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BIOLABO

www.biolabo.fr TPHA
FABRICANT :
BIOLABO SAS,
Les Hautes Rives Test d’hémagglutination pour la détermination qualitative et semi-quantitative
02160, Maizy, France des anticorps de Treponema pallidum dans le sérum ou le plasma humain.

REF 4500100 : 100 tests R1 20 mL R2 7,5 mL R3 7,5 mL R4 1 mL R5 1 mL


REF 4500200 : 200 tests R1 2 x 20 mL R2 2 x 7,5 mL R3 2 x 7,5 mL R4 1 mL R5 1 mL

SUPPORT TECHNIQUE ET COMMANDES


Tel : (33) 03 23 25 15 50
Fax : (33) 03 23 256 256
| IVD USAGE IN VITRO

INTERET CLINIQUE (1) (2) REACTIFS ET MATERIEL COMPLEMENTAIRES


La Syphilis est une maladie vénérienne causée par un micro-organisme 1. Pipette de précision adéquate pour distribuer 10, 25, 75, 190 µL.
spirochaete T. pallidum. Ce micro-organisme ne pouvant être cultivé sur 2. Plaque de microtitration à fond en U.
milieu artificiel, le diagnostic de la syphilis est basé sur la corrélation des
données cliniques et la détection d’anticorps spécifiques par des tests
sérologiques. Les tests de dépistage de la syphilis utilisant la cardiolipine STABILITE ET CONSERVATION
associée à la lécithine comme antigène sont simples d’emploi mais des Stocker à 2-8°C et à l’abri de la lumière
faux positifs sont fréquents en raison de la nature non-tréponémique des • En l’absence de contamination, stockés dans le flacon d’origine et utilisés
antigènes. comme indiqué dans la notice, les réactifs sont stables jusqu’à la date de
Les tests TPI (Treponema pallidum Immobilisation) et FTA-ABS péremption indiquée sur l’étiquette du coffret.
(Fluorescent Treponema Assay) utilisent le Treponema pallidum pathogène • Les flacons contenant les réactifs doivent être stockés à l’endroit.
comme antigène mais présentent quelques désavantages pour les tests de • Rejeter tout réactif contaminé ou qui ne donne pas des résultats corrects
routine. Le test TPI nécessite d’utiliser T. pallidum pathogène vivant et le avec les sérums de contrôle.
test FTA-ABS requière l’utilisation d’un microscope à fluorescence. De • Ne pas utiliser les réactifs après la date de péremption.
plus, ces tests nécessitent un niveau élevé de compétences. • Les réactifs contenus dans chaque coffret ont été standardisés pour
Le test TPHA est reconnu pour sa commodité d’utilisation et sa spécificité produire la réaction attendue et ne doivent donc pas être interchangés
pour le diagnostic des infections tréponémiques, sa spécificité est avec d’autres lots.
comparable à celle du test TPI et sa sensibilité proche de celle du test
FTA-ABS. Il ne nécessite qu’un minimum d’instruments de laboratoire et PRECAUTIONS
est très simple à réaliser.
Les réactifs BIOLABO sont destinés à du personnel qualifié, pour un usage
in vitro.
PRINCIPE • Utiliser des équipements de protection (blouse, gants, lunettes).
Le test TPHA est un test d’hémagglutination indirect (IHA) pour la • Ne pas pipeter avec la bouche.
détermination d’anticorps de T. pallidum dans le sérum/plasma humain. • Ne pas utiliser de réactifs endommagés ou contaminés.
Des érythrocytes aviaires stabilisés sont sensibilisés par des composants • En cas de contact avec la peau ou les yeux, rincer abondamment à l’eau
antigéniques de T. pallidum pathogène (souche de Nichol). Ces cellules et consulter un médecin.
« test » agglutinent en présence d’anticorps spécifiques de T. pallidum et • Les réactifs contiennent de l’azide de sodium (concentration < 0,1%) qui
forment une image (voile) caractéristique dans les puits d’une plaque de peut réagir avec les métaux tel que le cuivre ou le plomb des
microtitration. canalisations . Rincer abondamment.
Toute réaction non spécifique est détectée par l’utilisation des cellules • Les contrôles sont réalisés à base de sérums humains. Chaque sérum
« Contrôle » qui sont des érythrocytes aviaires non sensibilisés. humain utilisé dans la fabrication des contrôles a été analysé et a donné
Les anticorps de tréponème non pathogènes sont adsorbés par un extrait des résultats négatifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg),
de tréponèmes de Reiter, inclus dans la suspension de cellules Test. les anticorps de l’hépatite C (anti-HCV) et du VIH 1 et VIH 2. Cependant
Le résultat du test est obtenu en 45-60 minutes et le voile caractéristique comme aucun test ne peut garantir de façon absolue l’absence de tout
de l’agglutination cellulaire est facilement lisible et persistante. agent infectieux, traiter ce produit comme potentiellement infectieux.
• Pour plus d’informations, la fiche de données de sécurité peut être
REACTIFS obtenue sur simple demande.
• Elimination des déchets : respecter la législation en vigueur. Les
Flacon R1 Tampon de dilution accessoires réutilisables doivent être stérilisés par une méthode
Diluant pour la prédilution des spécimens appropriée après utilisation. Les accessoires à usage unique doivent être
considérés comme des déchets potentiellement infectieux et incinérés ou
Flacon R2 Suspension de cellules Test autoclavés. Des déversements accidentels de matériel potentiellement
infectieux doivent être absorbés et traités comme ci-dessus. La surface
Erythrocytes aviaires stabilisés sensibilisés avec l’antigène de T.
potentiellement contaminée doit être désinfectée avec un désinfectant ou
pallidum. de l’alcool à 70%.
Flacon R3 Suspension de cellules Contrôle Par mesure de sécurité, traiter tout spécimen comme potentiellement
infectieux, dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire. Respecter
Erythrocytes aviaires stabilisés. la législation en vigueur.
Flacon R4 Sérum de contrôle Positif (prédilué au 1/20)
Sérum humain contenant des anticorps contre T. pallidum. PRELEVEMENT ET PREPARATION DU SPECIMEN
Prêt à l’emploi. Le test quantitatif donne un résultat équivalent à un titre Sérum : Prélever un échantillon de sang de patient et laisser coaguler.
de 1/640 à 1/2560. Centrifuger le sang coagulé et séparer le sérum clair. Travailler
impérativement sur sérum fraîchement prélevé.
Flacon R5 Sérum de contrôle Négatif (prédilué au 1/20) Plasma : Prélever un échantillon de sang de patient dans un flacon de
collecte de plasma. Centrifuger le spécimen et séparer le plasma clair.
Sérum humain exempt d’anticorps contre T. pallidum. Travailler impérativement sur plasma fraîchement prélevé.
Ne pas utiliser de sérum ou plasma hémolysé, contaminé ou lipémique qui
PREPARATION DES REACTIFS sont susceptibles d’interférer avec le test.
Le sérum peut être conservé à 2-8°C pendant au moins 7 jours.
Les réactifs sont prêts à l’emploi. Pour une durée prolongée, stocker à -20°C (une fois seulement).
Homogénéiser les échantillons congelés avant utilisation.

IVD REF LOT →


Fabricant Date de péremption Usage “In vitro” Température de conservation Référence Produit Consulter la notice Numéro de lot Conserver à l’abri de la lumière Suffisant pour diluer avec

Made in France Dernière version : www.biolabo.fr Version : 18/09/2014


INTERFERENCES INTERPRETATIONS DES RESULTATS
Les anticorps développés lors d’une Syphilis peuvent persister après la Méthode qualitative:
guérison. C’est pourquoi un test TPHA positif peut indiquer une infection RESULTATS CELLULES TEST CELLULES CONTROLE
présente ou passée. Fortement Positif Voile de cellules couvrant la Pas d’agglutination,
De même que d’autres tests de sérodiagnostic le test TPHA ne permet pas de totalité du fonds du puits. bouton compact
distinguer la syphilis d’autres infections tréponémiques (ex : pian). Légèrement Voile de cellules couvrant Pas d’agglutination,
Les signes cliniques doivent être pris en considération. Positif environ 1/3 du fonds du puits. bouton compact
Bien que le test TPHA soit très spécifique, des résultats faux positifs ont été Indéterminé Voile de cellules avec un trou Pas d’agglutination,
constatés chez des patients souffrant de lèpre, mononucléose infectieuse et central bien visible bouton compact
troubles du tissu conjonctif. Négatif Cellules compactées en un Pas d’agglutination,
Le test FTA-ABS permet la différentiation entre les IgG et les IgM plus bouton central, habituellement bouton compact
précoces et peut donc être utilisé pour confirmer le test TPHA. Ce test est avec un petit centre clair.
aussi très utile dans le cas de Syphilis très précoce où le test Non-spécifique * Réaction Positive Réaction Positive
d’hémagglutination peut rendre des résultats négatifs.
Méthode quantitative :

CONTRÔLE DE QUALITE - + + + + + +/- -


Contrôles positif et négatif inclus dans le coffret.
Programme externe de contrôle de la qualité.
Il est recommandé de contrôler dans les cas suivants :
• Au moins un contrôle par série. Négatif 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120
• Au moins un contrôle par 24 heures. Le titre correspond à la plus forte dilution conduisant à une agglutination.
• Changement de flacon de réactif. Tout spécimen donnant une agglutination inférieure à “+/-“ est négatif.
Si les résultats du contrôle sont incorrects, appliquer les actions suivantes: Tout spécimen donnant une agglutination supérieure à “+/-“ doit être
1. Répéter le test en utilisant le même contrôle. considéré provisoirement comme Positif. Le Test doit être répété en
2. Si les résultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de contrôle et duplicate, en ajoutant les cellules Contrôle dans la première série de puits et
répéter le test. les cellules test dans l’autre série.
3. Si les résultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de réactif et Si l’agglutination est plus forte dans la série de cellules test que dans la série
répéter le test de cellules Contrôle, le spécimen contient des anticorps anti-tréponémiques
4. Si les résultats sont encore incorrects, contacter le service technique et sera soumis à d’autres tests de confirmation.
BIOLABO ou le revendeur local.
Si l’agglutination dans la série de cellules Contrôle est supérieure ou égale à
celle de la série de cellules test, la procédure ci-dessous pour absorption non
PERFORMANCES spécifique doit être appliquée.
Spécificité : deux études indépendantes sur 2900 sérums de donneurs « Procédure en cas d’adsorption non spécifique » :
appartenant à une population à faible risque ont montré chacune 100% de
consensus avec des méthodes préexistantes. Le taux de réactivité initiale était 1. Transférer 100 µL de sérum à tester dans un petit tube puis ajouter 400 µL
de 0,1% et le taux de réactivité répété était de 0%. de cellules Contrôle. Bien mélanger et laisser incuber une heure.
2. Centrifuger 15 minutes à 1000 tpm et tester le surnageant avec la méthode
Une étude indépendante sur sérum anténatal montre 100% de spécificité
qualitative.
(avec 95% de confiance, 98,04%-100%).
Remarque: Le spécimen est ainsi dilué au 1/5, ceci doit être pris en
Sensibilité : Une étude interne réalisée sur 110 spécimens déterminés comme considération pour préparer les dilutions. Si le résultat est à nouveau non
positifs donne 100% de résultats positifs (avec 95% de confiance, spécifique, répéter le test avec une autre méthode : ex. Réagine ou FTA-ABS.
98,04-100%)
Interprétations des résultats :
Des réactions fortement positives peuvent conduire à des pliures en bordure
MODE OPERATOIRE (TECHNIQUE MANUELLE) du voile cellulaire.
Quand le puits Test est positif, il faut également observer le puits Contrôle.
METHODE QUALITATIVE Les cellules Contrôle se tassent en un bouton compact. Elles ne doivent en
Prévoir 3 puits de la plaque de microtitration par échantillon. aucun cas servir de référence en tant qu’image de non-réactivité car les
1. Ramener chacun des composants à température ambiante. cellules Contrôle apparaissent sous la forme d’un bouton plus compact que les
2. Ajouter 190 µL de diluant dans le puits 1. cellules Test non réactives.
3. Ajouter 10 µL de sérum dans le puits 1. Une agglutination dans le puits de contrôle indique la présence d’agglutinines
4. A l’aide d’une micropipette, mélanger le contenu du puits 1 et transférer 25 non-spécifiques dans le spécimen, un tel résultat doit être considéré comme
µL de cette dilution 1/20 dans les puits 2 et 3. NON VALIDE. Un sérum donnant ce type de résultat doit être adsorbé en
5. Remettre en suspension par retournement les cellules Test et Contrôle. utilisant les cellules Contrôle comme indiqué dans la « Procédure en cas
6. Ajouter 75 µL de cellules Contrôle dans le puits 2. d’adsorption non spécifique ». Une réaction douteuse avec les cellules Test
7. Ajouter 75 µL de cellules Test dans le puits 3. est considérée comme INDETERMINEE. Ce résultat peut correspondre à un
8. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits. début de Syphilis primaire ou à un pian. Ces spécimens doivent dans un
9. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et de premier temps être testés à nouveau avec la méthode qualitative puis
toutes sources de vibration. ultérieurement pour vérifier si le titre augmente ou non. Il est également
10. Incuber 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats. recommandé de réaliser un test de confirmation Réagine et/ou un autre test
11. Les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les (FTA-ABS) pour compléter le tableau diagnostique.
précautions ci dessus sont respectées.
12. A la fin du test, jeter les plaques usagées (voir § Précautions). REFERENCES
(1) Rathlev T. - Haemagglutination tests utilizing antigens from pathogenic and apathogenic
METHODE SEMI-QUANTITATIVE Treponema pallidum WHO/VDT/RES 1965 ; 77 : 65.
Prévoir 8 puits de plaque de microtitration par échantillon. Identifier de A à H. (2) Tomizawa T, Kasamatsu S. - Haemagglutination tests for diagnosis of syphilis. A preliminary
1. Distribuer 25 µL de diluant (flacon R1) du puits B à H inclus. report. Japan. J. Med. Sci. Biol. 19, 305-308, 1966.
2. Transférer 25 µL de sérum dilué 1/20 du test de dépistage dans les puits (3) Rathlev T. - Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the
serodiagnosis of syphilis. Br J Vener Dis 1967 ; 43 : 181-5
A et B. Bien mélanger le contenu du puits B. (4) Tomizawa T. Kasamatsu S. Yamaya S. - Usefulness of the haemagglutination test using
3. Prélever 25 µL de sérum dilué du puits B et diluer en aliquotes de 25 µL Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. Jap J Med Sci Biol 1969 ;
de manière répétée du puits B à H inclus, en rejetant 25 µL de la dilution 22 : 341-50.
du puits H. (5) Sequeira P,J,L. Eldridge A,E. - Treponemal Haemagglutination test. Br J Vener Dis 1973 ; 49
4. S’assurer que les cellules test sont bien remises en suspension. Ajouter : 242-8.
75 µL de cellules test du puits A à H inclus. Ceci conduit a une dilution (6) Larsen S.A., Hambie E.A., et coll., Specificity, sensitivity and reproducibility among the
fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for Treponema
1/80 dans le puits A jusqu’à 1/10240 dans le puits H. pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J. Clin. Microbiol.,
5. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits. 1981 ; 14 : 441 – 445.
6. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et de (7) Paris Hamelin, A., Dreux P. et coll. – Tréponématoses : aspects cliniques et biologiques.
toutes sources de vibration. Feuill. Biol. 1991a ; 23 : 88-89.
7. Incuber 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats. (8) Houng H. - Syphilis : new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992 ; 3 : 391-413.
(9) Sluis J.J. Van Der. - Laboratory Techniques in the diagnosis of syphilis : a review. Genitourin
8. Les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les Med. 1992 ; 68 : 413-9.
précautions ci dessus sont respectées. (10) Daguet G.L. - Diagnostic Biologique de la Syphilis. Technique et Biologie, 1995 ; 120 :5-30.
9. A la fin du test, jeter les plaques usagées (voir § Précautions). (11) North ML et Guntz Ph. Sérodiagnostic de la syphilis. La Revue Française des Laboratoires,
1997 ; 294 : 51-58

Made in France Dernière version : www.biolabo.fr Version : 18/09/2014