерий применяют в сельском хозяйстве более
100 лет, урожай повышается на 5-20% (соя, фасоль, горох).
Используются следующие группы мокроорганизмов:
- клубеньковые бактерии родов Rhizobium (быстрорастущие)
и Bradyrhizobium (медленнорастущие); препарат нитрагин;
бобовые культуры (Rh. trifolii - клевер, Rh. japonicum- соя, Rh.
faseoli- фасоль, Rh. lupini—люпин и др.);
- Frankia, актиномицеты, осуществляют, как и ризобии
симбиотическую азотфиксацию в корнях деревьев и кустарников;
- Azotobacter, препарат азотобактерин, в основном для оран­
жерейных и парниковых растений, свободноживущие микроорга­
низмы, несимбиотическая азотфиксация;
- Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum и другие прокариоты
осуществляют несимбиотическую, ассоциативную азотфиксацию
(в ризосфере, на ризоплане —поверхности корня). Среди этой
группы бактерий встречаются фитопатогены, к примеру,
Agrobacterium tumefaciens;
- Синезеленые водоросли (цианобактерии) Tolypothrix tennis
Anabaena cylindrica, Nostoc linckia и др. За вегетационный период
связывают до 50 кг атмосферного азота на 1 га, но для их
культивирования нужно много воды и солнечных лучей.
Биоинсектициды
Более 1 млн. видов различных насекомых, в том числе вреди­
тели урожая, переносчики болезней. Наряду с химическими
пестицидами достаточно широко в качестве энтомопатогенных
препаратов применяется биомасса живых бактерий и грибов, а
также бакуловирусы.
Один из наиболее вирулентных для насекомых бактерий-
Bacillus thuringiensis. С. Исивата выделил этот микроорганизм из
погибшей личинки шелковичного червя и назвал ее Вас. sotto.
Однако более детально она изучена и описана в 1915 году Е. Бер­
линером и названа В. thuringiensis. В 1938 году препарат из этой
культуры начали применять во Франции как инсектицид. Раз­
личные штаммы В. thuringiensis (35 серотипов) синтезируют
токсины, безвредные для животных и растений, но специфичные
в отношении определенных видов насекомых, в том числе:
J. /. Ж м и м икриорганиш ы . микробная бш ш лекв

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki- моль, бабочки, личинки


гусеницы;
В. thuringiensis subsp. israelensis комары, мошки:
В thuringiensis subsp. tenebrionis колорадский жук, хлоп­
ковый долгоносик.
Также энтомогтатогенностью обладаю! Bacillus sphericus
(комары), Pseudomonas spp. (жук, саранча), из семейства нмеро-
6ак 1ерий - Serratia marcescens и Entervbacter aerogtnes и т.д.
Хорошо известны препараты для уничтожения вредных насе­
комых, изготовленные из биомассы грибов:
Beauveria hasxiana (колорадский жук),
Metarhizium anisopliae (клопы на пастбищах, жук-носорог
поражающий пальмы),
- Verticilium lecanii (тля и алейродид в оранжереях)
В качестве биоинсектипила против саранчи применяется
биомасса простейших Nose та locuslae. Ьаку.ювирусы (вирус
ядерного полиэдроза, вирус гранулеза и др.) также инфицируют
насекомых в естественных условиях, но технология разработки
биопрепаратов на их основе сложна.
Ьиодмрадаиив ксеиобиошков и токсичных соединений
Существуют два проблемы по очистке окружающей среды:
переработка отходов, постоянно образующихся а огромных
количествах и разрушение токсичных соединений, десятилетиями
накапливающихся на свалках, в почве и воле
Ксенобиотики (xenos чужой) пестициды, органические
растворители, моющие средства, пластмассы, полиэтиленовая
пленка, нефть и нефтепродукты, лакокрасочные, синтетические
фармпрепараты и др. 'Это сложные по химическому составу соеди­
нения, в том числе галогеннэироаанные и негалогенизированные
ароматические вещества.
Многие микрооргаиишы почвы и воды способны к быстрой
адаптации своих ферментативных систем к утилизации антро­
погенных загрязнений, чаше при температуре 0-20 С.
В качестве микроорганизмов биодеструкторов используются:
- грамотрнцательные бактерии - Pseudomonas. Alcaligenes,
Acinetobacter. Flavobacterium, метаноокисляющие и нитрифи­
цирующие;
60 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

- грамположительные - Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus,


Bacillus, некоторые представители нитрат - и сульфатредуци-
рующих бактерий, а также метаногенные археи;
- в процессах биодеградации участвуют грибы Penicillium,
Aspergillus, Fusarium.
Среди бактерий высокой биодеструктирующей способностью
обладают Pseudomonas, расщепляющие более 100 органических
соединений, благодаря наличию многокопийных автономных или
интегрированных в хромосому плазмид деградаций. Они детер­
минируют синтез широкого спектра индуцибельных ферментов
(оксидоредуктазы, гидролазы и др.), разлагающих углеводороды,
ароматические соединения. Плазмиды деградации имеют
Alcaligenes и Arthrobacter.
В природных условиях в процессах деградации и детоксикации
участвуют гетерогенные микробные сообщества.
Микробное сообщество активного ила
Принцип «отходы в доходы» и «не навреди природе» сегодня
не менее актуален, чем вчера.
Способ очистки сточных вод активным илом существует с
1914 г, основная цель - удаление органических веществ (угле­
воды, белки, мочевина, жироподобные вещества и др.).
Активный ил содержит микроорганизмы, способные к дегра­
дации органических загрязнений; имеет поверхность с большой
адсорбционной способностью; образует флокуллы, легко осаж­
дающиеся при отстаивании.
Микроорганизмы: бактерии, грибы, простейшие; иммобилизо­
ванные и в свободном состоянии. Бактерии Zooglea ramigera,
продуцирующие слизь, образуют слизистую биопленку, где
размножаются фиксированные группы микроорганизмов.
Свободные клетки микроорганизмов активного ила поглощаются
инфузориями Verticella и Opercularia.
В составе активного ила:
- бактерии Z. ramigera, Leucothrix, Thiothrix, Nitrobacter,
Acinetobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Rhodococcus, Bacillus,
Clostridium, Corynebacterium, Arthrobacter, Methanosarcina,
Methanotrix и др. В бактериальном сообществе доминируют
Zooglea ramigera, Leucothrix, Triothrix\
t . l . Ж ивы* м ик/ш ир/ани 1Мы, миьройнии оиомш <и 61

среди грибов - Aspergillus, Мисок Torula. Thermuphita и др.


По мнению и сследователей, идентифицировано лиш ь 5%
микробного сообщества активного ила. в 95% пока неизвестны.
Бактерии, выщелачивающие м е т а л л ы
Бактериальное выщелачивание - это процесс растворения
металлов (Zn, Ni, Со, С г. РЬ, Си и др.) иди их *стракциа из
минералов, находящихся либо в горных породах, либо в форме
минеральных концентратов. Экстракция осуществляется и счет
окисления в водной среде сульфидов до растворимых сульфатов
хемолитотрофиыми ацидофильными бактериями:
1) грамотрицатсльные: At idothiobatUlus thiooxidans. A. ferro-
oxidans, A. caldus, Lepiaspirillum jerrooxidans;
2) грамиолож ительные: Sulfolobus therm osulfidooxidans. S.
acidophilus,
3) археи: Acldianus brierleyi, Metallosphaera sedula. Sulfolobus
metallicus, Ferroplasma acidiphilum.
Скорость окислительных процессов зависит от соотношения
хемолитотрофиых ацидофильных бактерий с ацидофильными
гетеротрофамн. К последним относятся: Acidiphihum cryptum, Ac
angustum, Ac. ruhrum Ac facilis Они способствуют выщелачи­
ванию металлов хе мол итотроф н ы м и микроорганизмами
В бйогеотехноло! и и микроорганизмы также используются для
удаления мегана из угольных пластов, увеличение добычи нефти
(микрооргани )мы снижают поверхностно-активные вещества,
снижают вязкость нефти). Bacillus. Pseudomonas. Micrococcus.
Methanococcus. Desulfovibrio и др
Заквасочны е культуры
Микроорганизмы, чаще их ассоциации, используемые в техно­
логиях, основанных на бродильных процессах (неполное разло­
жение органических соединений) относятся к заквасочным или
стартовым культурам
Стартовые культуры, как биологический объект, способствуют
созреванию, повышению пищевой и биологической ценности,
улучшению органолептических свойств сбраживаемого продукта.
В основном зто ассоциации следующих родов
62 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

- Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus- при


приготовлении кислом олочны х продуктов (айран, кефир,
простокваша);
- Streptococcus, Lactobacillus, Penicillium, Propionibacterium —
мягкие и твердые сыры;
- Saccharomyces - хлебопечение;
- Saccharomyces, Torulopsis, Aspergillus - созревание мяса и
рыбных продуктов;
- Saccharomyces, Zymomonas- спирт;
- Saccharomyces, Pediococcus, Leuconostoc-ъшю;
- Saccharomyces -пиво.
Наиболее часто в стартовых куьтурах применяют следующие
виды микроорганизмов:
- Saccharomyces cerevisiae var. carlsbergensis, Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoides,
- Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus
thermophilus, Streptococcus diacetolactis,
- Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus
fermentum,
- Penicillium roqueforti,
- Propionibacterium shermanii.
В целом эти микроорганизмы отличает ферментативная актив­
ность и кислотоустойчивость, устойчивость к концентрации
этанола и высокая продукция органических кислот, синтез
ацетоина, ацетальдегида, диацетила.
Пробиотики
Пробиотики - это консорциум живых микроорганизмов и их
метаболиты, улучшающие физиологические функции и нормали­
зующие микроэкологию организма.
Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков чаще
являются представителями нормальной микрофлоры человека, его
кишечного и генитального биотопов либо ротовой полости. Они
характеризуются следующими свойствами: отсутствием побочных
эффектов, антагонизмом к болезнетворным микробам, высокой
адгезивностью , антибиотикорезистентностью ; синтезирую т
амино- и органические кислоты, витамины, летучие жирные
кислоты; обладают иммуностимулирующим эффектом.
i. I Живые MUKpoopsaHu мы , чикробнам бвтмтсеш 63
3 2 Ичмопи id тианныг микроор.'антмы

Пробиотические микроорганизмы, используемые в животно­


водстве чаще выделены из opi анизма здоровых сельско-хозяйст-
венных животных.
В технологии создания пробиотических препаратов в основном
используются молочнокислые бактерии, реже бациллы, ниерихии
и др. Состав некоторых пробиот ических препаратов
- Lactobacillus rhamnosum, Lh casei, Lh faecium бактолакт
(Япония),
- Lb hulgaricvt, Lb acidophilus Bifidobacterium Ion gum В
bifidum, Streptococcus thermofllus нормофлор (Франция),
- Lactobacillus. Bifidobacteriurn, Streptococcus линекс (Россия).
Bacillus subiilis, В cereus биоспорми (Украина).
В bifidum, Escherichia coli бификол (Россия).
В ж и во i но воде гве при n il отоплении пробно«иков также
доминируют кисломолочные микроор! анизмы, но иногда в их
состав вводятся Saccharomyces cerevisiae, Candida spp , Aspergillus
orizae, Asp. niger.
3.2. Иммобилизованные микроорганизмы
Подавляющее большинство м и кроорг а ни ш ов встречается в
природе в прикрепленном, нммобилизованном состоянии: в виде
биопленок, образуя noiружейные в слизь микроколонии или в виде
наростов на тверд»»м субстрате Преимущество использования
иммобилизованных микроорганизмов в биотехнолгии в повы­
шении стабильности, ;ци тельном сохранении активности, возмож­
ность полного и быстрого отделения целевого продукта и др.
Используются инактивированные или живые, покоящиеся клетки
к стационарной фазе развития. И м м обилизованны е ми кро-
органи 1мы применяются в биотехнологии при биотрансформации
органических соединений, разделении рацемических смесей
аминокислот, гидролизе ряда сложных >фиров и др..
- Acetobactcr aceti адсорбированный на древесных стружках
трансформирует этанол в уксусную кислоту;
- Lactobacillus delbrueskii —адсорбированный на полиакрила­
мидном геле (ПАЛП, получение из крахмала молочной кислоты.
* Escherichia coli ПААГ, биотрансформ ация фумарата
аммония в I. аспарагиновую кислоту';
64 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

- Е. coli - ПААГ или каррабинон, гидролиз пенициллина до


6-аминопенициллановой кислоты;
- Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes— в составе биопленок,
флокулл участвуют в очистке сточных вод.
В электронике м икроорганизм ы , им м обилизованны е на
диализных мембранах с помощью кислородных электродных
датчиков способны определять минимальные концентрации
следующих веществ:
- Brevibacterium lactofermentum - сахара,
- Methylomonas flagellata - метан,
- Pseudomonas fluorescens — глю козу (такой глю козны й
электрод позволяет определять в образце l O ’- l O 5 молекул
глюкозы, электрод активен в течение 4 месяцев) и др.
Генетически модифицированные микроорганизмы
Создание генетически модифицированных микроорганизмов
преследует ту же цель, что и селекция мутантов - сверхпро­
дуцентов. Это повыш ение качества и количества конечного
продукта, усиление биосинтезирую щ ей и деградирую щ ей
активности штамма и др.
Вместе с тем технология рекомбинантных ДНК открывает
принципиально новые возможности - синтез эукариотных белков,
биологически активных веществ не микробного происхождения
в прокариотных клетках.
Следующие генно-инженерные методы создания генетически
модифицированных продуцентов сегодня отработаны в лабо­
раториях и в некоторых случаях использую тся в производ­
ственных масштабах:
- оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариот­
ных клетках (сильные промоторы, мультикопийность плазмид,
интеграция плазмидных векторов в хромосому клетки-реципиента,
слияние генов, детерминирующ их целевой продукт с геном
сигнального пептида, ответственного за секрецию);
- объединение разных метаболических путей биосинтеза или
катаболитной деградации в одной прокариотной клетке путем
переноса генов детерминирующ их синтез соответствую щ их
ферментов из одного микроорганизма в другой;
i. i. И нмобили иншнные ш*лрааргя «и»змы

- клонирование генов эукариотных белков, биолог ически актив­


ных веществ (инсулин, фактор роста фибробластов и др.) в про­
кариотной системе;
химический синтез небольшого числа генов, аналогичных
природному фрагменту ДНК, лигирование с вектором и после­
дующее клонирование;
направленный мутагенез внесение изменений в последо­
вательность кодируемой ДНК, приводящее к определенным изме­
нениям аминокислотной последовательности в синтезируемом
белке-ферменте (повышаемся его стабильность, активность,
специфичность действия);
клонирование генов синтеза ферментов, позволяющих про­
дуценту расти на доступных, дешевых субстратах.
Ниже приведены некоторые i енетически модифицированные
биообъекты:
- E.coli - синтез инсулина, соматотропина, интерферона;
- Aspergillus nidulans секрет ирует интерферон,
- Bacillus licheniformis интерлейкин,
- Xanihomonas campestris - растет на широко доступном
субстрате, на молочной сыворотке в отличие от природного
штамма;
- Вас.thuringiensis объединены гены токсинов 4 подвидов
(subsp.aizawai. kurstaki, israelensis, tenebnonis ) в 1 подвиде
Вас. th. subsp. kurstaki;
- Sacch.cerevisiae - а) клонирован геи гауматита, растительного
белка, превосходящего сахарозу по сладости в 3000 раз;
б) экспрессирован ген, кодирующий синтез фермента ф-тлкжо-
назы, расщепляющей [5-глюкан и тем самым осветвляющий пиво:
в) клонированы гены, позволяющие модифицированному
штамму расщеплять крахмал до тганола (природный - только до
глюкозы);
г) клонированы гены синтеза HBs антигена гепатита В, белка
оболочки вируса СПИД, колоннестимулирующего фактора
гранулоцитов, фактора роста фибробластов и др.;
- Envinia herbicola - клонированы гены Connebacteriит spp..
ответственные за синтез фермента, катал изируюше! о превращение
2,5-дикето-Д-глюконовон кислоты в 2-кетo-L -гулоновую кислоту
66 Г ла ва 3. М икроорганизм ы м огут использоват ься с различной целью

Природны й ш тамм E.herbicola способен синтезировать только


2,5-дикето- Д -глю коновую кислоту из Д -глю козы , т.е. 2 м ета­
болические реакции синтеза промежуточного продукта витамина
С объединены в одном микроорганизме.
3.3. М икробные метаболиты

А м инокислоты
Для синтеза аминокислот используются ауксотрофные штаммы
- сверхпродуценты .
М икробиологическим синтезом получаю т глю там ин, ф ени­
лалан ин, лизин, лейци н, L -асп ар аги н о ву ю ки сл о ту , аргини н,
ти рози н , валин и др. Н еко то р ы е ам и н о к и сл о ты (три п тоф ан ,
треонин) получают генно-инженерным путем. В наиболее крупных
масштабах производится глютамин, лизин и метионин. Основные
продуценты грамположительные бактерии, реже дрожжи. К при­
меру, Corynebacterium glutamicum - грамположительная палочка,
более древн ий в эволю ционном отнош ении м икроорганизм в
отличие от грам отрицательны х; с хорош о изученными путями
биосинтеза аминокислот из промежуточных продуктов гликолиза,
п ен тозоф о сф атн о го цикла, Ц ТК; си н тези р у ет ам инокислоты ,
принадлежащие к нескольким семействам; с низкой активностью
в н у т р и к л ет о ч н ы х п р о т е и н аз, п о это м у с и н те зи р у ем ы е этим
м и к р о о р ган и зм о м б ел ки - ф ер м е н ты , ам и н о к и с л о ты д о л го
остаются в активном состоянии. Некоторые примеры:
• Г лю там ин, ф ен и л ал ан и н - C orynebacterium glutam icum ,
Brevibacterium flavum, Micrococcus
• Лейцин, аспаргиновая кислота - Brevibacterium lactofermentum
• Лизин - Corynebacterium glutamicum
• Аргинин, тирозин, валин - B.subtilis, Brevibacterium flavum,
Corynebacterium glutamicum
• Т р и п то ф ан - ге н е т и ч е с к и м о д и ф и ц и р о в а н н ы е ш там м ы
Corynebacterium glutamicum, B.subtilis, Candida utilis
• Треонин - генетически модифицированные штаммы E.coli К12.
Ф ерменты
Ф ерм енты синтезирую тся ж ивы м и клеткам и, в том числе
микроорганизмами, накапливаются внутри клеток или выделяются
i J М икробные метаболиты Ы

во внеклеточную среду. Применяю тся в пищевой отрасли, произ­


водстве сп и рта и п и воварен ии, кон ди терской, кож евенной,
целлю лозобум аж ной промышленности, в производстве моющ их
средств и м едицин е; наиболее востребованы внеклеточны е
гидролизы (ам илазы , пектина зы, протеинам, i лю коизом еразы и
др.); основны е продуценты микроскопические грибы и бациллы,
а также дрожжи, актиномицеты и друт ие бактерии
Наиболее широко в биотехнологическом производстве исполь­
зуются гидролизы
(X-амила «а В suhtillis, В luheniformis, Aspergillus oryzae. Asp.
awanwri, Asp niger;
- Г л ю козоизомеразы : Bacillus spp., Streptomyces sp p . Asp niger;
П ектин азы : Bacillus ч р р Aspergillus spp . Fusarium spp.,
Penicillium spp.;
- flp o re n пазы: Bacillus t pp . Aspergillus spp Penk illium spp.;
Ц еллю лазы : Clostridium spp , Trichoderma spp . Aspergillus
spp., т.д.;
Щ елочная ф осф атаза В suhtihs
А нти би оти ки
О сновны е продуценты антибиотиков выделены из почвенной
микрофлоры, это сапрофиты, аэробы я анаэробы, гетеротрофы; в
основном мицелиальные грибы, актиномицеты и спорообрв'эуюшме
бактери и.
Образуются антибиотики из первичны х метаболитов м икро­
о р г а н и зм о в (аминокислоты, у гл ев о д ы , азо т и с т ы е основании,
жирные кислоты и др.) путем их конденсации, полимеризации с
последующей модификацией.
О дин вид м икроорган изм ов мож ет продуцировать в зави си ­
м ости о т у слови й к у л ь т и в и р о в а н и я р азн ы е ан т и б и о т и ч е ск и е
вещ ества и. наоборот, сходны е по природе антибиотики си н те­
зируются разными таксономическими группами.
С и н тези р у е м ы е м и к р о о р ган и зм а м и а н ти б и о ти к и н ак ап л и -
I вам гея внутри клеток (грамицидин С, эндометацин, нистатин), как
в н у т р и , та к и в н е к л е т о ч н о (р н с то м и ц н н , к а н д и и и д и н ), л и б о
п р е и м у щ е с т в е н н о в ы д е л я ю т с я и з к л е т к и (с т р е п т о м и ц и н ,
тетрациклин, макролиды).
68 Г ла ва 3. Микроорганизмы могут использоваться с различн ой целью

Наиболее известные продуценты антибиотиков:


- Грибы - Penicillium chrysogenum и Aeromonium (Cephalospo-
rinum) chrysogenum - пенициллины и цефалоспорины;
- А к ти н о м и ц еты - про д у ц ен ты п очти 70% п р и м ен яем ы х
антибиотиков из родов Streptomyces и Micromonospora - стрепто­
мицин, гентамицин, тетрациклин, неомицин и др. Актиномицеты
основные продуценты антибиотиков. Только один вид Streptomyces
griseus продуцирует около 50 антибиотиков.
- Бактерии - Bacillus polymixae, В.brevis, B.subtilis, Streptococcus
lactis и др. (полимиксин В, грамицидин С, субтилин, низин).
С то л ь ж е акти в н ы и д р у ги е гр у п п ы а к т и н о м и ц е т о в как
п р о д у ц ен ты а н т и б и о т и к о в : P seudonocardia, A ctinom odura,
Dactilos. По-видимому, актиномицеты обладают непревзойденной
способностью синтезировать антибиотики, благодаря высокой
с т еп ен и о б м ен а ге н е т и ч е с к и м м а те р и а л о м , п р и су тстви ем
м ногокопийны х плазм ид, детерм инирую щ их продукцию этих
вторичны х м етаболитов. Кроме того, актином ицеты обладаю т
ш ироким набором ферментов, их используют для биотрансфор­
м ации ар о м ати ч ески х в ещ еств, с тер о л о в и стер ои дн ы х с о е ­
динений, для деградации трудно разлагаемых соединений. Также
ак ти н о м и ц е ты н а к а п л и в а ю т эк с тр а ц е л л ю л я р н о д о ст а т о ч н о
ш ирокий спектр ам инокислот, однако активность к подобной
продукции весьма низкая.
А н ти б и о ти к и п р и м ен я ю тся в м ед и ц и н е, в е т ер и н ар и и и
ж и вотн о во дстве, пищ евой и кон сервной п ром ы ш лен н ости , в
сельском хозяйстве.
О рганические кислоты
О рганические кислоты , продуцируемы е м икроорганизм ам и,
являю тся про м еж у то ч н ы м и (и н те р м е д и а ты ) или кон ечн ы м и
продуктами расщепления углеводородсодержащ их органических
с о е д и н е н и й . Д ля ан а эр о б н ы х м и к р о о р ган и зм о в м о л о ч н ая,
масляная и пропионовая кислоты являются конечными продуктами
метаболизма углеводов. Кислоты, образуемые аэробными микро­
организмами являются интермедиатами катаболизма источников
углерода. Так, глюконовая, винная кислоты - это интермедиаты
i . i Микробные иетиоо.читы 69

прямого окисления глюкозы; лимонная, янтарная, фумаровая и


яблочная интермедиа! ы цикла трикарбоновых кислот; уксусная
кислота - продукт неполного окисления этанола Промышленные
продуценты ороническия кислот:
■ Молочная кислота: в 1847 г С .Блондо впервые показал, что
молочная кислота получается в результате брожения; JI. Пастер
установил, что брожение вытыкают микроорганизмы; в произ­
водстве молочной кислоты используют гомоферментативны е
молочнокислые бактерии L plantarum, L casei, St г lac tis:
- Лимонная кислота: Aspergillus niger, Candida lipolytica;
- Уксусная кислота: Acetohacter suboxidans, G luconobacter
suboxidans;
- Глюконовая кислота: Aspergillus suboxidans, Gluconobacter
ox (dans;
- Винная кислота: Gluconobacter suboxidans.
- Яблочная и фумаровые кислоты: Rhizopus nigricans;
• Янтарная кислота: B acterium succinic urn,
- Пропнонован кислота: Propionibacteriurn skermanii;
- Итаконовая кислота: Aspergillus ten us. Aspergillus itaconu us.
Применяются органические кислоты в фармацевтической,
пищевой, текстильной, кожевенной и химической промышлен­
ности, металлургии и др.
П олисахариды

Полисахариды или глюканы, состоят из моносахаридов одного


или нескольких типов, входят в состав клеточных стенок микро­
организмов, выделяются из клеток. Внеклеточные полисахариды
(декстран. ксантан, леван, хитин и др.) применяются в нишевой,
химической, фармацевтической и технической промышленности,
медицине, гидрометаллургии, при добыче нефти:
- Декстран Leuconostoc m esenteroides, Leuc.dextranicum.
Streptococcus mu tans, Str.viridans, Strviscosus.
- Ксантан Xanthomonas campestris, X.phaseoli. X juglandis.
Кормонан, лентинан, пахнман выделены из биомассы
базиднальных грибов Coriolus versicolor. Lentinus edodes, Poria
cocos.
70 Глава 3. Микроорганизмы могут использоваться с различной целью

Витамины
Витамины, водо —и жирорастворимые, применяют в медицине
и сельском хозяйстве, получают химическим и микробиоло­
гическим синтезом.
- Кобаланин, В ]2- Propionibacterium freudenreichii var.
shermanii, Pseudomonas denitrificans;
- Рибофлавин, В, - Eremothecium ashbyii, Ashbya gossipii,
B.subtilis, Asp.niger;
- Бета-каротин - Blakeslea trispora, (+) и (-) штаммы;
- Никотиновая кислота, РР - Sacch.cerevisiae, Brevibacterium
ammoniagenes;
- Аскорбиновая кислота, С - Gluconobacter oxydans, также
Erwinia punctata, Corynebacterium spp. (получают путем биотранс­
формации).
В кормопроизводстве в качестве продуцента В 12 используют
Brevibacterium spp. Витамином Д2 обогащают кормовые дрожжи
путем облучения ультраф иолетовы м и лучами биомассы
Sacch.cerevisiae, содержащей эргостерин, предшественник этого
витамина.

3.4. Биотрансформация
Наряду с биосинтезом метаболитов в биотехнологии исполь­
зуется и биотрансформирующая способность микроорганизмов.
Биотрансформация - это результат изменения молекулярной
структуры трансф орм ируем ого субстрата под действием
индуцибельных ферментов микроорганизмов, т.е. превращение
субстрата в структурно сходный целевой продукт. Но это не
биосинтез молекул de novo. Биотрансформация осуществляется
в результате ферментативных реакций: гидроксилирование,
дегидрирование, окисление, восстановление, изомеризация и др.
Биотрансформирующая способность присуща микроорганизмам
различных таксономических групп.
Бактерии: Acetobacter suboxidans, Gluconobacter suboxidans,
Corynebacterium simplex, Mycobacterium globiforme. Streptomyces
spp., Pseudomonas spp. и др.;
.1 4 buompuut формации 7»

Грибы Aspergillus niger, Rhizopus nigricans, Tieghemella


acchidis, Curvularia lunatu и др.
Ьиотраисф орм ирую ш ая способность микроорг ани j m o b
Используется при получении следующих биопрепаратов:
путем неполного окисления этанола получают уксусную
кислоту Gluconobacter subox idans. Ai etobacter suhoxidans;
путем де<идрирования h i Д-сорбита получаю l L-сорбозу
(необходимую для синтеза витамина С) Acetohacter suhoxidans.
ит стероидов и стеролов путем i идроксилироваииа или
дегидрирований получают i идрокортиш и. п ре дни лон,
преднитолои, прогестерон Rhizopus nigricans. Rh arrhizus,
Mycobacterium globiforme, Cunninghamella hlalesleeana,
Streptomyces argenteolus, Arthrobacter simplex
(идролит пенициллина до 6-аминопснипи.ыановой кислоты
(6 Л 11К ). используем ой в получении пол ус и н i е т и ч ес к их
пенициллинов Bacillus megaterium. Е coli
ГЛАВА 4 . Ф ерм ентационная техн ологи я

Ферментационная технология в промышленных масштабах


реализует результат микробного синтеза и брожения:
- ф ерм ентация основана на росте и разм нож ении
микроорганизмов в условиях биореактора и нацелена на получение
биомассы либо метаболитов микроорганизмов (антибиотики,
аминокислоты и др.);
- ферментация является этапным, последовательным техноло­
гическим процессом, начинающимся с посева микроорганизма —
продуцента в культуральную среду и до получения целевого
продукта, его выделения и очистки;
- ферментационный процесс осуществляется в присутствии
трех объектов: чистая культура микроорганизма - продуцента,
м ногоком понентная питательная среда и биореактор с
технологической обвязкой и блоком автоматического контроля и
управления.
К ачество и количество целевого продукта зависит от
биологических свойств продуцента, питательной ценности
субстрата и инженерной реализации технологического процесса.
Начинается ферментационный процесс с культивирования
продуцента в лабораторных условиях, в колбах с последующими
пересевами в возрастающих объемах в лабораторные и опытно­
промышленные биореакторы. Количество посевного материала
доводится до 5-10% от объема культивируем ой среды.
Проверяется жизнеспособность, численность микроорганизмов
в одном мл посевной культуры, чистота культуры.
П араллельно подготавливается среда культивирования
(субстрат), которая затем загружается в биореактор. Компоненты
среды культивирования подбираю тся в зависимости от
особенностей обменных процессов продуцента. В среду при
необходим ости дополнительно вводятся предш ественники
целевого продукта, стим уляторы роста и развития
микроорганизмов.
Г л а в а 4. Фе/швштацштшшш т вкш ш , мне 73

Таблица 2. Основные факторы среды, определяющие рост


и биосинтетическую активность продуцентов
Рилк при Метилы управления фактором
Ф то р кулыивяриваиии
~ п
Т о с таа и кон­ Обвслсчиаиот | Составление оптимальной коми о-
центрация инт а- метаболнш ' шции; подпитка во время фе р-
гельных веществ ментацин; непрерывност ь проце с-
са; многостадийное гь с учетом
пофебностей продуцента по ф а­
там развития и г.д.
Концен грация ш иддаст биох и Осаждение продукта но мере на*
продукта и и и- мические реакции коплення; ферментация с диал и-
1мбитороа том; ферментация под ратрежен и-
ем с испарением летучего ироду a* j
та и др

pH Оитимишоул Ре< у шрошшие путем добавления


скорости оно* и- кислоты и щелочи
ммчсских реакции
(пределы
от 3,5 до 9,0)
Температура Оигимитирует Охлаждение или подогрев кул ь-
туральной жидкости при помощи
скорость биохи­
теплообм енников или температ у- I
мических реакций
(обычно равна ры подаваемых а биореактор су б- I
20-70°С) страхов
Осмотическое Определяет Составление сред с оптимальной 1
давление или 1ранимы «и «никонцентрацией питательных и е - }
активность волы (составляет аиста или влажностью твердой !
0.6-0.998) среды п о т р и «пит на поспи и-
ном уровне во время ферментации
путем раэбавления воюй или д о-
бавления отдельных компонентов
Содержание рас* Для аэробов обе с- | Для аэробных проиесеов регчл и- ■
творенного ки­ печивает аэроб­ руки инт енсивн остью аэрации !
слорода ный метаболнэм; или добавлением к галовой смеси !
является акцепто­ кислорода; при атмосферном да в-
ром Н; ингибирует 1 тении и 20X а I а среды раство­
ратвнтне ана тро- ряется 0.28 мМ О).
бов Анаэробные процессы реал изуяэт
в бескислородгюй среде, что лас* j
тигается продуванием N: и СО;
яаа добавками восстанов и гелей J
(цнетенна, аскорбиновой кислоты 1
• m l ________________________
Глава 4. Ферментационная технология

1 2 3
Содержание ди­ Источник углеро­ Продувание в фотосинтезирую­
оксида углерода да для автотрофов, щих процессах ферментации га­
гетеротрофы не­ зовой средой, обогащенной СОг,
которые нуждают­ выделению СОг из жидкой фазы
ся, а некоторые способствует перемешивание
замедляют мета­
болизм в присут­
ствии СО?

Перемешивание Равномерное рас­ Организуют макро- и микропере­


среды пределение пита­ мешивание в биореакторах при
тельных веществ и помощи механических мешалок,
биомассы по все­ барботажных, циркуляционных и
му пространству других систем. Аэрация способст­
среды вует осаждению биомассы

Вязкость среды Определяет диф­ Регулирование компонентами пи­


фузию питатель­ тания, характером и концентраци­
ных веществ и пе­ ей биомассы, а также наличием
ремешивание кле­ некоторых полимерных экстра-
ток продуцента целлюлярных продуктов. Вяз­
кость влияет на перемешивание и
аэрацию, для чего требуются спе­
циальные технические средства

4.1. С убстраты ф ерм ентации


П и тател ь н ая среда содерж и т источники углерода, азота,
ф осф ора, серы, микроэлементы, минеральные соли, соответст­
вующие характеру питания, ферментативной способности проду­
центов. Продуценты - это в основном гетеротрофные микроо­
рганизмы, ауксотрофные аэробы при биосинтезе или анаэробы в
процессах брожения.
Источниками углерода служат органические соединения, при
р асщ еп л ен и и которы х образую тся метаболиты - предш ест­
вен н и ки , являю щ иеся строительны м и блоками для процесса
биосинтеза, а также необходимая для жизнедеятельности клеток
энергия.
П итательная ценность источников углерода зависит от моле­
кулярной структуры. Лучшие источники - органические соедине-
4 1 Субстраты ферментации 75

ния, содержащ ие частично окисленные атомы углерода (СИОН,


С Н ,О Н , С О Н ), то есть содерж ащ ие спиртовы е труппы. Хуже
ассимилируются opi анические соединения с большим количеством
полностью восстановленных углеродных групп (СН,, СН,) и почти
не усваиваютса вещества, содержащие органические соединения
в форме карбоксильных групп (СООН).
Д оступность органических соединений метаболическим прев­
ращениям зависит от лег кости их перехода в углеводы, от раство­
ри м ости , степ ен и оки слен пости а ю м о в у глерода, п р о ст р а н ­
ственной конфигурации молекул.
П оглощ ен н ы е м и к р о о р ган и зм ам и opi ан и ч ески е вещ ества
вовлекаю тся в сопряж енны е окислигельно-восстановительны е
процессы. При этом часть атомов углерода окисляется до СО и
СООН, из которых лат ем образуется СО,, другая част ь, восстано­
вившись до - СИ ,, - С Н „ - С входит а состав аминокислот, пури­
новых и пиримидиновых оснований, высш их жирных кислот и
Т.Д.
Источники азота необходимы для обраю вания «минных - NH
и и м ин ны х - NH групп в м о л еку л ах н у к л еи н о вы х ки сл о т,
аминокислот и других соединений в клетках микроорганизмов.
Самый доступный источник аэота аммиак и аммоний, которые
л егко п ро н и каю т в клетки и тран сф о р м и р у ю тся в амин о- и
иминогруппы Лучший источник - аммонийные соли органических
кислот, неж ели м инеральны е ам м онийны е соли. П отребление
органических источников азота связано обычно с отщеплением
от них аммиака и поглощением последних микробной клеткой
Источниками углеродного и азотного питания, используемы ми
в ферментационном процессе чаше являются доступные и деш е­
вые субстраты , нередко отходы м ясо -м о л о ч н о го , спи ртового
производства, отходы переработки культурных растений и др.
Используются следующие источники углерода:
I. Углеводсодержащие (глюкоза, сахароза, лактоза) соединения:
- м еласса отход сахарного производства (45-60% сухого
вещ ества сахароза, такж е содерж ит органические кислоты ,
ам инокислоты , некоторы е витам ины , м инеральны е вещ ества)
Чаще используется в биосинтезе аминокислот, ферментов, хлебо­
пекарных дрожжей;
76 Глава 4. Ферментационная технология

- крахмал (картофельный, кукурузный), этот полисахарид


применяется в пищевой, фармацевтической технологиях, при
культивировании микроорганизмов, обладающих амилолитичес-
кой активностью;
- кукурузная мука, содержит 67-70% крахмала, 12% белков,
используется при производстве антибиотиков, ферментов;
- пшеничные отруби (отход мукомольного производства),
используются при поверхностной, твердофазной ферментации,
содерж ат 16-20% крахмала, 10-12% белков. Они достаточно
дорогие, их смешивают со свекловичным жомом, древесными
опилками, фруктовыми выжимками;
- молочная сыворотка (отход производства сыра, творога),
содержит 4,0-4,7% лактозы, 0,5-1% белков;
- гидролизаты растительных отходов (гидролизаты древесины,
соломы и др). Готовят путем кислотного или щелочного гидролиза
при высокой тем пературе. При этом вы соком олекулярны е
соединения - полисахариды целлюлоза, лигнин расщепляются до
олиго-, ди - и моносахаров (4-8% сахаров). Гидролизаты расти­
тельного сырья используются для производства этилового спирта
с последующим выращиванием кормовых дрожжей на после-
спиртовой барде либо для непосредственного выращивания
дрожжей без получения спирта. Также используются сульфитные
щ елока — это отходы целлюлозо — бумажного производства,
продукты гидролиза лигнина и гем и целлюлозы, содержат 3,5%
сахаров.
2. Неуглеводные источники углерода:
- углеводороды ж идкие - н-парафины, С и-С |4 фракции.
Достаточно чистое сырье, но дополнительно нужны источники
азота и минеральных веществ. Используются при производстве
кормовых дрожжей, лимонной кислоты;
- 12% этанол для культивирования микроорганизмов при произ­
водстве уксусной кислоты; метиловый спирт при получении
кормового микробного белка;
- углеводороды газов (метан, этан, пропан, бутан).
В природе азот встречается в виде NH4, NO,, N,, в составе
аминокислот, мочевины, пуринов и пиримидинов. В результате
восстановления или гидролиза аммиак превращается в аммоний,
4.1. Субстриты ферментации И

который затем ассим илируется клеткам и с участием четырех


основных переносчиков амино и амидогрупп (глутаминовой
кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и карбомоилфосфата).
Источниками азотною питания является:
■ неорганические источники: сульфат аммония (чаш е всего),
нитрат аммония, аммиачная вода, карбамид:
- органические соединения:
1) кукурузный экстракт, побочный продукт крах мало- паточ­
ного производства, содержит 6,4-8% общего азота;
2) соевая мука (45% протеина. 25-30% yi яеводов, минеральные
вещества);
3) гидролизаты дрожжей (кислотные, ферментативные гидро-
л и заты и эк с тр а к ты ко рм овы х д р о ж ж е й ), содерж ат 40-60%
аммонийного азота, углеводы, аминокислоты;
4) рыбная мука (65% белков), мясокостная мука (50% белков),
сухое молоко обезжиренное (34% белка).
Источники серы сульфаты. П ереносчиком серы в клетке
сл у ж и т цистеин, и » которого сера в кл ю чается в клеточн ы е
компоненты в виде сульфгидрильнон группы SH Сера в составе
метионина, липоевой кислоты, тиамннпирофосфата, кофермента
А вероятно происходит из иистеина (кистени синтезируется путем
поглощ ения сульфата).
Источники фосфорного питания кукурузный экстракт, соевая
мука и др. фосфорсодержащие о р га н и ч е с к и е с о ед и н ен и я.
Неорганический источник аммофос, одно- и двузамещ енные
фосфат калия и натрия. Органические фосфорсодержащие соеди­
нения не прон икаю т через клеточную м ем брану, поэтом у их
расщ епляю т фосфатазы, локализованные в переплазматнческом
пространстве. При избы тке фосфаты образуют полифосфаты в
виде цитоплазм атических вклю чений как источник энергии и
фосфора. Высокие концентрации фосфора в питательной среде
стимулируют рост биомассы и многих продуцентов, но подавляют
синтез целевого продукта.
М икроэлементы и минеральные соли в малых концентрациях
нужны для роста и развития микроорганизмов. Это Са. Co. S, Mg.
Fe, Си, Zn, Nt; их соли и другие химические элементы. Факторы
роста - аминокнелоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые
78 Глава 4. Ферментационная технология

основания, ряд других соединений, по которым наблюдается


ауксотрофность продуцентов.
Также в среду культивирования вносятся метаболиты - пред­
шественники: при биосинтезе лизина —аспарагиновая кислота,
пенициллина - фенилуксусная кислота, эритромицина - пропи-
ловый спирт, витамина В,, - 5,6 - демитил - бензимидозод трип­
тофана - антрониловая кислота и т.д. Они представляют собой
соединения, входящие в структуру целевого продукта, увеличи­
вающие продукцию последнего.
Наряду со средой культивирования, содержащий нутриенты,
необходимые для роста и развития микробных клеток в био­
реактор в процессе ф ерментации периодически вносятся
следующие реагенты:
- поверхностно активные вещества - пеногасители (олеиновая
кислота, костный и свиной жиры, пропинол, лапрол и др.);
- титранты для коррекции pH (карбонат кальция, мел хими­
чески осажденный и др.);
- иногда антибиотики, для поддержания асептических условий.
Массообмен в процессе ферментации происходит в трехфазной
среде: культуральная ж идкость - газ - микробны е клетки.
К примеру, кислород должен диспергировать из газообразного в
растворенное состояние, затем из жидкости диффундировать в
микробную клетку. Поэтому необходима подготовка субстрата,
гомогенизация среды культивирования в биореакторе.
Гомогенизация питательной среды создает оптимальные усло­
вия для доставки и отвода от микробных клеток субстрата и мета­
болитов, кислорода и углекислого газа; равномерно распреде­
ляются компоненты питательной среды и кислород в биореакторе.
Гомогенность обеспечивает правильный контроль физико­
химических параметров и поддерж ание гидродинамических
условий эффективной ферментации.
Качественный и количественный состав питательной среды
оптим изируется конкретно к каждому производственном у
штамму, с учетом его метаболических особенностей. Критерий
оптимизации питательных сред - выход целевого продукта.
Постоянными задачами при разработке сред культивирования
являются:
4.t. { vm* траты ферментации 4.1 Ферментации

- повышение уровня стандартности сырья в результате стро­


гого соблю дения технологии вы ращ ивания и переработки
сельскохозяйственных культур;
■ выявление и внесение в технические условия на сырье
параметров, характеризующих его биологическую доступность;
- поиск новых, нет ради ни он ны х источников сырья, в первую
очередь возобновляемого и недефицитного;
- подбор для каждого технологического процесса резервного
вида сырья на случаи перебоев со снабжением основного.

4.2. Ферментация
Процессы ферментации в зависимое!и от используемых групп
микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, мине.шальные грибы),
получаемого продукта (микробная биомасса или их метаболиты),
различаются по технологии, динамике, аппаратному оформлению
на следующие варианты:
периодическая, непреры вная, а также периодическая с
добавлением питательной среды,
глубинная и поверхностная, жидко - и твердофазная;
аэробная и анаэробная ферментация.

Технология фер м ентации

аэробная периодическая
анаэробная поверхностная непрерывная

микроорганизмы ферменты

суспендированные растворимые
иммобилизованные иммобилизованные

При периодической ферментации в предварительно простери-


д изо ван но и биореактор в герметичных условиях загружается
гомогонезированная, подготовленная по компонентному составу
80 Глава 4. Ферментационная технология

стерильная питательная среда и посевной материал. Устанавли­


вается pH , тем п ература, при необходим ости дозированная
аэрация и перемешивание. По завершении процесса ферментации
биомасса выгружается из реактора. Ферментер вновь подготав­
ливается к работе, стерилизуется и процесс повторяется.
Если при периодической ферментации микроорганизмы выра­
щиваются без добавления в ходе ферментации свежей культу­
ральной среды, то в случае периодической ферментации с добав­
лением субстрата в процессе ферментации к культуре перио­
дически добавляют определенное количество свежей питательной
среды. Если процесс ведется на многокомпонентных средах
(м еласса, кукурузны й экстракт, различны е гидролизаты
целлюлозы и белоксодержащих веществ), то подпитку целесо­
образно осуществлять полностью ассимилируемыми субстратами
(сахароза, спирты и др.), это позволяет повысить продукцию
целевого метаболита. По окончании процесса биомасса выгру­
жается для дальнейшей обработки.
И, наконец, при непрерывной ферментации свежая питательная
среда непрерывно с определенной скоростью поступает в био­
реактор и такой же объем культуральной жидкости или биомассы
непрерывно удаляется из аппарата. Концентрация микробных
клеток, компонентов субстрата, удельная скорость роста про­
дуцента постоянна, в отличие от периодической ферментации.
Для осуществления ферментации в аэробных условиях (нара­
щивание биомассы, синтез антибиотиков, аминокислот, фер­
ментов и др.) необходимо обеспечить интенсивную аэрацию и
перемешивание культуральной жидкости, соблюдение строго
асептических условий, своевременное гашение обильного пено-
образования и т.д. В целом технологический процесс нацелен на:
- обеспечение подвода О, и отвода СО, от микробных клеток
(аэробы):
- интенсивное перемешивание культуральной жидкости, обес­
печиваю щ ее гом огенизацию , равном ерное распределение
нутриентов, микробных клеток, кислорода по всему объему
биореактора, исключение застойных зон;
- осуществление стерилизации биореактора и связанных с ним
коммуникаций, обеспечение асептических условий;
4.2. Ферментация II

автоматизирование системы контроля и управления про­


цессом ферментации.
Ферментация в анаэробных условиях проводится при получении
этанола, вин, о рган и ч ески х кислот, пива и других процессах
б р о ж е н и я . В этих случаях н е с к о л ь к о ины е т р еб о в ан и я к
технологическом у процессу:
влияние перемешивания на динамику процесса ферментации
н езн ач и тел ьн о , оно главны м обраю м необ ходи м о для го м о ­
генизац ии бродящ ей ж и д к о еIи с и сп о льзо ван и ем а качестве
показателей температуры, pH и др.;
- в больш инстве случаев значительно проще обеспечить рост
монокультуры, то есть проблема стерильности стоит менее остро,
- пена образуется главным обраю м в результате выделения
углекислого газа, следова 1ельно, она значительно лег че гасится,
- при производстве вина, пина и других продуктов брожения
на первый план выдаю анис я их вкусовые качества, а не сверх­
продукция. Поэтому выбор средств, которыми пользую тся для
интенсификации процесса, обычно не столь ак i у алей.
Культивирование продуцентов можно в е с i и поверхностно и
глубинным способами.
Глубинным методом выращивают микроор* ан и «мы в жидкой
питательной среде, и ним методом можно вырастить как а пробные,
так и анаэробные культуры.
Поверхностным способом можно вырастить аэробную культуру
м и к р о о р !а н и imob, в основном на твердой питательной среде,
редко на жидкой.
Твердофазная ферментация чаще используется при культиви­
ровании мицслиальных грибов. Необходимы достаточная влаж­
ность субстратной поверхности, рыхлость структуры среды для
эффективной аэрации культивируемой поверхности, для обес­
печения доступа кислорода и удаления углекислого газа, и юытка
тепла потоком воздуха, что особенно важно в фа те интенсивного
роста мицелия.
Т вердоф азны й субстрат помещ ается в растильны е камеры,
толщина слоя субстрата в пределах 200-300мм и зависит от техно­
логических особен ностей . Р астительны е камеры пом еш аю тся
вертикально или тори юнтально секциями в специально сконструи­
рованные аппараты для твердофазной ферментации.
82 Глава 4. Ферментационная технология

В идиоф азе накапливаю тся вторичны е м етаболиты , идет


процесс спорообразования, заканчивается процесс ферментации.
Целевой продукт извлекается из мицелия, растильные камеры
освобождаются от питательного субстрата, промываются, стери­
лизую тся, вновь заполняю тся свеж ей питательной средой,
засеваются спорами грибов и процесс повторяется.
Поверхностный способ ферментации на жидких субстратах
реализуют в кюветах со средой, помещенных в вентилируемые
воздухом камеры. Культура микроорганизмов при этом образует
биомассу в виде пленки или плотного слоя на поверхности жидкой
среды. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой
фазы - воздуха, массообм ен м алоинтенсивны й, требую тся
большие производственные площади для выращивания проду­
цента. Вместе с тем низкая себестоимость производственного
процесса и малая энергоемкость позволяют в промышленных
масштабах получать органические кислоты (лимонная, итако-
новая) и другие продукты.
Глубинное культивирование осуществляется в биоректорах, в
асептических условиях, чаще при интенсивном аэрировании
среды. Массообмен происходит в трехфазной системе: жидкость -
твердая взвесь (микробные клетки) - газ. Для создания опти­
мальных условий взаимодействия этих фаз требуются различные
аппаратурные оформления ферментационного процесса. Оно
сводится к регуляции гидродинамического процесса в биореак­
торе: дозированная подача и отвод жидкости, тепла, газов;
постоянная гомогенизация для обеспечения микроб/субстратного
взаимодействия; контроль и управление физико-химическими
параметрами среды культивирования (pH, pOr t°C и др.).
Процесс ферментации с использованием рекомбинантных
микроорганизмов, продуцирующих эукариотные белки (инсулин,
интерферон и др.), проводится последовательно в двух биореак­
торах. В начале наращивается биомасса рекомбинантного микро­
организма в одном из реакторов, затем биомасса перекачивается
в другой реактор с иными технологическим и параметрами.
В измененных условиях происходит индукция синтеза рекомби­
нантного белка. Индукция и экспрессия клонированных генов
приурочиваются обычно к концу экспоненциальной фазы роста
клеток.
4 2. Ф ерментации 83

Почему не целесообразно проводить процесс ферментации в


одном реакторе при постоянной активной экспрессии синтеза
рекомбинантного белка. О казалось, что в этом случае, при
непрерывной транскрипции и трансляции истощаются энерге­
тические ресурсы продуцента и его рост замедляется, соот­
ветственно уменьшается синтез целевого продукта.
Н епрерывная ферментация в двух биореакторах также
используется при получении микробных метаболитов, т.н.
двухстадийный хемостат. Среда, выходящая из первого аппарата,
поступает во второй; кроме того, нмеетса дополнительная
подпитка свежим субстратом во втором аппарате Нередко в
первом биореакторе создаю тся условия для интенсивного
накопления биомассы микроор! аиизмов, во втором идет
оптимально процесс биосинтеза целевою продукта (рис. 15).

Выход Подача

Рис. 15. Система и »двух биореаггаро*. использующаяся для температурной


индукции синтеза белкового продукта. Из опоре актора, в котором осуществится
культивиронанис при М)"С. клетки поступают в бнореак гор с температурой 424 .
где происходит индукция и синтез продукта.
Глава 4. Ферментационная технология

4.3. Биореакторы
Биореакторы создавались в промышленном масштабе в эру
антибиотиков и кормовых дрожжей. Множество существующих
конструкций биореакторов можно отнести к трем группам, в
зависимости от способа аэрации и перемешивания:
- аппараты с механическим перемешиванием культуральной
среды;
- барботажные реакторы, в которых перемешивание осущест­
вляется потоком воздуха или иного газа;
- эрлитные реакторы, обеспечивающие не только перемеши­
вание, но и циркуляцию культуральной жидкости внутри реактора
потоком воздуха или иного газа.
В технологии глубинной ферментации наиболее распростра­
нены биореакторы периодического действия с механическим
перемеш иванием и барботажем - комбинированные (рис.
16,17,18).
Подобные аппараты характеризуются по следующим пара­
метрам:
- соотношение высоты реактора и его диаметра - 3:1 и 2:1;
- соотношения диаметра мешалки к внутреннему диаметру
ферментера - 1:3 и 1:5;
- мешалки обычно имеют 4-6 лопастей, подразделяются на
быстро- и тихоходные, пропеллерные и турбинные, лопастные
(чаще), дисковые и др. Мешалки разбивают крупные пузырьки
воздуха, разносят их по всему реактору и увеличивают время
пребывания в культуральной среде;

Рис.16. Промышленные биоректоры. Рис. 17. Лабораторные биоректоры.


4 -i. h u o p v a km v p u

m наличие на внутренней поверхности аппарата вы ступов ■-


о тр аж а тел ь н ы х п е р е го р о д о к (о т б о й н и к и ) для то го , чтобы а
процессе п ерем еш и ван и я не бы ло тавихрения иди сниж ения
скорости движения биомассы в пристеночном слое;
наличие датчиков: pH, рСО „ рО,, e li, температуры, скорости
вращения меш алки, давления в реакторе, расхода воздуха (аэра­
ция), т.е. постоянный контроль i идродинамической обстановки в
биореакторе;
наличие водяной рубашки или змеевика, помешенного внутри
аппарата для теплообмен; наличие отверстий iai ру 1ки и слива,
подачи пара. Внутренние тмееаики нередко покрываются слоем
биомассы растущ их клеток, чго ухудшает теплообмен, иногда
эти наросты мешают эффективному перемешиванию кулы ураль-
ной среды;
многие кулм уральны е среды химически активны и во избе­
ж ание коррозийн ого или м еханического повреж дения стенок
биореактор изготавливается и» высоко лиг ированной марки стали
С отполированной бет углов внутренней поверхностью . С тек ­
л ян н ы е д ета л и и с п о л ь т у ю i в л аб о р ато р н ы х б и о р е а к т о р а х ,
емкостью 3-10л;
внутренняя поверхность аппарата не должна иметь каких-
либо углублений, недоступных стерилизации паром. 1 орячему
пару должны быть доступны все входные и выходные отверстия,
клапаны и датчики.
Д ля более «ффективиой ферментации м икроор г а низ мы
продуценты или выделенные ферменты им м обилизую тся на
носителе, фиксированном внутри биореактора, а питательная
среда, протекая через аппарат, как бы омывает их Иммобилизация
обеспечивает более стабильное и длительное сохранение биоло­
гической активности продуцента, фермента. Существует и иное
инженерное решение, когда в биореактор с питательной средой
помещается контейнер, заполненный гранулами им м обилизо­
ванных клеток, ферментов; контейнер п ори сты й , вращается
внутри аппарата, аэрируется.
Технологическая обвязка биореактора обеспечивает: очистку
и стерилизацию технологического воздуха; обезвреживание
отработанных га юв. загрузку посевного материала, питательной
86 Глава 4. Ферментационная технология

среды; отбор проб и выгрузку биомассы; подачу титрантов и пено-


гасителей.
Воздух предварительно очищается от механических примесей,
охлаждается для освобождения от сконденсированного пара, влаги
и затем стерилизуется прогреванием.
Питательная среда стерилизуется паром после загрузки ее в
биореактор либо во время подачи в аппарат. Термолабильные
ком поненты питательной среды подвергаю тся холодной
стерилизации (фильтрации).
Биореакторы непреры вного культивирования двух типов:
тубулярные (аппарат в виде длинной трубы, большого диаметра;
питательная среда и посевной материал непрерывно поступают в
аппарат,по мере продвижения в аппарате идет рост биомассы,
синтез метаболитов; соответствующ ий объем культуральной
Мотор

Рис. 18. Схема биореактора.


4.i. Ииореакторы - 4 4 Эффективность ферментации 17

жидкости выходит hi аппарата) и хемостатные (биореактор с


перемешиванием, регулируетев подача субстрата и выход
культуральной жидкости). Существует хемостат с рециркуляцией
биомассы, когда часть выходяшей из аппарата культуральной
жидкости вновь вотвращается в аппарат с целью поддержания
концентрации микробной биомассы в хемостате.
Биореакторы для анаэробной ферментации несколько упро­
щенной конструкции. Отсутствует система стерилизации и подачи
воздуха в аппарат. Н связи с меньшей интенсивностью биохими­
ческих процессов и уменьшенным тепловыделением также
упрощается система теплоотвода Анаэробный реактор снабжен
подводами для посевного материала, питательной среды, пара,
волы; отводами продуктов фермент вини, выделяемых газов
4.4. Эффективность ферментации
В динамике роста и развития культуры меняются потребности
продуцента в тех или иных компонентах питательной среды,
степень аэрации, оптимальное течение pH, температурный режим
и др. Слаженная регуляция этих процессов это залог создания
условий для максимальной биопродукции
pH
При поверхностном культивировании pH среды меньше влияет
на процессы биосинтеза, так как в силу высокой буферности и
малой влажности среды он почти не изменяется
При глубинном культивировании pH среды имеет решающее
значение, он сильно изменяется при стерилизации питательной
среды н особенно в процессе культивирования
В целом для грибов и дрожжей pH в пределах 3,8-5,6. для бак­
терий 6,2-7,4. Клеточные метаболиты, поступая в культуральную
среду, могут существенно изменить pH Нежелательные изменения
pH в первую очередь сказываются на активности ферментов
биосинтеза, стабильности целевого продукта.
Аэрация.
Кислород необходим для роста и размножения продуцента
аэроба. Обеспечивается аэрация барботированием (продуванием)
88 Глава 4. Ферментационная технология

стерильного воздуха через слой питательной среды. Способствует


равномерному распределению кислорода и диспергированию
пузырьков воздуха перемешивание. Кислород плохо растворим,
быстро используется клетками, поэтому важны непрерывность и
достаточность аэрации. Аэрация более необходима в фазе экспо­
ненциального роста микроорганизмов, наращивания биомассы;
потребность в кислороде снижается в стационарной фазе, когда
усиливается продукция вторичных метаболитов.
Температура.
Биопродуценты в основном относятся к мезофилам: грибы -
22-32°С, бактерии 35-37°С. Температурный режим влияет на
каталитическую активность ферментов, теплообмен, вязкость
среды культивирования. Если температура ниже оптимальной, то
рост микроорганизмов замедляется, и интенсивность метаболизма
снижается. Если же, напротив, температура слишком высока, то
может произойти преждевременная индукция синтеза белка и т.д.
Пеногашение.
В условиях аэрации и интенсивного перемешивания наблю­
дается обильное пенообразование. Излишняя пена уменьшает
полезный объем биореактора, способствует контаминации куль­
туральной среды посторонней флорой. Пена термодинамически
неустойчива: непреры вно происходит разруш ение старых и
возникновение новых пузырьков. С целью ускорения процесса
разрушения пузырьков пены применяются механические средства
или вводят химические пеногасители. Но избыток пеногасителей
может нарушать процессы массообмена, перенос кислорода к
клеткам.
Эффективность ферментации или повышение выхода целевого
продукта при тех же производственных затратах достигается
рациональны м управлением в динам ике культивирования,
регулированием этих физико-химических параметров.
Е стественно производительность биотехнологического
процесса зависит от оптимальности состава питательной среды,
необходимого избытка или лимитации источников углерода,
азота, фосфора, наличия предшественников целевого продукта.
4 b Bmitf irtm t приОуктив иикрийного о и а г м !

4.3. Выделение продуктов микробного синтеза

К ультуральная среда к окончанию процесса ферментации


содерж ит клетки микроор! ани ш о в , их м етаболиты , остатки
субстратов, а также неизрасходованные реагенты (пеногасители,
расIворы кислот либо оснований, применявшихся для регуляции
pH). Э ю сложная по составу среда, содержащая твердую и жидкую
ф азы .
Процесс выделения целевою продукта начинается с разделения
твердой и жидкой фаз, отделения микробной массы, твердых
частиц от раствора Дальнейш ие п ап ы очистки и выделения
проводятся из ж идкой или ( вердой фаты. Это зависит от
характеристики целевого продукта, (микробная масса, внутри
или внеклеточный метаболит)
Процесс выделения и последующей очистки многоэтапен,
поэтому часто применяю тся комбинации методов, наиболее
щ адящ ие и полностью извлекаю щ ие целевой продукт из
культуральной жидкости.
Выбор методов выделения зависит от свойств культуральной
ж идкости (вязкость, дисперсн ость др.), ф изико-хим ических
свойств целевого продукта (термолабильность, чувствительность
к химическим веществам, исполыуемым в технологии очистки),
от требований к конечной форме целевого продукта (общая и био­
логическая концен траци я, степень чистоты , м едицинский
препарат, биоудобрение и т.д )
П рим еняю тся следую щ ие методы очистки и вы деления
продуктов м икробиоло! ического синтеза: обезвож и вание,
осаждение, фильтрация, сепараиив, экстракция, ионообменная
адсорбция и лр
1во.ж ивание
Я вляется одним из просты х м етодов переработки к ул ь­
туральной жидкости
Удаление излишней вла 1 и выполняется в вакуум-выпарных
установках без выделения продукта в чистом виде. Культуральная
жидкость концентрируется до пастообразного состояния или
сухою вещества. Этот метод используют при получении кормовой
аминокислоты лизина и кормовых концентратов витаминов В. и
90 Глава 4. Ферментационная технология

Вр в животноводстве, биоудобрений и биопестицидов в расте­


ниеводстве, ферментные препараты в кожевенном производстве
и т.д.
В случае твердофазной ферментации биомасса мицелия (при
культивировании грибов) собирается с поверхности среды,
измельчается с последующей конвективной сушкой в потоке
теплого воздуха.
Осаждение
Осаждение часто используется при условии стабильности
целевого продукта, когда ф актор времени (осаж дение -
длительный процесс) не влияет на него.
В технологии выделения ферментов (белков) для ускорения
выделения осадка в культуральную среду вносятся нейтральные
соли (сульфаты аммония и натрия, поваренная соль). В присут­
ствии ионов солей усиливается ориентация диполей воды, раз­
рушается гидратный слой вокруг молекул белка и его коагуляция.
Органические растворители (ацетон, этанол, метанол) так же
активно разрушают гидратную оболочку белка, особенно при
низких температурах (0-5°С).
Для осаждения микробных клеток, крупномолекулярных белков
используются органические коагулянты (желатин, казеин и др.),
переводящие взвешенные частицы в агрегативно неустойчивое
состояние либо флокуллянты (метилцеллюлоза, пектин, альгинат
натрия и др.), способствующие разрушению коллоидных структур
и образованию хлопьев.
Отстаивание или осаждение под действием силы тяжести имеет
место при очистке сточных вод, при концентрировании ила.
Фильтрация
В производстве, где целевым продуктом является метаболит,
растворенный в культуральной жидкости, для отделения микроб­
ной биомассы от растворенной части чаще всего используют
фильтрацию.
Для разделения твердой и жидкой частей используют мембраны
с порами заданного диаметра. Мембраны представляют собой
4 S. В ы деление п р о д укт о в м и к р о бн и w п м аги 91

пористые или трубчаты е перегородки, изготовленные из высоко­


полимерны х или неорганических материалов.
Суть фильтрации - пропускание культуральной жидкости через
п ор и стую п ер его р о д ку . Э ф ф екти в н о сть, ско р о сть ф и л ьтрац и и
прям о п роп орцион альн а р а зн о с т и д а в л е н и й , п л о щ ад и
ф ильтрую щ ей поверхности, диам етру пор.
При использован ии ф ильгра-пресса культуральная ж идкость
под давлением пропускается через фильтрационное сито. Одним
из н е д о с т а т к о в эт о го м ето д а яв л яется н а к о п л е н и е о сад к а на
поверхности ф ильтра, забиваю щ его поры, скорость ф ильтрации
при этом резко сниж ается, этот вариант ф ильтрации применим
для отделения частиц диаметром 50-100 мкм
Более ш ироко исп ользуется м икроф ильтрация М икроф и ль­
трация это чащ е м еталлокерам ические трубчаты е мембранные
кон струкции , которы е м ож но реген ер и р о вать обратны м током
пара. С ъ ем н ы е кассеты и м ем браны ф ильтров при м ен яю тся в
кач естве м одульны х ком п о н ен то в в систем ах для м и кроф и ль­
трации, в многокамерных фильтрационны х установках
При обы чной ф ильтрации поток ф ильтруем ой среды направ­
л яется п ер п ен д и к у л я р н о повер х н о сти ф ильтра А при микро-
ф и льтрац и и поток ку льтуральн ой ж и дкости идет парал л ельн о
поверхности фильтра (поперечно, тангенциально), а та часть жид­
кости, которая проходит через поры мембраны движется перпен­
дикулярно поверхности ф ильтра Т акаа ф ильтрация назы вается
фильтрацией в поперечном потоке Она i»еуществл яегея в замкну­
той систем е, в условиях непреры вной циркуляции фильтруемой
суспензии с н еп р ер ы вн о й под пи ткой для ком п енсации убы ли
объема культуральной жидкости та счет ф ильтрата
По мере проведения м и крофил ьтрапи и кои цен грация биомассы
в фильтруемой жидкости возрастает. О бы чно скорость движения
ц и ркул и ру ем о го потока 1-2 м сек для полим ерны х мембран и
4-7 м /сек для керамических М икрофильтрация оптим альна для
частиц диаметром 2-5 мкм
D целом при методе фильтрации избегается тепловое воздей­
ствие на целевой продукт, незначительно механическое воздей­
стви е. М етод х ар актер и зу ется п ростотой и м обильностью
ф и л ь т р ац и о н н о й у стан о в ки (съ ем н ы е кассеты с ф и л ьт р ам и ).
92 Глава 4. Ферментационная технология

отсутствием движ ущ ихся деталей, низкой энергоем костью


процесса, герметичностью и асептичностью процесса, хорошей
скоростью ф ильтрации, так как поры составляю т 70-80%
поверхности мембран. Трубчатые фильтрующие элементы легко
съемны, стерилизуются и многократно используются.
Сепарация
Центрифугирование позволяет отделить микробные клетки от
культуральной жидкости. Используются различные виды центри­
фуг: фильтрующие, осадительные, универсальные, осветляющие
и т.д.
Ц етриф угирование более производительно при больш ом
диаметре отделяемых микробных клеток, при высокой разности
между их плотностью и плотностью ж идкости, при низкой
вязкости культуральной жидкости, при более высокой угловой
скорости вращения ротора и увеличения радиуса центрифуги­
рования.
Для фракционирования культуральной жидкости используются
сепараторы различной конструкции.
Осадительный сепаратор - это центрифуга, характеризую­
щаяся высокой скоростью вращения ротора (12000 об/мин) и
оснащенная тарельчатым барабаном (рис. 19).
Аппарат имеет полый вал, непод­
вижный корпус с размещенным в нем
набором вращающихся конических
тарелок, находящихся одна над другой
так, что образуется коническое прос­
транство. К ультуральная жидкость
входит по полому валу над нижней
тарелкой и доходит до внеш него
цилиндрического края корпуса. Далее
она движ ется между коническими
тарелками к центробежному коллек­
тору, из которого осущ ествляется
Рис. 19. Схема сепаратора для выход жидкости. В процессе этого
разделения суспензий движения твердые частицы отбра­
сываются по направлению от центра
4.S Ди^чгггмг iif/ийукт о в чи кр и п н о го t ы м виш 93

вращения и сползаю т по конической поверхности тарелок к


боковой стенке корпуса, создавая возле нее слой сгущенной
биомассы микроорганизмов.
Из сопла (внизу) корпуса под давлением происходит выгрузка
сгущенной микробной массы. Микробная масса концентрируется
до 10-15% сухого веса
Экстракция
Экстрагирование целевою продукта проводится органическим
раствори телем , изменением pH среды, температуры и др
Экстракция основана на определенной и «жрат ельности процесса,
позволяющею в 2-5 ра* концентрировать выделяемый продукт
Эта технология широко используется в тех случаях, когда целевой
продукт не раст воряегся в водной среде, но легко элюируется
органическим и растворителями. Так, для выделения из
культуральной жидкости i идрофобны х белков, некоторых
витаминов и липидон применяется фенол, бензиловый спирт и др.
При необходимости жст рагироваиие мши о кратно повторяется
на фоне изменения pH. температуры »кстрат ируемой жидкости.
Ионообменна я адсорбция
Этот метод используется для выделения целевых продуктов,
являющихся достаточно сильными электролитами и диссо­
циирующих в волной среде с образованием многозарялных ионов
Адсорбция это избирательный и обратимый промесс
(десорбция), позволяющий в 10 раз и более увеличить концен­
трацию выделяемого продукта.
Исполыуемая аппаратура простая по конструкции, в процессе
выделения не применяются органические растворители, но сам
процесс длителен по времени и необходимо проведение регене­
рации сорбента.
Ионообменная адсорбция применяется при производстве
антибиотиков на этапе сорбции их из культуральной жидкости и
в других технологидх.
Хро.чатографыя и электрофорез
Эти методы относятся к современным и более тонким методам
очистки целевого продукта; позволяют более эффективно
94 Глава 4. Ферментационная технология

выделять из культуральной жидкости низкомолекулярные сое­


динения.
Хроматография (разделение ионитов) - гетерогенная хими­
ческая реакция, в которой участвуют подвижные ионы (целевой
продукт), а неподвижный макромолекулярный ион противо­
положного знака образует полимерную основу (катионит или
анионит).
Хроматографическое разделение веществ можно проводить на
бумаге, на пластинках и колоночной хроматографией (последняя
чаще используется в промышленных технологиях). В основном
применяется ионообменная и аффинная хроматография.
Электрофорез позволяет разделять белки в зависимости от их
подвижности в электрическом поле на поверхности агарозного,
полиакриламидного или другого геля. Разделение зависит от знака
заряда, молекулярной массы и других физических характеристик.
При электрофорезе в потоке жидкая фаза движется перпенди­
кулярно направлению электрического поля, при двумерном
электрофорезе на разделяемую смесь действуют два электрических
поля, направленные перпендикулярно друг другу. В этом варианте
электрофореза получаются не линейно расположенные полосы, а
распределенные на плоскости геля пятна, соответствующие
разделенным компонентам смеси.
Дезинтеграция
Для выделения внутриклеточных метаболитов применяются
физические, химические и ферментативные способы разрушения
(дезинтеграции) клеточной стенки микроорганизмов.
Физическое воздействие на клеточную стенку оказывают при
помощи стеклянных или полимерных шариков, диаметром 0,3-
0,5 мм (шаровые мельницы). Они смешиваются с суспензией
микроорганизмов во вращающейся камере и путем истирания,
раздавливания, нарушают целостность клеточной стенки.
Широко применяется воздействие ультразвуковых волн (уль­
тразвуковая дезинтеграция), частотой 15-25 кГц. Ударные волны,
локально изменяющие давление и температуру, вызывают
резонирующий эффект (кавитацию), приводящий к повреждению
клеточной стенки.
4 3. Выделение продуктов микробного иш ми

Нередко ислолы уетса неоднократное замораживание-оттаи­


вание суспензии микробных клеток, приводящее к разрушению
клеточной стенки
Химические вещества (растворы щелочей и кислот, органи­
ческие растворители, детергенты) повышают проницаемость
клеточной стенки, нарушают се целостность
Ферментативный лизис микробных клеток достигаете* возлей-
ствием протеаз, пегтиназ и других гидролитических энзимов

4.6. Стабилизация и хранение целевого продукта


Выделенный и очищенный целевой продукт является орга­
ническим соединением, легко подвержен воздействию темпе­
ратуры, влажности и иных факторов окружающей среды, легко
теряет биологическую активность.
Поэтому для длительною хранения жи .(неспособных микро­
организмов, инактивированных микробных клеток и их метабо­
литов в виде готовых для использования биопрепаратов суще­
ствуют следующие технологии:
- химическое консервирование, стабилизация структуры
белка, мембран микробных клеток путем добавления низких
концентраций формальдегида , фенола, глицерина и т.д. Так, при
получении и стабилизации анатоксина используется 0,3-0,5%
формалин, мер тиол гг входит в состав вакцины АКДС Химические
консерванты используются при получении и хранении инактиви­
рованных вакцин. К кормовой микробной массе добавляют
наполнители (кукурузная мука, пшеничные отруби и др ),
способствующие более длительному хранению и повышению
биологической ценности продукта,
- криоконсервация, т.е. хранение при низких температурах.
К примеру, длительное сохранение жизнеспособности микроорга-
низмов обеспечивается а жидком азоте при -196'*С:
-- высушивание микробных биопрепаратов осуществляется
различными способами контактный, конвективный, терморадиа­
ционный, токами высокой частоты, сублимационный и комби­
нированный.
96 Глава 4. Ферментационная технология

Высушивание
Вы суш иванию подвергается культуральная ж идкость,
осаж денная биом асса м икроорган изм ов, концентрат после
упаривания. П оэтом у в зависим ости от консистенции
высуш иваемого биопрепарата (концентрированны й раствор,
паста, суспензия), влажности, термостабильности используется
тот или иной способ высушивания.
Терморадиационное высуш ивание-прогревание инфракрас­
ными лучами; сушка токами высокой частоты (10-30 тыс. мГц) -
подвергаемая высушиванию микробная масса или метаболит
помещаются между обкладками конденсатора, к которым подается
электрический ток. Эти методы используются в лабораторных
исследованиях.
Контактное высушивание - поток прогретого воздуха или
сухого пара в герметично закрытых вакуум-сушильных шкафах
вы суш ивает материал, неподвиж но улож енны й на полках.
Н едостаток — малая поверхность контакта, недостаточны й
контакт биоматериала с потоком горячего воздуха.
Конвективная сушка - распылительная, пневматическая, аэро-
фонтанная и в кипящем слое (рис. 20,21,22). Наиболее широко
используется в производственных условиях сушилка распыли­
тельного типа.
В сушилках распылительного типа суспензия высушиваемого
материала непрерывно подается чаще сверху на центробежный
механизм с механическими или пневматическими форсунками и
распыливается на мелкодисперсные капельки диаметром 30-
70 м км . П рогреты й воздух или сухой пар подается снизу
встречным потоком через направляемую насадку конической
формы с тангенциальными щелями, обеспечивающими высокую
скорость движения воздуха.
Благодаря большой поверхности контакта, высоким скоростям
движения частиц суспензии и воздуха высушивание биопродуктов
происходит очень быстро (10-15 сек). Высушенная микробная
масса содержит 6-8% влаги, хранится до 1 года.
Унос биопродукта, микробной массы из распы лительной
сушилки вместе с отработанным воздухом достигает 15%, высокая
температура теплоносителя частично снижает его биологическую
активность.
4.4 Стабилизация и хранение ц м и н м у и * и я ц 97

Суспемли* Рис. 20 Г ч г ш г г т т г п ---- ICC ной сушилки


1 калорифер; 2 - м г а г м ь ,
) сушильная труба; 4 а к м »
отделитель, 5 филыр, I вентилятор

Рис, 2 1. С хема рас 11ыли i сл ьной сушилки


I рас Iцелительный м п м ч м .
2 распределитель r t a , 3 сушильная
камера. 4 т и п м с
5- груба пне— огрейспорта

Рис. 22. Схема с у я я я л с «кипящими слоем:


I сушильная камера; 2 гаэовод; 3. 8 калориферы; 4. Ч вентиляторы;
3 - грану лятор; 6. 10 циклоны: 7 - сетки
98 Г ла ва 4. Ф ерм ент ационная т ехнология

Сублимационное высушивание или лиофилизация - это


высушивание микробных клеток из замороженного состояния под
вакуумом, минуя жидкую фазу (рис. 23).
Технология сублимационного высушивания состоит из следую­
щих этапов:
S выделенный и очищенный целевой продукт подготавливается
к высушиванию, смешивается с подобранной защитной средой;
- биопродукт, микробная масса в ампулах или флаконах
охлаждается до -30-50°С (до эвтетической точки) с определенной
скоростью замораживания;
- высушивание в условиях вакуума. Вначале удаляется
свободная вода, в процессе испарения температура повышается
до 0°С, остаточная влажность составляет 5-10%. Затем под
вакуумом при +30-40°С удаляется связанная вода, влажность
уменьшается до 1-3%;
- ампулы или флаконы укупориваются под вакуумом или после
заполнения инертным газом. Хранятся в условиях холодильника,
флаконы в течение одного года, ампулы несколько лет (рис. 24).
Удаление испаряемой влаги, пара осуществляется конден­
сацией на охлажденную поверхность конденсатора (-40-50°С);
влага связывается химическими поглотителями.
Эвтетическая точка - это полное замораживание суспензии в
твердую массу, так называемую эвтетику, состоящую из кристал­
лов льда и солей, свободная вода отсутствует.

Рис. 23. Лабораторная аппаратура для лиофилшации.


4 4. ( таЛти шция и хранение ц<‘ нгвого щршфуали w

Рис. 24. 'Этапы сублимации


100

ЧАСТЬ II
Г Л А В А 5 . П ри м ен ен и е м и к ро о рга н и зм о в

В БИОТЕХНОЛОГИИ

5.1. Микробная биомасса в качестве пищевой


и кормовой добавки
Клетки микроорганизмов способны синтезировать все необ­
ходимое аминокислоты, в том числе и незаменимые из
органических и неорганических соединений. Количественное
содержание незаменимых аминокислот в микробных белках близко
к таковому в клетках животного и растительного происхождения
(табл. 3.)

Таблица 3. Незаменимые аминокислоты в разных белках


(г/Ю0г белка)

Амино­ Молоко пше­ дрож­ бакте- ! водорос-


соя грибы
кислоты коровы ница жи рии | ли
лизин 6,6 6,6 2,6 6-8 6-7j 5-10 3-7
триптофан 7,4 1,3
14 1,3 1-1,5 1-1,4 j 0,3-2,1 Г 1,4-2
метионин 2,4 1,7 Ь3~ 2-31 1,4-2Л|
треонин 4,6 ЗдГ 2,6 4-6 _ 1 ± Ю з- 4 И З
валин 6,9 5,4 4,6 5-7 4-6 I 5-7 □ у м
1 ~
леицин 9,9 7,9 6,9 1 # 5-11 6-10
изолейцин 6,6 5,3 3,4 4-6 5-7 3,5-7 3-61
фенилаланин 4,9 5,1 4,3 3-5 3 -4 Т 3^5 Г ~ 3-6J

Клетки микроорганизмов, как и растительные, и животные,


кроме белков, содержат и другие компоненты, обладающие
пищевой ценностью, в частности нуклеиновые кислоты, углеводы,
аминокислоты, органические кислоты, фосфолипиды, витамины,
микроэлементы и др.
В Мексике местное население издавна употребляет в пищу
лепешки, изготовленные из микроводорослей Spirulina, в
Германии в годы I мировой войны в супы и колбасы добавляли
S. I. Микробная 4«мм(Ч< • качит ие пищевой и ■ирлмнмй А й а м а 101

биомассу пекарских дрожи Sacchammyces cervvisiae как белковый


компонент, в годы II мировой войны использовали в качестве
пищевой добавки биомассу Candida arhon-a и C.uiilis и т.д.
Основания для использования микробных белков в качестве
пищевой добавки
- по ам инокислотном у составу белок м икроорг ан и зм ов
сопоставим с белками человека;
высокое содержание углеводов, липидов и витаминов,
-- повы ш енное содерж ание ам инокислот в сравнении с
кормовыми растениями.
■■ высокая интенсивность роста и размножения, синтеза белка
у микроорганизмов;
- субстрат для наращивания биомассы микроорганизмов что
отходы м я с о -м о л о ч н о й , кондитерской и иных отраслей
промышленности, легко доступный и дешевый;
- технология культивирования микроорганизмов не сложная,
не многостадийная, осуществляется в мягком режиме (30-45"С,
pH 3-6), круглогодично, в компактных условиях (ие нужны
большие производственные площади),
- путем селекции, мутагенеза, технологии рекомбииаитиой
ДНК создаются штаммы - сверхпродуценты
В качестве пищевого и кормового белка используются дрожжи
(Saccharomvccs,С'andida ), бактерии* Methylophilus, Pseudomonas
M cth ylom o n a s. A c in e to h a e te r ), одноклеточны е водоросли
( Spirulina . Cklorella, Scenedesmus) и \рц6ы (Р и\апит )
Дрож ж и
Клетки Saccharomyces cerevisiae. Sacch.carls hergens is содержат
около 50% белка, заменимые и незаменимые аминокислоты,
различние витамины; превышают растения по содержанию лизина,
греонина, вал и на и лейцина, но мало метионина, цистенна.
Биомасса дрожжей нарабатывается на досту пном субстрате,
ферментация экономична и выгодна для получения белкового
продукта.
102 Г лава 5. П р и м е н е н и е м и к р о о р г а н и з м о в в б и о т е х н о л о г и и

Таблица 4. Содержание аминокислот в мг на 100 г продукта


Дрожжи Телятина 1
Аминокислоты творог
Sacch. cerevisiae категории 1
Незаменимые
аминокислот ы: 4802 7680 7626 1
Валин Ж8 990 1156
Изолейцин 741 1000 998
Лейцин 903 1850 1484
Лизин 913 1450 1683
Метионин 233 480 414
Треонин 644 800 855
Триптофан 174 180 245|
Фенилаланин 496 930 791 j
Заменимые
(шинокислоты: 5785 10270 12333
Аланин 366 440 1124
Аргинин 528 810 1278
Аспарагиновая кислоты 684 1000 1844 !
Гистидин 302 560 739
Глицин 465 260 948
Глутаминовая кислота 1570 1 3300 33291
Пролин 490 2000 1333
Серии 583 820 813
Тирозин 676 930 689
Цистин 121 150 236
Заменимые/незаменимые 1,2 1 1,34 1,62

Продукты, полученные из биомассы дрожжей Sacch.cerevisiae


по общему количеству и соотношению незаменимых аминокислот
соответствуют требованиям, предъявляемым к высокопитатель­
ным пищевым продуктам; обладают оптимальным соотношением
заменимых и незаменимых аминокислот.
Дрожжи в качестве источника азота ассимилируют соли
аммония и реже нитраты. Превращение неорганического азота в
белок, использование различных органических субстратов как
источников углерода для быстрого наращивания биомассы
являются основой промышленного производства.
3.1. Мцкробная биомасса в качестве пищелои ы «умммг ёаАтякт >63

Т а б л и ц а 5. Содержание основных витаминов в пищевых


продуктах

Название витамина Источник витамина


В |- тиамин Дрожжи, печень, почки, яйца, ржаные
; и пшеничные продукты
В] - рибофлавин Дрожжи, печень, яйца, ржаные и
пшеничные продуты
В? • пентотсновая кислота Дрожжи,печень, мясо, рыба,
; яйца,молоко картофель,морковь
Ва - пиридоксин Дрожжи,печень, яйца, перец зеленый,
1 морковь, пшеничные продукты
В« - фолиевая кислота Дрожжи,печень, петрушка, салат^iy*
зеленый, цветная и пеленая капуста
Bii - циапкобалампн Дрожжи, печень, почки,
сердае,сельдь,мясо
| В у,,, нашамовая кислота J Дрожжи, печень, рис, семена растсиий
ГII
II - биотин Дрожжи,печень, яйца, томаты,соя,
: МОрКОВЬ _________ _____ ___
С - аскорбиновая кислота IIлолы шиповника, черная смородина,
j рябина, облепиха, лимон .хвоя
РР - никотиновая кислота I Црожжи печей! мясо, рыба, отруби

Д] - эргокальциферол ! I jw iH I IH wm рыба, масло


сливочное, яйиа, молоко

Дрожжи выращивают на гидролмзатах « отходов древесины


и другого целлюл озосодержащего растительного сырья, которое
при гидролизе образует легкоусвояемы е для микрооргани ш о в
формы углеводов. Также в качестве сы рья используют отходы
деревообрабаты ваю щ ей пром ы ш ленности, солом у, хлопковую
ш елуху, стержни кукурузных початков, свекловичную мелассу,
картофельную мезгу, виноградный выжим, отходы кондитерской
и молочной промыш ленности.
Измельченное растительное сырье подвергается кислотному
ги д р о л и зу при п о вы ш ен н о м а т м о сф ер н о м д авл ен и и и
температуре. Целлюлоза гидролизуется до олиго-и моносахаров.
У даляю т из ги д р о л и зата лигнин» вносят м ин ер ал ьн ы е соли.
104 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

витамины и другие вещества, необходимые для культивирования


дрожжей.
Осуществляется глубинная, периодическая ферментация, в
условиях аэрации и перемешивания. Полученная дрожжевая био­
масса сепарируется, высушивается в вакуум-упарных установках
до 8-10% воды, облучается ультрафиолетовыми лучами (обогаще­
ние витамином Д,).
Наряду с получением традиционных форм дрожжевой био­
массы - прессованными или сушеными пекарскими дрожжами,
выпускается дрожжевой экстракт. Для этого биомассу дрожжей
тщательно очищают, лизируют клетки при помощи ферментов,
растворов щелочей и кислот, механическим путем. Гидролиз
дрожжевых клеток осуществляется в герметичном оборудовании
в условиях перемешивания и нагревания в течение 1 суток.
Далее клеточный лизат сепарируется (обычно применяется
тарельчатый сепаратор) на две фракции - жидкий экстракт и
клеточные стенки микрорганизмов. Жидкий дрожжевой экстракт
затем сгущается в вакуум-выпарных установках до 20-25% сухого
вещества (рис. 25).
Автолиз
Фермонтолиз
Д ро ж ж и
Фермент

Вода

Рис. 25. Схема технологии получения сушеного дрожжевого экстракта.


J,/. Микрчппин tiuiiuai i а в w w m м и ^ м и u ац^шм* Jnitawrn

П оследую щ ая стадия расиылиl ельная сушка с использованием


центробежных или форсун ча ты\ распылителей.
Дрожжевой экстракт при переработке в пищевой белок допол­
нительно очищается путем осаждения, диалита с целью удаления
низкомолекулярных примесей, в том числе нуклеиновых кислот,
аномальных липидов, Д-амииокислот и других соединений.
Дрожжевой белок добавляется в сосиски, паштеты, студни;
вносится в мясо, творог для ароматизации,
Ацидофильно-дрожжевое молоко и творог в цельное молоко
добавляется 2% сахара, 3% суточной культуры дрожжей и выдер­
живается при 32-33°С в течение 14-17 часов. Полученную таким
путем такваску внося i в свежую пориию молока и выдерживают
до свертывания. Такое молоко и гворог богаты витаминами В,,
В,, и С.
Н ар ащ и вая биомассу Torulbpsis на молочной сыворотке
получают жидкий белковый продукт «Промикс», содержащий в
2-3 раза больше белка, чем в исходной молочной сыворотке.
О б о гащ ен н ы й дрожжевыми белками продукт ><Провил акт»
используется как заменитель сухого обезжиренного молока
В корм дрожжевая масса добавляется в количестве 5-10% от
сухого вещества рациона животного.
М и кро водорос л и
Ch loreИа и Scenedesmvs (однокл еточ ные водоросли), Spirulina
(сине-зеленые водоросли) способны синтезировать белки и j CO..
Н.О и минеральных веществ та счет *нергии солнечного света в
условиях теплого бассейна.
Клетки Chhrvlla и Scenedesmus содержат 55% белка. Spirulina
65%. В ми кро водорос л я\ мало метионина и лизина, но много
полезных полиненасыщенных жирных кислот, до 150 мт% бета-
каротина, 15-20% углеводов,3% пищевых волокон.
Мексика, озера Тскскоко, теплое, шел очное (pH 10-11), на ее
поверхности бурно размножается Spirulina. Ее собирают, сушат
и употребляют в пшцу. Из Spindina изготавливается мука, которая
экспортируется из Мексики в диетические магазины Японии,
США. Европы. Мука в форме таблеток, капсул.
106 Гла ва 5. П рим енение м икроорганизм ов в биот ехнологии

В У збеки стан е (1970-80 гг.) на поверхн ости 400 водоем ов


вы р ащ и в ал и S pirulina как ко р м о ву ю д о б а в к у д ля кр у п н о го
рогатого скота, домашней птицы и для тутового шелкопряда. При
д о б а в л е н и и м и к р о в о д о р о с л е й в корм т у т о в о г о ш ел к о п р я д а
значительно увеличивался выход шелка и его качество.
С 1 га водной поверхности собирается до 70 тонн сухой био­
массы микроводорослей в год.
И Д л я вы р ащ и в ан и я м и к р о в о д о р о с л е й такж е и сп ользую тся
сто ч н ы е воды т еп л о в ы х эл е к тр о с та н ц и й , ж и в о тн о во д ч ески х
комплексов, предприятий легкой промышленности.
Б актери и
Почти 30 видов бактерий используются как источники белка,
в том числе Methylomonas, Methylotrophus, Pseudomonas .
Бактерии растут быстрее, чем дрожжи, но клетки меньше по
размеру. Белки бактерий (65-70%) содержат больше метионина и
цистеина, чем дрожжи.
В качестве сырья можно использовать природной газ, газовый
конденсат, ме1анол, этанол, водород. Н еобходимо для фермен­
тации герметизированное, взрывобезопасное оборудование. Для
разд ел ен и я ку л ьту р ал ьн о й среды исп ользую тся тар ел ьч аты е
сепараторы, клетки дезинтегрируются ультразвуком, высушивание
конвективное, получают кормовой концентрат.
Г рибы
Белки микроскопических грибов - это клетки мицелия. Они
содержат в своем составе комплекс ароматических веществ, улуч­
шающих вкусовые качества, богаты витаминами и легкоусвояе­
мыми липидами. Это Penicillium, Aspergillus, Fusarium. Tricho-
derma.
По сравнению с дрожжами содержат больше серосодержащих
аминокислот, по белка в клетках грибов меньше (20-60%), грибы
медленно растут (бактерии-время генерации 20-30 мин, дрожжи-
2-3 часа, грибы 4-16 часов).
В качестве сы рья, источника углерода использую тся расти­
тельные отходы (целлюлоза, лигнин), торф, навоз; гидролиз сырья
растворам и кислоты или щ елочи, при высокой тем пературе и
i.J . Muhpoo/jsuiiu т ы • лтчвгтт вттщтш 107

давлении. На гидролизованном субстрате культивируются


поверхностно, в условиях а (рации, до 7-8 суток
Разработана гехнология получения пищ евою белка-мико-
протеииа. на основе Fusarium gramimrmrum, выращенного на
глюко 1ном сиропе из пшеничного или кукурузного крахмала

5.2. Микроорганизмы в качестве вакцин


Вакцины и антибиотики важнейшие составляющие меди­
цинской биотехнологии, иммунобиоiехнол oi ии Профилактика
инфекционных болезней, предупреждение глобальных эпидемий
стали возможны благодаря вакцинации, проводимой в плановом
порядке во многих странах мира
В технологии вакцинации используются живые, убитые микро­
организмы, их компоненты и вторичные метаболиты в качестве
чужеродных антигенов, способны х вызвать специфический
иммунитет в организме
В технологии вакцинации в первую очередь очень важны такие
свойства микробных белков, жиров, углевозов и их комплексов
как антигенность, иммуногенность и безвредность для человека
В производстве вакцин «конечный продукт» не является
результатом процессов брожения и ж биосинтеза, нет проблемы
сверхпродукции, максимального накопления биомассы микро­
организмов. Но существуют м а ч и выделения чистых целевых
антигенов, получения генно-инженерных - субъединичных,
съедобных и других видов вакцин.
Вакцинация впервые была применена Э. Дженн ером, а способы
получения и применения живых вакцин разработаны ;1 Пастером.
Живые вакцины получают путём ослабления (аттенуации) виру-
тснгноети. с сохранением антигенной стуруктуры и иммуноген-
ности потенциально патогенных микроорганизмов (чумная
палочка, бруцеллы. возбудитель туляремии >.
Аттенуируются штаммы физическим (изменение темпера­
турного режима, осмотического градиента, воздействием УФ Л и
др.) и химическим (низкие концентрации антибиотиков, желчи,
красителей и др.) способами, пассажем на невосприимчивых
животных, курином эмбрионе, культуре тканевых клеток (в случае
вирусов).
108 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Чистая культура микроорганизма

♦ Ч
морфолого-культурал- биохимические аитигеиность,
ные свойства и генетические иммуногенность
характеристики

~Т~
оптимизация питательной среды, условий культивирования
(pH, температура, рОг и др.), выбор типа биореактора


Ферментация, получение биомассы микроорганизмов,
отделение от культуральной жидкости, стабилизация вакцины

убитые живые субъединичные


(инактивация) (лиофилизация) (дезинтеграция)

Рис. 26. Схема технологии получения вакцин.

- 1881 год. JI.Пастер получил ослабленный вакцинный штамм


возбудителя сибирской язвы, культивируя штамм при 42°С в тече­
нии 2-3 недель. В 1940 году Н.Н. Гинзбург и A.JI. Тамарин раз­
работали более безопасный вакцинный штамм сибиреязвенной
бациллы;
- 1919 год. А.Кальмет и М.Герен разработали вакцину против
туберкулёза, БЦЖ (BCG, Bacille Calmete et Guerin) путем много­
летнего культивирования патогенного Mycobacterium bovis на
картофельно-глицериновом агаре, с добавлением желчи в возрас­
тающих концентрациях. Было выполнено 230 пассажей патоген­
ных микобактерий на протяжении 13 лет, чтобы получить БЦЖ.
Живые вакцины наиболее иммуногенны, но трудности в стан­
дартизации и длительном хранении (лиофилизация, в условиях
холодильника).
Инактивированные вакцины получают путем физической и
химической инактивации высокопатогенных штаммов полно­
ценных в отношении вирулентности и антигенной структуры
(формалиновая, спиртовая и др).
Так возбудители коклюша инактивируются формалином и
мертиолятом, лептоспиры - высокой температурой, холерный
вибрион - формалином.
J J. Микраоргани/мы в киче< т««• вакцин 104

Инактивированные вакцины достаточно иммуногенны. менее


реактогенны чем ж ивы е, легко стандарти ж р у к л ся их проще
хранить, транспортировать
Вакцины изготовленные и < компонентов микроорганизмов или
су б ъ ед и н и ч н ы е. Ч ащ е »то м ак р о м о л ек у л яр н ы е п и ко- или
липопрогеиды К примеру брюшнотифозная спиртовая вакцина,
содержащая Vi антиген возбудителя.
Субъединичные вакцины стандартны, низкая реактогеиность,
но слабая нммуногенность.
Анатоксины получают путём выделения, очистки и инакти­
вации вторичного метаболита микроорганизмов жзотоксина
Технология получения анатоксина из дифтерийного экзоток­
сина разработана в 1923 i оду Рамоном Воэбудитель дифтерии
Coryttebacterium diphthvriae культивирован на жидкой питатель­
ной среде, затем из культуральной жидкости выделен и очищен
дифтерийный ж ю токсин и инактивирован 0,3-0,4% раствором
ф ормалина я нейтральной среде при 37°С в течение I месяца.
Инактивированный токсин с сохранённой антигенной структурой
и иммуноген НОстью анатоксин адсорбирован на гидрате окиси
алюминия (адъю вант).
Таким же способом получают столбнячный, стафилококковый,
ботулинический и другие анатоксины Анатоксины характери­
зуются достаточной иммуногеностъю, специфичностью, создают
прочный, активный, приобретённый иммунитет.
Генно-инж енерные т ехнологии получения вакцин
А ттенуированны е вакцины получаю т путем ингибирования
генов патогенности. Так, жтеротоксин возбудителя холеры Vibrio
cholerac состоит из I субъединицы А (стимулирует аденилат-
циклазу) и 5 субъединиц В (обусловливают специфическую связь
токсина с рецепторами слизистой кишечника) Рекомбинантный
штамм холерного вибриона не синтезирует »нтсротоксин. так как
изменён ген пептида А. Штамм стал непатогенным и может быть
использован в качестве вакцины. Получен модифицированный
ш тамм S a lm o n ella sp. с и зм ен ени ям и в ген ах, кодирую щ их
ферменты биосинтеза. Такой микроорганизм слабо размножается,
со сниженной патогенностью.
110 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Субъединичные вакцины получают путем клонирования генов


протективных антигенов возбудителей в геном вектора (вирусы
или инвазирующие культуры бактерий).
Так, ген HBs антигена вируса гепатита В клонируют в геном
вируса оспо - вакцины (вектор), которым заражают культуру
тканевых клеток. При репродукции вируса в клетках одновременно
синтезируется HBs антиген. Его выделяют, очищают; можно
использовать в качестве субъединичной вакцины.
Либо другой способ доставки целевого гена в животные клетки.
Для этого клонируемый ген внедряют в Shigella flexneri (возбу­
дитель дизентерии, инвазирующий в эпителиальные клетки
кишечника). Шигеллами заражают животного энтерально.
Бактерии инвазируют в эпителиоциты, размножаются.
Плазмиды Shigella flexneri попадают в цитоплазму эпителио-
цитов; последующая экспрессия клонируемого гена в составе
плазмиды, синтез искомых антигенов. Выделение, очистка и
применение антигенов в качестве субъединичных вакцин.
Доставку клонируемых генов, кодирующих синтез вакцинных
антигенов можно осуществить путем бомбардировки животных
клеток микрочастицами золота с адсорбированными на их
поверхности фрагментами ДНК.
Съедобные вакцины
Мукозные или съедобные вакцины впервые получены Мэйсон
в 1992 году путем клонирования гена, детерминирующего HBs
Ag вируса гепатита В в клетках табака. Трансгенный табак при
росте продуцирует наряду с растительными белками и HBs Ag.
Затем гены HBs Ag были экспрессированы в геном картофеля,
кукурузы.
Желательно использовать для создания съедобных вакцин рас­
тения, широко используемые в пищу без термообработки (томаты,
бананы, салатные листья и др).
Желательно усилить экспрессию целевых генов в трансгенных
растениях, так как съедобные вакцины, как и в целом генно -
инженерные вакцин характеризуются недостаточной иммуно-
генностью.
3.2 Микрпор.чтишы в качестве аакцин III

Технология получения вакцин


При производстве живых и инактивированных вакцин предва­
рительно подготавливается посевной материал и среда
культивирования. Бактериальные вакцинные штаммы культиви­
руются I дубинной фермешацней или поверхностной на твердых
питательных средах. Вирусные штаммы в куриных эмбрионах,
первично-трипсицитированны х и перевиваемы х культурах
клеток, Процессы выполняются в строго ассепi ических условиях,
исключающих конгаминацню посторонней микрофлорой, фагами.
Биомассу аттенуированно!о анамма концентрируют, стандар­
тизируют по количеству микроорганизмов в единице объема,
лиофилитируюI со стабилизирующей средой, фасуют в ампулы
или флаконы. Срок хранения лиофили тированных живых вакцин
1*2 года при 4-8°С.
При получении убитых вакнин микроорганизмы концентри­
руют, стандартизируют по числу микробных клеток в единице
объема, инактивируют. Далее лиофилизаиия, фасовка и упаковка
во флаконах или ампулах, хранение.
При создании еубъединичных вакцин клетки микроорган измов
лизируют, выделяют вакцинный антиген из клеточно! о детрита
путем сорбции, фильтрации, хроматографии и др.
Если разрабатываются вирусные вакцины, то предварительно
подготавливается культура тканевых клеток для культивирования
вирусов. В асептических условиях вирусом заражается клеточная
культура. Вирус репродуцируется, его выделяют, инактивируют.
стандартизируют, лиофилизируют, фасуют в ампулы и укупо­
ривают.
В технологии приготовления вакцин используются
консерванты мертиолят (1:10000), азид натрия, формаль­
дегид (0,1 -0,3°о), они подавляют постороннюю микрофлору в
процессе хранения;
стабилизаторы - сахароза, желатин, обезжиренное молоко; они
предотвращают от быстрого разрушения лабильные антигены;
- адъю ванты, усиливающие иммуногенность вакцин. Это
гидрат и фосфат окиси алюминия, липополисахариды. синте­
тические полимеры.
112 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Требования, предъявляемые к вакцинам:


- отсутствие посторонней микрофлоры;
- безвредность для человека;
- стандартность;
- слабая реактогенность;
- выраженная иммуногенность.
В технологии получения вакцин необходимо:
- применение щадящих физико-химических методов, по воз­
можности - сокращение этапов в технологической цепи;
- сохранение первоначальной структуры и иммунных свойств
антигена.
Вакцины применяют:
- моно (БЦЖ), ассоциированные (АКДС), аутовакцины (стафи­
лококковая аутовакцина);
- с профилактической (БЦЖ, АКДС) и редко с лечебной (гоно­
кокковая, стафилококковая) целью;
- в плановом порядке (БЦЖ, АКДС) и по эпидемическим
показаниям (чума, холера).
5.3. Пробиотики
Пробиотики - это биопрепараты, содержащие живые микроор­
ганизмы - симбионты человека или животных, обладающие
способностью восстанавливать нарушенную микроэкологию
организма.
К симбионтным микроорганизмам, используемым в качестве
пробиотических препаратов относятся бифидобактерии, лакто­
бациллы, стрептококки, присутствующие в организме с самого
рождения, кислотоустойчивые, а также другие группы.
Это Bifidobacterium bifidum, B.longum, В.breve, B.adolescentis.
Lactobacillus acidophilus, Lb.lactis, Lb.plantarum, Lb.fermentum. Lb.
casei, Lb.ramnosus, Streptococcus lactis, Str.cremoris, Bacillus subtilis
и др.
В ветеринарной практике при разработке пробиотиков также
используются Saccharomyces cerevisiae, Candida pintolonesi,
Aspergillus niger, Asp.oryzae.
iJ. Ilpotiuomuки IIS

У здорового человека микрофлора, населяющая кишечный,


генитальный биотопы или слизистую ротовой полости (в этих
биотопах больш е всего различных м икроор!анизм ов и это
«ворота» кишечных, рсснирщирных и восходящей мочеполовой
инфекций) в своем большинстве представлена симОионтными
микроорганизмами н о состояние »убиоза.
При самых различных заболеваниях (инфекционные, сома! и-
ческие и особенно при патологии тех opi анов. где вегетирует
симбионтная миклофлора) нарушается микро экология в
вышеуказанных биотопах, начинают доминировать случайные или
гринзигорные, а том числе условно-патотс иные микроор! ани шы
(протей, кандида, гемолитический стрептококк, »олотистый
стафилококк, лактозоне! ai ииные энтеробактерии), а количество
симбионтов уменьшается это состояние дисбактериоза. Дисбак­
териоз в свою очередь отягощает, является причиной других
шболеваний.
Чтобы восстановить эубноз. нарушенную микроэколог ию,
нужно восстанови гь в первую очередь популяционный уровень
симбионтной миклофлоры, одновременно и морфофуикциональное
состояние слизистой оболочки, где они вегетируют. Пробиотики
разработаны и применяются с целью коррекции микроэкологии.
Пробиотики характеризуются следующими биологически
полезными свойствами:
• Антагонизм в отношении условно-патогенных микроорга­
низмов, обусловленный продукцией бактериопионов, перекисных
соединений, снижением pH среды та счет образования органи­
ческих кислот, конкуренцией за питательный субстрат.
• Стимуляция роста симбионтной миклофлоры в биотопе,
укрепление колони «анионной резистентности или устойчивости
слизистой к размножению посторонней, в том числе условно-
патогенных микрооргани шов за счет биопленки на поверхности
эпителиоцитов, состоящей из симбионтной миклофлоры;
• Стимуляция местного иммунитета, усиление продукции
секреторных иммуноглобулинов;
• Участие в процессах внутрикишечного пищеварения, ней­
трализация токсических метаболитов, сорбционная способность,
способность утилизовать холестерин, противоопухолевые
свойства, протео- и липолитическая активность:
114 Глава S. Применение микроорганизмов в биотехнологии

• С интез витам инов, ам ин оки слот, орган ических кислот,


источники минеральных солей и микроэлементов.
П олезны е би ологи ч ески е свой ства пробиотиков в целом
способствую т восстановлению нарушенных физиолого-биохи-
мических процессов в организме.
М и кроорган и зм ы , и сп ол ьзуем ы е в к ачест ве п робит иков
должны быть:
• Не патогенными, не токсичными, отсутствие мутагенности;
• Технологичны, то есть легко культивируются в производст­
венных условиях, при этом стабильно сохраняют биологическую
активность, полирезистентны к антибиотикам.
Пробиотические препараты разрабатывают на основе одного
штамма, нескольких штаммов одного вида, консорциума из разных
видов, а также сочетания микроорганизма-симбионта с сорбентом,
ферментом, иммуномодулятором и т.д.
В разных биотопах организма сосуществуют микроорганизмы
определенных видов и в определенных количествах. Именно сооб­
щество микроорганизмов-симбионтов обеспечивает колониза­
ционную резистентность организма, состояние эубиоза. Поэтому
создание пробиотиков на основе сообщества микроорганизмов
вполне логично.
Наиболее часто пробиотики разрабатываются на основе бифи­
добактерий и лактобацилл. Для их культивирования в качестве
источника углерода необходимы углеводы, бикарбонат, диоксид
углерода, цистеин как источник азота. Также в среду культи­
вирования вносятся готовые аминокислоты (аланин, лизин, арги­
нин) в составе казеина, пуриновые и пиримидиновые основания в
составе дрожжевого автолизата, рибофлавин и биотин, мине­
ральные соли (Mg, Мп и другие), глюкоза или лактоза.
Сырье, используемое для приготовления среды культивиро­
вания должно быть безвредным для человека. Основной субстрат -
обезжиренное молоко, гидролизованное молоко.
Длительность ферментации в биорекакторе около 10-IS часов,
процесс останавливается в конце логарифмической - начале ста­
ционарной фазы развития м и кр о о р !ан и зм ов. в период их
наибольшей биологической активности.
i.4 . Мик/торга ммmix rmtiKi ш у н т ртлм />и> тении 115

Биомасса м икроорганизм ов-сим бионгов копнентрируется на


сепараторах, далее вносятся компоненты поддерживающей среды
при хранении (ж елатин, с а х а р о за , обеглсиренное м о л око),
разливаются в ампулы или флаконы, лнофили шруются
Готовый п репарат проверяется на отсутствие посторонней
м иклоф лоры , ко ли чество ж и зн ес пособн ы х микроор! ани змов-
симбиоитов, их ан гагонистическую акт ивиость в отношении тест-
штаммоа.
Первый дечебно*профилактнческий препарат на основе живых
бифидобактерий был изготовлен в 1956 j оду а I ермании В нас­
тоящее время в качестве препаратов либо пищевых и кормовых
добавок используется больш ое количество различных пробио­
тиков:
бифидумбактерин (моноштамм В bifidum ), бификол (В longum
E.coli M l 7), б и ф и л н » (В bifidum +лиэоцим), бифидумбактерин-
форте (В.bifidum + косточковый угольный сорбент), лактобактерин
(Lb.ferm enium ), ап и лак (L b,acidophilus), аи и лаат (3 ш там ма
Lb.acidophilus ), М арин» () штамм Lb.acidophilus ), тастрофарм
( Lb.delbrueckii ), сим биф лор (Lb acidophilus, Sir.thermophtlus,
B.longum , B. bifidum, E.coli), биоферм и н ( Lb.rhamnmus , Lb л asei,
B.subtilis, Str.fdecahs. Lb. acidoph ilus), биоспорин (В. sub tilis) и т.д.

5.4. М икроорганизмы стимулирую т рост растений

М икроорганизмы способствую т росту и развитию растений,


повыш ению урожайности зернобобовых культур путем:
фиксации атмосферного азота, который затем используется
растениями:
образования легкоусвояемы\ форм железа и фосфора и/или
поглощ ения из почвы и доставка этих полезных минеральных
веществ в растение;
- син теза ф итогорм онов, стим улирую щ их рост и развитие
растительных клеток:
- подавления ф итопатогенов продукцией ант ибиотических
соединений либо конкуренцией за субстрат.
Фиксация атмосферного азота является одним из этапов его
круговорота в природе (рис. 2?)
116 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Атмосферный азот

Денитрификация Фиксация азота


Нитраты восстанавливаются Атмосферный азот фиксируют бактерии
до газообразного азота родов Azotobakter. Clostridium. Rhizobium.
бактерии, главным образом цианобактерии и др.
рода Pseudomonas Фиксированный азот используют растения
и превращают его в растительный белок;
растения поедают животные - образуется
животный белок и т.д.

¥
Нитрификация Аммонификация белков и аминокислот
Аммиак окисляют Белки животных и растительных остатков
до нитртов бактерии разлагаются в почве микроорганизмами:
Nitrosomonas, а нитриты Pseudomonas. Bacillus. Clostridium.
в нитраты - Nitrosobacter. В результате образуются аминокислоты,
они дезаминируются с выделением
NH, и других соединений азота в природе.

Рис. 27. О сновн ы е направления круговорота азота в природе.

Еж егодно в мире производится 50-70 млн. тонн химических


азотных удобрений. Стоимость азотных удобрений в 6 раз выше
ф осф орны х и в 16 — калийны х удобрений. При этом растения
и сп ользую т 3 0 -7 0 % вн есен н ы х в почву азотн ы х у д о б р ен и й ,
остальные просто вымывается из почвы.
А л ьтер н а ти в н ы й вар и ан т - вм есто м и н ерал ьн ы х азотн ы х
удобрений производить биологическую фиксацию атмосферного
азота, используя микробные землеудобрительные биопрепараты.
Способность восстанавливать молекулярный азот (N2) до NHj
встречается среди свободноживущих либо образующих симбиоз
с высш ими растениям и прокариот (бактерии, актин ом ицеты ,
цианобактерии).
Биологическая ф иксация атм осф ерного азота наблю дается
среди сельскохозяйственных бобовых растений, включая важные
зернобобовые культуры (горох, бобы, соя), кормовых культур
(люцерна, клевер), среди многолетних кустарников и деревьев.
Большинство азотфиксирую щих микроорганизмов являются
диазотрофами, то есть могут использовать атмосферный азот в
качестве еди н ствен ного источника азота (диазотроф ность
i.4 М икроорганиш ы стимулируют раст рм теыии П7

способность ф иксировать N,). Д иаш троф ия встречается среди


гетеротроф ов, ф оготроф ов, хемоли (оавтотроф ов, метанотенов,
метилотроф ов, цианобактерий.
Азогфиксируюш ие прокариоты подраздел я к»тся на
- с в о б о д н о ж и в у ш и е, не свя «анные с к о р н ево й си стем ой
растений а ю т фиксаторы. К примеру, ана >робы к.кк гридни, для
которых источником азота служат соли аммония, азотной кислоты.
органических соединении, а также атмосферны й аю т. Аэробы
Azotobacter источник азота соли аммония, нитриты, нитраты,
аминокислоты, в их отсутствие атмосферный аэот;
- симбиотические или клубеньковые азотфиксаторы, в первую
очередь >то бактерии рода Rhizobium , выделенные впервые в IVKK
году из клубеньков растений.
Различные виды бактерий рода Rhizobium об лад аю т о п р е ­
деленной специф ичностью взаим одействия с бобовыми расте­
н и ям и ; Rhizobium m eiiloti - си м б и о н т л ю ц ер н ы , Rhizobium
leguminosum гороха. Rhizobium trifoli - клевера. Rhizobium
fhaxeoli - ф асоли, Rradizhizobium japonicum сои. М асштабы
фиксации атмосф ерного азота ризобиями достигаю т 100 кг на
I гектар почвы в год.

Т аб л и ц а 5. Симбиоз ризобий с растениями

Микрооргани 1мы Растения - амии

* Rizobium leguminosum
биовар \h те горох, чсчевииа. вика
биовар phasmti фасоль
биовар frifolu клевер
• Ri~ohium meiiloti люцерна, донник
(Sint n hizobium melitoli)
• Rizobium loti лядвеиец
• Rizobium galegae акация
• Rizobium spp. соя
• Bradyrhizobium iaponkum вигна. арахис
• Brath'rhizobium spp,
сесбания
соя
• izorhizobium caulinodam
• SinorhizoNum fredii
118 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Многие виды покрытосеменных растений (многолетние кустар­


ники, деревья) формируют корневые клубеньки, образуют симбиоз
с актином ицетам и рода Frankia. М асш табы азотф иксации
варьируют от 40 до 350 кг/га в год.
Цианобактерии также образуют симбиоз с растениями. Наи­
более изучен эндосим биоз гетероцистны х цианобактерий
Anabaena с водным папаротником Azolla, a Nostoc с цветковым
Gunnera. Масштабы азотфиксации в пределах 50-100 кг/га в год.
Механизм азотфиксации у прокариот
В результате взаимодействия Rhizobium с бобовыми расте­
ниями с участием растительных веществ —индукторов и бакте­
риальных факторов нодуляции обеспечивается образование на
корнях вы сокодиф ф еренцированны х органов - клубеньков.
Бактерии проникают в цитоплазму растительной клетки, проис­
ходит деление и дифференцировка их в бактероиды - азотфик-
саторы (рис. 28).
В фиксации атмосферного азота участвуют 7 координиро­
ванных регулируемых оперонов, кодирующих около 20 различных
белков, принимаю щ их участие в процессе азотф иксации у
ризобий.
Инициируют образование клубеньков nod-гены (nodulation-
клубенькообразование) бактерий. В свою очередь nod-гены
индуцируются под действием флавоноидов и изофлавоноидов,
выделяемых корневой системой бобовых растений.
Реакцию восстановления N, в NH3 катализирует нитрогеназный
ферментный комплекс, инактивирующийся в присутствии кисло­
рода. Поэтому фиксация атмосферного азота осуществляется в
условиях низкой концентрации кислорода. Внутри клубенька
концентрация кислорода около 30 нм, вне - 250 мм. Кислород
практически не проникает в клубеньки, а его содержание внутри
клубеньков регулируется белком леггемоглобином. Глобин и
гемовая часть синтезируются растительными клетками. Бакте­
роиды, находящиеся в клубеньках, также синтезируют гем, но его
участие в азотфиксации состоит в биосинтезе цитохромов, обес­
печивающих транспорт электронов к нитрогеназе. Лег гемоглобин
встраивается в м ембрану бактероида и обладая высоким
1 .4 M u x p o o p s It*

C jjw J | c ТО ЗА
ЯИЯМ М *
CO, 4-^---- we*
МАЯИ
|C SD
MOO, n « n
-
o*

ltssm S

Рис. 28. Метаболичсскдя w w i p i w иартнсро* при образовании


аэотфикснруюшего симбиоза.
SSasc - w y w a c w r n t . PF.P фосфенол пирунат.
PEPCase - фоефоеио 1 пир\м т п рОпашм ц О А - « « и ш т и .
MDH м и п щ и д р о г е т и . 1МЛ с > « ш м т к |м е п |.Ш п у т м ш м п с т т ,
OOGAT I in гаматсинт а <а. dc \ ликарбоновые кислоты IС) п и н и . малат)
ТСА никл грикарбоновых кислот.O i l ! - глутамин, GLN - глутамат.
akeroGl U ш кетоглуларат, FixGHlS ■ f u N O Q f си— фичсскис яд*
бактероидов цитохромы с высоким сродством с кислороду.
РВМ 1icpnoa ктероидная мембрана. ВМ мембрана бактероида

сродством к кислороду, регулирует его поступление в цитоплазм)


и обеспечение бактероидов О, непосредственно перед азотфик-
сацией.
120 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Специфичность симбиотического взаимодействия ризобий с


растительными клетками зависит от поё-генов, а собственно
процесс азотфиксации, нитрогеназная реакция регулируется nif
и fix -генами (эти гены кодируют нитрогеназный комплекс
ферментов). Гены чаще локализуются в плазмидах.
Симбиотическая азотфиксация у цианобактерий несколько
отличается. Так, при переносе АпаЬаепа в безазотную среду часть
клеток увеличивается и превращ ается в гетероцисты с
ограниченным доступом кислорода в цитоплазму. В гетероцистах
в микроаэрофильных условиях формируются цианобактероиды,
синтезирующие нитрогеназный ферментный комплекс, фикси­
рующий атмосферный азот. Азотфиксация идет в гетероцистах
(цианобактероиды в цитоплазме растительных клеток), а
фотосинтез - в обычных свободноживущих цианобактериях.
О бразование NH, осущ ествляется с затратой энергии,
образуемой в процессе брожения у анаэробов, дыхания - у
аэробов, фотосинтеза - у цианобактерий.
Далее аммоний поступает из бактероидов в цитоплазму расти­
тельных клеток клубеньков в свободной форме, либо в составе
аланина. Фиксированный азот включается в метаболизм расти­
тельных клеток в результате реакций глутаматсинтазного (транс­
портер азота глутамин), амидного (транспортер азота аспарагин)
или уреидного (перенос фиксированного азота с помощью
аллантоина или аллантоиновой кислоты) циклов.
Биоудобрения производятся и применяются в сельском
хозяйстве с 1896 года, когда было разработано в Германии первое
биоудобрение —нитрагин. В настоящее время на поля вносятся
различные биоудобрения, в том числе:
- ризоторфин (Rhizobium), повышает содержание белка и
витаминов, урожайность на 5-20% у сои, фасоли, гороха и др.;
- азотобактерин (Azotobacter), стимулирует синтез биотина,
гетероауксина, гиббереллина, никотиновой и пантетеновой кислот
у оранжерейных и парниковых растений;
- использование цианобактерий - альголизация (около 130
видов синезеленых водорослей, фиксирующих азот) - АпаЬаепа,
Nostoc, Tolypothrix и др., на орошаемых полях, рисовых полях.
J.4- Мтумрмшимм iinuui шрутт рост растении 121

Бактериальные удобрения получают ферментацией ь био­


реакторах, биомасса сепарируется, концентрируется, высуши­
вается и вносится в почву перед посевом
Цианобактерии культивируют в специальных бассейнах, в
условиях инсоляции, через 3 недели с 1га поверхности воды
собирается около 15 тонн биомассы, используемой на орошаемых,
рисовых полях.
Если азотфиксирующие прокариоты удовлетворяют потреб­
ности растений в азоте и делают их таким образом отчасти незави­
симыми от наличия в почве сватанного а юта. то грибы обес­
печивают главным образом доступность для растений фосфата
В результате симбиоза грибов и растений образуется микориза.
Грибы, размножаясь в корневой системе, увеличивают ее объем,
могут переводить фосфаты в растворимые соединения, легко
усвояемые растениями.
Наряду с облегчением доставки до растительных клеток азота
и фосфора микроор!ани«мы стимулируют рост и развитие расте­
нии путем синтеза регуляторов роста, являющихся ни jko-
молекулярными, бе«азотистыми соединениями циклического
строения:
- ауксины, синтезируемые грибами (Nectiia gatligcne), бакте­
риями (Azotobacter,; Rhizobmm),
гиббередлины, синтезируемые грибами (Fusarium mnnthforme,
CollybUi conigens), актиномнцетами (Actinomyces ckromogtnes. A.
flaviis), бактериями (Azotobacter, Agrvbacterium. Rhizobfum);
- цитокинины, продуцируемые грибами (Nectria galligene,
Taphrine sp., Cvtospora sp.), актиномнцетами (Streptomyces sp.),
бактериями (Azotobacter, Agrobaeterium, Rhizobium)
Так при применении бактерий Azospirillum (A brasielense. А
lipoferrum) а качестве инокуляторов при обработке семян ячменя,
риса, пшеницы, сорго урожайность повышается на 10-30%.
Подавление роста и размножения фитопатогенов осу­
ществляется в процессе конкуренции та субстрат либо продукцией
антибиотических веществ:
- синтез сидерофоров. которые связывают большую часть
железа, находящегося в слое почвы, непосредственно при­
легающему к ризосфере. Фитопатогены также синтезируют
122 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

сидерофоры, но сродство к железу меньше, чем у ризосферных


бактерий. Последние оказываются вне конкуренции за субстрат;
- продукция антибиотиков, подавляющих рост и размножение
фитопатогенов. К примеру псевдомонады, агробактерии и др.
синтезирую т агроцины , гербиколин, оомицин, феназин,
пирролнитрин, ингибирующие фитопатогены.
Некоторые микроорганизмы (псевдомонады, энтеробактер и
др.) синтезируют ферменты (липазы, хитиназы, протеазы), разру­
шающие клеточную стенку патогенных грибов.

Некоторые примеры специфических микробных метаболитов,


препятствую щ их развитию болезней сельскохозяйственны х
культур (табл. 6).

Т абли ца 6. Микробные метаболиты, ингибирующие


фитопатогены
Эффективный
Болезнь Возбудитель
метаболит
• гниль корневой Greumannjmyces gram inis феназины
пшеницы var. tritici 2,4-днфцетил-
флороппоцинол

• бурая пятнистость j Pyrenophora tritici пирролнитрин


пшеницы

• полегание сахарной Pythium аммиак,


свеклы, хлопчатника пиолютеорин
2,4-дифцетил-
флороглюцинол

• черная гниль корней Thielaviopsis basicola j HCN


табака ! 2,4-дифцетил-
флороглюцинол

• галл корончатый Agrobacterium tumefaciens \ агроцин - 84


плодовых деревьев

• фузариозное Fusarium oxisporum псевдобактин В10


увядание льна
$ S Мин/хюргантмы и Оиоре.иеОииции 123

5.5. Микроорганизмы и биоремедиация


Биодеградация (биоразрушение) ксенобиотиков, ь гом числе
пестицидов и гоксических соединений, годами накапливающихся
на свалках, в воде и почве, и утилизация отходов пищевой и
ггерерабагываюгцсй иромышлсноо и от носятся к главным тадачам
экологической биотехнологии
Биоремедиация (биоочишение), т е устранение загрязняющих
агентов из окружающей среды осуществляется либо стимуляцией
микроорганизмов а биогеоценозе, либо их интродукцией из вне.
В процессах очищения окружающей среды от биозагря шений
огромная роль принадлежит микробиоте почвы и воды. Само­
очищение, утилизация органических соединений, биотранс­
формация токсических веществ микроорганизмами это
постоянно действующий механиш, основанный на многообразии
путей катаболизма у микроорганизмов, особенно у бактерий Так
пестициды в почве трансформируются химическими и физи­
ческими факторами, но главным обратом микроорганизмами
Однако природных сил не достаточно, особенно при широком
применении пестицидов, масштабных нефтератработках,
огромных отходах химической промышленности и т.п
Поэтому актуальна разработка биопрепаратов, основанных на
ассоциации микроорганизмов, утилизирующих ксенобиотики
Биопрепараты разрабатываются либо из штаммов, выделенных
из мест, загрязнённых ксенобиотиками, либо из уже селекцио­
нированных «готовых» микроорганизмов-деструкторов
Расщеплять ксенобиотики, пест ициды, токсические соединения
способны псевдомонады, нттероба ктери и. бациллы, коринебак-
терии и другие гру ппы микроорганизмов.
Микроорганизмы могут полностью расщеплять (минерали­
зовать) ксенобиотики либо имеет место не полная деградация
токсических молекул, а детоксикация путём фосфорилирования.
метилирования, а цетн л ирова ния и т.д. После повторного попа­
дания ксенобиотики уже быстрее разлагаются адаптированными
к субстрату, селекционированными в естественных условиях
микроорганизмами.
Бактерии, расщепляющие негалогеннзированные аромати­
ческие соединения, как правило, превращают их в ацетил СоА и
124 Глава S. Применение микроорганизмов в биотехнологии

сукцинат или пируват и ацетальдегид. Далее эти последние


соединения метаболизируются практически всеми группами
микроорганизмов.
Галогенизированные ароматические соединения - основной
компонент пестицидов, гербицидов - дегалогенизирую тся
микроорганизмами путём отщ епления атомов галогена от
органической молекулы, т.е. путём детоксикации токсического
соединения.
Часто применяемый галогенизированны й гербицид 2,4-
дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) активно расщепляется
Achromobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Flavobacterium,
Pseudomonas, Alcaligenes и др.
Ф унгицид амистар разлагаю т Nocardia, Arthrobacter,
Mycobacterium.
Пестициды, содержащ ие аллиловый спирт утилизируют
Nocardia, Corollina, Trichoderma vulgaris, Azotobacter и др.
Фосфорорганические соединения расщепляются Arthrobacter,
Flavobacterium, Pseudomonas.
Полихлорированные бифенилы (ПХБ) - токсические вещества,
попадающие в окружающую среду со стоками и выбросами
промышленных предприятий разлагаются псевдомонадами.
Последние являю тся основной группой почвенных
микроорганизмов, разруш ающ их ксенобиотики. Они
характеризую тся присутствием многокопийных плазмид
деградации, наличием различных групп ферментов деградации.
Так, оксидоредуктазы или гидролазы певдомонад разлагают
углеводороды и ароматические соединения (бензол, толуол,
ксилол, нафталин, камфару).
Природные м икроорганизмы -деструкторы , как правило,
разлагают ограниченное число загрязняющих соединений. Это
обусловлено, прежде всего, строгой специфичностью первого
ферментного пути деградации, расщепляющего только
определённый субстрат.
Расширить спектр деструктирую ш ей способности
микроорганизмов возможно путём расширения спектра ферментов
деградации. Так, в 1970-х годах Чакробарти создал генно-
инженерным путём «супербациллу», способную расщеплять
S. S. Mukpoofj.'UHU ш ы m IMwpw 125

большинство углеводородов нефти. В рекомбинатный штамм


клонированы путем коиыогации несколько плазмид д а радации
САМ * деградации камфоры, ОСТ - октана, NAH нафталина,
XVZ ксилола (рис 29).
Далее, в природных условиях, в почве и воде ксенобиотики
находятся в температурном режиме 0-204 Поэтому акт\льна
разработка рекомбинантных микроор! анитмоа-лес ipynopoa, ути­
лизирующих ксенобиотики при 0°С (Pseudomoas pud da. реком­
бинантный штамм утилизирует толуол и ешннжаат при в*С|

Пли 1м ида САМ П и и т * V ОСТ И м ш щ XVI. П м ш т МАМ


( ipcum Сщ ч
■■ИИ мши

Шгамм А Ш тамп В Юга— С Штамм D

Рекомбинация
H-'iaiM H.i
П тр ш САМ О ТТ

ГФ
("креята

О
(Ш амм Я Шгамм f
Плазмида XVL
П м а и ш САМ (Х 'Т
П а * м ш NAH

Штамм G

Рис. 29. Создание бактсриалшмо мтмамк. с—овО—но резр>шап>—мфару, октан,


ксилол и нафталин Штамм А, несущий нлазмиду САМ (она терминирует
разрушение кафары), скрещивают со штаммом В. несущим i i a a w j q ОСТ
(разрушение октана). При гттшстбратустс* гатамм I который содержит гяйрашгрв
плазмиду, обра ювавшукк* ■результате гомологичной рекомбинации между
исходными плазмидами и обладанчцую функция»«и —ждий т них Ш гамм С,
содержащий плазмиду XYL (растен и е ксилолаК скрешив— т со штамм*иаР.
содержащим ош зм м д ) ЧАН (ра »pv шенис нафиыина). и япаучит штамм F. который
несет обе m u t w u i Наконец, скрещивают штаммы F и f . • результате чего
образуется штамм G содержащий плазмиды САМ « X I . XYI ■ NAH
126 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

5.6. Микробные биопестициды


Химические средства защиты растений или пестициды под­
разделяют на:
- гербициды, уничтожающие сорняки;
- фунгициды, подавляющие жизнедеятельность фитопато­
генов;
- инсектициды, вызывающие гибель вредных насекомых.
В группу пестицидов входит около 20 различных групп сое­
динений, в том числе фосфороорганические и хлорорганические
соединения, производные карбаминовой кислоты, триазина,
урацила и др. Годовой оборот мирового производства пестицидов
составляет около 20 млрд. долларов, в том числе 1% - это
биопестициды.
Среди пестицидов более широко применяются хлор- и фос-
форорганические соединения, парализующие нервную систему,
мышцы насекомых - вредителей. Вместе с тем эти химические
соединения уничтожают не только вредителей, но и их врагов —
полезных насекомых, накапливаются в окружающей среде,
способны кумулировать в организме человека, токсичны для
человека.
Биопестициды обладают способностью подавлять рост и
развитие патогенных для сельскохозяйственных растений грибов
и бактерий, уничтожать вредных насекомых путём продукции
токсинов, летучих соединений (аммиак, HCN),конкуренции за
питательный субстрат.
Биофунгициды
Различные виды псевдомонад могут продуцировать HCN в
концентрациях, токсичных для некоторых фитопатогенных грибов
(напр. Thieloviopsis basicola , предупреждая тем самым чёрную
гниль корней табака).
Некоторые штаммы Bacilus subtillis проявляют выраженной
антагонизм в отношении таких фитопатогенов, как Rhizoctonia
solani и Botrytis cinerea.
Клубеньковая бактерия Agrobacterium radiobacter, выделяя
бактериоцины (агроцин — 84, низкомолекулярные пептиды
J.4 Микрсшмыг бионестици<)ы

плммидной локализации) предупреждает развитие корончатого


г ш , вызываемого фитопатогеном Agrobucterium tum tfaaens.
Биоинсектициды
Существует более I млн видов различных насекомых, среди
них есть вредители сельскохозяйственных растений и переносчики
болезней человека и животных
Для уничтожения вредных насекомых в качестве биоин­
сектицидов применяются препараты, разработанные на основе
бактерий, вирусов, грибов и даже простейших
Около 100 видов бактерий обладают инсектицидной актив­
ностью, в том числе P seu d o m o n a s, B a c illu s . M icro co ccu s,
Lactobacillus, Enterobacter, Erwinia , Serratia и др
Так, токсичны для саранчи и жуков Pscudomonas aeruginosa и
Ps. se p t tea у для бабочек - S erratia marc escens и E nterobacter
uerogenus, для шелкопряда Lactobacillus tp , для комаров Bacillus
sphericus н др.
Среди биоинсектииидов наиболее широко применяются
препараты разработанные на основе Bacillus thuringiensis. Впервые
этот микроор! ани «м был выделен в 1901 году в Японии из
тутового шелкопряда, а в 1938 году во Франции на его осмовс
был разработан первый биоинсектицид, токсичный и отношении
определённых насекомых вредителей Ьиоинсектицидиой
активностью обладают около 35 серо типов В thuringiensis. Что
B.lh. kurstaki (моль, бабочки, личинки гусениц), В th israelcnsis
(комары, мошки), В th.tenebrionis (колорадский жук, хлопковый
долгоносик) и др Токсины В thuringiensis белковой природы,
молекулярная масса 130-140 кДа, в микроорганизме находятся в
неактивной форме в форме протоксина. При поглощении микро­
организмов личинками насекомых в щелочной среде кишечника
(pH 7,5-8,0) и под действием пищеварительных протеиназ
превращается в токсин (мод масса 30-80 кДа), поражающий
мембраны эпителиальных клеток и гибель насекомых
Гены протоксина В thuringiensis локализованы в плазмиде,
длина нуклеотидной последовательности 71 т .н ., продуцируется
протоксин только в стадии споруляцни микрооганизма. Генно-
инженерные исследования позволили получить рекомбинантный
128 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

штамм В.thuringiensis путём модификации плазмид с целью


удаления генов низкоактивных эндотоксинов, переноса плазмид
для повышения токсичности и расширения спектра действия (на
большие группы насекомых).
Гены протоксина В .thuringiensis клонированы в микро­
организмы, обитающие на поверхности листьев, стеблей и корней
растений. К примеру, гены протоксина клонированы в
Ps.fluorescens, образующ ие колонии на корнях кукурузы;
клонированы в хромосомы растений.
Известно около 400 видов грибов, заражающих насекомых и
клещей. Metarhizium anisopliae - энтомопатогенный гриб,
проникает через эпикутикулу насекомого, гифы прорастают в тело
насекомого. П оражает клопов на пастбищах в сахарном
тростнике, жука-носорога - вредителя пальм.
Beauveria bassiana, продуцирует боверицин, токсичное
вещество для колорадского жука.
Verticilium lecanii эффективно поражает тлей и алейродид в
оранжереях.
Бакуловирусы (вирус ядерного полиэдроза и вирус гранулёза)
инфицируют насекомых в естественных условиях. Получен
рекомбинантный бакуловирус со встроенным геном токсина
скорпиона, поражающего нервную систему насекомых.
Разработан против саранчи протозойный биопрепарат Nosema
locustae.
Микроорганизмы способны препятствовать кристаллизации
льда
Некоторые эпифитные бактерии могут усиливать кристал­
лизацию льда на поверхности растений, способствовать их
замерзанию . Pseudomonas syringae, Ps.fluorescens, Erwinia
herbicola, Xanthomonas campestris патовар translucens синте­
зируют белки молекулярной массой 118 кДа, упорядоченно
связывающие воду с образованием льда уже при -2°С (в их отсут­
ствие этот процесс в растениях происходит при -6°С). Получены
рекомбинантные штаммы Ps.fluorescens , при их инокуляции
образование льда на поверхности растений замедляется, что
способствует сохранению плодов и ягод от замерзания. Ежегод­
ный убыток от их замерзания только в США достигает 1 млрд.
дол аров.
S. 7. Микраиргими /мы выщелачивают металлы п IX»

5.7. Бактерии выщелачивают металлы из руд


Термин «бактериальное выщелачивание» используется для
описания процесса paci ворения и жстракцни металлов из бедных
РУД- ____
Экстракция металлов из сульфидных минералов осу ществляется
за счет окисления в водной среде сульфидов до растворимых
сульфатов, переходящих в раствор, из которого эти металлы могут
быть легко извлечены.
Микрооргаии |мы играют важную роль в концентрировании и
распределении химических элемеи гов в литосфере
Железо и сера являют собой характерный пример химических
элементов, которые могут как окисляться, так и восстанавливаться
различными микрооргаии «мами. представляя собой важный
источник энергии для их роста.
В горных породах металлы находятся в виде сульфидных
минералов (сульфиды меди, цинка, железа, никеля, серебра и
другие).
П роцессы , когда бактерии непосредственно окисляю т
сульфиды металла в сульфаты (к примеру, сульфиты мели в
растворимые сульфаты) называют прямым выщелачиванием
Непрямое выщелачивание п о окисление сульфидов разных
металлов (Си, Zn, Ni и другие) в сульфаты опосредованно, с
участием сульфида железа Не' служит сильным окислителем, оно
химически реагирует с другими металлами в составе руды и
превращает их в растворимую окисленную форму в присутствии
раствора серной кислоты. При этом Fe3 переходит в Fe-', который
тиобациллм вновь микробиологическим путем окисляют в
сульфиды, процесс повторяется.
Активными окислителями восстановленных неорганических
соединений серы и железа в почве являются бактерии рола
Thiohacillm Thiohadllus впервые т t иг теш i из мереного ила в 1902 г.
Натансоном, в 1904 г. - М.Бейеринком.
Это неспорообразующие, грамотрииательные. мезофильные,
ацидофильные (pH 1,5-5,0) аэробы, облигатные хемолитотрофы,
то есть их рост и размножение осуществляются та счет энергии,
выделяющейся в процессе окисления неорганических соединений
серы, железа.
130 Глава S. Применение микроорганишов в биотехнологии

У тиобацилл существует природная устойчивость к повы­


шенным концентрациям металлов (Fe, Zn, Со, Си, Ni и другие).
Tiobacillus ferrooxidans получает энергию при окислении Fe(II),
растворимых и нерастворимых сульфидов, серы и растворимых
соединений серы.
Tiobacillus thiooxidans не способна окислять Fe (II) и
нерастворимые сульфиды, она окисляет элементарную серу и
растворимые соединения серы.
Кроме Tiobacillus активно окисляют соединения серы термо­
фильные, ацидофильные бактерии рода Sulfolobus, факультатив­
ные хем олитотроф ы ; соединения ж елеза - Leptospirillum,
мезофильные, ацидофильные, автотрофные вибрионы и другие
группы микроорганизмов.
В условиях природного выщелачивания в метаболической
систем е присутствую т, помимо активно вы щ елачиваю щ их
бактерий, много других симбионтов, то есть в процессе участвует
сообщество микроорганизмов.
Окислительные реакции, происходящие при бактерицидном
выщелачивании сульфидных минералов могут лучше всего быть
представлены при рассм отрении окисления пирита FeS, -
минерала сульфида железа. Пирит может считаться одним из
основных сульфидных минеральных субстратов для активно
выщелачивающих бактерий. Он содержит почти равные коли­
чества Fe2+ и S, которые являю тся основными источниками
энергии для таких бактерий. Пирит также самый распростра­
ненный из всех встречающихся в природе сульфидных минералов
и присутствует как сопутствующий минерал практически во всех
промышленных сульфидных рудных отложениях.
Th.ferrooxidans окисляют пирит (Fe S,) до сульфата и F e-\
который далее окисляется до Fe3'. Ионы Fe3’ химически окисляют
нерастворим ы е сульфиды м еталлов (C uS, ZnS и другие) с
образованием молекулярной серы и ионов двухвалентны х
металлов. Сера и Fe 2+ окисляются бактериями до сульфата и Fe'
соответственно.

(1) 4 FeS, +150, + 2Н ,0 » 2Fe(SQ4), + 2H ,S04


J .7 . Микрочр.-аииi/иы ыыщ1 иачининт, ш т лллш из f . J 131

(2) ZnS + Fe,(S04), ........ ■» ZaSQ4+2FcSO / + S


I ffц ф яд) Хлшшчя&шш M K M R M |4|нМфвИ

Это непрямое выщелачивание цинка, kin да в реакции ( 1) при


помощи Tiobacillus сульфид железа окисляется в сульфат; в
реакции (2) происходит химическое окисление сульфида цинка в
растворимый сульфат Hi последнего затем извлекается 7п
Таким образом, используя тиобациллы разработаны методы
бактериального выщелачивания цинка, урана, золота и других
редких металлов из бедных руд, переработка которых j идрометал-
лургическими методами гкономически не рациональна. Техно­
логия следующая: руду содержащую сульфиды металла орошают
подкисленной теплой водой, что способствует бактериальному
окислению сульфидов до H ,S 0 4 и Fe(HI) и сопровождается
снижением pH до 1,0-1,5 Кислота растворяет извлекаемый металл,
переводя его я двухвалентную форму, в сульфат
При и «влечении мели в ирои зводет вен ныл условиях исполь­
зуется кучное выщелачивание. Сульфидную руду дробят, делают
кучи на непроницаемых для растворов площадках Через кучи с
рудой пропускают воду, содержащую кисямй раствор Fe' и
воздух, который необходим для химического и биологического
окисления.
В результате окисления минералов тиобациплами образуется
раствор, содержащий CuS04, Н S 0 4, Fe,(S04), Далее и з раствора
извлекают медь
Роль бактерий в выщелачивании урана связана с образованием
F e ,(S 0 4), (I), под действием которого далее уранит (1 )0 ,>4
химически окисляется в растворимую форму :

UO,*4 Fe,(S04) , --------------- ►UO ,S 04 N 2FeS04

5.8. Очистка сточных вод активным илом


Биодеградация (биоразрушение) - это растепление загряз­
няющих органических соединений с помощью микроорганизмов.
Степень расщ епления органических соединений различна:
биотрансформация или незначительные изменения структуры
132 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

вещества; расщепление на простые одноуглеродные вещества;


минерализация или превращение до неорганичесих соединений
(Н20 , С 0 2, Hr NH3).
Применение активного ила для очистки коммунальных сточных
вод было разработано Ардерном и Локстом в 1914-1921 годы.
Коммунальные сточные воды содержат органические загряз­
нения (углеводы, белки, мочевина, ж ироподобны е вещ ества,
преимущественно детергенты из мыла и моющих средств), раз­
личны е неорган и чески е вещ ества, м икроорганизм ы (п с ев ­
домонады, бациллы, энтеробактерии и др.).
Для оценки степени загрязненности сточных вод определяются:
1. Биологическое потребление кислорода (БПК), показывающее
общее количество содержащихся в сточных водах органических
и неорганических загрязнений, окисляемых микроорганизмами;
2. Химическое потребление кислорода (ХПК), показывающее
количество кислорода, требуем ое для полного хим ического
окисления компонентов сточных вод до С 0 2.
Очистка сточных вод является комплексным многоэтапным
процессом:
* предварительная механическая очистка, процеживание через
решетки, осаждение крупных частиц, а также флотация жиров и
масел. В результате механической обработки из сточных вод
удаляется около 30% общей массы загрязнений;
* биологическая очистка, прежде всего расщепление органи­
ческих загрязнений аэробными и анаэробными микроорганизмами
активного ила;
* химическая очистка нацелена на удаление из сточных вод
фосфатов солями железа или алюминия (F eP 0 4, А1Р04). Часть
фосфатов накапливают аэробы (аценетобактерии и др.) в форме
внутриклеточны х полиф осф атов, вы полняю щ их функцию
запасания энергии, для образования АТР.
В целом, централизованные очистные сооружения (рис. 30)
включают технологии механической очистки (решетки, отстой­
ники), биологического окисления (активный ил), химического и
биологического удаления неорганических загрязнений (азот,
фосфор) и, наконец, обеззараживание очищенных вод (хлори­
рование, озонирование).
S.М. Очистьи ■точны* mud шяшшым илым 133

Рис. ЗВ. Установка для о чи сти с тчных вод. ■ «иторо# происходит рзчвитис
акдивжл о ила в ицчесгвс цен гралынм о, онол*м ичесжош и ж
Этан 1 - ш и н ш ч п 'п г ичи4.1 ка. »ran 2 ( w m a w w iM очистка,
т п я ) - химическая u h k iu

Основная задача биологической очистки заключается в уда­


лении органическою углерода, а последующем окисление аммиака
и удаление растворенного, связанного азота для нредотвращения
расхода кислорода в природной воде, принимающей сточные
воды. Аммиак, образующийся в процессе разложения оргаинческих
загрязнений, мочевины окисляется ло нигригов и нитратов
нитрифицирующими бактериями. Далее в анаэробных условиях
иигрвты восстанавливаются до азота и удаляются из сточных ьод.
Процесс биологической очистки включает д м стадии.
Взаимодействие отстоявшихся сточных вод с кислородом
по1 духа и микроорганизмами активного ила в а зротеике (от
нескольких часов ло I суток);
- Отделение очищенной, освет тенной сточной вош от частии
активного ила в неа зрнруемом отстойнике (от нескольких лней
до нескольких недель), уплотнение активного ила. Часть активного
ила постоянно возвращается m отстойника в атротенк для эффек­
тивною расщепления органических загрязнений в поступающей
сточной воле (рециклизация).
Активный ил означает
* Биомассу микроорганизмов (в основном бактерии, аэробы и
анаэробы), содержащие различные группы ферментов (протеазд,
липазы, амилазы, целлюлазы, пектиназы и другие), необходимые
для расщепления органических .загрязнений;
• Наличие большой поверхности иммобилизованных клеток
микроорганизмов, обладающих адсорбционной способностью,
134 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

• Стабильное образование флокул (взвешенных, легко осаж­


дающихся агрегатов бактерий), связанное с адгезивностью микро­
организмов.
Активный ил содержит 3 группы микроорганизмов:
• Углеродокисляющие флокулообразующие бактерии;
1 Углеродокисляющие нитчатые бактерии;
• Бактерии-нитрификаторы.
Флокулообразование необходимо не только для более эффек­
тивной деградации органических соединений, но и для образо­
вания стабильных флокул, которые способны быстро осаждаться
с образованием плотного ила в отстойнике.
Нитрификаторы ( Nitrosomonas и Nitrobacter) превращают
аммонийный азот в нитраты.
N H 3+ 0 , ----------------►N O , ; N 0 , + 0 2 ---------------- ► N 0 ,
Nitrosomonas Nitrobacer

Нитрификаторы особенно необходимы, если процесс нацелен


на очищение сточных вод от аммонийного азота.
Нитчатые бактерии ( Leucothrix, Thiothrix) образуют основу,
вокруг которой формируются флокулы. Но избыточное количество
этих микроорганизмов может вызвать ненужное пенообразование.
Микроорганизмы активного ила по пищевым потребностям
подразделяют (рис. 31):
• Гидролитические бактерии, обычно называемые ацидоген-
ными, так как они обеспечивают начальный гидролиз субстрата
до органических кислот и других малых молекул ( Zoogloea ,
Acetobacterium, Eubacterium, Clostridium. Bacteroides, Bifido­
bacterium, Peptococcus, Streptococcus) и др.
• Гетероацетогенные бактерии, которые продуцируют уксус­
ную кислоту и водород (Synthrobacter wolinii, Synthrophomonas
wolfii, потребляют жирные кислоты с образованием водорода);
• М етаногенные бактерии, образующие метан ( Methano -
bacterium, Methanospirillum, Methanococcus, Methanothrix,
хемолитотрофы, превращают уксусную кислоту, Н2 и С 0 2 в СН4;
70-75% метана образуется из уксусной кислоты):
С 0 2+4Н 20 __________ > СН4+ 2Н 20

СН ,соон ------------- ► сн4+со2


уксусная кислота метан
У в Очистка сточных eat) акиывнти илом

Субстраты, содержащие серу и а ют, могут вызывать рост еще


двух- групп бактерии - сул ьфа i ре д уциру щи х и денит рификаторов.
В ни ж них сл о ях а к т и в н о го ила дом и нирую т анаэробные
процессы (брожение, нитрат или сульфа тредукция); метаболиты
б р о ж ен и я , в о с с та н о в л е н н ы е со ед и н ен и я а зо т а и серы
диффундируют к поверхности ила, где используются аэробными
бактериями.

j Сложные органические соединения


4 гиЛр*1 ‘штиыс< кие бакт ерии
1
Я
Органические кислоты, другие малые милеьу.ш

....... ........... гетероацетогенные бактерии

| Одноуглеро<)ные соединения, ацетат. //„ СО,

^ «пммынмм* бшлшрм
1
.0
I
Рис. Л . Д м р и м ш органических ш р а н к н и * при ана *р<*6ном ори*снии

Таким обраюм, а активном иле есть aipei иронанные а составе


флокул микробные сообщества и свободные, а составе суспензии
бактериальны е клетки П оследн ие а к ти в н о п огл ощ аю тся
инфузориями, амебами, нематодами, коловратками, тем самым
способствуя ф локулированию и о саж д ен и ю , некоторому
очищению надосадочных сточных вод от микроор! анизмов.
В активном иле преобладают Zoogloea ramigera, Leucothrix.
Thiothrix, а также Nitn>hacter, Aeromanas, Pseudomonas. Nocardia,
Rhodococcus.
Кроме основной технологии очистки сточных вод (рис. 32,33)
применяю тся щ ебеночные биофильтры (предварительно
отстоявш иеся сточные аоды пропускают через дробленный
пористый камень или шлак, находящиеся а емкостях глубиной
1,5-2,5 м и диаметром 40-70 м. Обязательное условие - хорошее
дренирование для просачивания волы и воздуха. Очистка
136 Глава 5. Применение микроорганизмов в биотехнологии

Выход
жидкости

Поступление] Поступление
ж идкости 1 жидкости

Рис. 32. Современные типы реакторов для анаэробной очистки


сточных вод и активного ила.
A. Система анаэробной фильтрации. Биомасса прикрепляется к носителю, которой
либо фиксирован (фиксированный наполнитель), либо находится во взвешенном
состоянии в жидкой фазе (псевдоожиженный наполнитель).
Б. Реактор с псевдоожиженным нижним слоем, наполнителем и отводом для
рециклизации путем обработки кислых или иных токсичных отходов.
B. Анаэробный реактор с придонным слоем активного ила и восходящим потоком
жидкости. Просеиватели отстойника в верхней части служат для отделения газовых
пузырьков и хлопьев ила от очищенной жидкости (цит. по И. Ленгелер и др., 2005).

проводится однократно - сточные воды постепенно просачи­


ваются через биофильтр, поступают в отстойник и затем уда­
ляются.

удаление ила

Рис. 33, Схема биоочистки сточных вод.

На поверхности щебенки формируется биопленка из


микроорганизмов; иммобилизованные бактерии, грибы разлагают
органический субстрат, окисляют углеродные соединения. Ниж­
ний слой биопленки формируется из анаэробов, нитрификатаров.
Биопленка выедается простейшими, коловратками и нема­
тодами. Последние в свою очередь служат пищей личинкам
насекомых.
137

Г Л А В А 6. Бнгжкни»

Биотехнологическую п р о д у к ц и ю получают в брожении


Энергетический метаболизм и биосинтез протекают в клетке
одновременно, нередко с участием одних и тех же ферментов и
промежуточных метаболитов

Рм. М. Обобщающая схема важнейших брожений

Биосинтез нуклеиновых кислот, аминокислот, полисахаридов,


сложных липидов и) промежуточных продуктов, метаболитов
предшественников, происходит с использованием макроэрги-
ческих связей.
Энергетический метаболизм необходим клетке для получения
знергии и образования промежуточных продуктов, метаболитов*
предшественников, для осуществления биосинтеза.
Энергообразование осуществляется путем брожения,
аэробного и анаэробного дыхания
В процессе брожения имеет место неполное расщепление
органических соединений с высвобождением незначительного
количества энергии и накоплением богатых энергией конечных
138 Глава 6. Брожение

продуктов (спирт, органические кислоты), конечным акцептором


электронов являю тся органические соединения.
А эробное ды хание приводит к полном у расщ еплению орга­
нических соединений до углекислого газа и воды с выходом боль­
шого количества АТР, конечный акцептор электронов - кислород.
При анаэробном дыхании конечный акцептор электронов не
кислород, а неорганическое вещество, выход энергии немногим
меньше, чем при аэробном процессе.
В осн о ве эн ер го о б р азо ван и я леж ат проц ессы оки слен ия и
восстановления. Окисление - процесс отнятия 2 атомов водорода,
что р авн о си л ьн о удален ию 2 эл ектрон ов и 2 протонов - это
дегидрирование.
Восстановление - присоединение 2 атомов водорода (2 элек­
тронов и 2 протонов) - это гидрирование.
Переносчиком водорода являю тся 2 пирим идиновы х нукле­
отида (коферменты анаэробных дегидрогеназ) - никотинамида-
дениндинуклеотид (НАД) и НАД-фосфат (НАДФ).
Окислительно-восстановительный процесс, осуществляемый в
анаэробны х условиях и приводящ ий к об разован ию А ТР, где
д о н о р ам и и а к ц е п то р ам и в о д о р о д а я в л яю тся о р га н и ч е с к и е
соединения (чаще углеводы, но могут быть органические кислоты,
аминокислоты , пурины и пиримидины) называется брожением.
Субстратам и брожения чащ е всего служ ат гексозы и пентозы.
Кроме того, микроорганизмы способны сбраживать продукты их
расщ епления - органические кислоты, глицерол, цитрат, малат,
сукцинат, пируват, лактат, этанол и ацетат.
У бактерий расщ еплению гексоз и пентоз предш ествует их
фосфорилирование. Некоторые виды архей разлагают сахара без
их предварительн ого ф осф орилирования. И звестно несколько
типов брожения: сбраживаег микроорганизм глюкозу до спирта -
спиртовое брожение, расщепляет глюкозу до молочной кислоты -
м олочнокислое брож ение, заверш ается процесс образованием
п р о п и он о во й кислоты - п р о п и о н о в о к и сл о е б р о ж ен и е и т.д.
(рис. 35).
Процесс брожения схематично можно разделить на 2 стадии:
• Окисление глюкозы до пировиноградной кислоты;
• Восстановление пировиноградной кислоты до спирта, молоч­
ной кислоты и т.д.
199

М мммим среоя

Рмс. И . Схема и и р о б а м о метаболизма

Существует 4 пути превращения фосфоеахаров • пируват или


пирумт плюс ацетилфосфат с участием специфических ферментов
• Гликолитический путь, путь Эмбдена Мейергофа-Парнаса.
ключевой фермент фруктозобифосфатальдолаза
• Путь Энтнера-Дудорова, фермеит 2-дегилро-Здезокси-6-
фос фогл юкон атал ьдол аза
• Пентозофосфатный или ф о сф о -к то л ам ы й путь, фермеит
ксилулозо-5-фосфатфосфокеталаза
• Путь, обнаруженный у Bifidobacterium bifidum, ферменты
трансальдолаза и кеталаза.
Продуктом первых двух путей является пируват, в пентозо-
фосфатном пути помимо пирувата образуется ацетилфосфат.
В результате гликолиза образуется 2 молекулы АТР. брожение
по пути Энтнера-Дудорова - I молекула АТР и 2 молекулы НАДФ.
пентозофосфатный образуются пеитозы. необходимые для
синтеза нуклеиновы х кислот, обеспечивается образование
140 Глава 6. Брожение

большей части НАДФ (6 молекул), используемых микроорга­


низмами для биосинтетических реакций (для синтеза жирных
кислот, стероидов и др.).

6.1. Спиртовое брожение


Э танол в п рои звод ствен н ы х м асш табах используется в
химической, фармацевтической и пищевой промыш ленности,
важен как энергетический ресурс в качестве биотоплива.
В пищ евой отрасли сп иртовое брож ение леж ит в основе
виноделия, пивоварения, производстве этанола, хлебопечения.
В технологии спиртового брожения использую тся чистые
культуры дрож ж ей Saccharomyces cerevisiae, Sacch.vini,
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoides; бактерии Zymomonas
mobilis, а также Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora и др.
Различают Saccharomyces cerevisiae, расы низового и верхового
брожения. К расам низового брожения относится большинство
винны х и пивных дрож ж ей, к расам верхового брож ения -
спиртового, хлебного и некоторые пивные. Н изовые дрожжи
активны при 6-10°С, верховые адаптированы к 14-25°С. Дрожжи
лучше развиваются в кислой среде (pH 4-6) и сохраняют актив­
ность в 10-15% растворе спирта. Верховые дрожжи в процессе
брожения вызывают обильное пенообразование, выделение СО,,
сама дрожжевая масса подымается на поверхность бродящей
жидкости. Брожение с участием низовых дрожжей происходит
спокойно, масса дрожжевых клеток остается на дне емкости.
Zimomonas spp. - грам п олож ительн ы е палочки, такж е
устойчивы к концентрации этанола, температурный режим 35-
37°С , впервы е вы делены из алкогольного напитка пульки,
изготовленного из сока агавы, они также обнаружены в пальмовом
вине, соке сахарного тростника. Они быстрее дрожжей превра­
щают глюкозу в этанол, имеют небольшую биомассу, в процессе
брожения образуется немного уксусной и молочной кислоты.
Нашли применение дрожжи Kluyveromvces flagilis, сбражи­
вающие лактозу при получении спирта из молочной сыворотки.
Известны три пути превращения глюкозы в этанол:
А - кетокластический (молочнокислые бактерии),
В - фосфорокластический (кл остри дни, сарцины),
С —декарбоксикластический (дрожжи) (рис. 36).
I J . Слиртошм брожение 141

2 \4 & Г
СО,

HiM iy w w !■ /
I h 4ВГИ

тщеты i f J-A

*4#

i-C M

Г** * * * * **
V4H «
V 4»f

fc: 4Ш

40
In M #

Y4JW

JM4P

<ы - Л
p mmm

F
П*,
a>

« Н к Ы ^—

A.... - J
^
ещяттФшш
L—*41
\4 #

t %4MT

%4®

N * %4I

Гшс. Ж . П ути i ^ i i f — ни r * w n • n e w *
142 Глава 6. Брожение

Спиртовое брожение, вызываемое дрожжами протекает по


пути Эмбдена - Мейергофа -Парнаса:

Пируваткарбоксилаза
а) СН3СОСООН -------------- _ СН СОн + С 0 2;

Алкогольдегидрогеназа
б) СН3СОН + 2Н+ + 2е 1 .............. СН3СН2ОН

При этом пируват не превращается в ацетил СоА, как при


аэробном дыхании, а декарбоксилируется пируватдекарбок-
силазой (ключевой фермент) до ацетальдегида. Ацетальдегид
восстанавливается до этанола алкогольдегидрогеназой.
Zimomonas mobilis сбраживает глюкозу до этанола по пути
Энтнера-Дудорова
Еще в 1892 году братья Бухнер обнаружили, что экстракт
мацерированных дрожжей обладает способностью сбраживать
глюкозу до этанола, т.е. было показано, что образование этанола
может происходить и без участия микробной клетки.
Стадии производства спирта:
1. Обработка, предварительная подготовка сырья (субстрата)
к ферментации. Наращивание чистой культуры производствен­
ного штамма дрожжей (бактерий);
2. Ферментация сырья в биореакторе;
3. Дистилляция этанола.
1. Основными источниками углеводов для дрожжей являются
гексозы, крахмал, инулин; источники азота - соли аммония,
мочевина, аминокислоты, небольшие пептиды реже нитраты и
нитриты.
Сырье, используемое в процессе ферментации может быть трех
типов:
- сахаросодержащее, которое можно непосредственно сбражи­
вать (отходы сахарного и крахмалопаточного производства -
меласса, сок сахарного тростника и свеклы);
- крахмалистое, требующее предварительной обработки;
подвергающееся кислотному или ферментативному гидролизу
(ячменное, пшеничное сусло, кукурузный сироп, рис, рожь, овес).
6.1. ( nupmitrю н бро.т щ и M l

Поскольку дрожжи нс продуцируют м и л а ш , для ферментативного


гидролиза используются бактериальные и мицелиальные аминаш ;
- отходы бум аж но-картонного производства, картофельная
мезга, злаковая солома, початки кукурузы. Сырьё подвергается
к и сл о тн о м у или щ елочн ом у i идролизу с последую щ ей
ферментативной обработкой целлюлазами и ами.та ими Aspergillus
niger, Trichoderma reesi и др
2. Периодическая ферментация в течение 48-72 часов В про­
цессе ф ерментации вначале создаю т аэробные условия, чт обы
накопить биомассу дрожжей, после чего а «рацию прекращают
При доступе кислорода воздуха дрожжи начинают окислять
углеводы, то есть от брожения переходят к процессу аэробного
дыхания В а пробных условиях из пировиноградной кислоты через
ацетил СоА. цикл три карболовых кислот идет полное окисление
субстрата до СО, и И .О, что шергети чески выт и .т о для дрожжей,
они лучш е растут, больш е накапливается биом ассы , а цикле
гри карб он овы х ки сло т о б р азу ется б ольш е м етаб о л и то в
необходимых для клеточного синтеза.
При переводе в анаэробные условия выход этанола возрастает
в 3-4 раза, так как отпадает конкуренция между дыхательной цепью
и субстратным фосфор» тированном за свободную АТР, на гликоли-
тический путь идет большой отток энергии и субстрата.
По окончании процесса брожения этиловый спирт накапли­
вается в количестве 14-16%, что подавляет дальнейшее размно­
жение дрожжей
3. Дистилляция отделение летучих компонентов от жидкости
и твердых частиц, кон центрирование тганола в дистилляте до 30-
96% по весу и ректификация.
Поскольку этанол имеет более низкую температуру кипения,
чем вод а, в парах ко н ц ен тр ац и я этан о л а вы ш е, чем воды.
Например, если в водном растворе содержится 10% тганола, то в
парах его концентрация составляет 50% по весу, т е дистиллят
сильно обогащен этанолом. М аксимальная дистилляция дости­
гается при температуре 78.2'ХГ и равна 96% по весу, нс выше
О статок воды у д ал яется, сухие дрож ж и в последую щ ем
используются как кормовая добавка, а углекислый газ сжижается.
144 Глава 6. Брожение

превращ ается в жидкую углекислоту, необходимую для газиро­


вания воды , п и ва, б езал к о го л ьн ы х нап и тко в, при сварочн ы х
работах против окисления сварочны х ш вов, в литейном произ­
водстве. Сухой лед из сжиженного СО , — хладоагент в пищевой
промыш ленности, медицине, маш иностроении, энергетике.
И так, брож ение - это неполное расщ епление органических
вещ еств ф ерм ен там и м и кр о о р ган и зм о в. К лю чевой угл евод -
глюкоза превращается в этанол и углекислый газ:
С6Н 120 6 >2СН 3СН,ОН + 2СО , (формула Гей-Люссака).
В зависимости от субстрата, условий ферментации продуктами
метаболизма могут быть и иные соединения. Так, если спиртовое
брожение происходит в щ елочной среде, то одним из основных
продуктов может быть глицериа
2 СО
.Н 1.,0.
2 о + Н I,0 г СН,СООН
3 + СН,СН,ОН
j 2. + 2СН,ОНСНОНСН,ОН
1 I
глюкоза укс. кислота спирт глицерин
Н аряду с глицери ном из пировиноградной кислоты м огут
о б р а зо в ы в а т ь с я и д р у ги е в то р и ч н ы е п р о д у кты сп и р то в о го
б р о ж е н и я : у ксу сн ая, м о л о ч н ая , я н т а р н а я , п р о п и о н о в ая ,
муравьиная кислоты, ацетон, альдегид, сложные эфиры.
Т акж е м огут образовы ваться побочны е вещ ества - изоами-
ловы й сп и р т (си ву ш н ы е м асл а), ам и л о вы й , и зоб ути л овы й и
бутиловый спирты. Высшие спирты синтезируются путем дезами­
н ирования ам инокислот в кетоки слоты , которы е д екарбокси-
лирую тся в альдегиды . С ивуш ны е масла и эф иро-альдегидная
фракция относятся к техническому продукту.
Б и о этан о л
Биоэтанол или бензоспирт используется как горючее топливо
для автомобилей. Для его производства использую тся богатые
углеводам и культурны е растения. И спользование крахм ал о- и
с а х а р о с о д е р ж а щ е го сы рья я вл яется одной из сам ы х ранних
технологий в производстве спирта (рис. 37).
К п р и м ер у , за в о д у п р о и зв о д и те л ь н о с т ь ю 1 млн л и тр о в
биоэтанола в сутки для его 200 рабочих дней необходим урожай
сахарного тростника с площ ади в 40 тыс га. В СШ А ежегодно
t .l . Старше*** брожение 145

М озотое и р и

Пар

Ж елм роваины й продукт

F:
■О и м м м и
■а-Аммн

ый «р«

Г чкчагкяпмк-рв«а-
P « v / V
Чу
Г
О схарснный нр«дук1
^ - Дрож
'< Р ‘ *«

А \
*
Ф р угго »а Ф)г р м « т м м
Ф

Эгаам
Ряс. 37. Примышленное црм им глю w—в— п крахмала

перерабатывается около 100 млн тонн бумажных отходов и если


бы их использовать на получение м оторного спирта, то
потребность бенгина в стране снизилась бы на 15%.
Производство биоэтанола а мире с 2000 по 2005 ходы возросло
на 40-45% и составило более 50 млрд литров.
Ф ерментационны й процесс соверш енствуется по линии
инженерных технологий, улучшаются свойства производственных
штаммов. Это использование молекулярных с«т для дегидратации
зтаиола, применение систем распределительного управления для
автоматизации технологических процессов, совмещение ряда
технологических операций, использование дрожжей и фермент­
ных препаратов с улучшенными характеристиками.
Совмещение процессов брожения и дистилляции под вакуумом
позволяет исклю чить из технологической схемы бражную
колонку, исключить декантирование и выпаривание послеспир-
товой барды. Осахаренное сусло с содержанием сухих вешеств
146 Глава 6. Брожение

50% подается на брожение. В ферментерах происходит непре­


рывный процесс брожения с одновременной дистилляцией под
вакуумом. Наряду с удалением спирта и С 0 2 под вакуумом
одновременно идет испарение влаги, поэтому послеспиртовая
барда, благодаря высокой концентрации сухого вещества, сразу
направляется на сушку.
Технология спиртового брожения в условиях вакуума с одно­
временной отгонкой выделяющегося во время брожения спир­
товых паров позволяет ускорить сбраживание сусла. Благодаря
удалению спирта вакуум ом , концентрация последнего в
ф ерментационной среде составляет не более 2,5-3,5% , что
позволяет «свободно работать» дрожжам ( Saccharomyces
cerevisiae) или бактериям (Zimomonas mobilis). Ферментационный
процесс усиливается дополнительным применением гидролити­
ческих ферментов (глюкоамилаза - Aspergillus niger, Rhizopus
oryzae; а-амилаза - Aspergillus kawachi, Rhizopus niveus. Bacillus
polymyxa).
Технология производства вина
Белый или красный виноград, в соке которого содержится 15-
25% сахара, вносится культура Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoides, Sacch.vini , брож ение 3-5 дней при 20-24°С. Об
окончании брожения судят по остаточному сахару, количеству
этилового спирта (10-14%), глицерина, летучих жирных кислот.
Главное преимущество чистых культур дрожжей заключается в
том, что брожение виноградного сока протекает и заканчивается
бы стро, а отсутствие посторонней микрофлоры позволяет
получать вина хорошего вкуса и аромата (с хорошим букетом).
По окончании брожения молодое вино стабилизируют и дают ему
созреть. Эти процессы занимаю т несколько месяцев, а при
изготовлении высококачественных красных вин - даже несколько
лет. В течение первого года во многих красных винах происходит
второе, спонтанное брожение - яблочно-молочнокислое, которое
вызывают молочнокислые бактерии ( Pediococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus). В результате этого яблочная кислота винограда
превращ ается в молочную кислоту и СО,, т.е. дикарбоновая
кислота превращается в монокарбоновую, и кислотность вина
6 1 СnupnioHtjti 6fni **мт/ 147

уменьш аемся, они стан овится вы сококачесг венным. И гристое


вино тина ш ам п а н с к о го и о д в ер таю т втором у сп и р то во м у
брожению под давлением, добавляя в вино сахар. Образуишийся
углекислы й ш газирует вино Второе брож ение в ы ш в ае т с я
р азл и ч н ы м и ви н н ы м и д р о ж ж а м и , которы е после б рож ен и я
образуют комки и лег ко удаляю тся. Вино тина «Херес» крепят
добавлением спирта до 15% и выдерживают на воздухе; на его
п о верхн ости ин тен си вн о разм н о ж аю тся о п р ед ел ен н ы е виды
дрожжей, что придает вину специфический вкус
В ино, о со б ен н о красное содерж ит м етаб олиты , имею щ ие
разную химическую природу (антиоксиданты, пептиды, органи­
ческие ки слоты , алкалоиды , стероидны е i орм оны , углеводы ,
фенольные соединения и др.).
Технология по.имения пива
Ячмень осолаж иваю т, т.е. проращивают короткое время для
образования в зернах ферментов, катализирующих расщепление
крахмала. Осоложенный ячмень дробят и смешивают с водой при
65-67°C. В течение нескольких часов крахмал гидролизуется до
ОЛИго* и моносахаров. Полученный водный экстракт солодовое
сусло отделяю т от остатков зериа и варят, добавляя хмель для
придания пиву его вкуса и запаха, аромата. При варке сусла из
х м еля зкетрат ирую тся р а зл и ч н ы е а с ш е с т а а , пр ек ращ ается
действие ферментов, белок выпадает в осадок
Т еп ер ь сусло засеваю т чистой кул ьту р о й Sacс haromy ces
cerevisiae var. earlshergensis, так называемые низовые дрожжи;
брож ение идет при температуре 10-12 С в течение 7-10 дней.
Процесс брожения идет без обильного ценообразования, в конце
ферментации биомасса дрожжей удаляется и пиво оставляется
для созревания, на дображивая ис при 4 С в течение 7-30 дней с
последующей фильтрацией и пастеризацией.
При длительном хранении пива под воздействием тепла и света
возможно образование незначительной мутности, что снижает
товарную ценность пива. Поэтому в некоторых технологиях при­
меняется ограниченный гидролиз белков пива протеолитическими
ф ер м ен там и (папами, пеп си н, б ак т ер и а л ь н ы е п р о теи н азы ).
Необходимы протест ити чес кие ферменты -работающие* при pH
Глава 6. Брожение

4-5. Однако при полном гидролизе будет потеря пенообразования


и нежелательные изменения вкуса пива.

6.2. Молочнокислое брожение

В основе получения из м олока различны х кислом олочны х


продуктов (кефир, айран, кумыс, сметана, творог, сыры и др.),
при кваш ен и и о во щ ей и ф р у к то в , и зго т о в л ен и и сухи х и
сырокопченых колбас лежат процессы брожения.
При сбраж и вани и м олока в качестве основны х продуктов
образуются молочная, пропионовая, лимонная, уксусная и масля­
ная кислоты. Присутствующая в молоке лактоза гидролизуется
микроорганизмами с образованием глюкозы и галактозы, которые
затем превращ аю тся в L-, D-, или LD-молочную кислоту. При
повышении концентрации молочной кислоты и снижении pH до
4-5 образуется творожистая масса, отделяется сыворотка. С вер­
ты ван и е м олока п ро и сх о д и т всл ед стви е того, что м олочная
кислота отщепляет ионы кальция от казеина, белок превращается
в параказеин и выпадает в осадок.
Молочнокислое брожение в основном вызывают 4 рода гом о-
и гетероферментативных бактерий: Lactobacillus, Streptococcus,
Pediococcus, Leuconostoc, а также дрожжи рода Torulopsis (кефир,
кумыс). К гомоферментативны м относятся Streptococcus lactis,
Srteptoccus crem oris, P ediococcus a cidola ctici, Pediococcus
dextranicum , P ediococcus cerevisia e , Lactobacillus casei,
Lactobacillus xylosus, Lactobacillus plantarum. К гетерофермента-
ти вн ы м - Leuconostoc m esenteroides, Leuconostoc crem oris,
L a cto b acillus ferm en tu m , L actobacillus brevis, Streptococcus
diacetilactis.
При гомоферментативном сбраживании глюкоза расщепляется
до м олочн ой ки слоты (1 ), при гетер о ф ер м ен тати в н о м - до
молочной кислоты, этанола или ацетата, углекислого газа (2).

1. С6Н 120 6_ ► 2СН, - СО - СООН _ ► 2СН, - СНОН - СООН


глюкоза пируват лактат

2. СбН 120 6— к СН, - СНОН - СООН + СН, - СН,ОН + СО:


глюкоза лактат этанол
Л 2 Ми$втш-kui ше брожение Mf

Гомоферменгатинное брожение протекает по гликолиi ичес-


кому пути, со сбраживанием глюкозы по фр\ ктозоб «фосфатному
пути до пиру вага с последующим образованием молочной кислоты
под действием фермента лакт « 1 дегидрогеназы Пиру ваг ие
декарбоксилируется до ацетальдегида, как при спиртовом
брожении, а иеполы уегса непосредственио как акцептор
электронов.
Гегероферментат ивное брожение протекает по пентозо-
фосфатиому пути до обра ювания рибулозо-5-ф1 к;фатa Hotлсдиии
расщепляется фосфоветалазой на ацетилфосфат и 3-фосфо-
тлицериновый альдегид, дающие в итоге молочную и уксусную
кислоты.
Молочнокислые микрооргани шы характеризуются спирто-
устойчивостью (15-18"и), сохраняю! *инеспособность при
низких значениях pH (5,0-6,0) Кроме того некоторые виды
продуцируют антибиотические вещества: Sir locus ни чин, Sir.
crem oris диплококцин, Lh.plantarum лак голин. Pediococcus
acidoluctu i педиоиин и др.
Пищевая и биологическая ценность молочhi*-кислых продук­
тов улучшается благодаря обогащению их органическими
кислотами, витаминами, аминокислотами, ароматическими
соединениями (ацетон, диаиетальдегид) и другими полезными
веществами микробного метаболизма
6.2.1. Молочная кислота
В 1847 году С. Клондо в результате биохимических анализов
показал, что молочная кислота получается в результате реакции
брожения, а позже Л. Пастер доказал, что брожение не химический
процесс, а его вызывают определенные группы микроорганизмов.
Молочная кислота синтезируется химическим и микробио­
логическим способами.
Для промышленного получения лактата микробиологическим
синтезом используют гомофермснтативиыс молочнокислые
бактерии (Streptococuss spp.. Lactobacilus spp ) одного вида или
их сочетание. Микроорганизмы характеризуются способностью
расщеплять глюкозу по гликолитическому пути с образованием
монопродукта-лактата, устойчивы к низким значениям pH и
150 Глава 6. Брожение

концентрации спирта, но достаточно требовательны к составу


питательных сред.
пируваткиназа лактатдегидрогеназа
CH..CL--------►
О IZ О
СН3-СО-СООН------- ► 2СН3- снон-соон
глюкоза пируват лактат

В промышленной технологии производства молочной кислоты


в качестве субстрата используются сложные углеводсодержащие
соединения (крахмал, кукурузный экстракт, сыворотка молока,
меласса), содержащие необходимые аминокислоты (аргинин,
цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан,
тирозин, валин) и витамины (рибофлавин, тиамин, никотиновая
кислота, фолиевая кислота), источники азота и фосфора.
Применяется глубинная периодическая ферментация в течение
6-7 суток. По окончании процесса бактериальная масса отделяется,
из культуральной жидкости осаждается и очищается лактат.
Молочная кислота применяется в пищевой промышленности
при изготовлении мармелада, лимонадов, сиропов и др. напитков,
для консервирования рыбной продукции, маслин и др.
Молочнокислые микроорганизмы сквашивают овощи и фрукты,
происходит накопление молочной, уксусной кислот, этанола,
ингибирующие размножение гнилостных и маслянокислых
бактерий, образуются ароматические соединения, улучшающие
вкусовые качества продукта.
6.2.2. Квашение капусты
Капуста измельчается, добавляется 1,5-2,5% поваренной соли,
плотно уминается для обеспечения анаэробных условий.
В присутствии соли усиливается гидратация, соковыделение из
растительной ткани.
В этой среде вначале происходит самопроизвольное брожение
энтеробактерий и других микроорганизмов, повышается
содержание муравьиной и уксусной кислот, немного молочной,
янтарной кислот, этанола, газообразных соединений, придающие
специфический запах.
На 2-3 сутки начинают преобладать гетеротрофные бактерии
рода Leuconostoc с накоплением молочной и уксусной кислот.
6.2. М олично-кислое д р о м х ч и с 151

этан о л а, Д -м ан н и та (придаст горькова !ыи в к у с), д екстр ан а,


эфиров, диоксида углерода и др h n метаболиты симулируют
рост гомофермента!ивиых бакiерий рода Lactobacillus plantarum,
повыш ающ их содержание молочной кислоты в капусте до 1,5*
2%, они расщ епляю т маинит (тем самым устраняют горький
привкус. В конце брожения в продукте преобладают Lb.plantarum
И спольtoeanue брожении в технологии приготовления сухих
и сы рокопчены х колбас. В мясное изделие вносится культура
молочнокислых бактерий (Stг. lactis . Lh plantarum и др.). В про­
цессе брожения снижается pH среды, появляется специфический
вкус, у в ел и ч и в ается со ч н о сть п р о д у кта, кислы е протеазы
расщепляют белки до оли! опеш идов и аминокислот. Кроме того
в кислой среде не размнож аю тся патогенные микроорганизмы
(золотистый стафилококк, сальмонеллы).
Нередко при обработке сухих колбасных изделий используют
культуры Pediococcus (продукция молочной кислоты). Micrococcus
(восстановление нитратов до нитритов)
6.2.3. Кумыс
Кумыс приготовляется из свежего, кобыльего молока Пред­
варительная пастеризация и кипячение не используются. так как
вы зы ваю т появление неприятного вкуса Брожение вызывают
микроорганизмы родов Streptococcus, Lactohacilluss. Torulopsis
О бязательный компонент постоянное взбалтывание молока в
деревянных кадках или бурдюках в течение 15-20 минут через
каждые 2-3 часа с постоянным добавлением новой порции свежего
молока.
В процессе брожения накапливается молочная кислота. pH
снижается и начинается вторая ф в з а ~ спиртовое брожение. От
п р ав и л ь н о го соотн о ш ен и я м о л о ч н о ки сл о го и сп и р то в о го
брожения зависит качество кумыса.
Кроме молочной кислоты, спиртов, диоксида углерода. 40-50° о
б ел ков в м олоке превращ ается в пептиды и ам ин окислоты ;
образую тся уксусная и пропионовая кислоты, эфироподобные
вещества придают аромат и вкус.
К ислотность вы держ анного кумыса 80-100°Т, содерж ание
спирта 1,75-2,5%.
152 Глаша 6. Брожение

6.2.4. Сыроделие
Для производства сыров используют пастеризованное или
сырое коровье, овечье и козье молоко.
Процесс сыроделия состоит из следующих этапов: образование
казеинового сгустка и его обработка, прессование и придание
сырой массе определенной формы, посолку и созревание про­
дукта.
Технология изготовления сыра начинается со свертывания
молока, осуществляемого с помощью внесения заквасок и
сычужного фермента. Если молоко не свертывается или медленно
свертывается - оно не пригодно для получения из нее сыра.
При выработке твердых сычужных сыров закваску вносят в
количестве 0,2-0,5%, при изготовлении мягких сыров - 3-5%. В
их составе S tr.la ctis, Str.crem oris, S tr.d ia cetila ctis, L eu co n o to c
c itr o v o ru s , вызывающие процессы брожения, расщепление
лактозы, накопление молочной кислоты, ароматических веществ.
Последующая инкубация при определенной температуре приводит
к скисанию молока, начинается гидролиз молока.
Для усиления гидролиза белков вносится сычужный фермент -
реннин (из 4 отдела желудка 2-3 недельных ягнят и телят,
вскормленных молоком (рис. 38). Реннин разлагает белки молока
до пептонов, а ферменты микроорганизмов до аминокислот и
аммиака. Коагулированный казеин молока соединяется с жиром,

Рис. 38. Пищеварительная система жвачных животных


I. J О рганически е « ш :шты

о б разуется тво р о ж и стая м асса. Более глубокий распад белков


наблю дается в твердых сырах
Т в о р о ж и с та я м асса о тд ел я ется от сы в о р о тк и , отж и м аю тся
остатки влаги, подсу ш икаете а и оставляется на созревание. В
процессе созревания происходит дальнейш ий гидролиз белков и
жиров, расщ епление их до аминокис тот и жирных кислот. Процесс
созревания твердых сыров идет из глубины к поверхности, мягких
наоборот. М олочны й сахар при созревании сыров сбраж ивается
полностью.
В зависимости от сорта сыра в созреваю щ ий продукт допол­
н и т е л ь н о в н о с я т с я к у л ь т у р ы Р го р ю ш bacterium sherm anii.
Penicillium roqueforti и др.
С т е п е н ь с о зр е в а н и я сы ра, его вкус и ар о м а т, со д ер ж а н и е
свободны х ам инокислот тависят от ф ерментативной активности
микроорганизмов. К примеру, острый привкус сыра Рокфор выз­
ван кап риловой, капринокой и другим и кислотам и, об разовав­
шимися под действием липаз микрооргаии шон I азообразование
вызывает появление пустот в массе сыра, придает определенный
рисунок поверхноет и продукта.
П р е с с о в а н и е , у п л о т н е н и е п р о в о д и тс я при 18-20 градусах
Ц е л ь си я , у д ал я ю тс я о с т ат к и с ы в о р о т к и , к о л и ч е с т в о м и к р о ­
организмов 10“ КОЕ/г сыра.
С о зр е в а н и е сы ров дли тся от 10 дней ( закусочны й сы р) до
8 месяцев (ш вейцарские сыры, сыр Чеддер) в подвальных, теплых
помещ ениях.
П о со л к а п р и д а е т о п р е д е л ен н ы й вкус и а р о м а т, ч асти ч н о
консистенцию сыра; вносится 22-24°о поваренной соли. 8 -1 0 'С ,
6-8 суток.

6.3. Органические кислоты


О рган и ч ески е кислоты прим еняю тся в пищ евой, ф арм ац ев­
ти ч еской , хи м и ческо й , текстильной, кож евенной , м еталлурги-
ч ее кой и других отраслях промы ш ленности
С и н т е зи р у ю т с я о н и химическим и м и к р о б и о л о г и ч е с к и м
способами. Химическим путём органические кислоты в основном
производятся для технических целей из нефтехимического сырья,
п ро д у кто в сухой п ерегонки др евеси н ы . М икр о би ол оги чески м
п у тё м с и н т е з и р у е т с я б о л е е 50 о р г а н и ч е с к и х к и с л о т Т ак.
154 Глава 6, Брожение

лимонная, глюконовая, кетоглюконовая и итаконовая кислоты


получают микробиологическим способом, молочную, салициловую
и уксусную — химическим и микробиологическим, яблочную -
химическим и т.д.
М икробиологические процессы получения органических
кислот можно разделить на 2 группы: анаэробные (молочная,
пропионовая) и аэробны е (уксусная, лимонная, итаконовая,
глюконовая).
Для анаэробны х микроорганизмов молочная, масляная и
пропионовая кислоты являются конечными продуктами метабо­
лизма углеводов. Кислоты, образуемые аэробными микроорга-
Инизмами являются интермедиатами катаболизма источника
углерода, субстрата. Так, глюконовая, винная кислоты - это
промежуточные продукты прямого окисления глюкозы; лимонная,
янтарная, фумаровая, яблочная - интермедиаты цикла трикар-
боновых кислот и др.
При обычном выращивании микроорганизмов на питательных
средах накопления органических кислот не происходит; сверх­
синтез достигается блокированием метаболических путей их
использования в клетке и другими методами мутагенеза и
селекции.
В качестве субстрата, источника углерода используются
глюкоза, сахароза, меласса, гидролизный крахмал, н-парафины.
При лимитировании источника азота, увеличении углеводов и
энергии повышается синтез глюконовой кислоты из глюкозы;
синтез лимонной кислоты повышается, когда в среде лимитируется
содержание железа или фосфора и т. д.
Основными продуцентами являются: молочной - Lactobacillus
spp., масляной - C lostridium butyricum , пропионовой -
Propionibacterium shermanii, лимонной и глюконовой - Aspergillus
niger , винной - Gluconobacter suboxydans, пировиноградной
P seudom onas a eru g in o sa , янтарной - B acterium succinicum ,
яблочной и фумаровой - Rhizopus nigricans и т. д.
Уксусная кислота
Аэробное окисление, когда субстрат расщепляется не пол­
ностью и конечный продукт не углекислый газ, а органическое
соединение называется неполным окислением.
♦.J. и ^ м н м п м 'ш кнс.т яы 155

В основе производства уксусной кислоты к а ш неполное


окисмм ис этанола:
алкогольдсгидро!t a i n И.О м м ш м п ш 'М Р * г а а и *
СН,СН,ОН ..- ■. СНОСНО СНСН(СНК-------. с н р о о н
тгаиол вщ лити ацетальдсг и .и m pai уксусная и к м п

Окислительная ферментация разведенного раствора этанола


осуществляется уксуснокислыми бактериями Acetohtuter леей,
A. xylinum. A. peroxydans; Gluconobtuter oxxdans
Aceiohacter и Gluconobacter - n o c ipoi ие аэробы, ацидото-
лераитны (pll 3,0-5,0), устойчивы к 9-10% расi вору намола
Бактериям присуща способность к образованию органических
кислот путём неполного окисления сах ар о в и спиртов. При
высокой концентрации этанола и образующейся из него уксусной
кислоты другие микроортани 1мы могут лишь сохранять
жизнеспособность (если они кислотно- и спиртоустойчивые), но
не расти, т. с. создаются злективные условия .тля уксусно- кислых
бактерий.
У Acetobaiter высокая акзивиость алкогольде! идрогена зы
сочетается с низкой активностью ферментов цикла три кар­
боновых кислот, а у Gluconobacter вообще отсутствует ключевой
фермент ЦТК L-кетог л ютарат де! идрог ен аза
При уменьшении концентрации этанола 4cetobacter свособп
переключиться на потребление ацетата и медленно расти,
осуществляется его окисление до СО,, благодаря ЦТК Необ­
ходимый для этого фермеит ЦТК суцкинат aei идрог еназа,
отсутствует при росте с использованием этанола, появляется в
результате индукции при переходе на использование ацетата
Gluconobacter способна окислять глюкозу но пентозофос-
фатному пути до глицеральдегид 3 фосфата, далее окисляе-
мого до ацетата с образованием в качестве промежуточных
продуктов пирувата и ацетил СоА
В биотехнологии уксусно-кислые бактерии также используются
для трансформации сорбита в сорбозу при получении витамина
С, в синтезе глюконата и ацетона.
В результате неполного окисления этанола до уксусной
кислоты образуются побочные продукты - сложные эфиры.
156 Глава 6. Брожение

вы сш и е сп и р ты , д р у ги е о р ган и ч еск и е ки сл о ты , при д аю щ и е


определённый аромат и вкус. В спиртовом уксусе также выявлены
8 аминокислот, витамины группы В.
Уксусную кислоту получают из разведённого спирта (12% ),
также из сброженного яблочного сока (сидра), сусловый уксус из
ячменного сусла, сывороточный уксус из молочной сыворотки.
Существуют три способа изготовления уксусной кислоты:
- медленный (орлеанский или французский). Технологический
процесс ведётся в плоских чанах, наполненных на 2/5 подогретым
уксусом и 3/5 вином . У ксусная кислота п он иж ает pH среды ,
создавая элективные условия для размнож ения уксусно-кислых
бактерий. По окончании ферментации из чана выпускается 10%
сб р о ж ен н о й ж и д к о с ти , а вм есто неё д о б ав л я е тс я так о е же
количество вина и т. д.
- быстрый (проточный или немецкий), когда осуществляется
к о н так т м еж д у б ак т ер и я м и , во зд у х о м и этан о л о м путём
пропускания через д р евесн ы е струж ки и абсорб и рован н ы м и
(и м м о б и л и зо в ан н ы м и ) на них у ксусн о-кислы м и б актер и ям и
раствора этанола; стерильны й воздух или кислород подаётся
противотоком . Для питания бактерий такж е вносятся сусло и
м инеральны е соли. В течение трёх суток почти 80% этанола
окисляется в 12% уксусную кислоту (рис. 39).

Рис. 39. Схема биоректора для производства уксуса.


Л J Органичс< кие кислоты 157

- глубинная ферментация с перемешиванием и аэрацией в


биореакторах, процесс полу непрерывный при 27-324'.
Уксусная кислота применяется в пищевой промышленности для
растворения органических красителей, ирн получении пластмасс,
синтетических волокон, каучука. Технический уксус получают
хим ическим путём для последую щ его применения его в
производстве ацетона, auei илена, синтетических красителей.
Пищевой или столовый уксус п о 5-9% рас?пор уксусной
кислоты, очищ енный беитонитом (связывает уксусно-кислые
бактерии), пастеризованный. Уксус vto пищевая добавка, а также
консерван 1 для сохранения мясных и овощных продуктов В год
производится 1,6*104 литров уксуса (половина объёма техни­
ческий уксус).
Лимонная кислота
Л им онная кислота содерж ится в соке незрелых плодов
цитрусовых, ананасов, груш, брусники, клюквы и др Природными
источниками получения растительной лимонной кислоты являются
лимон и апельсин
В 1893 году К Вемер показал, что лимонная кислота
продуцируется мицелиалышми грибами рода Репи illium. В 1917
году американский ученый Кэрри сообщ ил что при культиви
ровании Aspergillus niger в присутствии С.’аСО, при pH 7,0,
происходило преим ущ ественно накопление i лю коновой и
щавелевой кислот, а в условиях высокой кислотности среды без
СаСО, синтезируется практически одна лимонная кислота
Основными продуцентами лимонной кислоты, получаемой
микробиологическим синтезом, являются штаммы мицелиального
гриба Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica.
Лимонная кислота образуется Asp.niger в цикле трикарбоновых
кислот в результате ф ерм ентации ацетата и ацетил Со А,
осуществляемый цитрат -синтстазой. Необходимые для реакции
оксалоацстат и ацетил СоА образуются из двух молекул пиру вата:
одна молекула пиру вага подвергается декарбоксилированию с
образованием ацетил СоА, вторая карбоксилнруется. давая
оксалоацстат. Пиру ват образуется из глюкозы гликолитическим
путём (рис. 40,А,В).
138 Глава 6. Брожение

А с6н12о6
глю коза

СНз-СО-СООН CHj-CO-COOH
пируват пируват

СНз-CO-S-CoA + со2 --------- 1 НООС-СН2-СО-СООН


ацетил С оА оксалоацета г

СН2-СООН
I
Н О -С — СООН
I
С Н з-СО ОН
лим онная кислота
В

Рис 40 (А,В). Схемы биосинтеза лимонной кислоты.


Л i Ор.'аничи кис кш лоты

Сверхсинтез лимонной кислоты наблюдается при лимитиро­


вании роста продуценюв минеральными компонетами среды, и
одновременно избыточным содержанием источника углерода.
Наилучшим субстратом для грибов продуценюв является
сахароза, но более доступна и широко используется меласса.
Предварительно и* мелассы удаляются избыточные концентрации
ионов железа, марганца, тормозаших рос i культуры и синтез
лимонной кислоты. Также а качестве субстрата применяется
крахмал, глюко зный сироп, молочная сыворотка, дрожжевой
экстракт, витамины. Флективные условия для рост a Asp.niger
создаются при иимих значениях pH и .достаточной а фации среды.
Производство iи ионной кис юты осуществ шется 2 техно­
логическими способами
поверхностное культивирование гриба на плотной или
жидкой питательной среде,
- глубинное культивирование, в течение 5-7 суток а био­
реакторе.
На плотной поверхности влажных отрубей риса или пшеницы
собирается проросший мицелий, затем водой экстрагируется
лимонная, глютаминовая и щавелевая кислоты, лимонная кислота
осаждается в виде соли кальция
На поверхность жидкой среды а не глубоких кюветах, лотках
засеваются конидии гриба, термостатнроаанне проводится в
специальных камерах. На поверхности среды образуется плотная
плёнка из мицелия; лимонная кислота из мицелиальных клеток
диффундирует в жидкость, откуда она осаждается солями кальция
Глубинное культивирование осущ ествляется и 2 этапа:
выращ ивание грибного мицелия в посевных аппаратах и
последующая ферментация мицелия в основном ферментере в
течение 5-7 суток. На первом этапе идёт интенсивный рост
мицелия, а на втором, в стационарной фазе роста интенсивный
синтез лимонной кислоты.
Ф ильтрацией отделяют массу мицелия, из культуральной
жидкости выделяют лимонную кислоту.
Ежегодно производится около 400 тысяч тонн лимонной
кислоты. Она применяется в пищевой (кондитерские, колбасные
изделия, сыры, виноделие) отрасли, при производстве шампуней
и моющих средств, медицине, изготовлении пластмасс.
160

Г Л А В А 7 . М ет а б о л и т ы м и к ро о рга н и зм о в -
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ

7.1. Ферменты
Ферменты (ferm entum - закваска, en zym e- в дрожжах), без них
нем ы слим а ж и зн ед еятел ьн о сть лю бой клетки , нем ы слим ы
биологические процессы в природе.
К п р и м ер у , есл и в н ести в п и та т е л ьн у ю с р е д у крахм ал, то
м икробная клетка долж на расщ еп ить ее до глю козы , доставить
моносахарид внутрь, гидролизовать до пировиноградной кислоты,
затем в цикле трикарбоновы х кислот образуются промежуточные
соединения, из которых синтезируются аминокислоты, пуриновые
и пиримидиновые основания, витамины, жирные кислоты, а затем
структурные белки, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной
стенки, синтезирую тся вторичны е метаболиты и т.д. В конечном
итоге образуется новая клетка. Выш еприведенный биологический
цикл осущ ествляю т ф ерменты .
Предлож енный учеником П астера Эмилем Д ю кло в 1898 году
принцип названия фермента по веществу, на которые он действует
с добавлением окончания « - аза» остается общ епризнанны м (на
крахмал —амилаза, на липиды - липаза, на протеины - протеиназа
и т.д.).
И зв естн о б о лее 6000 ф е р м ен то в , 150 вы д елен ы в к р и ста л ­
л и ч еск о й ф о р м е. Н ал аж ен о к р у п н о м а с ш т а б н о е п р о и зв о д ст в о
около 300 из них. Так, в Японии ежегодно производится 55-60 тыс.
тонн ферментов, из них 38% применяется в сельском хозяйстве,
26% в пищ евой пром ы ш ленности, 23% в технической отрасли и
др. В СШ А около 20 фирм ежегодно производят 30-35 тыс. тонн
ф ерментны х препаратов. По масш табам производства ферменты
занимаю т третье место, после антибиотиков и ам инокислот.
Ф ерм енты как и ины е глобулярны е белки синтезирую тся на
рибосом ах, ф ункционирую т внутри клетки (эндоф ерм ены ) либо
секретирую тся во внутренню ю ср еду (экзоф ерм енты ). Ф ерм ен­
тативный набор клетки типичен, характерен для вида, генетически
д е т е р м и н и р о в а н . В м есте с тем р а з л и ч а ю т к о н с т и т у т и в н ы е
(ж изненноваж ны е, чащ е эндогенны е), присутствую щ ие всегда в
1.1 Ферм ент ы

определенной концентрации • клетке и индуцибепыше ферменты,


концентрация и активность которых ш ш е т от наличия субстрата.
Клетка может сохранять жизнедеятельность бет последних.
От 0,1 до 5% общего количества белка в клетке составляет
каждый отдельны й фермент, т с . основная масса к неточных
белков - это ферменты.
Ферменты это достаточно сложные ортанические молекулы.
Если попытаться написать химическую формулу, а примеру,
фермента поджелудочном желе ты, то суммарное выражение будет
^IIJO ^17*3 Щ ММ*||*
Как и другие белки, фермент ы характеризуются первичной,
вторичной, третичной и четвертичной структурой;
первичная структура тго последовательность аминокислот,
соединенных в цепь пептидными связями;
- вторичная структура регулирует конформацию полипеп-
тидной цепи в виде спирали посредством водоро тных святей между
СО и NH-фуппами на отдельных участках цепи;
третичная структура проявляется специфической укладкой
полипептидной цепи а г л о б у л у с образованием гидрофобного ядра
молекулы фермента. Сгабилизируют ее все виды химических
связей. Сильные связи пептидные и дисульфидные; слабые
водородные, гидрофобные и здектростат и чес к ие
- четвертичная структура - организуется в результате ассо­
циации двух и более глобулярных единиц
В сложном ферменте различают белковую часть (апофермент)
и небелковый компонент (простетическая труппа, кофермент.
кофактор). В белковой части фермента расположены активный
центр и ал лостер ичес ки й центр. Активный центр представлен
сосредоточением неполярных химических групп, специфически
взаимодействующих с субстратом. Ом не имеет определенных
топографических границ, очерчивающих его от остальной части
полипептида. В активных центрах находятся специфические
аминокислотные остатки, являющиеся донорами (-СООН. NH .
-SW или акцепторами (-СОО-, -NH„ -S-) протонов.
Если специфичность взаимодействия фермента с субстратом
обусловлена свойствами активного центра, то аллостерический
центр имеет значение в регуляции каталитической активности.
162 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

П рисоединение к нему ингибиторов или эффекторов подавляет


или усиливает ферментативную активность. Поскольку ингибиторы
и эффекторы не являю тся стерическими аналогами субстратов,
ф ерменты долж ны содерж ать специальны е участки связы вания
ингибиторов. М оно, Ш анжё и Ж акоб ввели терм ин «аллосте-
рический центр» для обозначения таких участков фермента.
Кофермент может быть органическим соединением (витамины
В,, В„ никотиновая кислота и др.) или неорганическим веществом
(макро- и микроэлементы, минеральные вещества; чаще ионы Zn,
Си, Mg, Мп, К, N a). П росты е ф ерменты представлены только
белковым компонентам.
Ферменты могут повышать скорость катализируемой реакции
в 108-1020 раз. В проявлении каталитической активности ферментов
решающую роль играет его третичная структура.
С огласн о ном енклатуры М еж дународного биохим ического
союза единицей активности фермента является то его количество,
которое за одну минуту катализирует превращение 1 микромоля
субстрата при заданны х стандартны х условиях (t°C , pH , рО „
к о н ц е н т р а ц и я с у б с т р а т а и д р .). А к т и в н о с ть с т ан д а р т н о г о
препарата фермента определяется в единицах ФА на один грамм
препарата.
Наряду с субстратспецифичностью (взаимодействие с одним,
о п р ед ел ен н ы м с у б с т р а т о м ) ф ер м ен ты х а р а к т е р и зу ю тся и
специфичностью действия (типом катализируемой реакции).
По типу катализируем ой реакции вы деляю т 6 классов ф ер­
ментов:
1. Оксидоредуктазы, ответственны за окислительно-восстано­
вительные реакции (глюкозооксидаза, каталаза, дегидрогеназа и
др.)
2. Трансферазы, катализируют перенос химических (функцио­
нальны х) групп с одного субстрата на другой (протеинкиназа,
пируваткиназа, ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза и др.)
3. Гидролазы осущ ествляю т гидролиз,расщ епление химичес­
ких связей субстрата (амилазы, протеиназы, целлюлазы. пектиназы,
липазы и др.)
4. Л иазы , катализирую т отщ епление либо присоединение к
субстрату химических групп (аспартаза, фумараза и др.)
t.l. Фе/шеиты

5. Изомера jm, осуществляют структурные и вменения в пределах


одной молекулы субстрата или изомеризацию ( глюкозой юмерача,
триозофосфатизомерага и др.)
6. Литы, отнетстнеким ча синтез in простых более сложных
соединений с затратой энергии (ЛИ К - лигаза. асп араги нси н-
гетаза, пирува!карбоксилаза и др.)
К атал и ти ческая ак ти в н о сть ф ер м ен то в ж и в о тн о го , р а с т и ­
т ел ь н о го и м и к р о б н о ю п р о и сх о ж д ен и я зависят о т услови й
о круж аю щ ей среды тем п ер а ту р ы . pH . р О ,, к о н ц ен тр ац и и
субстрата и др. О птимальной является температура в пределах
30-40°С (бактерии Э$-Э?*С\ грибы 2й-М >*0. нейтральная
реакция среды (pH 7,0-7.4) Имеете с тем есть гермостабильные
ферменты (полимераза бактерии The гтыл aguaikus активна при
80-90°С, протеина ia гриба Kfalbranchea pul< hellu var sulfurika,
оптимальная тем пература 60-70'< ). ф ерм енты , устойчивы е в
кислой (амилаза Aspergillus niger. pH 1.0-2,0. пепсин pH J.5-2,5)
либо в щелочной ( Bacillus spp. pH 10.5; щелочная фосфата ча
9,0-10,0) среде.
Интенсивность синтеза ферментов наблюдается в стационарной
фазе, реже в конце "экспоненциальной фазы роста и развития
микрооргаии ш ов.
Ферменты увеличивают скорость каталишрусмой реакции, но
сами в данной реакции не расходуются, их присутствие не влияет
ни на природу, ни на свойство конечною продукта реакции, очень
незначительное количество фермента вызывает превращ ение
большого количества субстрата; активиость фермента опреде­
ляется реакцией среды, температурой, давлением, pH, концен­
трацией субстрата. Величина pH алиаст иа сродство фермента к
субстрату, на степень насыщения фермента субстратом, иа
стабильность его структуры
Быопр*н)\у$еммы ферментов
Ферменты животного происхождения выделяют из под­
желудочной железы, слюнных желез, слизистой оболочки желудка
и тонкой кишки, из сычуга, семенников половозрелых животных.
Из слизистой желудка получают пепсин и липазу, из слюнных
желез - амилазу, из поджелу дочной железы - коллагеназу. реннин
164 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

из сычуга молочных телят и ягнят (25 и 8 граммов от одной головы


со о тв етств ен н о ). Л а к та тд еги д р о ген азу , катал азу , сы чуж ны й
фермент, щелочную фосфатазу выделяют чаще из органов КРС.
Трипсин, химотрипсин, пепсин, амилоацидазу из органов свиней.
Ф ерм ен тн ы е препараты из п одж елудочной ж елезы китов:
ж елеза зам ораж ивается, изм ельчается, обрабаты вается слабым
раствором трипсина и хлористого кальция в течение 24 часов,
затем цен три ф уги рую т, осадок уд аляю т, из элю ата ф ерм ен т
экстрагируют ацетоном. Фермент близок к бычьему трипсину и
хим отрипсину.
С реди ф ерм ентов расти тельн ого происхож дения в б и о тех ­
нологии востребованы тиоловы е протеазы , такие как папаин,
бромелаин, фицин и др. П апаин вы деляю т из дынного дерева
(п ап ай я ) в стад и и м о л о чн о й зр ел о сти , когда в соке плодов
собирается значительное количество этого протеолитического
фермента. Сок собирают в лотки, высушивают в тени. Высохшую
пленку очищ аю т, экстрагирую т ф ермент, получаю т в кристал­
лической форме. Бром елаин получаю т из ли стьев, стеблей и
оболочек плодов ананаса. Зеленую массу за исключением корне­
вой части изм ельчаю т, ф ерм ент экстрагирую т водой с после­
дующей очисткой. Фицин, растительная протеаза выделяется из
листьев и молодых побегов инжира. Сырье собираю т вручную
ранним утром на восходе солнца в деревянную тару. Затем давят
в емкостях и экстрагирую т водой. Э кстракт концентрирую т и
используют при смягчении мяса, при производстве специальных
сортов колбас, копченных мясных изделий. Амилазы и протеазы
получают из злаковых культур, из проросшего зерна (ячмень и
др.). Пероксидаза выделяется из хрена.
Ферменты микроорганизмов в биотехнологии представлены в
основном гидролазами:
- амилазы и глю коамилазы, расщ епляю щ ие 1,4 - a -связи в
ам илозе и амилопектине (из этих двух полимеров образуется
крахмал). Это водорастворим ы е глобулярны е белки, терм ола­
бильны (за исключением |3 - амилазы Вас. licheniformis), метал-
лоэнзим ы , содерж ащ ие ионы кальция, мало серусодерж ащ их
аминокислот, богаты тирозином и триптоф аном , устойчивы к
протеазам. Продуценты: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Вас.
licheniformis
7 I Ферменты

- протеин азы включаю? нейтральные металлопрогеиназы,


содержащие чаще ионы цинка и расикплиощис белки с гидро­
фобными боковыми пенями; кислые протеинаш, содержащие в
активном центре остаток acnapat иновой кислоты, которая сходна
по действию с пепсином и реннином; щелочные протеина«ы - w*
внутреклеточпые ферменты, гидролитуки до Ml связей в белках,
активны при pH 9 - 10,близки по действию к трипсину и
химотрипсину, хотя имеют совершенно другую структуру
г* продуценты Вас. subtil i s Вас licheniformis. Вас cereus,
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger.
- пектинаш, включают гидроли туюшие и трасэлиминирующие
группы, отщепляют Д-галак гуроновую кислоту от молекул
пектина. Продуценты. Aspergillus spp, husarium *pp . Penh tlhum
*PP-
- липазы и триацилтлицеролации идролазы, растворимые в воле
гетерогенные белки, имеют липидный компонент, актиаим при 30-
40°С, делятся на кислые, нейтральные и щелочные. Липазы
гидролизуют нерастворимые сложные »фиры лирных кислот,
вплоть до образования глицерина, реакции обратимы т.с. из
глицерина могут вновь синтезироваться сложные эфиры
Продуценты: Corynebacterium at нем, Peni( illium cyclopium.
Gluconobacter Candida. Aspergillus niger. Rhizopus arrhizus,
Rh.japonicus.
- глюкоизомеразы, катализируют реакцию изомери зацин Д
глюкозы в Д фруктозу, внутриклеточные ферменты, активны
при pH 4,5-11,0. Продуценты Streptomyces griseus, Micromono-
spora spp., Nocardia spp.. Str.albus.Bacillus spp.и др
целлюлазы (эидоглюкоиаэа, целлобиогндролаза, жзоглюко-
ната и р-глюкозидаза или целлобиаза), гидролизуют целлюлозу до
глюкозы. Продуценты: 7Ук hoderma viridae, Tr rec.si, Tr longibra-
chiatum. Asp. niger. Asp. foetidus.
Регуляция ферментативной активности
Активность ферментативных реакций зависит от трех фак­
торов:
- количества фермента;
- концентрации субстрата:
- биологической активности фермента.
166 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов — биотехнологическая продукция

И зменения активности ф ерментативны х реакций адекватны


п о тр еб н о стям клетки в тех или ины х су бстр атах , зави сят от
н е о б х о д и м о с ти с и н те за или р асщ еп л ен и я к о н кр етн ы х м ета­
болитов. Эти динам ические процессы постоянно регулирую тся
на гено- и фенотипическом уровнях.
К оличество ферментов, продуцируемых клеткой зависит от
коп ийн ости д етерм ин ирую щ их генов, активн ости пром отора;
определяется интенсивностью клеточного метаболизма, наличием
субстрата (в случае индуцибельных ферментов), соотнош ением
скорости синтеза и распада фермента и др.
П роцессы биосинтеза и расщ епления органических соеди ­
нений в клетке, м етаболические пути клеток м ногообразны и
многоэтапны. Поэтому в них принимают участие не один, а скоор­
динированная группа ферментов. Регулируется их биологическая
активность по типу обратной связи: мало конечного продукта
усиливается деятельность фермента, м н о го - ингибируется.
И нгибирование по типу обратную связи, когда торм озится
активность начального ф ерм ента (Е ,) биосинтетического пути
конечным продуктом (Д):
Е Е Е е
А --------- !------ ►Б---------| ------►В— -----I------ ►Г------- — ►Д

Конечный продукт Д связывается с аллостерическим центром


на Е,, тем самым уменьшается сродство Ё, к субстрату А.
И нгибирование по типу обратной связи наблюдается и в тех
случаях, когда метаболические пути оказываются разветвленными:

Е Е,
А ♦ Б * В

д р4

В - предшественник Р,
Г - предшественник Р, и Р
Д - предшественник Р4
J.t. Ферменты 167

Ингибированные и в этом случае имеет линейный харак iер.


Существует более сложный механизм ингибированных во типу
обратной сии hi, когда начальный фермент hhi ипирует с я только
при условии одновременного действия 2 конечных продуктов
j* *

А * » Б ■» В Г ^****| * 3
д —» ж
Примечание Высокие концентрации К и Ж ингибируют t ,

Наряду с иигибировяиием активности фермента конечным


продуктом существует механизм катаболитиой репрессии В ее
основе диауксия, т е. последовательно используются д м
субстрата. К примеру, вначале активируютсв ферменты
расщепления глюкош, как более легкоусвояемого углевода После
его израсходования активируютсв ферменты, расщепляющие
другой субстрат - сорбит, ацетат и т.д.
Индукция, усиление биологической активности фермента
осуществляется двумя путями В случае координированной
индукции субстрат, содержащийся в питательной среде,
одновременно включает синтез всех ферментов, необходимых для
его распада (когда короткий метаболический путь) Если же
метаболический путь, приводящий к распаду субстрата длинный,
то обнаруживается носчедоват ельная индукция, поэтапная
активация ферментов. К примеру синтез ферментов образованна
пировииоградиой кислоты путем Эитиера - Дудорова связан с
координированной индукцией. А распад ароматических
соединений обусловлен последовательной индукцией ферментов
Кинетика ферментативных реакций
Скорость ферментативных реакций зависит от концентрации
субстрата, количества фермента, его сродства с субстратом,
наличия или отсутствия ингибиторов и эффекторов, температуры,
pH, рО, и др.
Вместе с тем знание динамики ферментативных реакций
является необходимым условием рационального ведения
168 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Ген
----- » ДНК

1 1 1 1 Т~=^
J # * * * 1
и-РНК
/ \W vV V
Сллл) I I
Т рансляция

f
С интез фермента

б
Рис. 41. Механизм индукции ферментов при отстуствии (а) и в присутствии (б)
индуктора: - белок репрессор; R - регуляторный ген, закодированный на синтез
белка-репрессора; Р - промотор (ген-активатор) - место связывания РНК-
полимеразы, активирующей структурный ген; О - ген-оператор, контролирующий
функционирование структурного гена S; —индуктор; —РНК-полимераза.

технологии ферментационного процесса, получения оптимального


объема целевого продукта.
Среди вышеперечисленных факторов, влияющих на кинетику
ферментативных реакций, два фактора являются основными:
концентрация субстрата и биологическая активность фермента.
В 1913 году А. Михаэлис и M.JI. Ментен разработали матема­
тическую теорию кинетики ферментативных реакций, которая и
по настоящее время является основой последующих теорий и
формул расчета.
S+Е — ES -Ь*. р + е
К,

где S - субстрат, Е - фермент, Р - продукт, К. и К, константы


скоростей реакций, К , константа скорости обратной реакции.
При взаимодействии фермента с субстратом образуется вре­
менный комплекс, субстрат - фермент, который через ряд проме­
жуточных превращений завершается образованием конечного
продукта с освобождением фермента. Комплекс ES был выделен
и исследован при помощи рентгено - структурного анализа.
9.1. Ферменты

Л ’

[V ^
Рис. Формы кинетических кривых для разных компонентов
ферментативных реакций

и _ ^ ^
Л« „ , константа Михаэлиса.
Щ
Km обозначает концентрацию субстрата, при которой
ф ерментативная реакция протекает со скоростью , равной
половине максимальной, ее размерность мочь.л Фи шчеекий смысл
Km фактически показывает степень сродства Е и S

жг _ К - H S ]
*о ц , уравнение М а ш я м Ментеа

Уравнение Михаэлиса Ментсн описывает повеление многих


ферментов в зависимости от изменений концентраций субетрата.
V* - начальная скорости» реакции при концентрации S.
Vw максимальная скорость реакции,
К, константа для данного F. соответствующ ая опреде­
ленному субстрату Величина Km ключевое звено в уравнении
Михаэлиса Ментен Она характеризует действие данного Е по
отношению к тому или иному S при определенных значениях pH
и t*C.
Технология получения ферментов
Из истории известно, что И.Такамнне получил патент в 1894
году на то, что в процессе выращивания Asp.onzae на влажном
рисе или на замоченных пшеничных отрубях сегрегируется
амилаза, которую экстрагируют водой или солевым раствором.
В 1915 году О.Ремом был запатентован «способ стирки всех
типов одежды с использованием добавок триптических фер-
170 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

ментов», также основанный на поверхностном культивировании


микроорганизмов (Bacillus spp.), с последующей экстракцией
ферментов. С 1940-х годов внедрена технология глубинного
культивирования в биореакторах, благодаря стремительному
развитию технологии производства антибиотиков.
В качестве сырья, источников азота и углерода используется
крахмал, глюкоза, кукурузная, пшеничная, соевая или рыбная
мука, казеин, соли аммония.
Н аращ ивается биомасса микроорганизмов путем поверх­
ностного (мицелиальные грибы) либо глубинного культивирования
(бактерии). Обычно используется периодическая глубинная
ферментация с соблюдением стерильности, исключая попадание
посторонней микрофлоры.
В конце ферментационного процесса культуральная жидкость
быстро охлаждается до 5°С, корректируется pH среды с целью
стабилизации фермента, предотвращения разрушения белковых
молекул.
Затем центробежным центрифугированием (сепарацией), либо
тангенциальным фильтрованием культуральная жидкость
отделяется от плотной биомассы. Если внеклеточный фермент,
то в дальнейшем обработке подвергается культуральная жидкость,
если же внутриклеточный - то объект выделения клеточная масса.
Культуральная жидкость концентрируется выпариванием, либо
ультрафильтрацией. Вносятся стабилизирую щ ие фермент
вещества - поваренная соль, бензоат, сорбинат и др. Чтобы
избежать потери биологической активности фермента исполь­
зуются защитные добавки (SH - содержащие соединения -
цистеин, глутамин, меркаптоэтанол). В процессе экстракции и
очистки фермента удаляю тся токсичные и нежелательные
метаболиты, микроорганизмы.
Далее фермент выделяют осаждением и фракционированием
органическим растворителем (этанол, метанол, ацетон, хлоро­
форм, диоксан и др.), солями (сульфат аммония, сульфат натрия
или сульфат магния, ацетат натрия), сорбентами (табл. 7).
Степень очистки фермента зависит от целей применения.
Полученные экстракты очищают диализом, ультрафильтрацией,
вымораживанием.
in
1.1. Ферменты

Таблица 7. I рсйшания к шрбпггам. истиыуемым ирги яыд? «сние фсрмев!

/ »шкропорш-юность, способст­ в случае ттяратертптш сорбен j


вующая проникновению фермен­ $тов сорбция ферментов прахо» |
тов в грин у /у сорбента flu») только t участием функции- 1
м и о и ./пи я. расположенны.х ми j
а м ф м ш н н т »рн*м
2. достаточная гигрофильно*: ть. ттогте сорбенты с гш1рофя6ты-
обеспечивающая сохранней ть тш матрицами вызывают Лена ]
нативной кстфортацм! и актив­ турацию ферментов
ности ферментов
J. угтойчивость матрицы сорбен- сорбенты ш яолтаетяртЛтет «ии |
та к во здеш. твию ферментов » целшюошо* опоог подвергаются |
микр(шрганиз.%им 4ояярукщеш при шидештвии куль- I
тура 1ьных жидкостей (ММ фер i
тентов
4 жёсткость i тру ктуры иат/т . та дни спрЛцш * Лесорёцеш |
цы и емтветств) югцая устой­ Лпяяпш проходить те недефор-
чивость ч<н тиц к Лтлютт мирующихся сврЛееотк с мини I
а м м м м тетшрштткм чаатшц
5. специфическан фарте и соот­ c<ftcpu4tH кая ферме чСпспечивает |
ветствие размеров аоштмшлшут скарсхть потока
А«ш м яппш тиеешртая> мг* регенерация сарбеттов ино.'да
w u k k tM w uг м ш ч и об­
(tn яуМ ичя рттеарит с различными
менной ёмюмти и m w w r m i « м м ш м pH ван органических I
inw iii itm vm u растворителей
f м м м м м м г KMMMWf o6*U'mu
при изменении pH н нош и» г и м t орСщия регенерация, промывка —J
1 Лвлжтш проходить в одной колон- j
j те без имяяететт и с п ёма слое сер- J
1 беште . 1

Если ферменты внутриклеточные, то отделяют биомассу,


клетки разрушают путем воздействия ультразвука, перемалывания
стекляными шариками, замораживанием оттаиванием. Остатки
клеток удаляют центрифугированием, иуклеииоаые кислоты
гидролизуют ферментами или осаждают катионом полиэтнле-
ним ином Стандартизируется активность фермента
172 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

В случае поверхностного культивирования (Aspergillus


spp.,Rhyzopus spp.) в качестве субстрата используются увлаж­
ненные (56-65%) пшеничные отруби с добавлением соевой и
просяной муки, солодовых ростков из пивоваренного произ­
водства; pH 5,6-6,2; для лучшей аэрации и иммобилизации
микроорганизмов вносят 10-20% березовых опилок. По окончании
культивирования мицелий отделяют, подсушивают, освобождают
от пигмента; фермент экстрагируют органическим или солевым
растворителем.
При глубокой очистке ферментов используется ультрафиль­
трация, аффинная и ионообменная хроматография; фермент
лиофилизируется. Это зависит от конечной цели использования
ферментного препарата.
При выделении ферментов из животного сырья, материал
измельчается специальными машинами - измельчителями, со
строгим контролем диспергирования, степени измельчения. Если
из культуры микроорганизмов фермент извлекают водной
экстракцией, то из животной ткани выделяют тремя видами
экстрагентов:
- водным раствором кислот, pH = 1,0 —2,0;
- водным раствором солей, pH = 7,0 - 8,0;
- концентрированным водным раствором органических
растворителей (этанол, ацетон, глицерин).
В зависимости от того, какой фермент извлекается (липаза,
амилаза, карбоксипептидаза, химотрипсин и др.) используется тот
или иной экстрагент.
В ферментных препаратах проверяют активность, влажность,
содержание углеводов, этанола, липидов, фенола, солей тяжелых
металлов, азота и белка.
Ферментные препараты чаше изготавливаются в жидкой либо
гранулированной форме.
Ферментные препараты должны соответствовать определен­
ным требованиям.
Для пищевых производств целесообразно использовать
комплекс ферментных препаратов, поскольку сырье зачастую
является гетерогенной системой сложного состава. При этом от
набора специфических ферментов и уровня их активности зависит
У I Ферменты т

общая эффективность преобразования компонентов пищевою


с ы р ы . Спецификация пищевых ферментов предусматривает
пределы содержания мышьяка, свинца, других тяжелых металлов,
афлотоксииа, антибиотиков, а также отсутствие возбудителей
инфекции сальмонелл, кишечной палочки, по—домом ал и др.
Ферменты для хлебопекарно!о, мясного и рыбного проит*
водства контролируются на содержание спор грибов и бактерий
(их не должно быть), проверяется токситенносгь на лабораторных
животных, определяется влажность и акт ивность в стандартных
единицах на I гр. препарата.
Применение ферментов
В промыш ленности в основном используются т идролазы
(детергенты в производстве синтетических моющих средств) и
гликозндазы (в производстве кондитерских изделий, фруктовых
и овощных соков). Достаточно широко применяются ферменты
в пищевой, цедлюлозобумажной. медицинской и других отраслях
Половина объема выпуска ферментов в нишевой промышлен­
ности приходится на глюкоамялаты и глюкоизомеразы, катали­
зирующие расщепление крахмала, являющегося основным суб­
стратом в производстве спирта, получении гякжон - фруктозных
сиропов.
Крахмал состоит из 2 полимеров' амилозы - линейный поли­
сахарид и амилопектина разветвленная молекула полимера, а -
амилаза расщепляет крахмал до олигосахаридов, декстринов;
крахмальный раствор «ожижается» Далее глюкоамилаза расшеп-
Ьляет декстрины до моносахаров, глюкозы, а пуллуиаза активно
катаболизирует амилопектин до дисахаридов (рис 42.43)
«Ожижается» крахмал бактериальной термостабильной а - ами­
лазой (В. liehenifbrmis) при SO-! 1O' С в течение 2-4 часов. Затем
декстрины охлаждают до 60°С и расщепляют до моносахаров в
течение 24-48 часов.
В сельском хозяйстве ферменты используются в качестве
кормовых добавок - амилосубтилин. протосубтилин, глюкамоварин.
амилоризин; в целлюлозе - бумажном производстве - целлюлазы
Амилазы используют для осахаривания зернового и карто-
фе льного крахмала, в основном, в спиртовой и пивоваренной
174 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

А милоза Декстрин

Рис. 42. А. Ферментный гидролиз амилозы. Б. Ферментативный гидролиз


амилопектина. Кружки - остатки D - глюкозы.

промышленности. Используются в хлебопечении, крахмалопа*


точном производстве.
Использование пектолитических ферментов позволяет на 5*
25% повысить выход сока с единицы перерабатываемого сырья,
что дает очень высокий экономический эффект, при осветлении
Т. I. Ферменты

Рис. 4S. Схема растепления нрааим а

соков и вина, в переработке льна, фермою гидроли зуют клейкие


пектиновые вещества с освобождение пучков волокон льна
Гидролиз целлюлозы способствует образованию глюкозы,
которую можно использовать для прон *водсгва пишевых и
кормовых белковых препаратов, получать биоэтанол (рис. 44).

J лю к о
Целлюлоза Олиго и дисахариды
Ц* яясЛиогидро-!

Ряс. 44. Схема расщепления целлю лты.

В медицине ферменты применяются с лечебной иелью.


- а-амплаты. В составе препарата фестал - при заболеваниях
желудочно-кишечного тракта,
- протеазы, при гнойных ранах,
- стрептокиназа - фибринолитический фермент, эффективен
при тромбозах.
- лизоцим - при различных воспалительных процессах и др.
176 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Протеолитические ферменты используются для мягчения


(тендеризации) мяса, мясных изделий, рыбы, что облегчает и
ускоряет обработку полупродуктов, повышает их качество.
Щелочные протеазы используются в составе синтетических
моющих средств, в кожевенной промышленности для удаления
волос и мягчения кожи, отделения щетины.
Препараты {3-галактозидазы, расщепляющие лактат приме­
няются в молочной промышленности, при переработке отходов
молока, содержащих лактозу. Лактоза является очень ценным
углеводом, но сахар этот плохорастворим, несладкий, не сбражи­
вается дрожжами, часто не усваивается животным организмом.
Если с помощью (3-галактозидазы осуществить его расщепление
до галактозы и глюкозы, то эта смесь уже имеет сладкий вкус,
хорошо растворяется в воде, глюкоза усваивается как животными,
так и микроорганизмами.
Безлактозное молоко необходимо части населения, страдаю­
щей лактозной недостаточностью.
Иммобилизованные ферменты
В естественной среде, внутри клетки, ферменты находятся на
поверхности мембранных структур, в определенной степени
иммобилизованы, локализованы в конкретном внутриклеточном
компартменте.
Применение иммобилизованных ферментов в биотехноло­
гическом производстве оказывается экономически более выгод­
ным, технологический процесс облегчается, так как становится
проще выделить конечный продукт из культуральной среды.
Сущность иммобилизации заключается в прикреплении фер­
мента в биологически активной форме к нерастворимой основе,
носителю(полисахариды - целлюлоза, хитин, декстран, агароза;
белки - коллаген, кератин; синтетические соединения - сополимер
стирола и дивинилбензола; неорганические вещества —силикагель,
глина, природные минералы).
Способ иммобилизации также многообразен по носителю: гели,
полупроницаемые мембраны, полые волокна, водонерастворимые
иониты, микрокапсулы, сшивка молекул фермента друг с другом
и др.
7.1. Ферменты 177

Связывание фермой а
с носителем

Заключение в микрокапсу лы
_Д ___ Д___ J L
DSDЕЭС f (^Л
Н
If
ЕШС
г V£ A ^
----- И----- 1 2
Рае. 4& С м еобм м м а б а м п м

Преимущ еств иммобилизации в болсс длительном сохранении


стабильности и биологической активное!и фермента. При
фиксации активность фермента может снизиться, но п о во много
раз компенсируется повторным, многократным его использова­
нием. в отличие от свободных ферментов. Существуют диффу­
зионные ограничения» т.е. субстрат должен «добраться» до
фиксированного к носителю фермента
Налажено производство получения биопродч кции с использо­
ванием технологии иммобилизованных ферментов:
- глюкозо-фрукто зные сиропы,
разделение рацематов и получение L - аминокислот,
синтез L аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты,
синтез L яблочной кислоты из фумаровой кислоты.
- получение диетического безлактозного молока,
- получение сахара из молочной сыворотки (в молочной сыво­
ротке содержится около 5% лактозы, состоящей из глюкозы и
галактозы),
178 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

- выделение и модификация 6 - аминопенициллановой кислоты


из пенициллина.
L - аспарагиновая кислота используется в пищевой и кондитер­
ской промышленности (вместе с глицином дает оттенки кислого
и сладкого). Ее получают с помощью иммобилизованной на геле­
вую основу аспартазы (аспартатаммиаклиаза), катализирующей
п р и соед и н ен и е ам м иака (N H 4) по д вой н ой связи ф ум аровой
кислоты. Используется колонный биореактор, пропускают раствор
фумарата аммония, «омывающий» иммобилизованную аспартазу.

7.2. Антибиотики

Антибиотики в истории биотехнологии, медицины занимают


о со б о е м есто. О бозн ач ая этапы разви ти я б и о тех н о л о ги и Е.
Х аувинк (1984) один из этапов назвал «эрой антибиотиков».
Несомненно, это уместно, так как наряду с вакцинами антибиотики
позволили человечеству избавиться от многих глобальных инфек­
ций, уносивш их жизни сотен ты сяч, миллионов лю дей, прино­
сивших социальный и экономический хаос в жизнь государств.
Сегодня они значимы , прежде всего, как лечебно-проф илакти-
ческие препараты, составляя около 13% от всех применяемых
лекарственных средств. Не стоит умалять роль антибиотиков в
пищевой промышленности, ветеринарии и сельском хозяйстве.
Термин «антибиотик» (anti - против, bios - жизнь) ввёл 3. Вакс-
ман, открывший в 1944 г. продуцент стрептомицина Str. griseus.
Антибиотики - это вещества природного происхождения, обла­
дающие выраженной антимикробной биологической активностью.
Они выделяются из микробных клеток, растительных и животных
тканей; могут быть синтезированы химическим путём.
Антибиотики, как и пигменты, алкалоиды, токсины относятся
к вторичным метаболитам микроорганизмов. Их биологическая
суть обозначается ролью в обеспечении конкурентного существо­
вания в среде обитания, путем подавления ж изнедеятельности
других групп микроорганизмов.
Это низкомолекулярные вещества, массой около 1000 дальтон,
синтезирую тся в клетке из ам ин окислот, углеводов, ж ирны х
кислот, пуринов и др. А нтибиотики это продукты непрямой
трансляции, имеют достаточно сложный биосинтетический путь.
t.J. ЛнтшЛышт**»

Вместе с тем, антибиотики не относятся к метаболитам основною


обм ена и клетки могут со х р ан я ть жи зн есп о с о б м е т ь в их
отсутствие.
Известно более 9000 антибиотиков, из них • медицине и других
отраслях и сп о л ьзу ю тся немног им б о л ее 200 со ед и н ен и й
Д оминирует п р о и зв о д с т в о п ен и ц и лл и н о » , ц е ф ал о сп о р и н о в,
особенно их пол ус и и re i и чес к и х производных, амниот ликозидов.
макролндон. а также синтетических препаратов фторхинолонов
О тличает антибиотики от других биол о ги чески активны х
веществ их антимикробное действие и избирательность этого
действия
Антибиотики, применяемы е в медицине не используются в
ветеринарии, сельском хо!яЙстве и наоборот
Р а зл и ч н ы е пути б и о с и н ie ia ан ти б и о ти к о в
Антибиотики являясь вторичными метаболитами. синзечируют-
ся в стационарной фате роста культуры, в идиофа*е.
Антибиотики могут накапливаться внутри клеток прилуиеитоа
и лишь в незначительных количествах выделяться м внеклеточную
окружающую среду (нистатин), могут в равной мере находиться
внутри клетки, так и активно выделяться (ристомицин. кандицидии)
или преимущественно выделяться в среду (стрептомицин, тетра­
циклин. макролилы \
Существует больш ое число антибиотиков, содержащих в
основе ароматические таместителн Они синтезируются клетками
м и к роорган и зм о в из промежуточных и конечных продуктов
превращения ароматических аминокислот тго биосинтетический
путь шикимовой кислоты (рис 46).
180 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов —биотехнологическая продукция

ГЛЮКОЗА

пентою-фосфатный путь путь Эмбдена - Мейергофа

Д - эритрозо - 4 - фосфат фосфоенолпируват

рифамицин ШИКИМОВАЯ КИСЛОТА п и о ц и а ни н

ароматические, 1
полиеновые, -* ---- хорнзмовая кислота-----*■антраниловая — «триптофан
макролиды кислота
акт ином ицин
нокардицин префенат
новооиоцин,
пептидные фенилаланин тироэин пепт идны е
антибиотики антибиотики

Рис. 46. Антибиотики синтезируются из ароматических


соединений, аминокислот.

Так, сопряжённые С - С связи хлорамфеникола и коринецина


«переносятся» из хоризмовой кислоты (через промежуточный
метаболит - п-аминофенилаланин), ароматический компонент
рифамицина - из антраниловой кислоты; ароматические кольца
актиномицина - из триптофана и т.д.
Основной предшественник —шикимовая кислота - образуется
конденсацией эритрозо - 4 - фосфата (продукт пентозо - фосфат­
ного цикла) с фосфоенолпируватом (продукт гликолиза), затем
превращается в хоризмовую кислоту.
Синтез хлорамфеникола клетками Str. venezuelae сходен с био­
синтезом ароматической аминокислоты —тирозина. Но при
синтезе хлорамфеникола хорнзмовая кислота превращается в п -
аминофенилпировиноградную кислоту, а не в п - оксифенилпиро-
виноградную кислоту, как при синтезе тирозина.
Ключевым этапом биосинтеза многих антибиотиков являются
реакции полимеризации путём конденсации:
• Ацетат-малонатных (реже пропионат-метилмалонатных)
единиц в поликетидном синтезе, когда в цепи полимера чередуются
кето- и метиленовые группы;
7.2- ЛшяшЬчтшшяы IKt

• А минокислоты с образованием олит о и п о д и н е т и до в то


гиоматричному механизму;
• Моносахаров (аминосахаров) с образованием о жгосахаридов
Эти реакции конденсации сходны с реакциями основных путей
метаболизма, посредством которых осуществляется синтез компо­
нентов клеточной стенки микрооргаии»мов Так, поликстидный
синтез, • определённой степени и тиомагричный механизм, по-
видимому, можно рассматривать как промиюлкые реакции бносии
теза жирных кислот в составе мембран, а образование аитибно
тиков углеводной природы сходно с синтезом полисахаридов
клеточной стенки трамотрицательных и я к р о о р м м м м
Наряду с полимерн «аиисй антибиотик и могут сяитемсромтъся
путём модификации тех или иных первичных метаболитов или
к о н д ен сац и ей нескольких м оди ф и цирован ны х м етаболитов
Синтез отдельных антибиотиков с м и а с метаболизмом нукле­
отидов (рис. 47).
Ш рацчяый мфммшв
м п 1м м я инА мпм ттнЛташт

Тт. 47. Метаболические е м м м и м у рсриичны! и ^ и и и й и ш и и


182 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов —биотехнологическая продукция

На основании анализа структурных формул аминогликозидов -


стрептомицина, сизомицина и гентамицина можно предположить,
что их биосинтез основан на углеводных единицах (глю коза,
ам иносахара). Из глю козы могут синтезироваться не только
остатки сахаров в молекулах аминогликозидов, но и их амино-
циклотольный фрагмент. Два других фрагмента молекулы стреп­
томицина - пентоза (стрептоза) и L - глюкозоамин также угле­
водного происхождения. Завершается синтез сборкой молекулы
стрептомицина из этих 3-х компонентов. Биосинтез антибиотика
осуществляют почти два десятка различных ферментов микро­
организмов.
И звестно более 150 антибиотиков нуклеозидной природы,
продуцируемых актиномицетами и некоторыми мицелиальными
грибами. Биосинтез их схож с метаболическим путём синтеза
пуриновы х и пирим идиновы х нуклеоти дов. К прим еру,
продуцируемый Sir. antibioticus противовирусный антибиотик
видарабин синтезируется из пути аденозина.
Группа антибиотиков из полиоксинового семейства, обладаю­
щих фунгицидным действием и применяемых в сельском хозяйстве
той же нуклеозидной природы, из уридинового метаболического
пути.
Большое количество антибиотиков синтезируется поликетид-
ным путём. Это эритромицин, тетрациклин, рифамицин, макро-
лиды, полиэфирные антибиотики. Продуцируются они актиноми­
цетами, реже миксобактериями и псевдомонадами. Механизм
полимеризации данных антибиотических соединений подобен
биосинтезу жирных кислот клеточных мембран. Также сходны
протекающ ие биохимические реакции, первичные структуры
ферментов, осуществляющих эти реакции.
Так, у актином и цетов конденсация ацетата и малоната в актив­
ной форме (ацетил СоА и малонил СоА) с образованием сложной
тиоэфирной связи осуществляется двумя синтезами —поликетоме-
тиленсинтеза I и II типов; этот начальный процесс биосинтеза
схож у поликетидных антибиотиков и у жирных кислот (к примеру,
пальмитиновой).
Пропионовая кислота и пропиловый спирт стимулируют био­
синтез макролидных антибиотиков через метилмалонил СоА.
l« S
7.2- Лчт ш бт омш кт

С мит тетрациклина стимулирует моииамил маавмовей кисю ты


Э ритром ицин 14-атомный лактонны й макроцикл, несущий
кето- и мет ильные группы, остатки двух сахаров конденсируется
ит следующих строительных блоков - I молекула амстата, 4 моле­
кулы м ал он ата, 7 м олекул м етилм алона га и I м олекула м и л
малоната
Строительны»; блоки рнфамицина включаю! З-амкно-5-гид-
роксибеи юйную кислоту, 2 остатка мл юна!а. 6 мелилмалонатных
остатков
С интезировано более КО антибиотиков, относящ ихся в пол и -
эф ирны м соединениям Это моненлин. сам иом акии и др При­
меняю тся как фуитистатикш при кокци лиоте. как стим уляторы
роста с ел ь ск о х о зя й ств ен н ы х ж ивотны х ( троительны е блоки
моиси тина А 1 молекула ацею на. 4 молекулы малоната. 7 молекул
мстил малоиата и 1 молекула »ти л малоната
Рад пептидных а т и б и о гиков продуцирую!ся с испольюванием
с и с т е м т р а н с к р и п ц и и и тр ан с л я ц и и б е ш м на р и б о со м а х
П одобные антибиотики называются антибиотикам и <наличие
лантионииойых структур, имеющих ссровоапуолные с м ш между
остатком цисте ии а и серима или греи ни к а) Их» ни <нн и субтилин,
п родуц ируем ы е стреп тококкам и а бациллам и со о тветствен н о ,
анкоасиин и актогардин акт иномицетами Они образуются из
более крупных, см итерируе­
мых на рибосомах пептидов,
наты каем ы х прелантибио-
тики. К примеру, циклическим
пептидный антибиотик гра­
мицидин С, продуцируется
tkh'illus Anrvit (рис. 49) в идио-
фате, так как грамицидин С
сиитетата не обра чуется в
клетке до пиша логарифми­
ческой фаты роста Сложный
антибиотик из двух цепей, по
5 аминокислотных остатков
в каждой фенилаланин, про-
лии, орнитин, валин, лейцин
(рис. 49). гаража А. Гарса».« f m
184 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Leu > D - Phe Полимиксин В (продуцент

t почвенная спорообразую щ ая
бактерия Bacillus polymyxa) -
От Pro представитель группы, в кото­

t
Val
I
Val
рую входят более 20 различных
полимиксинов, отличающихся
по остаткам аминокислотных
1 остатков, по составу жирных
Pro От кислот. Этот антибиотик состоит

t
D - Phe < -------------------------- ----- Leu
I
из 3 частей: линейного трипеп-
тида, циклического пептида и
остатка 6-метилоктановой кис­
Рис. 49. Структура грамицидина С лоты (непептидная часть моле­
кулы, (рис. 50).

__ Phe ^

дм к - —> Т ге дм к L eu
I А
1 Ф т I
м ок ДМК -> Д М 1С дм к
ДМК

Рис. 50. Структура полимиксина В.


Примечание: ДМК - остаток а , у -диаминомасляной кислоты;
МОК - остаток 6-метилоктановой кислоты.

М икроорганизмы - продуценты антибиотиков


А нтибиотические вещ ества продуцирую т в основном различ­
ные группы почвенных микроорганизмов, относящ ихся к актино-
м и ц етам , б ак тер и я м , м и ц ел и ал ьн ы м гр и бам . Э то сап р о ф и ты ,
аэробы , гетеротроф ы .
Среди почвенных анаэробов, ацетоно-бутиловы х, дисульфати-
рую щ их, пропионовокислы х бактерий редко встречаю тся анти-
биотикопродуценты , поскольку конкурентная среда анаэробам и
создаётся путём накопления м етаболитов брож ения: бутанола,
пропионовой, уксусной кислоты , этанола, а такж е за счёт п р о ­
дукции сульфидов, сероводорода и др.
4ш тМ т ит **ы 186

Гране!юрта* И И

Гм. II. М т т м Ш*И 1Ч .... ................ щ вЛт


себя практически и» м м и ярмим**
Пенициллинм и и ф м н н у м *
Блеомниины и яитряаик шиы нарушают р т ш и м ЛИ*
синету матричной РНК • щ чш еесе ?рв№с*р*гаии
хлорямфеикод и N t f M i w м м а я т * щ т
матричная РНК транслируется с
различаются я бяктерияч и «летка* м

ярем я менее >ффепи»»о, че*


найдено мяло соединений, об,
Я № *бм м п клеткам ■ г^швяая 0:tnv ■*

деятельность клеточной мембраны ф в о о я


186 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов —биотехнологическая продукция

Продуценты антибиотиков отсутствуют среди уксусно-кислых,


тиоловых, метилотрофных бактерий. Эти аэробы как бы вне
конкуренции, так как окружающие микроорганизмы не исполь­
зуют их специфический субстрат либо не могут существовать в
сильно кислых условиях, которые они создают.
Микроорганизмы одного вида могут продуцировать антибио­
тики различной природы и, наоборот, один и тот же антибиотик
могут продуцировать микроорганизмы разных таксономических
групп.
К примеру, различные штаммы Str. griseus в зависимости от
условий среды продуцируют: аминогликозид стрептомицин, полие-
новый антибиотик кандицидин, антибиотик пептидной природы
виридогризеин. П енициллины , беталактам ны е антибиотики
продуцируют не только мицелиальные грибы, но и некоторые
актиномицеты.
Доминирующее положение среди продуцентов антибиотиков
занимают актиномицеты. Известно более 4000 антибиотиков,
продуцируемых этой группой микроорганизмов. Только один вид
актиномицетов Str. griseus продуцирует около 50 антибиотических
соединений.
Известно более 1000 антибиотиков бактериального происхож­
дения, в основном продуценты почвенные, спорообразующие бак­
терии рода Bacillus. Синтезируемые ими антибиотики пептидной
природы.
Мицелиальные грибы как продуценты антибиотиков, прежде
всего, знакомы по беталактамам - пенициллинам и цефалос-
поринам, а также их полусинтетическим производным. Основные
продуценты грибы родов Penicillium, Cephalosporium (Acremonium).
Антибиотики, синтезируемые актиномицетами подразделяются на:
• тетрациклины (хлор-, окситетрациклины и их производные -
доксициклин, метациклин - Str. rimosus, Str. aureofaciens),
• аминогликозиды (стрептомицин - Str griseus, неомицин - Str
fradiae; канамицин - Str. kanamyceticus и др.),
• макролиды (эритромицин - Str. (saccharopolyspora) erythraeus,
олеандомицин - Str. antibioticus),
• ароматические соединения (хлорамфеникол - Str. venezuelae),
• полиеновые (амфотеррицин В, нистатин - Str. neurasei),
t.i АнтиОитпили if?

* рифамицины (рифамницнн - Sir t\<nardwt и I,


* антраииклины и я ^ о т н в о в я у м м м к (блеомицин - 0*г
verticillius/.
Тетрациклины, а миног л иколиды, макролиды и «ром агичссш
соединения имгнбирую! трансляцию бельа на рибосомах
прокариот (рис. 51).
Полменовые антибиотики нарушают проницаемое* ь цитоплаз­
матической мембраны возбуди*елей лей ко юн
Рифамицины ингибируют РНК полимеразу бактерии
Антраииклины нарушают репликацию ДНК
Бактерии продуцируют антибиотики ям тм лю й нрироаы
грамицидин С, Bacillus Ыгм» Р Даобо. I W
полнмнксии В, Bacillus рЫут\ ха. 1#47 г я др.
бацитрапины, Bat itlus tickemformis
Пептидные ипиА ятики нарушают ярпимямипсп цитошждоя-
тнческоЙ мембраны прокариот
Мицелнальные грибы, продуцируют бета.»актамные антибио­
тики и ия производные, иш ибируюшие синтез п е т и ннликана
компонента клеточных стенок i рамотрицательныч. и о с о б е н н о ,
i рам положи i ел ьныч. микрооргаии «мои
• пенициллины (пенициллин и их пояусиВДРетичес кие проитоа-
ные, Р. скгуя*>цгтыт, Р. тоШыя),
• цефалоспорины (ц с ф и о с т ^ н к С ■ прои ою.шыс ( <■krywege
яыт, Смсгетот'ит),
• цефамнцины (цефамнцни С, цефоксии и ар )
Синтетические и пилусинтетическне антибиогики фторхино-
лоны офлоксацин, зноксацин, пефлоксацин и др., ингибируют
активность фермента ДНК шразы, ответственной м с\ перепира­
ли лацию ДИК у прокариот.
Растительные антибиотики фитонциды, а я к и Б Токи* l*2f г ,
малоустойчивы я химически чистом виде, быстро разрушаются.
Это аллицин из чеснока, нманин ит иеробоя, сальван ил шалфея,
рафаннн ит редиса и ар
Антибиотические вещества животного происхождения: экмо-
лии ш осетровых рыб, »ритрин из >ригроци тов; люоцим и интер
ферон обладают микробоцидньгм действием
188 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Штаммы - сверхпродуценты антибиотиков созданы путём


последовательны х, многоступенчатых мутаций и селекции.
Выделенные из почвы продуценты образуют немного антибио­
тика. Путём мутаций и ступенчатого отбора удаётся в 100-1000
раз увеличить продукцию антибиотика по сравнению с исходными,
«дикими» продуцентами. Повышают биосинтетическую способ­
ность продуцентов двумя путями: получение новых генотипов с
повышенной продукцией антибиотика и подбор наиболее опти­
мальных условий культивирования отобранных мутантов.
Получение рекомбинантных промышленных культур - сверх­
продуцентов находится в стадии экспериментальных разработок
из-за сложных механизмов генетической и биохимической регу­
ляции синтеза антибиотиков. К примеру, путь синтеза хлортетра-
циклина включает образование 72 промежуточных соединений.
Клонировать столь большую группу генов достаточно сложно.
При конструировании рекомбинантного штамма актиномицета для
того, чтобы трансформировать клонируемую молекулу ДНК
необходимо разрушить клеточную стенку мицелия, получить
отдельные протопласты. Проникновение вектора плазмидной ДНК
в протопласт облегчается в присутствии полиэтиленгликоля.
Трансформированные протопласты высеваются на плотные среды,
где вновь при росте и размножение, образуется клеточная стенка.
Затем клетки пересевают на селективные среды для отбора тех
клеток, где прошла трансформация. Клонирование включает 10 -
30 ферментативных реакций, вводится в клетку-реципиент целый
набор генов (с высокой репликационной активностью, сильным
промотором и др.), обеспечивающих сверхсинтез антибиотиков.
При помощи технологии рекомбинантной ДНК, возможно, не
только усилить продукцию антибиотиков, но и получить модифи­
цированный антибиотик путём перестройки пути биосинтеза.
Продукция химерного антибиотика достигается путём смешения
генов двух антибиотиков: актинородина и медермицина,
эритромицина и олеандомицина. Рекомбинантный штамм актино­
мицета продуцировал в первом случае антибиотик - медерродин,
во втором - 2-норэритромицин.
Другим путём в создании сверхпродуцента является адаптация
штамма к низким концентрациям кислорода. Нередко лимити­
7 j Антибиотики m

рующим фактором в промышленном синтезе антибиотиков


является снижение коицентрации растворенного кислорода а нуль
туральной жидкости из-за нарастающей плотности размножаю­
щихся клеток стрептомииетов. Задача усилить биохимические
механизмы более эффективного использования кислорода
клеткам и - предуцента ми
Продолжается активный поиск новых антибиотиков, образуе­
мых различными группами микроорг анизмов Это связано, с одной
стороны, с тем, что, многие антибиотические вещества находят
широкое применение в медицине, ветеринарии, пищевой промыш­
ленности, сельском хозяйстве, а также в научных исследованиях
как реагенты, блокирующие реакции обмена веществ изучаемых
организмов, при создании селективных условий питательной
среды и др. С другой стороны, поиск обусловлен тем, что приме­
нение антибиотиков в медицинской практике способствует
появлению значительного числа устойчивых с ним форм микро­
организмов.
Регуляции анти('щотикоп[Ю&\кции
Синтез антибиотиков регулируется условиями ферментаций
микроорганизмов, качественным и количественным составом
субстрата, т е. субстратное регулирование
При замене мгаоусаоомого субстрата глюкозы на более мед­
ленно расщепляемые источники углерода (крахмал, лактоза)
быстрее наступает идиофаза роста культуры и усиливается про­
дукция антибиотиков. Нежелательно применение в качестве
источника азота солей аммония, лучше внести в культуральную
среду белковые соединения (соевая мука и др.). Неорганический
фосфат, ингибируя активность фосфатаз, участвующих в биосин­
тезе антибиотиков стрептомнцетами также ингибирует ндиофазу
Усилить синтез антибиотиков можно внося в культуральную
среду метаболиты - предшественники для бензилпенициллина -
фенилуксусная кислота, макролидных антибиотиков - пропио-
новая кислота и пропиловый спирт, пептидного антибиотика
грамицидина S - L фенилаланин. Эго направленный биосинтез
антибиотиков.
190______ Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Регуляция продукции антибиотиков осущ ествляется по


механизму обратной связи, когда избыток антибиотиков подавляет
активность начального фермента пути биосинтеза, либо инги­
бируются все ферменты этого пути.
Так, сверхконцентрация канамицина подавляет синтез аце-
тилтрансферазы, хлорамфеникол - ариламинсинтетазы. Ингибиро­
вание синтаз антибиотиков известно также для путей биосинтеза
бацитрацина, грамицидина S, эритромицина, тилозина, тетра­
циклина.
В случае сверхпродуцентов механизм ретроингибирования
ослаблен, так как сверхпродукция антибиотиков наступает в
идиофазе, когда рост культуры уже завершается. Кроме того,
антибиотические вещества быстро выводятся из клеток, не
создавая высокую концентрацию внутри клеток продуцента.
Изучаются молекулярные механизмы регуляции биосинтеза
антибиотиков азотсодержащими, углеводными и фосфорными
компонентами среды; исследуются корреляции между биоэнерге­
тическими параметрами клеток и биосинтезом антибиотиков,
связанные не только с содержанием аденилатов и различных фрак­
ций полифосфатов, но и с учётом активности альтернативных
электронно-транспортны х цепей в мембранах продуцентов;
оценивается роль биорегуляторов первичного метаболизма типа
высокофосфорилированных нуклеотидов, от которых зависит
продукция антибиотика.
Технология синтеза антибиотиков
В промышленности применяются следующие способы произ­
водства антибиотиков: микробиологический синтез (полимиксин,
грамицидин), химический синтез (левомицетин), комбинирован­
ный (полусинтетические пенициллины и цефалоспорины).
Микробиологический синтез начинается с подготовки среды
культивирования. Субстрат должен давать хороший рост микро­
организма, должен быть дешёвым и доступным. Среда стери­
лизуется предварительно в биореакторе влажным паром под
давлением.
Одновременно идёт подготовка посевного материала, чистая
культура штамма-продуцента наращивается последовательно в
t . i . Антийиотичи

колбах, лабораторных и опытно*иромышлеыных ферментерах


( 1л —♦ Юл —» 1Ш)л и более).
Следующий этап эта аэробом, глубинная, гтериодичее кая фер­
ментация в тсчмнмг 7*10 суток. В процессе ферментами»» поддер­
живается температура, pH. рО.. происходи! постоянное иеремt-
шивание культуральной среды, н с м а и у м т а химические и
механические способы пеноташения
Нередко испольэустся ааухфамша культивирование. вначале
происходит быстрое накопление биомассы на более лктум ю м и
дешевом субстрат*, ■ ватам вносятся предшественники,
усиливающие продукт ивносп. пита тельной срезы. иидуиируюшис
синтет ферментов вторичного м п й в м м а в я д я о ф а к .
Предшественники .добавляются в конце нсспоненниальнои фаты,
в период роста культуры Ьввсяятет антибиотиков возрастает в
фате тамедленного роста (конец трофофаты) и ааетшвет макси -
мума а стационарной фате, ндаофеы (рис 52)

1 о

Рис. 52, Ои Дммнстя ф я т и — « » ярчяяст при тхчучеи*т яия!и»яяя»


I - трофофатя; II яввфяв. I (ммакя. 2 ямяймяяв. 1 умяааем.
4 - «С!о ЯИ1 «яги

Затем проводится обработка фермеетввеояию* биомассы


I фильтрация, если антибиотики а культуральной жидкости, если
антибиотики в клетках, то осаждение антибиотиков а стгваея
вместе с клетками, потом их выделение иэ клеток.
192 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов —биотехнологическая продукция

В процессе выделения и очистки антибиотиков используются


методы экстракции, ионообменной сорбции, осаждения и т.д.
Экстракция заключается в многократном переводе антибиотика
из одного растворителя в другой с предварительным осаждением
(кристаллизацией) - это перекристаллизация.
Ионообменная сорбция основана на том, что антибиотики как
отрицательно заряженные ионы осаждаются на катионной смоле
и, наоборот; адсорбированный на смоле антибиотик элюируется
растворителем.
При осаждение антибиотик соединяется либо с органическими,
либо неорганическими веществами, выпадающими в осадок. Затем
начинается процесс экстракции.
Выделенный в гомогенном состоянии антибиотик высуши­
вается при помощи распылительной или лиофильной сушки,
стабилизируется с целью сохранения биологической активности,
придаётся лекарственная форма.
Проводится биологический (стерильность) и фармакологи­
ческий (токсичность, пирогенность и др.), контроль готового
препарата.
Применение антибиотиков
Антибиотики применяются в медицине и ветеринарии, пищевой
и консервной промышленности, сельском хозяйстве.
Ещё в 1885 г. румынский учёный В. Бабеш, изучая явление
антагонизма в берлинской лаборатории Р. Вирхова писал: «...
экспериментально изучил способ, при помощи которого бактерии
одного известного вида производят химические вещества или
изменяют окружающую среду таким образом, что наносят ущерб
бактериям другого вида. Если бы было начато изучение антаго­
низма между бактериями, то мы пришли бы к выводу, что заболе­
вания, вызываемые какой-то бактерией, нужно лечить при помощи
другой бактерии. Подобное взаимодействие между бактериями
может привести к новым идеям в терапевтике».
В медицинской практике антибиотики широко использовались
при лечении контагиозных инфекций (холера, чума, дизентерия,
туберкулёз и т.д.) и всевозможных инфекций, обусловленных
условно-патогенными микроорганизмами (золотистый стафи-
7.2, А и м А и м м - вм* * Ф ШОк IV1

лококк, кандида, г е ш м т и ч ю ш ! стрептококк, м п и н с п т м н ы с


эитеробактерии - протей. цитробакгер. клебснелла и др )
Есть антибиотики, пб т и н н м г у т м а о и у м л и ми « i r m m i
(блеомицин), иммуносунрессорным шик доспорим)
В пищевой и консервной промышляйтети а с я м ы ^ п н мгми
(Str Iactis) с целью консервирования пищевых продуктов
Н им и кроме обычных аминокислот, содержит л изим. гисти­
дин, премии, метионин, и млеицин. а также редко агтр*ввввшввсв
серосодержащие а лаю ионии и |i метиддаиттмиш Налвжяагт
рост стрептококка, стафилококка, бацилл Добаалеив е его в
консервированным продуктам во «во диет св я amтк температур* а
продол ж втвльиость стерилизации и тем самым сохранить ид
вкусовые н питательные качества
В животноводстве как кормовая добавка, стимуле гор роста
применяются более 2d антибиотиков, в т м числе биомицин и
террамнцнн (мицелиальные трибы); |рн »ав. фчавомицин.
монен чин, тилозмн (стрентомицеты» Наполнителем кормовой
добавки чаше всего исполыуется соевая мука
Для мициты растений от фитонатотенов нитолыукп рамвчимг
антибиотики:
-■ трнхоцегнн Н1 триба Ггн hoiecium я т и , против корневой
гнили пшеницы и ячменя; против фу*ариоta. ви н а хлопчатника,
а теплицах против мучнистой росы вгурив
фитобак териомицнн, Str luvandula для обработки семян
фасоли, сои, пшеницы с целью профилактики бактервовоа.
корневой гнили
- властицидии S, S$r grtseochnmogenes-, лечение грибковой
болетин риса
П еииниллвиы
В сентябре 1<Ш года А Флеминг так описывает свои наблю­
дения, связанные с открытием впвнвмяиив « ... весомвемио. что
каждый бактериолог имал в своей лаборатории кудатуры, с р а ­
жённые плесенью н причинявшие ему неприятности Обычно
такие культуры выбрасываются в коробку с испорченными
препаратами. Многие из них выбросил в к. ив в один прекрасный
момент я зам ета на некоторых пластинкак. что вокруг плесневой
Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

колонии появился участок, очищенный от стафилококковых


колоний. Таким образом, мне повезло, поскольку, учитывая мои
старые занятия, направленные на поиск веществ, подавляющих
бактерии, я смог заметить это явление и, заинтересовавшись,
проследить противобактериальное вещество, производившееся
этой плесенью». В следующем (1929 г.) в 10-м томе «Британского
журнала экспериментальной патологии» учёный опубликовал
результаты своих исследований, возвестивших миру об открытии
антибиотиков.
Пенициллин - вторичный метаболит мицелиальных грибов
P. поtaturn (открытый А. Флемингом), P. chrysogenum. P. crustosum
и др. Н азвание антибиотика было дано первооткры вателем.
В стабильной, кристаллической форме препарат был получен в
1940 г. Х.У. Флори и Э.Б. Чейном.
В настоящее время продемонстрирован синтез пенициллина
N, цефалоспорина С и различных цефамицинов некоторыми
актиномнцетами. Кроме того, способность образовывать цефало-
спориноподобные антибиотики установлена для различных видов
грамотрицательных почвенных бактерий.
Биосинтез пенициллина начинается с образования из амино­
кислот - предшественников (L - аминоадипиновой кислоты, L -
цистеина и L - валина) LLD - трипептида. О лигомеризация
происходит по тиоматричному механизму с участием ферментов-
синтаз.
На последую щ ем этапе LLD - трипептид зам ы кается в
беталактам ное кольцо, затем ф ормируется тиазолидиновое
кольцо. Процесс циклизации катализируется ферментом изопе­
нициллин - N - синтазой. Это последний общий промежуточный
продукт путей биосинтеза пенициллина и цефалоспорина S. Далее
у грибов изопенициллин N превращается в пенициллин G, у
актиномицетов - в пенициллин N. При синтезе пенициллина G
или бензилпенициллина участвует фенилуксусная кислота,
приводящая к отщеплению аминоадипиновой кислоты (рис. 53).
Метаболический путь синтеза пенициллина начинается с пред­
шественника - б-кетоадипиновой кислоты общего и для первич­
ного метаболита - лизина. Повышение в среде культивирования
лизина ингибирует активность начального фермента - гомоцит-
7.2. ЛштщЛштты

ратсинтазы, с о о т и т м и м в снижаем я продукция ашибмотика


(механизм регроингнбированн* > Д о в а м т м • кулы уральную
среду 6 - аминоадипинокой кисло!ы, наоборсн, стимулирует
синтез м м ш ш ш м .

лиши
И нарм ^ю тм няим м м

Рис. S3. ( леча <ттпгт m rm m и w w w <я“иа Р f*rv«ugrw i

Производственный штамм Р. сЬпнФцетыт. полученный в


результате 21 цикла мутагенеза и селекции ирололж—д е й ся
почти 2 десятка лет, продуцирует в « е к м м сотен раз больше
пенициллина, нежели исходный природный штамм
В качестве субстрата используется кукуру »ный эгс ту гт
2 «JV лактоза 1.5%, крахмал, сульфат аммония и фофасфаты -
0.5-1%. фенилоксиуксусная кислота 0.?-0.6%. I w t n t i пророс­
шими спорами плесневого гриба; глубинная, периодическая
ферментация при 23-26'С , pH 5,0-7,5 в течение 4 суток. По
завершение ферментации загустевшую культуральную жидкость
пропускают через фильтр, отделяя клетки, ш л к я я й гриба от
196 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

жидкости, содержащей пенициллин. Из фильтрата белок удаляют


солями алюминия, железа, или коагулируют при 65-70°С.
Пенициллин экстрагируется органическими растворителями
(бутилацетат, амилацетат) при pH 1,9-2,0. Растворитель уносит с
собой воду и образуется кристаллическая суспензия антибиотика.
Кристаллы вновь растворяют в воде при помощи раствора
бикарбоната натрия. Затем снова экстрагируют органическим
растворителем. Выход кристаллического пенициллина 86-90%
(потери 10-14%).
Если эту кристаллическую соль пенициллина G поместить в
бульон и внести фермент ацилазу, либо секретирующие их бак­
терии, то ацилаза избирательно удаляет из молекулы бензильную
группу, превращая пенициллин G в 6 - аминопенициллановую
кислоту (6 - АПК). Она слаба антибактериально, но к ней можно
химическим путём присоединить боковые группы и получить
полусинтетические пенициллины (рис. 54,55).

Боковая цепь 6-аминопенициллановая кислота


I
I
I
1 / \ СН
R - СО — INH —СН — СН \ —
l i i w
I I ^С Н ,
ОС - N ■СН----- СООН

(З-лактамное Тиазалидиновсе
КОЛЬЦО кольцо

осн, оII
-С“ ( ^ V ch - c -
I
NH.

^ ^ о с н , А сн.
о
Метицнллин Оксациллин Ампициллин

Рис. 54. Схема синтеза полисинтетических антибиотиков.


Удаляя боковую цепь - бензилпенициллина (а) и вместо неё присоединяя другие
боковые группы можно получить соответствующие полусинтетические
пенициллины (б): метицнллин, оксациллин, ампициллин.
t.J. Антибиотики

Кристалл и чес кий порошок пенициллина белого цвета, хорошо


растворим • воде, применяете* • виде Na, К. C l солей. Порошок
сохраняет активность при комнатной температуре • течение трёх
лет, ■ растворе не стойкий.
Пенициллин практически не токсичен Соотношение тераиев
гнческой/токсически* л т для табораторных животных 1:80000
Применяете* при инфекциях, обусловленных трам положи тель­
ными бактериями, вводится внутримышечно внутривенно Иней да
возможны аллергические реакции
В 60-70-е годы усилия по улучшению беталактамиыч анти­
биотиков были направлены иа добавление в беталактамному
кольцу новых боковых групп I к м усни гг ти чески# способ основан
ка том, что в беи и л пенициллине няи цефал <*сгторине, полученных
микробиологическим сиитеюм при помани химического синтеза
одна боковая цепь меняется на другую.
В цефалоспоринах могут изменяться нм боковые цепи 1аесь
в качестве исходной структуры гчя модификации {по ана-тогин с
пенициллином) используется асфалосиприи С.
На основе 6 АПК идёт химический синтез я е м м в я я и и м -
устойчивого метнциддииа. кислотоустойч и вою и широкое пек-
тральното ампициллина, кислого- и пеннцил-тиназоустойчивого
оксациллина и других пол усиитетичех ких пеннииллинов Сама
б - АПК обладает слабым антибакгериальиым действием
По.чл'чение ампииииина: бензилпенициллин гидрояитуввт
ацилазой мутя итого штамма Kluvvera irmphih при pH 7 -1,0 и
40-50*С. Затем в ферментер вносится другой микроорганизм -
мутант Pseudomonas melanogenum и фенилтлнция Условия
ф ерментации изменяю т (pH 5,в-?.5). чтобы вин ля за f i
metamngm um осуществила ацелирование аминогруппы Ь АПК
с получением ампициллина.
Ампициллин действует иа грамотрицательные и греетояожи
тельные бактерии, больш е иа гра мотри цате л ьн ые и потгому
показан при кишечных инфекциях в отличие от пенициллина
можно применять перорально
198 Глава 7. М етаболиты микроорганизм ов - биотехнологическая продукция

NH2 S СН3 S СНз


| / V / ашшюа /
R - СН - СООН + N H -C H -C H С -С Н 3 —► R - СН - СО - NH - СН С - СН2
I I I 1 I
C O -N СН N - СН
I I
СООН СООН
фенилглнцин 6 - АПК ампициллин

Рис. 55. Схема синтеза ампициллина.

7.3. Витамины

Витамины - это низкомолекулярные органические соединения,


присутствующие в клетке в малых количествах и обладающие
биологической активностью.
Биологическая активность витаминов определяется тем, что
они входят в состав активных центров ферментов в качестве
кофакторов. Поэтому недостаток витаминов понижает биокатали-
тическую активность ферментов, влияет на обменные процессы,
рост и развитие организма.
Термин «витамин» впервые ввел Функ, для обозначения
веществ, обладающих каталитической способностью.
Существует буквенная классификация витаминов: В —тиамин,
В., - рибофлавин, В - пантотеновая кислота, В^— никотиновая
кислота, В - пиридоксин, В9 - фолиевая кислота, В -кобаламин,
Н - биотин, С - аскорбиновая кислота, А - ретинол, Д - кальци­
ферол, Е — токаферол, К - нафтохиноа
Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые
(табл. 8). Все водорастворимые и жирорастворимый витамин К
являются коферментами биохимических реакций. Витамины А, Д
и Е участвуют в регуляции генетического аппарата клетки.
Биосинтез витаминов в естественных условиях осуществляют
растения и микроорганизмы. При обработке растительной пищи
нередко наблюдается потеря витаминов. Так при получении муки
высшего сорта теряется 80-90% витаминов.
П отребность взрослого организма в зависимости от вида
витамина составляет от нескольких мкг до десятков мг в сутки.
Водорастворимые витамины в организме не накапливаются, кроме
Т аб л и ц а 8 . Классификация вж ам инов
byiKH
f Ьу. Ап
Химические Лечебный эффект
мне
ШИ ови-
■ю ик
шаченне
BotiofMKi
I тт 4«ф «
j (II1Ф). штщ/Лтшт
■а , пм и ипуяф к-
] фаг(ТТФ)
Вз рибофмаии ФМН, ФАЛ
В. ■ипм ии I КоА - V I мфавф*- «тиирм ттш А
■кит I Kl>А ^ ф и ф ш м ;
I ЯШ
В,(РР) мишмм НАЛ иНАДФ
в» иирндокснн м рим ш ф яф я, м им рм птнв
' п и ри док сам нниф» *
‘♦ «
■мвмамям Iш м И и м а чняй
;й м м я и м и м -
вшшммв
K te f f lm m i ' аск о р б и н о в а я и л г регулл о р мегаболи
■ см п ] гчфвасаарвшмааа
I ясанм

у ц —1)1 | ретинол реI ни атициф тим -

кальциферол ГПф**1
ям ф ам

филлоХИНОЙ ш тягм ирралткавй

B (J, п оэто м у н ео б х о д и м о их еж едневное посту п л ен и е Ж иро­


растворим ы е витамины накалливаю тся в тканях п т о индукторы
си н теза бел ко в, структурны е ком поненты клеточны х мембран,
проявляю т антиоксидантны е свойства).
В итамины А. Е, К и бета-каротин устойчивы к высокой тем­
пературе, по чувствительны к свету, кислороду воздуха.
Гспамлм м п э г т —-а —ио>
В 1930-40 п и м в качестве витаминных препаратов ис— зо
вали пекарские зрожжи. солерясащне в составе клеток эргостерин.
200 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

О блучая биом ассу дрож ж ей ультраф иолетовы м и лучами из


эргостерина получали витамин Д - эргокальциферол. Витамин С
получали путем трансф орм ации сорбита в сорбозу уксусно­
кислыми бактериями.
Существуют следующие технологии получения витаминов:
- Экстракция витаминных препаратов из растительного и
ж ивотного сырья (В - и з сырой печени КРС, каротин - из
моркови);
- Химический синтез - основной путь производства витаминов;
- М икробиологический синтез витаминов, чаще получают
кормовые концентраты витаминов (В,, В р);
- Сочетание химического и микробиологического синтеза
(витамины С и В ).
Витамины применяют в качестве лечебных препаратов:
В( - антиневротический, В - витамин роста, Bfi - антидермати-
ческий, В]2 - антианемический, С - иммуностимулирующий,
А - антисклерофтальмический, Д - антирахитический, Е - анти-
оксидантный, К - антигеморрагический; применяют как кормовой
концентрат для сбалансированного питания и улучшения роста
сельскохозяйственных животных, птиц (В , В ), как пищевые
добавки (Д), как консерванты (С).
Витамин В (цианокобаламин)
Витамин впервые описан в 1948 году, представляет собой
биологически активное соединение, включающее трехвалентный
кобальт, аминные и цианистые группы. Структура витамина В
состоит из корридного кольца, нуклеотидного ядра и амннопро-
панолового мостика.
Витамин В участвует в регуляции углеводного и липидного
обмена, в процессах синтеза аминокислот, пуриновых и пири­
мидиновых оснований; особо значима роль В в стимуляции
образования предшественника гемоглобина в костном мозге, в
созревании эритроцитов.
Природными источниками витамина В ]2 являю тся только
м икроводоросли; его синтез представляет собой достаточно
сложный метаболический путь:
сукцщшл КоА
ттштшщг Мрфвй#1
АШЬсншшшш кнелша(АЛК) яшштт
уронорфиро! СИ
(Упг) Св&кмлмил ■ Im m h (1 J
5.0 д м ь

Рис. М. Си м а м м м а мпгаммна В

В качестве биопродуцентов исполы укнея одноклеточные


микроор! ани1мы, актиномицоы, мманобразуюишс, фотосин­
тезирующие бактерии, в том числе более 10 видов иропио
новокислых бак Iерий (Propionibacterium яквгтали, P.freunden
reichii и др. V, ftn Jo m n w » drmttnfrmmi, М к и м м м р н г* purpurae
Nacmrdia гицом . Eubaciermm hmotwm Сех ш и инр » 111 штамм
Propionibacterium an, способный к т в м о пыле и т ь В п клетки
в отличие от вышеприведенных продуцентов, накапливающих
витамин внутри ш и п я
Технология получения кристалл ической формы В следующая
Глубинная, периодическая фермент— в продуцента Р akerman it
в анаэробных условиях на субстрате, содержащем кукурузный
экстракт; глюкозу, соли ю в м ь п и сульфат аммония Чере* 3 «ума
культивирования в культуральную среду вносят 5.*-я«метия-
бензимндазол (5,6 ДМБ) Последующая ферментация в присут­
ствии прсдшесtвенника продолжается еще 12 часа до достижения
концентрации витамина не менее 250 м п Т Выделение накопив­
шегося в клетках В(1 осуществляется путем сепарации и экстрак­
ции водой при 1S T , pH 4,5 5,0 Hi экстрагента осаждаются белки,
жидкость пропускают через иеиообммняые к м м м п ( орбирнтай­
ный на колонках В(, элюируется ацетоном и затем крист ал л и
туггея, нзготавли ваются лекарственные формы витамина
При производстве витамина В , в качестве кормового концен­
трата используется консорциум термофильных мвяроорг ш м в я.
осуществляющих метановое брожение В их числе целлюлозо­
разлагающие, углеводсбражнвающие, аммонифицирующие,
сульфитвосстанавливающие и мстанобратующис бактерии
В течение первых 10-12 дней размножаются углеводсбра-
ж ивающие и аммонифицирующие бактерии, о м превращают
органические кислоты в жирные кислоты и аммиак (pH 5,0-7,0)
202 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Во второй стадии ферментации среду подщ елачиваю т до pH 8,5,


п остеп ен н о н ачи н ает п р ео б л ад ать б и о м асса м етанобразую щ их
бактерий, расщ епляю щ их жирные кислоты и аммиак до метана и
диоксида углерода. М етанобразую щ ие микроорганизмы являются
основны ми продуцентами витамина В р , вы ращ ивание их проис­
ходит в анаэробных условиях. Субстратная среда оптимизируется
добавлением солей кобальта и низш их ж ирны х кислот, низш их
сп иртов. П ери од и ч ески о тб и р ается ч асть ку л ьту р альн о й ж и д ­
кости, она упаривается в вакууме, высушивается распылительной
суш кой, см еш и вается с н ап о л н и телем , влаж н ость кон ц ен трата
10-15% (рис. 56, табл. 9).
Таблица 9. Характеристики микробиологических процессов
получения витамина В 12
Выход
Основные компоненты
Микроорганизм витамина Примечание
среды
В12мг/л
свекольная меласса,
аэробный процесс
Bacillus фосфат аммония,
0,45 продолжительностью
megaterium соли кобальта,
18 ч.
неорганические соли
кукурузный настой,
Propionibacte- кобальтовое аэробная (3 сут.) и
rium freuden- производное глюкозы; 19 анаэробная (3 сут.)
reichii pH поддерживают около стадии
7,0 добавлением NH4 ОН
кукурузный настой, непрерывный
Propionibacle- кобальтовое двухстадийный
riumfreuden- производное глюкозы; 8 процесс
reichii pH поддерживают около продолжительностью
7,0 добавлением NH4 ОН 33 ч.
кукурузный настой,
периодический
кобальтовое
Propionibacle- процесс
производное глюкозы; 23
rium shermanii продолжительностью
pH поддерживают около
7 сут.
7,0 добавлением NH4 ОН
глюкоза, соевая мука,
растворимые отходы продолжительность
Streptomyces
спиртового 3,3 ферментации с
oliyaceus
производства, аэрацией 6 сут.
неорг анические соли
I продолжительность
Streptomyces соевая мука, глюкоза,
5,7 ферм с т ации с
кобальтовая соль
1_____J L _____ аэрацией 6 сут.
7. J Пита мини т

Витамин В . (рштф ш*ы*>


Входит ■ состав ферментов, участвующих в клеточном дыха­
нии, синтезе белков и липидов, регуляции состояния нервной
системы, функции печени; при его недостатке ц м ц м г т и рост
нарушается белковый обмен Витамин входит в состав м т и м м х
групп окисли гельво-восс тановительных ферментов ф чавинмо-
нопуклеотида (ФМН) и флавинадениидинуклеотида (ФАЛ)
Рибофлавин синте ж рунн высшие рас гения, дрожжи мице­
лиальные грибы и бактерии H i I тонны мирком можно получить
1г В)( и» I то н н у пенсии 6r, i при ку тьтнвировании пронт*
•о дет венных штаммов Fп mot ha шт mhfryu и л и 4 i K h e gm *ipn
в I тонне питательной среды накапливается 25 кг bhi амина Также
в кач естве продуцентов использую тся мутан гные ш таммы
В suhlilis и Asp niger
Н . хорошо рве творим в воде, устойчив при м а м и pH, но
нестабилен в нейтральной и щ елочной средах, а такж е при
действии УФЛ.
Технологический процесс получения В включат * а эробную
ферментацию» термоли» и концентрирование, сушку и грану­
лирование
Ферментация осуществляется в ферментерах н а я о ш *©-НЮ м
при 2l-J0*C, а стерильных условиях, при постоянной а «рации
В качестве субстрата ие пользуется соевая мука, ме пасса, молоч­
ная сыворотка, рыбная и кукуручная мука, катеин, технический
жир, карбонат кальция, однотамешен ны й фосфат калия Как
стимуляторы роста вноевтев биотин, тиамин, и нопо
П родолж ительность ферментации 60-80 часов, до начала
литнеа мицелия, до образования спор гриба; концентрация
рибофлавина достигает 1200 мг'а.
По окончании ферментации культуральная жидкость вместе с
мицелием помещается а вакуум-выпар ные аппараты При К0 4
происходит термоли тис клеточных структур и о дю арем гняо
упаривание, концентрирование Затем сиропообразная масса
подвергается распылительной сушке до остаточной влажности
8%. Высушенная масса грану тируется совместно с наполнителем
(15 мг В. на !г концентрата) и испольтуется как кормовая добавка
Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

В итам ин В2 прим еняем ы й в м едицинских целях подвергается


дальнейш ей очистке и кристаллизации. Витамин В получаю т
также химическим синтезом.
Витамин А (ретинол)
Ретинол - это циклический, непредельный, одноатомный спирт.
Образуется в кишечнике и печени из провитаминов (альфа-, бета-
и гамма-каротины) под действием фермента каротиндиоксигеназы
до альдегидной ф ормы ретинола - ретиналя (альф а- и гамма-
каротины расщ еп ляю тся с образован ием 1 м олекулы , а бета-
каротин - 2 молекул ретиналя). Далее фермент алкогольдегидро-
геназа переводит ретиналь в ретинол.
Каротиноиды - пигменты, их много в высших растениях, водо­
р о с л я х , в к л е тк а х н е к о то р ы х м и к р о о р г а н и зм о в ; ж и во тн ы е
организмы их не синтезируют.
Бета - каротина много содержится в моркови, тыкве, облепихе,
лю церне, салате, черной смородине, чернике, крыжовнике, пер­
сиках, абрикосах и др.
С реди м и к р о о р ган и зм о в б ета-к ар о ти н си н тези рую т ф ото-
троф ы , акти н о м и ц еты , плесн евы е грибы , д рож ж и . О сновной
продуцент Blakeslea trispora (+) и (-) штаммы.
К прим еру, 1г моркови содерж ит 60 мкг бетакаротина; при
культивировании В.trispora 1г биомассы содерж ит 3-8 тыс. мкг
провитамина.
П р о м ы ш л е н н о е п р о и зв о д с т в о р е т и н о л а о с у щ е ст в л я ет с я
микробиологическим и химическим синтезами.
М и к р о б и о л о ги ч е с к и й с и н те з о сн о в ан на и с п о л ь зо в ан и и
В.trispora, в качестве субстрата применяется пшеничная или рисо­
вая мука, растительное масло (хлопковое, кукурузное или под­
с о л н е ч н о е ). В н о с я тс я с т и м у л я т о р ы с и н т е за б е т а -к а р о т и н а
В-ионон или цитрусовая меласса, а также тиамин. Свет усиливает
выход этого пигмента.
Раздельно готовится посевной материал из (+) и (-) штаммов
В.trispora, их смешивают в биореакторе, непосредственно перед
ферментацией. Соотношение (+) и (-) штаммов 1/15, т.е. мужской
формы (-) пятнадцатикратный избыток. При слиянии разнополого,
1.4 llu шеихаршУы

женского и мужского (•) мицелия обра*уется w io ra . и ю р и


синтезирует в 5*17 р п больше бетв-карогииа. чем каждый штамм
в о т д е л ь н о с т и . Ф е р м е м п ц м со п р о в о ж лает с я аэр ац и ей и
перем еш иванием . Н акопление б ета-каротин а « а б r a i i r r t i м
второй фате развития, после прекращения роста мицелия В к\ ть-
гуральной среде уменьшается кон цен грация липидов вследствие
их активной переработки и бета-каротин Концентрация послед­
него достигает 2000 mi л.
По окончании ферментации биомасса сепарируется, подвер­
гается распылительной сушке до 7% остаточноА влаги Далее а
зав и си м о с т и от н а зн а ч е н и я . цели пр и м ен ен и я гсхноло! ии
различаются:
- П осле суш ки порош ок см еш и вается с н ап олн ителем и
гранулируется, применяется в качества кормового концентрата.
■ Э кстрагируете в м аслом , во ивен три руетса, промы вается
этанолом, получают каротин в масле ( м д м а и ч в м или другое)
С содержанием 2,0-2.5 i кг ирови >амина, применяют и в пншевум»
добавку к хлебу, маслу,
- Кристаллический бета-каротин * экстра! ируют фреоном,
оч и щ аю т от о р га н и ч е с к и х п ри м есей , получаю т кри стал л ы
оранжево-красного цаета, применяю! а медицинских агава
Витамин О (кальциферол)
Различаю т два родственны х соединения ж ирораетворимого
витам ина D D: и О». Dj *ргак алкай фера л (валаииф ерол --
«несущ ий кальц ий») подучаю т путем иблучеиия тргастерни а
ультрафиолетовыми лучами
П, хо лекал ьпмферол образуется *1 7 -лег и дрохолес герина
Липофильность витамина D определяется структурой ут геродных
циклов (А,В,С, D) В орг аиитме человека и а и а отных кальциферол
регулирует усвоение кальция и фосфора из пиши и отложение их
в костной ткани
И сточником эргостерииа (зргоста - 5,7, 23-трава ■ 3 {У-ол)
являются микронодоросли, плесневые грибы, но особенно богаты
ими дрож ж и (табл. 10). П оэтому при получении витамина D5
вначале микробиологическим синтезом накапливаете я биомасса
206 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Таблица 10. Содержание эргостерина у микроорганизмов

Количество эргостерина, %
Микроорганизмы
(на сухое вещество)

Saccharomyces carlbergensis 0,49-4,3


Saccharomyces ellipsoides 1,2-1,5
Rhodotorula glutinis 0,7-0,9
Candida utilis 0,4-0,6
Candida tropicalis 0,2-0,3
Aspergilus niger 1,2-1,4
Penicillium westlingii 2,2

дрожжей. Затем при обработке дрожжевой суспензии или


высушенных дрожжей УФЛ происходит фотохимическое
превращение эргостерина в эргокальциферол (рис. 57).

Рис. 57. Фотохимическое превращение предшественника


витамина Д в эргокальциферол

В качестве продуцентов эргостерина используются Saccharo­


myces carlsbergensis, S.cerevisiae,S.ellipsoides и другие микро­
организмы. Эргостерин продуцируется и в клетках бактерий, но
в очень низких концентрациях.
1.4 Полис алириоы

П р едш ествен н и к »ргостерина - c i m m l С и т е » c h w h •


клетках дрож ж ей повыш ается но мере старамма культуры и про­
долж ается в стационарной фазе роста.
Ф ерм ентация дрожжей осущест алеется в условиях а ф а ими и
при избы тке источников углевода по отнош ению к источникам
м о т е . П олученную биом ассу г м у п и и у т р а е п ц и н соляной
ки слоты , татем о ч и щ а ю i спиртом , концентрирую т и облучают
У Ф Л а д ли н о й волны 2 8 0 - НЮ им >то излучение aesA y ejaaai
отдельные химические саачи а ут леродных циклах А и В ш я ш м
превращ ение »piостерина а витамин 1)
Д ля получения м асляной ф орм ы витам ин после ф ильтрации
растворяю т а р асти тел ьн о м м асле и использую т как пиш евую
добавку.
При получении крнсувеличаткою витамина проводиic* и м я *
ни тельная очистка.

7.4. Полисахариды

П олисахариды или i ликаны являются полимерами построен


ны м и не м ен ее чем и > II м он оевхари д и ы х ед и н и ц (круп н ы е
молекулы полисах арилов оостп ат из нескольких с т е н тысяч моно
меров) Гомополисахари.ты состоят тл одного типа моносахаров,
гетерополисахариды включают разные сахара
П олисахариды п о обязательны й структурны й и ф ункц ио­
нальны й ком понент клеток м икробного, ж ивотного и особенно
расти тельн ого происхож дения П олисахариды а составе клетки
самостоятельны либо а соединении с белками, лирами, нуклеино­
выми кислотами, фосфатами
Р а зл и ч а ю т в н у т р и к л е т о ч н ы е и в н е к л е т о ч н ы е м и к р о б н ы е
полисахариды
В цитоплазме микроор! анизмов содержится 20-50% полисаха­
ридов от сухой массы клетки, особенно г тюканы (типа гликогена),
а также крахмал, маннаны. леваиы. ксиланы и арабаны
В м ем бранны х структурах углеводы представлены гликолн-
пядами и гликопротеинами, в количестве от 5 до 20% а зависи­
мости от вила микроорганизмов А клеточные стенки дрожжей а
мицелиальных грибов содерж ат 80-90% полисахаридов, в основ­
ном зто хитин, целлюлоза (г тюканы), маннаны
208 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

В н ек л ет о ч н ы е п о л и с а х а р и д ы с и н те зи р у ю т с я из гек со з
(глюкоза, галактоза, манноза, рамноза), пентоз (арабиноза, ксилоза,
рибоза), уроновых кислот (галактуроновая, глюкуроновая). К ним
относятся декстраны, леваны и др.
Биосинтез полисахаридов осущ ествляется путем полим ери­
зации м оносахаров гликозилтрансф еразам и. М икробны е поли­
сахариды могут быть нейтральными, катионными или анионными
полимерами, в зависимости от содержания в боковых цепях ацетат­
ных, пируватсукцинатны х, липидны х и других групп. Больш ая
часть микробных экзополисахаридов — гетерополимеры, состоя­
щие из нейтральных сахаров и уроновых кислот.
Некоторые полисахариды, продуцируемые бактериями, дрож ­
жами или мицелиальными грибами нашли применение в пищевой
п р о м ы ш л ен н о с ти , м ед и ц и н е и ф а р м а ц е в ти к е , н еф т егазо в о й
отрасли, косметологии, гидрометаллургии (табл. 11).
Декстраны
Д екстр ан ы - это вн ек лето ч н ы е кап сульн ы е полисахариды
м икроорган изм ов, гом ополисахариды , ней тральны е глю каны ,
высокомолекулярные, разветвленные полимеры, содержащие 50-
200 тыс. остатков глюкозы; синтезируются из мономеров глюкозы
при участии фермента декстрансахаразы .
декстрансахараза
Сахароза —> Глюкоза + Фруктоза , Г л ю к о за ------------------ Декстран.

О сновны е продуценты полисахарида бактерии рода Leuco-


nostoc, реже Streptococcus. Aerobacter, Klebsiella.
Д екстран - первый м икробны й полисахарид, которы й был
получен в п р о м ы ш л ен н ы х усло ви ях , в том ч и сл е сеф ад ек с,
производимый с 1960 года в Швеции. Сефадекс получен на основе
сшитых поперечными связями, нерастворимых полимеров декст-
рана, широко используется в гель-фильтрационной технологии.
Для осуществления микробиологического синтеза в качестве
источника углерода используется субстрат (чаще меласса), содер­
жащий 10-20% сахарозы, дрожжевой экстракт (источник органи­
ческого азота), неорганический фосфат, соли магния (способст­
вуют продукции декстрана). Глубинная, периодическая фермеи-
t.4> ffajut ихириаы

Таблица I I . Микробмыс ш ипи м ц и ш К «А применение

Продуцент
Декстран ^ П а г м м н Jexm m "jf-tjm

HUN. W tU X M M
210 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

тация в течение 24-32 часов. По окончании ф ерментации куль­


туральную ж идкость отделяю т от клеточной массы, подвергают
кислотному гидролизу для получения молекул декстрана в 40-60
тыс. м оном ерны х единиц (им енно такой м олекулярной массы
полисахарид востребован в м едицине, ф армацевтике, препара­
тивной химии). Затем полисахарид осаж даю т (этанол, метанол,
ацетат), отделяю т, обезвоживаю т, высушивают.
П оскольку ф ермент декстрансахараза вы деляется в среду, и
синтез полимера осуществляется вне клетки, декстран получают
и ф ерм ентативны м способом . Для этого культивирую т м икро­
организмы в условиях, обеспечивающих наибольшую продукцию
декстрансахаразы. О тделяю т культуральную жидкость, фермент
очищают частично и стабилизируют при pH 5,0-5,2 и температуре
-15°С; биологическая активность декстрансахаразы сохраняется
в течение 1 месяца. Затем в среду, содержащую сахарозу вносится
ф ерм ен т; б и о си н тез п о л и сах ар и д а осу щ ествл яется в течен и е
8 ч асо в . Ф е р м е н та ти в н ы й сп о со б б о л ее р е гу л и р у ем , чтобы
получать декстран необходимой молекулярной массы, что значи­
тельно упрощ ает и удеш евляет последую щ ие технологические
стадии.
Ксантаны
К сан тан ы - это в ы со к о п о л и м е р н ы е , л и н е й н ы е э к зо п о л и ­
сахариды, состоящие из молекул глюкозы, остатков глюкуроновой
кислоты и маннозы. Синтезирую тся внутри микробной клетки
п утем п о с л е д о в а т е л ь н о г о п р и с о ед и н е н и я м о н о с ах ар и д о в и
ацильных групп к липидным промежуточным метаболитам. Имеют
поли-р (1 —>4)-Д -глю копироназную структуру, напоминаю щ ую
целлюлозу, но содержат три боковые цепи сахаров.
В 1963 году была выделена ксантановая слизь у грамотрица-
те л ь н ы х п о ч в ен н ы х б ак т ер и й , ф и т о п а т о ге н о в X anthom onas
campestris, X.phaseoli, X.juglandis.
Ксантан даже в малых концентрациях образует очень вязкие
растворы, сохраняющие свои физико-химические свойства в усло­
виях очень высокой концентрации солей, изменениях pH и темпе­
ратуры в ш ироких пределах. Реологические свойства полисаха-
1.4 Пани ахаршш

рида зависят от боковых групп, • их образован ие у hсайтам а


зависит от содержания н среде пиру eat а <1-8% I
Технология получения к а а т м и основана и m риодической
глубинной ферментации Во время ферментации продуци­
рующийся нолисвкерил существенно увеличивает вязкость среды
'h o необходимо учитывать при выборе гипа ia ifH iT a p a , системы
перемешивания и пр ен и я, отвода теш и И вя«ой среде ухуд­
шается доступ растворенного кислорода в вяетаам микро-
организмов Наибольшая продукция ксантана наблюдается в
стационарной фазе ра звития к уавгуры миярноргвиинион
В качестве субстрата м м ш р о к а ву*урум*ы§ крахмал,
меласса. Цитрат и гиутиит у м т ч м и и продукцию поя иса харида
Xanthomonas campestri* Высока* концентрация фосфата,
наоборот, лимитирует синтез «сеетвив
Культуральная среда содержит 2-4% углеводов. 0.05-0, 1% а «па
минеральные соли; pH 7,0-7,4, ферментация в течение 2 суток.
выход продукта 20»30 r/;i культуральной жидкости. Кели фермен­
тация осуществляете я при .354'. то образуется игвитаи с меньшей
молекулярной массой, чем при МТЧ
Получен рекомбинантный штамм Xmn*k»mдина campestns с
клонированными а него генами I <Ыи отеггстесниемн н синтез
ферментов ^ ( м м т о а и п ы и лактотопермеачы Н а н т у штамм
культивируется не на крахмале, а не дешевой молочной сыво­
ротке, способен утилизировать не только гн и и ч у. но и ш и п у .
Водные растворы ясяитане стабильны в условиях применения
агрессивных жидкостей и нспольдуются в нофтвгнвовоО отрасли
как стабилизаторы и с тру ктурообра зователи промывных жидкос­
тей, предназначенных дна бурения скважин. Применяется ксантан
как стабилизатор и отверлнтеав пищевых издетнй. фармацевти­
ческих препаратов, косметических средств

7.5. Аминокислоты
В мире ежегодно производится 700-800 тыс .тонн аминокислот
(более половины составляет глютамин я лизин), в основном
микробиологическим и химическим синтезом
Известно около 300 различных аминокислот, в живой природе
используется 2 0 . h i н и х 8 незаменимые для человека («полейцин.
212 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

лейцин, лизин, метионин, треонин, валин, фенилаланин,триптофан).


Последние поступают в организм с белком животного и расти­
тельного происхождения. Аминокислотный состав, их количество
в клетках животного, растительного и микробного происхождения
имеют определенные отличия. Так, в белках растений недоста­
точно лизина, метионина, триптофана, треонина.
Большинство микроорганизмов в отличие от высших орга­
низмов способны синтезировать все 20 аминокислот, за исклю­
чением молочнокислых бактерий и некоторых других групп.
Биосинтез клеточных структур эукариотных и прокариотных
микроорганизмов осущ ествляется, прежде всего из белков,
нуклеиновых кислот, полисахаридов и сложных липидов. Их
предш ественникам и являю тся аминокислоты , пуриновые и
пиримидиновые основания, моносахариды, жирные кислоты,
многоатомные спирты, амины и другие соединения.
Исходным материалом для синтеза ам инокислот служат
метаболиты-предшественники, такие, как ацетил СоА, пируват,
оксалоацетат, |3-оксокетоглутаровая кислота,фосфоенолпируват,
гексозофосфат, фумарат, эритрозо-4-фосфат и др. Метаболиты-
предшественники образуются как промежуточные продукты цикла
трикарбоновых кислот, гликолиза и пентозо-фосфатного цикла.
10 из 20 аминокислот, входящих в состав белков образуются из
промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот.
Метаболиты-предшественники для биосинтеза и необходимая
для этого энергия поставляются за счет катаболических процессов,
которые чрезвычайно разнообразны у микроорганизмов в отличие
от высших организмов.
Микроорганизмы, получающие энергию путем окисления неор­
ганических веществ и использующие в качестве единственного
соединения - источника углерода диоксид углерода или одно­
углеродные (С1) соединения - хемоавтотрофы, образуют из
подобных субстратов те же метаболиты-предшественники, что и
гетеротрофы.
Поскольку в реакциях катаболизма от органического субстрата
отщепляются группы, содержащие фосфор, азот и серу, то обра­
зующиеся метаболиты -предш ественники состоят только из
углерода, водорода и кислорода (некоторые содержат фосфатную
М 4мимии«им ш

группу). А длл биос и н Iе I иs e t кич процессов. происходящих с


затратой же pi ни (ATPi и участием м к о м м м т ш (НАДФН)
необходимы а н м , фосфат, серосолср*аш ие i руины, • t u i с
одноу глеродные единицы.
Мнкроорганизмы woryi м с г р м и а* промежуточных про*
дуктов катаболи»ма только y i тгрпаам скелеты м ш м ц м и . На
последующих папах биос ми i eta аминокислот в толоку мы проме­
жуточных продуктов ноуитса при помощи реакций «им м рим м м
и переамииироаания аминогрупп Превращение м ор г ваичесааго
•ЮТ» в органический осуществляете* черст иретвариi ельное
образование ионов аммония, и т щи с *атем включают сл в состав
органических веществ Ряд аминокислот (аланин, глутамин, аспи­
рат им) обрат уюте а путем прямою аминнрования (рас. 51). Эта
первичные аминокислоты Остальные называются вторичными
синтезируются путем переамииироаания, т е а результате
перенос* аминогруппы от первичных амннокисвот. которые
служат донорами, на соответствуюшие вето*«клоты, e tp a iy v -
щиеся а ходе реакций катаболизма

На основе радиол эотопиого анализа, а влишм ■ча ш иссле­


дований и применения генетических методов с получением мутан­
тов расшифрованы пути биосинтеза аминокислот, разделенных
на 5 семейств (рас. 59V
14 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

глюкоза (C<s)

(Сб Nj) гистидин пенmoia (С$)


1 'лицин (С} У)
тетрош (CJ :ерия (Cj У)

лргынын ( C ^ \j

Рис. 59. Биосинтетические пути образования различных семейств аминокислот.

Глутаминовая кислота, глутамин, пролин и аргинин относятся


к семейству глутаминовой кислоты; предшественником является
2-оксоглутаровая кислота.
В семейство аспарагиновой кислоты включают 5 аминокислот -
аспарагин, треонин, метионин, лизин и изолейцин. М етаболит-
предшественник -г аспартат.
Семейство аминокислот с разветвленной цепью или семейство
пируватов составляют аланин, валин и лейцин; предшественник -
пируват.
Серии, глицин и цистеин объединены в семейство серина, пред­
шественник - 3-фосфоглицерат.
Предш ественниками семейства ароматических аминокислот
служат эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват. Ароматическое
кольцо в составе фенилаланина, тирозина и триптофана образуется
из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата. В биосинтезе аро-
матичесикх аминокислот есть общий участок (путь шикимовой
кислоты).
У1 4 м м я м м м m

Гистидин сн тл о н р у стсм отдельны м ш а б м м м ш н аут см


В се 20 ам и н о к и сл о т о п ти ч еск и u t n m w 1кр о м е г ш — i t ,
поскольку содерж а! u n i 6м 1 хнральный (м х и м е ф и м к н * ( « ш
yi перо да, 1.1 . Г м D-формы А минокислоты шллантя i i f N i M i -
ными кислот ж и р н о ш и a f o M iN W i i M t рядов, содержат одно­
временно амино-(ЫП t я карбоксиim y w (C O O N l группы

Ш
Я' I с ш ж

Н аличие и р б к м ы м я и аминных ip y u u обеспечивае» и таи­


мо д ей стви е ам инокислот • [ х м ш и » ацн ли роваиия. t a i i ^ y
том им я и иери ф н кацн н А минокислоты , i M M 't u i структурной
единицей белков, обеспечиваю т об раш вани с пептидных святей
Кроме тою» они вовлечены в биосинтез ферментов, ряда i ормонов,
витам и н о в, ал кал о и д о в, н>к (енновы х кислот м т а б а и т н в м и
токсинов.
П ром ы ш ленн ое п р о и зв ед етв о ам инокислот осущ ес1 вджется
несколькими технологиями:
- м икробною » нческнй синтез путем глубинной ферментации
штамма-сверхпродунента. Около 60*% аминокислот получают л е й
техн ологи ей . П реим ущ ество В том. что синтезирую тся только
L -формы аминокислот,
химический синтез для получения некоторы х амин окис лот
более приемлем в силу ботьшей экономической u t юсмЙркняостн
Н о при этом синтезирую тся об е раце м ичеекяе формы (1 и D
а м и н о к и с л о т ы \ р азд елен и е которы х достаточно трудоем кий я
дорогостоящ ий процесс. М етионин в n p o v ышленных масштабах
производится только химическим синтезом, так как он не стереоиз-
бнрателен. нет необходим ости ра плетен и* рапемических форм.
■ оно трансф орм ация или хими ко-зн зи молот и чес кий синтез,
ко гд а в н а ч а л е х и м и ч еск и м с и н те зо м получаю т м етаб о л и ты -
предшественники аминокислот, в осят яш я зто соепгветствующяе
карболовые кислоты Затем эти кислоты при помогай ферментов
ммкрооргани тмон превращают в соотвстстнуюштн аминокислоты.
216 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

- г и д р о л и з п р и р о д н о го б е л о к с о д е р ж а щ е г о сы р ья (о тх о д ы
пищевой, молочной промыш ленности и др.)- Сырье обрабатываю т
растворам и кислот либо щ елочей при вы сокой тем пературе. Но
при гидролизе полностью разруш ается триптофан, денатурируется
10-30% цистеина, м етионина и тирозина.
О сновны е продуценты ам инокислот бактерии, такж е исполь­
зую тся д рож ж и: C orynebacterium glutam icum и Brevibacterium
fla v u m п р о д у ц е н т ы л и з и н а и ф е н и л а л а н и н а ; B revib a cteriu m
lactofermentum, Serratia marcescens, Corynebacterium glutamicum -
лейцина; Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Brevibac­
terium fla v u m , E scherichia coli - ар ги н и н а; M icrococcus spp.,
Bacillus subtilis. Candida utilis - триптофана; Brevibacterium flavum.
Corynebacterium glutamicum — тирозина и валина и др. И споль­
зуем ы е ш таммы являю тся ауксотроф ам и - сверхпродуцентам и.
С верхпродукция аминокислоты достигается путем блокирования
м еханизм а регуляции по типу обратной связи, увеличения про­
ницаемости клеточных мембран для синтезируемой аминокислоты
и т.д.
Особенно часто в качестве биопродуцента аминокислот исполь­
зуется Corynebacterium glutamicum. Аминокислоты синтезируются
этими коринебактериями из промежуточных продуктов гликолиза,
п ен тозоф осф атн ого цикла и цикла тр и карб он овы х кислот, т.е.
н ескол ьки м и м етаб о л и ч ески м и путям и и об р азу ю т н еск о л ько
сем е й ств . К о р и н еб ак т ер и и не т р еб о в ат ел ь н ы к п и тател ьн ы м
средам , технологичны в ф ерм ентационном процессе, мало под­
верж ены ф аголизису, характеризую тся стабильностью сверпро-
дуцирую щ ей активности.
П рименяю тся аминокислоты в медицине, пищ евой, ф арм ацев­
тической, химической промышленности, парфюмерии. К примеру,
лизи н, м етион ин использую тся в к ач естве корм овой д о б авк и ;
глутамин, аспарагиновая кислота, аланин - улучшают вкусовые и
а р о м а т и ч е с к и е с в о й с т в а п и щ е в ы х п р о д у к т о в ; ги с т и д и н и
т р и п т о ф а н о б л а д а ю т а н т и о к с и д а н т а м и с в о й с т в а м и ; ц и стен н
используется в хлебопечении; серии - в косм етологии; лейцин,
тирозин, валин, глицин, метионин, глутамин полезны в медицине.
7.1 4/ттонш юты 1*1

Гяут аиинония кислота


Востребованность нишевых продуктов определяете* их
питательной ценностью и вкусовыми качествами Наиболее
широко а нишевой промышленности с целые улучшения вкуса
продукта используется гдутамаг натрия, по (учаемый «9
глутаминовой кислоты.
Глутамин и 1лу «аминовая кислота составляют основу
биосинтеза аминокислот, так как обеспечивают образование
непосредственно и» аммиака аминогрупп, необходимых для
синтеза вторичных аминокистот.
В качестве продуцентов глутаминовой кислоты исполыув>ив
вуксотрофные штаммы Сагхт Ын t+num glmtama им ш Brevihac
imum flavum
В основе еверхеинте за м утм ям и нт! кислоты п г я к п н лежат
ДМ биохимических механизма; ингибирование н т я ю о с т я м б а
синтеза р-кетог л у гарат дет идрогена зы и Г». котирование продукции
биотина (рис АО)
Биотин является кофермсн том анегня Со А карбоксила зы,
фермента участвующего в блесните те жирных ik j w t . Поэтому
уменьшение концентрации биот ина соответственно у и гяы м ст
концентрации' липидов в клеточной мембране, что повышает
проницаемость последней и облегчат? быстрый выход р глута­
миновой кислоты ит клеток путем активного транспорта в
культуральную среду
Предшественником «глутаминовой в не лоты служит о к е т о
глутурат, образующийся в цикле лимонной кислоты А п в ам сть
«того циклл у дуксотрофного штамма СогутеЬш, lerium glutamicum
ограничена иа этапе а-кетоглут ара глегидрогенатной реакции.
I Поэтому в результате прямого аминирования а-кетоглу rapai
превращается в а-г лугам иновую кислоту (рис 61).
Ферментация произволе гвенного штамма Corywebatien*»
glutamicum осуществляется на простых питательных средах с
добавлением глюкозы, при ни зких концентрациях а среде б а ш е н
Используется периодическая, глубинная ферментация с
аэрацией и перемешиванием при 30-354', pH 7,0-8.0, в течение
2-3 суток. Выход «-глутаминовой кислоты равен 50-60% вне­
сенной в среду глюкозы и составляет около 100 г л.
218 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Рис. 60. Влияние биотина на выделение L-глутамата клетками Corynebacterium


glutamicum. При лимитировании роста биотином снижается содержание
фосфолипидов в плазматической мембране и возрастает продукция L-глутамата.
/

-A T .

fat. II. ( 'm i (w narm гт т м м м 4 я к « м Canm^ » *m— хШяятчт

Jh ММ
В промышленных масштабах ли мин с м т я ^ у т а . прежде
всего как кормовая лвбаиа
Лизин о т н о с и т с я к семейству асшрагамиоА п к м к , предше­
ственником являются м е м о ш т м и п и р у я Hi м е м а п г т а
в реакции карбоксилнровани■ фосфоеня — ру та, образуется
аспарагиновая кислота, из нес св ите i f y t i c i яттт. В процессе
биосинтеза одновремсн но с лизином продуцируете* ж гионин и
треонин (рис. 62). Регулируется §■ ас— тез этих i m w w c m t
одним из м ш ы м п ферментов «етаболического пути - аспартат-
220 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Рис. 62. Синтез лизина, метионина, треонина и изолейцина.

киназой. Одновременное повышение концентрации лизина и трео­


нина по типу обратной связи ингибирует активность аспартат-
киназы и синтез аминокислот прекращается (рис. 63).
Получают штаммы-сверхпродуценты следующими мутациями:
- мутанты, не способные синтезировать фермент гомосерин-
дегидрогеназу; наблюдается сверхпродукция лизина при низкой
концентрации треонина ; аспартаткиназа не ингибируется;
- мутанты дефектные по структурному гену, детерминирую­
щему конформацию аспартаткиназы, необходимой для взаимо­
действия лизина с аллостерическим центром фермента; при
отсутствии конформации теряется чувствительность аспартат­
киназы к повышенной концентрации лизина, фермент не инги­
бируется, синтез лизина продолжается.
Кроме того можно повысить проницеамость клеточной стенки
Corvnebacterium glutamicum для лизина путем снижения концен­
трации биотина (соответственно снижается концентрация
?Д I ыттишш —ты
Глава 7. Метаболиты микроорганизмов — биотехнологическая продукция

фосфолипидов клеточной стенки) или добавления в питательную


среду пенициллина (нарушается синтез пептидогликана). Быстрый
вы ход лизина предупреждает его накопление внутри клетки и
активность аспартаткиназы не подавляется.
И сточником углерода для штаммов-продуцентов Corynebac­
terium glutamicum являются глюкоза, сахароза, реже фруктоза,
мальтоза (в составе мелассы, молочной сыворотки, гидролизата
казеина и др.).
Источником азота могут быть мочевина, сульфат или фосфат
аммония, кукурузный экстракт, гидролизат дрожжей. В качестве
стимуляторов роста используют кукурузный экстракт, дрожжевой
гидролизат, витамины группы В, макро- и микроэлементы (Са, Mg,
Мп, Fe, Р).
В промышленных условиях лизин получают глубинной перио­
дической ферментации Corynebacterium glutamicum при 30-33°С,
pH 7,0-7,2 в течении 2-3 суток. Лизин накапливается в куль­
туральной жидкости к концу экспоненциальной фазы роста. По
окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от
клеточной массы. Лизин выделяют из культуральной жидкости,
смеш иваю т с наполнителем (пшеничные отруби и др.), грану­
лируют либо в жидкой форме используют в качестве кормового
концентрата.
Гранулированный лизин содержит 7-10% лизина. Кроме микро­
биологического разработан химико-энзиматический путь получе­
ния л и зи н а из (5-ам ино-е-капролактам а,которы й получают
химической реакцией из циклогексана, б-амино-е-капролактам
гидролизуется в L-лизин штаммами родов Cryptococcus, Candida,
Trichosporon.
Треонин
Треонин, как и лизин, метионин, изолейцин относится к семей­
ству асп арагин овой кислоты. М етаболический путь синтеза
вышеприведённых аминокислот начинается с образования аспара­
гиновой кислоты, а затем в определённой последовательности
остальных.
Регуляц и я продукции треонина в клетке осуществляется
следующим образом:
повышение концентрации треонина • клетке интибирует
активность фермента м еi аботнческото пути томосернн ле-
тидрогена ш , прекращаете» синтез гомисгр— и к т а м ш If» -
межуточных соединений, необходимых хяя Шр&лушн треонина;
- если же имгибмровамие о м ш м с т с ! недостаточным н
концентрация треонина ifo M O ta rf нарастать. «• • щтеггтт*
иирувата усиливается продукция >«)4е*ммм И юыток двух г * »
аминокислот совместж» инт ибирует синто к п ферментов war*
метаболического пути
Для с вер х ироду кц и и треонина с коне i уумрв —я мутантный
штамм Е coli К12, ауксотрофный «о и ш <* а м у и с мрушмшп*
конформацнонной п т п м е ш о <ч у к ш п т ы ю с т м И фермент»
гомосеринлегилрот еиазы к w awift «in иск грани i f m m
При нарашнвании биомассы «гутаяпмга штамма Т. <г*Н к 12 а
зкепоненинальнои фа к роста м б-ш д асти ( W f ita iT ti греонина
■ силу того, что ro w o o tfw iu cfiifM IM li не утетаетса высокой
концентрацией аминокислоты: громе того • о и у а у ю т р ф н с т а
нет избытка и юлейцина
Триптофан
Саерхсиитез триптофана осу шастал acre* n y a i путями
химнко- »н шматнческой техно.ют ней ■ вехивлшш* рашиибммшп-
ных ДНК.
При х а и м о - м п я м и а м с м м синтезе вначале химическим
путём подучают метабол и чес* и и предшественник триптофваа
антраннловую кислоту, затем при помоши Сл*ёл4л иИШ
антраниловуто кислоту превращают в триптофан 1рмс М).
Антраниловая кислота еннте«нруется ю < у п мм а 1 в ш ш
под действием фермента м т р я а а м к к а т а ж Повышение
концентрации триптофана иш ибирует к г а а м с т ь антранидат-
синтстачы и тем самым прекращает синтез предшественника -
антраниловой кислоты. Поэтому а п р ш а а м м кислота нараба­
тывается химическим путем и ш избытке вводится в среду
культивирован ия С яЫи. Кроме того» яршшгушестяшшмА синтез
триптофана достигается путем блокиров—ал превращения
хорнзмовой кислоты в префеновую вс л едет вие мутационного
ингибирования активности фермента пот» превращения
224 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Рис. 64. Синтез триптофана, фенилаланина и тирозина.

Ф ерм ентационны й процесс начинается с н аращ ивания б и о ­


м ассы Candida utilis на с в е к л о в и ч н о й м е л а с с е , м о ч е в и н е и
минеральной соли в течении 24 ч при 30°С. Д алее в биореактор
н ач и н а ю т в в о д и ть сп и р то в ы й 5% -ы й р а ст в о р а н т р ан и л о в о й
кислоты и 50% -ый раствор мочевины . В последую щ ем п ери о­
дически осущ ествляется подпитка м алассой, м очевиной, антра­
ниловой кислотой; общая длительность ферментации около 120 ч.
С о д е р ж а н и е т р и п т о ф а н а в к у л ь т у р а л ь н о й с р ед е с о с т а в л я е т
примерно 6 г/л. Также разработаны технологии на основе исполь­
зования ауксотрофных мутантов Bacillus subtilis.
С верхпродукция триптоф ана достигнута при помощ и техн о­
логии реком би н ан тн ой Д Н К , когда в клетки Corynebacterium
glutamicum были введены модифицированные гены трёх ключевых
ф ерм ен тов: З -д езо к си -Д -ар аб и н о геп ту л о н азат-7 -ф о сф атси н те-
f t Микроо/канишы ешшамтр утт беты «ыаим ш

газы, антранилатсинтеташ и ангранилатфосфорвбозилтранс-


ф еразы. Благодаря изменениям в генам ферменты потеряли
сродство, стали м ч у к п и т ш м м м к н т ибировапню конечным
подуктом грилюфаиом
Асяири.'иношую K
tMU
M R
v по щучощш щ ф\ нарочой
Раствор фумаровой кислоты пропускают через ко доньи, где
иммобилизованы клетки K .coti шли Serraiia т & т -ы енл. о&м-
даюшие аспарташ ой активностью Под действием фермента тл
фумаровой синтезируется аспарагиновая кислота
Ф*ни шчлнин - н о сырье для м ш е м и о поделаетители
аспартата, который слащ е с а х а р о ш в 200 р а .» Получают
аминокислоту при помощи мутант мот о штамма В т чЫ т ю ш я
lactojermеп(ит, ауксотрофното м тиромиу и метионину,
7.в. Микроорганизмы синтезируют человеческие белки
Технолотия ревембинаитмей ДНК позволяет получать в
производственны х масш табах б елки человека, «бяалаю ш не
лечебными свойствами В качестве продуцентов м и в я ы у м т е !
генетически модифицированные м а с р > п у гм м м м f emti. I
яыЫШм и др.
Инсулин, сомаю тропиа интерферон W « другие биологически
активные соединения необходимы для лечения саялраюге лнвЛета
карликовости, вирусных инфекнин и др
Инсулин
Инсулин синтезируется клетками Л аятергаяса в поджелу­
дочной железе, юрмои регу лирует р м ж и и ы ! ебмем а оргамгмае,
обеспечивает усвоение глюкотм клетками, его недостаток
приводят к сахарному диабету
С 1922 года свиной и бычий инсулин применяйся как лечебный
препарат при диабете. Технология заключается в шетра» нроваиии
белка иисуляна иг поджелу дочной железы ( НЮ г крист аллического
инсулина и* 800*1000 кт поджелулочной железы). Инсулин живот­
ного происхождения несколько отличается по амя ноемслотной
последовательности от янсулнма человека, ю н о м у ю ю о в ю
выработка на неге антител в организме больного человека
226
Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическ<
ская

ДНК

тРНК

Цитоплазма

Рис. 65. Синтез белка в рибосоме (по А.С. Спирину, 1977).

С п ом ощ ью технологии рекомбинантной ДНК получен


генетически модифицированный штамм E.coli, продуцирующий
человеческий инсулин.
Инсулин — это белок из 51 аминокислотного остатка, состоит
из двух полипептидных цепей А и В, связанных дисульфидными
мостиками. В клетках Лангерганса в результате процессинга из
препроинсулина образуется проинсулин и затем инсулин:
препроинсулин, i------ —ч )------— | j--------- ~i i-----
Сп А С В
7.й М Ц р м у м м н т п м м я ^ м <««* < т м м 22?

г м Сп-сж нальный пептид, необходимый д м »кспрсесни белка.


С -соединительный пен гид, обеспечивающий необходимую
ориентацию А и В цепей при смыкании дисульфиды*. стжА, А
цепь состой г и» 21 амииокислотжм о ост а пса, 1й м ь - и В м ш м -
кислотных остатком.
- проинсулин ' « ■''*■ »■■•' - ■-ц , отсутствует Сп;
А С В
-- инсулин, А т ----- - у-- СООН
. ■*. ■' — t

NH Й i .. I , tic y K iv y v i Сн и С

Транскрипция i енов )укариот происходит • ядрах с образо


ваннем иРНК предшественника При его перемещении •
цитоплазму через ядерную мембрану иPHК предшественник
подвергается процессингу
1 - присоединение в 5' концу и РНК предшественника
необычно! о основания (7 мети .try а пот т мят КЭП). ♦ у н и и »
КЭП по присоединение и PH К к 40 S' субъс линииг рибосомы
для инициации трансляции туирявгяв# иРИК
2 - полиадени лирование или прнсiujh i h h w * Т концу иРНК
предшественника подиадеииловой цепочь и р а в к р м м м и 300
п и Функция этих последовазеяьностен в б е с я г к м с стабиль­
ности транслируемой иРНК;
3 - удаление из и PH К-пре дшее гвен ника яитромов сплайсинг
Поэтому, если просто клонировать геи инсулина человеиа а
зксирессироваi ь его в прокариотах, то получится а р т р о и к у а я
(в бактериях нет процессии! а), а ие инсузин Можно потом
препроинсулин o flp a fo ta n ферментами и получить инсулин, то
это сложный и дорогостоящий процесс
П опону разработана п используется другая технологи* полу­
чения генно-ииженерного иисузапаа Предварительно химическим
путем синтезируются н\ клеотидные последова i t ть иости. коли­
рующие А цепь и отдельно - для В - цепи т е. t a a i a n i u j w e
фрагменты клонируемой ДНК Затем их встраивают в ратные
векторные плазмиды, последние трансформирую! в разные
228 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

штаммы E .co li. В этих фрагм ентах к ДНК нет нуклеотидны х


последовательностей, кодирующих сигнальные и соединительные
пептиды. Генетически м одиф ицированны е два штамма E .c o li
раздельно культивируют, затем выделяют А и В цепи инсулина и
их соединяю т дисульфидными связями, получают биологически
активный инсулин (рис. 66).
Синтез ДНК. кодирующей A-цепь, Синтез ДНК, кодирующей В-цепь,
и встраивание ее в lacZ -ген составе и встраивание ее в lacZ -ген составе
плазмиды pBR322 плазмиды pBR322
Трансформация плазмидой клеток Трансформация рекомбинантной
E.coli плазмидой клеток E.coli

Ген А-цепи Ген В-цепи


О Ген lacZ Ген lacZ

Плазмида Плазмида

А-цепь В-цепь

Р-гал cod I
(З-гал
П Лидирование клеток П
V Расщепление V
химерного белка
A-цепь инсулина finnuuuaunu
оромиианом В-цепь инсулина

□ Очистка

Т Окисление

И
I I

Инсулин

Рис. 66. Принцип производства человеческого инсулина с использованием


технологии рекомбинантной ДНК. Химически синтезированные гены А- и В-цепей
инсулина по отдельности встраивают в ген lacZ (кодирующий (J-галактозидазу)
в составе плазмиды pBR322. Полученными гибридными плазмидами
трансформируют клетки E.coli, продуцирующие в результате химерные белки,
включающие фрагмент (i-галактозидазноЙ цепи и A-цепь, В-цепь инсулина.
После отщепления А и В-цепи рекомбинируют, получая нативный
двухепочечный инсулин
7.6. Микроорганизмы гтштвшфуш» 1 и в «мамам

Одноцепочечные олигонукпеотиды м у о т а к фрагменты ДНК.


кодирующие по А и В цени ■олушот ангоматически и м п к п м
синтеюм, при помощи ДНК - смитететора Э м аппарат. о*сте#-
ший ш системы клапаном и м г о с м , по июли кмин х в реакционную
смесь по строго заданной программе вводить нуклеотиды и
реагенты, обеснеч и ва ю т и е присоединение нужных мономерных
единиц к растущей цени I отличие от биологического • м и и
химического сингета ДНК каж дый новый ну кяеог ид можно
присоединить к 5* i идрокенльному концу цепи Все реакции
осущестеляются последова»си.но а одной реакционной колонке
с компьютерным иркираммимм обеспечением
Технология получения генно - шн.шген*рш»го и м т я м г м и и р
Е.е&Ш
• химический сии те I ДНК послеловагельностей, таетствеииы»
та получение А и В цепей,
*- эти последовательности ну» и а щ м встраивающее I iac 7
ген Е соН, ко лиру ими ий часть молекулы фермента бета-i аяакт о
тидаты, lac 2 - ген находится а састаае pBR322 платмнлы
- каждую иг п л а т и л ♦ lac / ♦ А<или В цепь) вводят в отдельный
штамм Е.еЫг;
- трансформированные Е cot t продуцируют химерные белки.
Выделив химерные белки, их обраАетмиают в у м я и и ю м . расам**
ляющим белки по остатваи м т ю а м и а А и В я а и м м а в м е а т
белковых фраг ментов бета-гал актотид аты:
- очищенные А и В цепи о м и и в к а д и у м ф а а м м и сипами,
получаю! двухцепочечный мономер инсулина
Иптер^гроты
Интерфероны (Нт) являются глобулярными белками с присое­
диненным небольшим углеводным остатком. m глнкопротсины.
В организме человека сннтетируются интерфероны тейкоци
теми (а-интерферонк фибробластами (§ иитерферпи» и лимфо
цитами (у-интерферон). Они обладают аитииирзеимм и противо­
опухолевым действием; применяются при острых вирусных
гепатитах, ал и ю -, герпес- и других вирусных инфекциях, при
лим ф ом ах, мне л ом е. остеосарком е, рассеянном склерозе,
грану лемато те.
230 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Интерфероны видоспецифичны, т.е. человеческий интерферон


биологически активен только в организме человека, мышиный -
в организме этого животного и т.д.
М еханизм действия интерферона: связы ваясь с клеточными
рецепторами, они индуцируют синтез двух ферментов в клетках
(2”5' - олигоаденилатциклазы и протеинкиназы). Оба фермента
п р о явл яю т свою ак ти в н о сть в при сутстви и д ву х ц еп о ч еч н ы х
ви русн ы х Д Н К , о б р азу ю щ и х ся в к л етк ах при р еп р о д у к ц и и
вирусов. Активация этих ферментов ингибирует биосинтез белка
и размножение вирусов в инфицированных ими клетках организма
путем деградации вирусных иРНК и рРНК, клетки лизируются.
В лейкоцитах синтезируется преинтерферон, состоящий из 187
ам инокислотны х остатков. Затем ф ерм ентативно отщ епляется
сигнальный пептид (21 аминокислотны й остаток) и образуется
интерферон, размером в 166 аминокислотных остатков.
И нтерферон лейкоц итарн ы й можно получать из донорской
крови; из 1 л и тра крови вы деляю т 1 мкг а-и н тер ф ер о н а, т.е.
1 дозу для инъекции. С ущ ествует химический синтез молекул
интерферона.
Технология получена генно-инженерного интерферона
Гены лейкоцитарного интерферона встраиваются в плазмидный
вектор pB R 322 E .coli (рис. 67,68). В со став е плазм иды есть
пром отор, инициирую щ ий репликацию п оследовательн ости -
точка ori; есть терминирующий кодон, регулирующий окончание
синтеза молекулы интерферона.

промотор ori гены Ит. терминир


. кодон

pB R 322^
Рис. 67. Гены лейкоцитарного интерферона в составе плазмидного вектора pBR322.

При культивировании генетически модифицированного штамма


E.coli экспрессирую тся гены , ответственны е за синтез интер­
ферона; гены интерферона не содерж ат интронов; полученный
7,6. Мн i u im t ju p ) ю т ite m тв я в я т

“ * яы т

ривяии
Рнс. I ( т ш п ш ш ы ы у к в ш м и и м * век!ора рШ Ш 2. Г в и у г а й и м п
или ■клину (ТеГ) в ампициллину (Аяф ) содержат у и в в в м м сайты унивамш
1ЙМ П 1. М к ^ в М М 1« 1г р в я и и в и в к « я 11« м
Д и в и м и 43Й1 вн

интерферон биолот ически активен. Кон цент рани* Ит достигает


5 мг на 1л культуральной жидкости E.coli (1.10 КОЕ/Тля).
С целью усиления антивирусной, противоояухолевой актин-
нос ги созданы век юры, несущие гены ратных интерферонов
(к примеру юны, кодирующие Ит а . и Ит а .
Гибридные интерфероны индуцировали образование 2‘-5'
олигоитоаденилатсинтетаты а ш п и . Этот фермент участвует в
сии!с le 2'-5* сватанных олигонуклеотидов, которые в свои»
очередь активируют латентную клеточную шдорибонуклеазу.
расщепляющую вирусную мРНК Некоторые гибридные Ит
проявляли выраженную антипролиферативную активность •
культурах ратлнчных раковых клеток человека, и мм унимоду­
лирующую активность.
Считается перспективным использование в качестве
продуцента интерферона эукариотных клеток - 5 cerevhtat
S. c e re v isia e характеризуются отработанной технологией
промышленной ферментации, легко сепарируются, нет токсичных
и пирогенных веществ, как у неотрицательны х микроорга­
низмов; могут осуществлять процессии!, т.е отщеплять сигналь
ный пептид; обладают собственными сайтами инициации и
терминации, транскрипции и трансляции.
232 Глава 7. Метаболиты микроорганизмов - биотехнологическая продукция

Соматотропин
Соматотропин или гормон роста человека, состоит из 191
аминокислотного остатка, применяется для лечения карликовости.
При его недостатке задерживается рост ребенка.
Гормон видоспецифичен, поэтому для лечения карликовости
(встречается у 1на 5000 человек) использовали соматотропин,
выделенный из гипофиза умерших людей. Гипофиз содержит
около 4 мг этого пептида, ребенку на недельный курс необходимо
7 мг, лечение продолжается несколько лет. Кроме того, наличие
определенной гетерогенности пептидов, выделенных из разных
гипофизов в ряде случаев, приводило к выработке против этих
пептидов антител в организме больного, получавшего препарат.
Используя генно-инженерную технологию, биосинтез сомато-
тропина был осуществлен в 1979 году. Ген, кодирующий синтез
гормона был сконструирован посредством комбинации хими­
ческого и биологического синтеза.
Участок гена, кодирующий первые 24 аминокислоты пептида,
был химически синтезирован из отдельных нуклеотидов. Для полу­
чения остальн ой части гена исп ользовали ряд ф ерм ен тов.
С помощ ью обратной транскриптазы на м атричной РНК,
выделенной из гипофизарной ткани человека, была синтезирована
копия гена сом атотропина. Нужный ф рагм ент был вырезан
рестрикционными нуклеазами и присоединен с помощью ДНК —
лигазы к синтетическому фрагменту. Полный ген был встроен в
модифицированную плазмиду pBR322, несущую 1ас-оперон.
Синтетическая часть гена соматотропина была снабжена при
конструировании своим собственным инициирующим кодоном
(АТЦ), т.е. группой из трех нуклеотидов, служащей сигналом
начала транскрипции. Поэтому гормон мог продуцироваться
микроорганизмами не в составе какого-либо микробного белка, а
самостоятельно.
П лазмида pBR322 трансф орм ируется в E.coli К 12, ф ер­
ментация, в 1 литре культуральной жидкости содержится до 100
мл гормона.
Применение генно-инженерной технологии позволило избежать
побочного эффекта, связанного с рецепцией гормона. Соматотро­
пин связывается в разных типах клеток организма, как с рецеп-
тором гормона роста, так и с пролактшювым рецепторе»*. Чтобы
исключить ненужное связывание гормона с прояакти новым
рецептором при помощи сайт-спеиифического мутагенеза
внесены изменения в боковые группы некоторых аминокислот-
лигандов для ионов Zn* . необходимых для высокоаффннвого
связывания соматотропина с нролактнновым рецептором
В результате получен модифицированный гормон роста человека,
связывающийся только со «своим» рецептором.
Одноцепочечные антитела
Гибридомиая технология получения моноклональных антител
из-за трудоемкости и дорог овишм не исполыуется в повседневной
медицинской практике.
Технология рекомбинантных ДНК позволяет, используя •
качестве продуцента Е coli синтезирован в больших количествах
одноцепочечные антитела различной специфичности
- N1 продуцирующих антитела лимфоцитов человека
выделяется мРНК, синтезируется к ДНК;
- раздельно амплифииируются кДНК. кодирующие X- и Н
игам,
амплифииированные кДНК обрабатывают рестриктазами и
объединяют в одном плазм идном векторе:
вектор, содержащий гены, колирующие X- и h цепи ант и
тела трансформ ируют в /Г coli:
~ культивирование E coli, выделение m культуральной жид-
кости одноцепочечных антител
Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение
в клинике при разработке диагностических препаратов, либо,
обладая рецепторной специфичностью к тем или иным тканям
организма адресно доставлять конъюгированные с ними лекарст­
венные вещества
234

Г Л А В А 8. М и к р о б и о л о г и ч е с к а я т р а н с ф о р м а ц и я
ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Биотрансформация - процессы микробиологического превра­


щения веществ в определенные продукты, структура которых
сходна с исходным веществом.
В отличе от процессов брожения или биосинтеза, в которых
участвует большое количество ферментов разных метаболических
путей, при трансформ ации в микробиологическом процессе
участвуют один, реже два - три фермента.
М икробиологическая трансформация применяется в техно­
логиях химического синтеза как одно из звеньев, когда необходимо
воздействовать на конкретную часть вещества и это сложно
осущ ествить хим ическим методом. При биотрансф орм ации
м икроорганизм ы использую тся только в отдельной стадии
сложного и многоэтапного процесса химического синтеза из
исходного вещества конечного продукта.
Процессы биотрансформации осуществляются различными
ферментативными реакциями: окислением, восстановлением,
гидроксилированием, дегидроксилированием, гидрогенированием,
дегидрогенированием, гидролизом эфиров, изомеризацией.
В результате подобных реакций могут происходить модифи­
кация структуры, частичная деградация вещества, удлинение
молекулы вещества. Происходящие при этом ферментативные
реакции характеризуются:
- каталитической специфичностью, т.е. имеет место только
один тип реакции;
- регионарной специфичностью , когда молекула вещества
подвергается воздействию в одной и той же структурной части
молекулы;
- стереоспецифичностью - активный центр фермента обес­
печивает ассиметрию, что позволяет распознавать оптические
изомеры (L —и Д - формы) в рацемическом веществе.
Практический интерес представляют те реакции биотранс­
формации, которые востребованы в биотехнологии, в промыш­
ленном производстве целевых продуктов.
Микробиологическую трансформацию начали применять в
ш ш р п ш с к м процессе в t t M годах, когда выяснили, что с
помощью Acetohacter suhoxydans п Л-сорбитола можно получить
L-сорбозу, необходимую а синтезе аскорбиновой кислоты Mb 6
гидроксильных групп Л-сорбитола микробное окисление имеет
место только во 2-ой позиции а образуется только L o e f f c a
Технология получения витамина С иди caf c i Райкштейна-
Грюсснера состоит из нескольких химических и одной
микробиологической стадий с участием Gluconobacter oxydans
Д глюкоза химическим путем превращаете* в Д-глюцнтол
(сорбитол), далее при помоши дегндро<еиаш фермента
Gluconobacter oxvdans, сорбитол м а с л и т с я a L-сорбот),
Последующий химический нал включает осаждение L-сорбозы
ацетоном с образованием сорбозоацезона Затем окисление до
диаиешн 2 кето-Ь-гулоновой кислоты, из которой получают L
аскорбиновую кислоту.
Существуй!I силе 2 технологии получения витамина С
- двусгаднйный м икробмологическии синтез, когда вначале
глюкоза превращается в 2, 5- шкето Д глюкомат (ферментами
Erwinia), а потом с помощью C&rynehaetenvm из 2.5 дикето Д
глюконата синтезируется 2-кето- L гулонат;
—одностадийный основанный на использовании рекомбинант­
ного штамма Erwinia, в которую клонирован ген фермента 2,5 -
дикето-L-гл к«конатреду ктазы из Corynebacterium
Ежегодно производится около 70 тыс тонн аскорбиновой
кислоты, используемой в медицине, пишевой промышленности и
других отраслях
В 1930 году из коры надпочечников животных было выделено
гормональное вещество-кортизон Спустя десятилетие пока тана
лечебная эффективность кортизона (выделяли из надпочечников
быка) при ревматоидном артрите. Было налажено химическое
производство гормона из де зокси холи новой кислоты, технология
состояла из 37 стадий. Одна из ключевых стадий связана с
гидроксилированием прогестерона. Для тгого необходимо ввести
атом кислорода в положение 11 а прогестерона, что оказалось
достаточно сложно осуществить и затратно химическим путем .
236 Глава 8. Микробиологическая трансформация органических соединений

Разработка способа гидроксилирования прогестерона при


помощи Rhizopus nigricans позволила более эффективно ввести
атом кислорода в положение 11 а прогестерона, сократив при
этом число стадий с 37 до 11. Прогестерон, получаемый химичес­
ким путем из стигмастерола (предшественник) превращается в
11 а-гидроксипрогестерон с помощью Rhizopus nigricans. Дале
11 а-гидроксипрогестерон химически модифицируется в гидро­
кортизон и кортизон или дегидратируют с помощью Streptomyxa
ajfinis, Corynebacterium simplex в положении С 1 с образованием
преднизолона и преднизона.
Прогестерон —>11 а-гидроксипрогестерон —» кортизон —> преднизолон
Rh.nigricans химической Corynebacterium
гидроксилирование синтез simplex
Дегидрирование

Схема получения стероидного гормона

При другом способе диосгенин (растительный предшествен­


ник) химически превращается в соединение S, затем его 1 1 -а -
гидроксилирование с использованием Curvularia lunata для
получения гидрокортизона, последний с помощью Arthrobacter
simplex превращается в преднизолон.
В качестве предшественников микробиологического синтеза
стероидов наряду с диосгенином ( Dioscorea composita) и
стигмастерола ( Clycine max.), используются холестерол и а -
ситостерол животного происхождения.
В технологии производства стероидных гормонов приме­
няются 4 реакции биотрансформации:
- 11 а-гидроксилирование прогестерон a -Rh.nigricans - 11-а-
гидроксипрогестерон,
- 16 а-гидроксилирование стероидов - Streptomyces agentoelus -
триамициналон,
- 11 а-гидроксилирование - Curvularia lunata, из соединения
S (1 1-дезоксикортизол) получают гидрокортизон,
- введение двойной связи в стероидное кольцо А (С1-дегид-
рогенирование стероидов) - Streptomyxa a/finis- преднизон и
преднизолон.
По масштабам производства в фармпромыш ленности сте­
роиды занимают второе место после антибиотиков; это кортико­
/ ш«и $. ЫшшшЛшшашшшшяшш тртшеф * им

стероиды, прогестерон, к т р а г м ш и андрогены. В медицине


применяются ■ качестве противовоспалительных, диурегических,
анаболических, контрацептивных, противораковых лекарствен­
ных препаратов.
Л ол ус и нтети чес к ие пенициллины получают из 6 аминопени-
циллановой кислоты (6 AI1K). 6 АПК выделяют из бенгилпени­
циллина или ф еноксимегил-неннциляина путем ги д рояи ш
ферментом пснициллиидимлаюА (Kluyvera citntphila и др ) с м я
СО-NH между боковой группой и «ядром» - Ь АПК 1 м ш осуще­
ствляется ацилироваиие аминогруппы 6 АПК с получением
полусинтетического пенициллина.
Разделение оптических томерое аминокислот
Биотрансформацией возможно осуществить избирательное
воздействие на один из оптических изомеров рацемической смеси.
К примеру, Ь'аминоацилаза из Aspergillus oryx** гидролизует
исключительно апил L-аминокислоти. оставляя Д-ишмеры без
изменения Ацнлированиая L-аминокислота ле»ко выделяется и»
смеси.
Получение фру кто ты путем иномерации гтмгммпы <рис W)

Рис. И. ФерменI ативный гндролмг крахмала н превращение


г ч ч н ы во ф руктов а — ним и — и ц р м и крахм аи т щвгщшшл
( м т м р ш м к которые яма* п м р и п у и а ш г ш м н г я м и и и г и !
И м я р п я м я н м к* фру*тут> катаяяэмру ci п и м м и р ш
238

У казатель микроорганизм ов
Acetobacter 21,134
- aceti 61,155
- suboxidans 69, 70. 71, 235
- xylinium 155
Achromobacter 124
Acidianus brierleyi 61
Acidiphilium 61
- angustum 61
- cryptum 61
- facillus 61
rubrum 61
Acidothiobacillus 61
caldus 61
- ferrooxidans 61
thioxidans 61
Acinetobacter 57, 59, 60,101
Aerobacter 208, 209
Aerobasidium pullulans 209
Aeromonas 135
Agrobacterium 20, 58, 121
- radiobacter 126
tumefaciens 52, 58, 126
Alcaligenes 59, 60, 64, 124
Altemaria 28
Anabaena cylindrica 58, 120
Arthrobacter simplex 23, 58. 60, 71, 124, 236
Aspergillius 28. 57, 60, 62. 67, 106, 172
awamori 67
terrus 69
- foetidus 165
graminearum 57
itaconicus 69
kawachi 146
nidulans 65
■ niger 25, 28. 63, 67, 69. 70. 71. 112, 143, 146, 154, 157, 163, 164. 165. 203, 206
oryzae 63, 67, 112, 164, 165, 168, 237
Ashbya gossipii 70, 202
Azolla 117
Azospirillum 58
- brasielense 121
lipoferrum 121
Azotobacter vinelandii 20. 58. 116, 117, 120. 121. 124. 209
ВтШш V, 22. 40 61, 44 67. 1/4. 126.163, 165. !?0 /94 2*3
• Ьпенл 68, И З. 187
• * t erm* 42. / U
• luhemjormis 65. 47. 164. 165. 173. 187
• megatenum 71, 202
- рЫутула 44, /*> 1*4, 187
• tfk m tm 59, Ш
- и М » //. «J м м * 112, 1/3, Ilf. 165. 214. 124 229
• thuringentu ДД 39. 65. 122. 128
Bacterium sturlnk um 69 I $4
Bmemmdm Ii4
Btauvena bussiana 58. 128
Bi/idubuL it num 63,124
- iM k « M U 112
• bifuium 63. 112.114. 199
• M w 112
• . 1шщрт 4k 112. I t $
Blakenlea шщтгя it. 294
Bointis ciHereu 126
Hradyrhisohium japtmnum J l 117
Btwibfunenum 79
« и м щ и п 7$
• (lavum 41, 66. 216. 217
• U iofcrnuiuum 64 M . 216 229
Г т М 27. 56, 91 U 222
• «Mu n i 27, $1
. ш+mrm 24 27, H i
• j Upa/ytua 69. 137
• i jnmuhmm 142
• u № M. 57, лл. 101. 294, 216. 222, 229
Серкакнрчтпит > и ч и » > fri n »иу Ц 9 M. It* l*~
СЪЬ*вШ $ 7 .т . 105
Chfvkfeps purpurea 26
СЬштЛшя « 47. ltd 194,194
Г а М и й н ц м 121
Cmhetm i ermwimt Л9
С»птеЫи и; шт 22. 24. 60, 49 '0. 124. 149. 299

. . gknmmmwm 41. 4k 44. 216 217 218. 2/9 229 222 224
. f < w 79. 224
Corolhm 124
О ч у ч ш ш 222
Cunmnghometla bakexteeana 7l
Cvnttlona bmata 71. 294
0 «Mp*ni 121
240 Указатель микроорганизмов

Desulfococcus 23
Desulfovibrio 61

Enterobacter aerogenes 59,126


Eremothecium ashbyii 70, 203
Erwinia 126, 235
- amylovora 140
herbicola 65, 66, 128
- punctata 70
Escherichia coli 9,10.11.12,13, 32. 42. 43, 63. 65. 66. 71,115, 211. 216.223.225.226.
227. 229, 230, 232. 233
Eubacterium limosum 134, 201
Flavobacterium 59, 60, 124
Ferroplasma acidiphilium 61
Frankia 24, 58, 117
Fusarium moniliforme 28, 56, 60, 67, 101, 106, 107, 121, 165
Halococcus 23
Halobacterium 23
Kluyvera citrophila 197,237
Kluyveromycesflagilis 140
Lactobacillus 22. 62, 63. 126. 146. 148. 149. 151, 154
- acidophilus 63, 112,115
bulgaricus 63
- casei 62. 63. 69, 112, 115, 148
- delbrueskii 63, 115
- faecium 63
- fermentum 62, 112, 115, 148
- plantarum 22. 62. 69. 112, 148. 149, 151
rhamnosum 62. 112, 115
- xylosus 148
Lentinus edodes 69
LeptospirUlum ferroxidans 61, 130
Leuconostoc 21, 62, 146, 148, 149, 208
citrovorus 152
- cremoris 148
dextranicum 69, 209
mesenteroides 69, 209
Leucothrix 60, 134, 135
Malbranchea pulchella 163
Metallosphaera sedula 61
Metarhizium anisopliae 59, 128
Methamonas 23
Methanococcus 61,134
Methanophilus 23
Methanosarcina 60
Methanothrix 60,134
Methylococcus 21. 37
Meihyiomonas flagellate 21. 57, 64. 101, 106
Methylophilus 101
Methykitrophus 106
Uicrocvccus 61,126,151,216
MUromomspora fw purue 24, 6H, 165. 201
Mucor 29. 60
Mycobacterium gUtbiforme 24, 70, 71. 124
Nadsonia 27
Nectria galIщепе 121
Nitrobactar 60. 116, 134. 135
Nitrosomonas 116. 134
Nm ardia rugosa 24, 60. 124, 1)3, 165. 201
Nosena lacunae 39
Nmloc tinckia l i t 119. 120
Pediococcus 21. 62, 146, 14*. 151
• acidolattUi 14$, 149
- cerevisiae 148
- Jettremcum 149
Penicillium 29 99, 57. 60. 62. 67. 106.137.165. 1*6
. chrysogenum » 29 29 M 187. 194. 195
- cnи м и 194
• cvcLtpium 165
• notation 197. 194
• roqueforti 93, 153
Pepttfcoi i n i 134
Pmria cnrot 99
Pmpionihai tenum 23 62
- m m
- JmmdeHreickii 70. 201. 202
. shermanii 62, 69, 153. 154, 201. 202
Pseudomonas 20, 57, 99, 60. 61. 63, 68, 70. 101. 106. 116, 124. 126 135
- aeruginosa 126. 154, 299
iienifrifi< an.s 70. 201
- fluorescent 64,128
melanogenum 197
• septic# 139

57. 116, 117, 118. 120, 121


- fhaseoh 58. 117
I leguminozum 117
- metilotti 117
- ttifoli 58.117
Rkixoctonta solani 126
242 Указатель микроорганизмов

Rhizopus 29, 172


- arrhizus 71, 165
- nigricans 69, 70, 71, 154, 236
niveus 146
- oryzae 146
Rhodococcus 60,135
Rhodosporidium 27
Rhodotorula 26, 206
Saccharomyces 24, 31, 56, 57, 62, 63, 70
carlsbergensis 44, 101, 147, 206
- cerevisiae 11, 25, 26, 31, 56, 57, 62, 65, 70. 101. 102, 112. 140, 146, 206, 231
- fragilis 57
- globosus 44
- lipolytica 26
- vini 140,146
Salmonella 109
Sarcina ventriculi 140
Scenedesmus 57, 101, 105
Schizosaccharomyces 26
Sclerotium 209
glucanicum 209
rolfsii 209
Serratia marcescens 59. 126, 216, 225
Shigellaflexneri 110
Spirulina platensis 56, 57, 100, 101, 105, 106
Sporobolomyces 26
Streptococcus 62, 63, 134, 148, 149, 151, 208
- albus 165
- lactis 62, 68, 69, 112. 148, 149. 150. 152, 186, 193
antibioticus 182
- aureofaciens 186
- rimosus 186
- cremoris 62, 112, 148, 149, 152
diacetolactis 62,148,152
erythraeus (saccharopolyspora) 186
- faecalis 115
- fradiae 186
- griseochromogenes 193
- griseus 178, 186
- kanamyceticus 186
lavandula 193
mediterranei 187
mutans 69
viridans 69, 209
neurasei 186
244

Подписано в печать 30.06.2008 г. Гарнитура “KZ Times”. Формат 60к84'/ .


Бумага офсетная. Печать офсетная.
Уел. печ. д. 14. Тираж 500 экз. Зак. № 561.

Отпечатано в Департаменте издательско-полиграфических систем


РГКП “Дирекция административных зданий Администрации Президента
и Правительства Республики Казахстан"
Управления делами Президента Республики Казахстан
г. Астана, ул. Бигельдинова, 78. Тел.: 75-12-59