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gov/pmc/articles/PMC34941/

Des glucanes α (1 → 4) phosphorylés comme substrat


de l'enzyme I. ramifiant l'amidon de pomme de terre

L'implication possible de l'enzyme de ramification I de l'amidon de pomme de terre


(Solanum tuberosum L.) (PSBE-I) dans la synthèse in vivo d'amylopectine
phosphorylée a été étudiée dans des expériences in vitro avec du PSBE-I isolé
utilisant des protéines non phosphorylées marquées au 33H, marquées au 33P et
marquées au 33H (1 → 4) glucanes comme substrats. Il a été démontré que PSBE-I
catalysait la formation de polysaccharides ramifiés phosphorylés à double marquage
(3H / 33P) avec un degré de polymérisation moyen de 80 à 85. La masse moléculaire
relativement élevée indiquait que le produit était le résultat de multiples réactions de
transfert de chaîne. La présence de points de ramification α (1 → 6) a été
documentée par traitement à l'isoamylase et par chromatographie sur échangeur
d'anions. Bien que les étapes initiales du mécanisme in vivo responsable de la
phosphorylation de l'amidon de pomme de terre restent floues, la présente étude
démontre que le mécanisme enzymatique disponible dans la pomme de terre a la
capacité d'incorporer des glucanes α (1 → 4) phosphorylés dans des polysaccharides
neutres dans une réaction catalytique interchaîne. . Les mini-tubercules de pomme
de terre ont synthétisé l'amidon phosphorylé à partir de 33PO43− et de [U14C] Glc
fournis de manière exogène à des vitesses 4 fois supérieures à celles obtenues
auparavant avec des tubercules de plants de pomme de terre complètement
développés. Ce système était plus reproductible que les tubercules cultivés dans le
sol et a donc été utilisé pour la préparation de chaînes de glucane α (1 → 4)
phosphorylées marquées au 33P.

L'amidon est composé des deux polymères, l'amylose et l'amylopectine. Les


molécules d'amylose sont essentiellement des chaînes de glucanes α (1 → 4)
linéaires, alors que les molécules d'amylopectine sont fortement ramifiées et
contiennent souvent de petites quantités de phosphate lié par covalence (Hizukuri et
al., 1970). L'amidon de pomme de terre se caractérise par une teneur élevée en
phosphate par rapport à l'amidon de céréale (Rooke et al., 1949; Hizukuri et al.,
1970). Les groupes phosphates sont situés sous forme de monoesters aux positions
C-6 (environ 70%) et C-3 (environ 30%) des résidus Glc (Hizukuri et al., 1970;
Takeda et Hizukuri, 1982). Les niveaux de phosphorylation diffèrent de 3 fois parmi
les variétés de pommes de terre (Bay-Smidt et al., 1994) et dépendent fortement des
conditions de croissance (Nikuni et al., 1969). Les petits granules d'amidon
contiennent environ 25% plus de phosphate lié par résidu Glc que les gros granules,
alors que le niveau global de phosphorylation ne dépend pas de la taille du tubercule
(Nielsen et al., 1994).
Dans une étude précédente, il avait été découvert que la phosphorylation était
concomitante à la synthèse de novo de l'amidon dans les disques de tubercules de
pomme de terre (Solanum tuberosum L.) (Nielsen et al., 1994). Cependant, le
mécanisme sous-jacent à la phosphorylation de l'amidon reste insaisissable. Ni
l'identité d'un intermédiaire phosphorylé, qui pourrait être incorporé dans les
chaînes de glucane α (1 → 4), ni le système enzymatique responsable de son
incorporation ne sont connus.

Étant donné que l'amylopectine est phosphorylée et que l'amylose ne l'est pas, il est
intéressant de déterminer si le SBE de la pomme de terre (EC 2.4.1.18) peut utiliser
des glucanes phosphorylés comme substrat. Dans la présente étude, nous avons testé
l'implication possible de la SBE dans la formation d'amidon phosphorylé. Le mode
d'action normal du SBE consiste à catalyser le clivage d'une liaison glucosidique α (1
→ 4), suivi d'une condensation du glucane α (1 → 4) libéré en une chaîne accepteur,
introduisant ainsi une glucosidie α (1 → 6). lien. Le mécanisme catalytique peut
impliquer une liaison séquentielle de la chaîne accepteuse puis de la chaîne donneuse
(Borovsky et al., 1976) ou, en variante, une liaison de deux chaînes de glucane α (1 →
4) ayant formé une double hélice.

Les glucanes avec un DP inférieur à 40 ne servent pas de substrat pour le PSBE-I à 30


° C (Borovsky et al., 1976). Cependant, à des températures plus basses, lorsque la
formation de doubles hélices est facilitée, des chaînes plus courtes servent de
substrats et la présence de points de ramification stimule la vitesse de catalyse
(Borovsky et al., 1975b). Cela suggérerait que PSBE-I agisse sur une double hélice de
glucane α (1 → 4) plutôt que sur deux chaînes de glucane α (1 → 4) non associées.
Cette hypothèse a également été étayée par le suivi de l'association entre le PSBE-I et
les malto-oligosaccharides linéaires (Blennow et al., 1998b). L'association maximale
s'est produite avec des chaînes avec un DP de 10 à 15, ce qui coïncide avec la
longueur minimale de chaîne de 10 Glc nécessaires à la formation initiale de la
double hélice par des maltooligosaccharides linéaires (Gidley et Bulpin, 1987). En
conséquence, une implication de SBE dans la synthèse d'amylopectine phosphorylée
nécessiterait que l'enzyme puisse utiliser des α-glucanes phosphorylés ayant un DP
de 10 à 15 ou de préférence plus grand comme substrat. De tels glucanes
phosphorylés peuvent être dérivés de l'amidon de tubercule de pomme de terre en
débranchant avec de l'isoamylase (Blennow et al., 1998a). Une version radiomarquée
des glucanes peut être obtenue par marquage in vivo préalable du phosphate lié à
l'amidon, comme décrit par Nielsen et al. (1994). En utilisant de tels α (1 → 4)
glucanes marqués au 33P et des α (1 → 4) glucanes non phosphorylés marqués avec
3H à l'extrémité réductrice en tant que substrats, nous démontrons que le PSBE-I
catalyse les réactions de transfert de chaîne en utilisant les glucanes linéaires
phosphorylés comme donneurs. former des polysaccharides phosphorylés ramifiés.
MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Produits chimiques et réactifs


Les produits chimiques et la phosphorylase a provenant du muscle du lapin ont été
fournis par Sigma, l’isoamylase était de Megazyme (Sydney, Australie), l’a-amylase
(Termamyl Type L) de Novo Nordisk A / S (Bagsværd, Danemark) et les substances
radiochimiques d’Amersham.

Matériel végétal et culture in vitro

Des plantes de pomme de terre (Solanum tuberosum L. cv Dianella) ont été cultivées
en serre comme décrit précédemment (Nielsen et al., 1994). Des tubercules d'environ
5 cm de diamètre ont été récoltés à partir de plantes âgées de 4 mois, rincés à l'eau
du robinet et utilisés immédiatement pour des expériences d'incubation. Les mini
tubercules ont été cultivés comme décrit par Visser et al. (1994) avec la modification
suivante: Des plantes stériles, cultivées in vitro, utilisées comme plantes donneuses,
ont été initialement obtenues en plaçant des sections de tige stérilisées en surface à
partir de plantes cultivées en serre sur un milieu induisant des pousses. Les plants de
pomme de terre in vitro ont été cultivés à 22 ° C en utilisant une période de lumière
de 14 h (160 µmol m -2 s -1). Pour l'induction des tubercules, une section de tige (1
cm) avec un bourgeon auxiliaire au repos et une feuille complètement développée a
été excisée d'une plante donneuse. La feuille a été retirée et la tige a été transférée
dans un milieu induisant des tubercules et placée dans un endroit sombre à 14 ° C. Au
bout de 4 semaines, les tubercules formés (3 mm de diamètre) ont été récoltés et
utilisés immédiatement pour des expériences.

Expériences de radiomarquage

Incubation de mini tubercules


Six mini tubercules (chacun pesant environ 100 mg de poids frais) ont été coupés en
moitiés et incubés pendant 4 h (volume total: 100 μL) dans 300 mm Glc et 3,7 MBq
33PO43− ou dans 300 mm de sorbitol et 74 kBq [U-14C] Glc à température ambiante.
Trois disques de tubercules de pomme de terre (chacun pesant environ 100 mg de
poids frais) ont été excisés de tubercules cultivés dans le sol (5 cm de diamètre)
comme décrit précédemment (Nielsen et al., 1994) et incubés de la même manière
que les mini-tubercules.

Isolement des granules d'amidon

Les granules d'amidon ont été isolés et lavés comme décrit précédemment (Nielsen
et al., 1994), en incorporant deux lavages supplémentaires de l'amidon dans 10 ml
d'acide phosphorique à 100 mm pendant 5 min à température ambiante.

Isolement des α (1 → 4) glucanes phosphorylés marqués au 33P

L'amidon isolé marqué au 33P (environ 10 mg) issu de l'expérience d'incorporation a


été gélatinisé (2 ml d'eau, 5 min, 100 ° C). Après addition d'acétate de sodium (pH
4,0) à une concentration finale de 50 mm, l'amidon a été déramifié par l'isoamylase
(2 unités, 2 h, 37 ° C). Après la période d'incubation, l'enzyme a été inactivée par
ébullition (5 min) et les glucanes phosphorylés produits ont été isolés par
chromatographie sur échangeur d'anions (DEAE-Sepharose, Pharmacia) comme
décrit dans Blennow et al. (1998a). La teneur en 33P de chaque fraction a été
quantifiée par comptage à scintillation liquide. La teneur en sucres totaux a été
déterminée en utilisant la méthode de l'acide phénol sulfurique (Dubois et al., 1956).
Après séparation des glucanes neutres et phosphorylés, le matériau a été lyophilisé
et utilisé immédiatement pour des expériences.

Pour la dégradation enzymatique, les glucanes phosphorylés (0,1 mg) ont été dissous
dans 0,5 ml de Mes, 5 mm, CaCl2 4 mm, pH 6,5 et incubés avec de l'a-amylase (1
unité, 2 h, 25 ° C). Après incubation, un échantillon de 100 μL a été immédiatement
appliqué sur une colonne échangeuse d'anions CarboPac PA-100 (voir ci-dessous) et
analysé à l'aide de la méthode décrite par Blennow et al. (1998a).

Synthèse de glucanes α (1 → 4) et réduction avec NaB (3H) 4


Les glucanes α (1 → 4) ont été synthétisés par incubation (37 ° C, 20 h) de
phosphorylase a du muscle de lapin (100 unités) dans 20 ml de maltoheptaose de
0,35 mm, de 60 mm de Glc-1-P et de 1 mm d’AMP (pH). 7.0). Après inactivation de
l'enzyme (100 ° C, 5 min), la fraction de glucane résultante a été précipitée avec de
l'éthanol à 80% (v / v), lyophilisée et stockée à -20 ° C.

Une modification de la méthode de Borovsky et al. (1976) ont été utilisés pour
synthétiser chimiquement un substrat de glucane α (1 → 4) non phosphorylé
marqué par 3H. Des glucanes neutres (1 mg) dans 100 ul de NaOH 0,1 n ont été mis à
réagir avec 0,5 MBq de NaB (3H) 4 (25 ° C, toute la nuit). Pour assurer une réduction
quantitative de toutes les extrémités réductrices, un excès de NaBH4 non marqué (2
mg dans 200 pi de NaOH 0,1 n) a été ajouté et la réaction a été laissée se poursuivre
pendant 2 h supplémentaires. Le réactif en excès a été détruit par addition de HCl 1 n
jusqu'à ce qu'il ne reste plus d'hydrogène. Le borate précipité a été éliminé par
application de l'échantillon sur une colonne de NAP-10 (Pharmacia) et l'élution des
glucanes a (1 - 4) a été réalisée avec 1,5 ml de tampon phosphate 50 mm (pH 7,5). La
fraction de glucane α (1 → 4) marquée à l'extrémité 3H a été utilisée immédiatement.

Expérience de transfert en chaîne

Le PSBE-I a été isolé des tubercules de pomme de terre jusqu'à homogénéité par
chromatographie d'affinité. Le PSBE-I isolé était dépourvu d'amylases et d'autres
activités hydrolytiques, analysé par des mesures d'activité et une analyse en
zymogramme en utilisant la méthode décrite dans Viksø-Nielsen et al. (1998). Pour
les expériences de transfert de chaîne, PSBE-I (10 ng) a été incubé (25 ° C, 2 h) avec
des α (1 - 4) glucanes phosphorylés marqués au 33P (1 mg), solubilisés dans 0,25 ml
de NaOH 0,1 n et neutralisés avec 0,1 n HCl) et avec des α (1 → 4) glucanes marqués
avec 3H (1 mg) dans 0,5 ml de tampon au phosphate de sodium de 50 mm, pH 7,5,
0,05% de n-octylglucoside et 0,1 mg / ml de BSA.

L'enzyme a été inactivée par ébullition (5 min) et le produit résultant a été appliqué à
une colonne échangeuse d'anions (1 x 5 cm, DEAE-Sepharose) équilibrée dans Mes 5
mm, pH 8,0. Les glucanes neutres ont été lavés de la colonne avec 15 ml d'eau. Les
glucanes phosphorylés ont ensuite été élués avec 15 ml de NaCl à 100 mm et de HCl à
10 mm (fractions de 1,5 ml).

Chromatographie par perméation de gel


La distribution des masses moléculaires des substrats et du produit phosphorylé
obtenus à partir de la réaction de transfert de chaîne a été analysée à l'aide d'une
colonne (830 x 26 mm) de Sephacryl S-200 (Pharmacia) comme décrit par ailleurs
(Blennow et al., 1998a) et étalonnée. en utilisant un mélange de glucanes α (1 → 4)
linéaires comme marqueurs de masse moléculaire.

HPAEC

Un système DX 500 (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) équipé d’un échantillonneur


automatique S-3500 et d’une colonne CarboPac PA-100 a été utilisé pour analyser les
chaînes de glucanes α (1 → 4) isolés, neutres et phosphorylés (Blennow et al.,
1998a).

Comptage par scintillation liquide

L'incorporation de 33PO43− et de [U-14C] Glc dans de l'amidon a été mesurée à


l'aide d'un compteur à scintillation liquide WinSpectral 1414 (Wallac, Helsinki,
Finlande) avec le logiciel WinSpectral version 1.0 et le liquide à scintillation Ecoscint
A (National Diagnostics, Manville, NJ). Les échantillons contenant 3H et 33P ont été
comptés en utilisant une bibliothèque d'isotopes distincte pour chaque isotope et une
correction automatique des chevauchements de courbes.

RÉSULTATS

Incorporation de phosphate dans l'amidon

L'incorporation de 33PO43- et de [U-14C] Glc dans de l'amidon à l'aide de mini-


tubercules s'est révélée 4 fois plus efficace que l'incorporation dans des disques de
tubercules de pomme de terre (Tableau I). L'incorporation était linéaire avec le
temps jusqu'à 4 heures et se poursuivait pendant au moins 14 heures (données non
présentées). Ces résultats sont similaires à ceux rapportés précédemment avec les
disques de tubercules de pomme de terre (Nielsen et al., 1994). Sur cette base, le
système de mini tubercules a été choisi comme système expérimental optimal pour la
production de chaînes de α-glucanes phosphorylés radiomarquées.

Tableau I
Incorporation de [U-14C] Glc et de 33PO43− dans de l'amidon à l'aide de disques de
tubercules de pomme de terre et de mini-tubercules de pomme de terre après 4 h
d'incubation
Isolement Et Caractérisation Du Glucane α (1 → 4) Marqué À L'aide De 33P De
L'amidon Debranched

Des chaînes de glucane α (1 → 4) phosphorylées ont été isolées à partir d'amidon


déramifié par l'isoamylase par chromatographie sur échangeur d'anions. Les chaînes
de glucane neutres ont été élues de la colonne avec du Tris-HCl de 5 mm, pH 7,5
(figure 1.1, figures 1 à 6), puis les chaînes de glucane phosphorylées ont été ensuite
éluées avec 100 mm de NaCl et 10 mm. HCl, pH 2,0 (fractions 13 à 18).
Figure 1
Isolement d'α (1 → 4) glucanes phosphorylés marqués au 33P par chromatographie d'échange
d'anions d'amidon débranché de l'isoamylase isolé à partir de mini-tubercules de pomme de terre. Les
glucanes phosphorylés ont été élués avec 100 mm de NaCl et 10 mm d'HCl, pH 2,0. Les barres
représentent la radioactivité provenant d'α (1 → 4) glucanes phosphorylés marqués au 33P.

Les glucanes phosphorylés isolés ont été lyophilisés, redissous dans NaOH
0,1 n et fractionnés par HPAEC. La présence possible de chaînes de glucane
phosphorylées portant plus d'un groupe phosphate et une localisation
interne variable du groupe phosphate dans chaque chaîne de glucane,
associées à la variabilité de la longueur de la chaîne, ont abouti à un profil
d'élution large. La radioactivité a été éluée dans les mêmes fractions que le
glucane phosphorylé (Fig. (Fig.2,2, A et B). Pour garantir que tout le
marqueur 33P provenait de groupes phosphate liés à α (1 → 4) glucane,
une fraction Le profil d'élution obtenu (Fig. (Fig.2C) 2C) était celui attendu
de la conversion du glucane phosphorylé en un oligosaccharide plus court.
Le schéma de marquage superposable (Fig.2D) 2D) documente le fait que
le marqueur 33P détecté dans l'échantillon non dégradé (Fig.2B) 2B) est
lié aux chaînes de glucane α (1 → 4).
Figure 2
A, Profil d'élution des chaînes de glucane α (1 → 4) phosphorylées marquées au 33P,
déterminé par HPAEC / PAD. B, Distribution de la radioactivité du 33P dans des
fractions de 1 mL de l'éluat échangeur d'anions de A. C, Élution de l' α (1 → 4) glucane
phosphorylé à la limite de l'a-amylase. D, élution de la radioactivité de 33P dans des
fractions de 1 mL de l'éluat échangeur d'anions dans C. nC, Nanocoulombs.

Synthèse de glucane α (1 → 4) à l'aide de phosphorylase a

Pour créer un second substrat bien défini pour PSBE-I, le glucane non
phosphorylé α (1 → 4) a été synthétisé à partir de Glc-1-P en utilisant une
phosphorylase a et du maltoheptaose comme amorce. La distribution des
longueurs de chaîne de la fraction de glucane précipitée a été déterminée
par HPAEC et a révélé une distribution approximativement binomiale
culminant à DP 33 (Fig. (Fig.3) .3). Pour produire un substrat marqué au
3H différent des chaînes de glucane phosphorylé marquées au 33P, le
centre anomérique libre a été réduit avec NaB (3H) 4.

figure 3
Distribution des chaînes de glucane α (1 → 4) neutres synthétisées avec la
phosphorylase a de maltoheptaose et de Glc-1-P, déterminée par HPAEC / PAD en
utilisant une colonne CarboPac PA-100. NC, Nanocoulombs.

Transfert de chaîne catalysé par PSBE-I

Les α (1 → 4) glucanes marqués 33P et 3H ont été testés en tant que substrats de PSBE-
I, lesquels ont été isolés jusqu'à homogénéité (Fig. (Fig.4) 4) par chromatographie
d'affinité (Viksø-Nielsen et al. , 1998). Après incubation des glucanes marqués 33P et
3H avec du PSBE-I, la moitié du mélange réactionnel a été appliquée à une colonne
échangeuse d'anions pour séparer les produits neutres et phosphorylés obtenus à
partir du processus de transfert de chaîne. Comme prévu, les produits neutres étaient
exclusivement étiquetés 3H. Au contraire, les produits phosphorylés élués ont été co-
marqués avec 3H et 33P (figure 5A) .5A). Cela indique que PSBE-I a catalysé une
réaction de transfert de chaîne, entraînant la formation d'une liaison covalente entre les
glucanes α (1 → 4) marqués 33P et 3H.
Figure 4
SDS-PAGE et zymogramme de PSBE-I isolés jusqu'à homogénéité par chromatographie
d'affinité γ-cyclodextrine. Ligne A, SDS-PAGE de PSBE-I isolé. Ligne B, Zymogramme de
PSBE-I isolé. L'emplacement des marqueurs de poids moléculaire SDS-PAGE (M. 116
000, 66 000, 45 000 et 27 000) est indiqué à gauche.
Figure 5
Chromatographie par échange d'anions (DEAE-Sepharose) de produits obtenus à partir
d'une réaction de transfert de chaîne catalysée par PSBE-I. A, produits de réactions de
transfert de chaîne catalysées par PSBE-I. B, Échantillon comme dans A, ramifié avec de
l'isoamylase. Les barres noires représentent la radioactivité provenant d' α (1 → 4)
glucanes phosphorylés marqués au 33P. Les barres blanches représentent la
radioactivité provenant des groupes marqués aux extrémités 3H.

Pour démontrer la présence de liaisons α (1 → 6) dans les produits marqués


3H / 33P, la seconde moitié du mélange réactionnel initial a été débranchée
avec de l'isoamylase. La séparation des glucanes non ramifiés par
chromatographie sur échangeur d'anions a révélé une nette séparation des
marquages 33P et 3H en pics distincts (figure 5B) .5B). Cela prouve que
PSBE-I a formé des liaisons α (1 → 6) entre les glucanes marqués 3H et 33P.
La distribution de la masse moléculaire des substrats marqués 3H et 33P
et des produits générés lors du processus de transfert de chaîne (Fig.
(Fig.5A, 5A, fractions 11 à 16)) ont été déterminées par chromatographie
sur gel de perméation (Fig. (Fig.6,6, A, B et C, respectivement). Deux
groupes principaux de produits ont été générés (Fig. (Fig.6C) .6C). Le
premier groupe de produits élue autour de 210 ml et a été marqué avec 3H
et 33P et présentaient un pic principal autour des DP 80 à 85. Le large pic
obtenu indique que les produits synthétisés dans le processus de transfert
de chaîne sont des oligosaccharides complexes contenant le plus souvent
plusieurs points de ramification. mL et était exclusivement marqué avec
33P.
Figure 6
Chromatographie par permeation sur gel de substrats et de produits dans les réactions
de transfert de chaîne catalysées par PSBE-I. A, Distribution des α (1 → 4) glucanes
marqués aux extrémités 3H (Fig. (Fig.3) 3) utilisés comme substrat pour PSBE-I. B,
Distribution de glucanes α (1 → 4) phosphorylés marqués au 33P isolés à partir de
mini-tubercules de pomme de terre (Fig. 1,1, fractions 13 à 18) utilisés comme substrat
de PSBE-I. C, Distribution du produits obtenus à partir de réactions de transfert de
chaîne catalysées par PSBE-I (Fig. (Fig.5A, 5A, fractions 11 à 16)) après élimination des
chaînes neutres par chromatographie sur échangeur d'anions. Le schéma d'élution des
étalons synthétisés à la phosphorylase a la moyenne est indiquée par un DP de 33, 42 et
83. V0, Volume vide. •, Radioactivité provenant de glucanes α (1 → 4) phosphorylés
marqués au 33P; ○, radioactivité provenant des groupes terminaux marqués au 3H;
sucre en μg mL − 1.

DISCUSSION

Dans la présente étude, nous avons démontré que les mini-tubercules de


pomme de terre incorporent efficacement le [U-14C] Glc et le 33PO43−
administrés dans un amidon phosphorylé. Auparavant, Nielsen et al.
(1994) ont utilisé des disques de tubercules de pomme de terre comme
système modèle pour l'analyse de la biosynthèse de l'amidon. Le système
de mini tubercules est supérieur au système de disques de tubercules car
l’amidon phosphorylé est synthétisé à un taux 4 fois plus élevé (Tableau I).
En outre, l’état physiologique des mini-tubercules est bien défini car ils
sont synchronisés en fonction de leur âge et de leur taille (Visser et al.,
1994), offrant ainsi un système expérimental hautement reproductible. En
revanche, l'état physiologique des tubercules récoltés sur des plants de
pomme de terre normaux varie, certains pouvant croître activement,
d'autres de même taille étant au repos, comme en témoigne une activité
beaucoup plus faible de l'appareil de synthèse de l'amidon. Les mini-
tubercules constituent donc un système expérimental approprié pour la
production de chaînes de glucanes dérivées d'amylopectine phosphorylées
marquées au 33P. Le profil d'élution des glucanes phosphorylés obtenus
par HPAEC / PAD (Fig. (Fig.2A) 2A) était similaire aux profils d'élution de
glucanes phosphorylés isolés à partir de plants de pomme de terre
complètement développés (Blennow et al., 1998a).

La présence préférentielle marquée de phosphate dans l'amylopectine par


rapport à l'amylose suggère un lien fonctionnel entre les réactions de
ramification et le mécanisme de la phosphorylation de l'amidon. Les
premières études sur la spécificité de la SBE de pomme de terre à l'aide de
substrats définis ont été menées par Borovsky et ses collaborateurs
(Borovsky et al., 1975a, 1975b, 1976). Cependant, il n'y a aucun rapport
dans la littérature sur les recherches utilisant des glucanes phosphorylés
comme substrat pour l'une des isoformes de la SBE.

Pour surveiller spécifiquement l’apparition de réactions de transfert de


chaîne, les glucanes α (1 → 4) phosphorylés marqués au 33P ont été
utilisés en association avec des chaînes glucanes α (1 → 4) linéaires non
phosphorylées marquées à l’extrémité 3H (Fig. 6,6, A et B,
respectivement). Les produits phosphorylés ont été isolés par
chromatographie sur échangeur d'ions.Le fractionnement en fonction de la
taille par chromatographie sur gel a révélé la formation de
polysaccharides à double marquage (3H / 33P) avec des masses comprises
15 000 D, indiquant qu'ils sont le produit de réactions de transfert de
chaîne (Fig. (Fig.6C) .6C). La fraction mineure dans la plage de masse
comprise entre 4 500 et 6 000 D (éluant autour de 320 mL) pourrait être
phosphorylée α ( 1 → 4) chaînes de glucanes non utilisées par PSBE-I dans
la réaction de transfert de chaîne ou fragments résiduels clivés par PSBE-I
au cours de la réaction.

Deux mécanismes hypothétiques de transfert de chaîne catalysés par


PSBE-I sont décrits dans la figure figure 7.7. Dans la réaction A, il se forme
un produit contenant une radioactivité provenant à la fois du groupe
terminal marqué 3H et du groupe phosphate marqué 33P. De tels produits
ont bien été isolés (Fig. (Fig.5A), 5A), documentant que la réaction A a eu
lieu. Ainsi, nous concluons que PSBE-I est capable d’utiliser un glucane
phosphorylé en tant que chaîne donneuse. Nous ne pouvons ni vérifier ni
exclure que l'enzyme puisse également utiliser un glucane phosphorylé en
tant que chaîne accepteuse (réaction B). Si la réaction B se poursuit, deux
produits mono-marqués contenant du 33P ou du 3H se formeraient. Dans
ce cas, le produit marqué au 33P contiendrait un groupe phosphate chargé
négativement et ce glucane co-éluerait avec le produit formé dans la
réaction A au cours de la chromatographie par échange d'anions. La
troisième possibilité d'une réaction de transfert de chaîne catalysée par le
PSBE-I, à savoir un transfert intra-chaîne impliquant des glucanes
phosphorylés, ne peut être ni vérifiée ni exclue à l'aide des méthodes
utilisées dans cette étude. Un produit issu d'un processus de transfert
intra-chaîne ne peut pas être distingué des produits phosphorylés isolés
sur les figures 5A, 5A, car il co-élue avec les autres produits phosphorylés
en raison du groupe phosphate chargé négativement.
Figure 7
Modèle d'un processus simple de transfert inter-chaîne à médiation par SBE-I de
pomme de terre impliquant une chaîne glucanique α (1 → 4) phosphorylée et une
chaîne neutre. Dans la réaction A, l'α (1 → 4) glucane phosphorylé est utilisé par PSBE-I
en tant que chaîne donneuse. Le glucane α (1 → 4) phosphorylé est clivé et une liaison α
(1 → 6) est formée pour former le glucane α (1 → 4) marqué par 3H. Cette réaction
laisse un fragment résiduel (RF) non étiqueté. Dans la réaction B, la chaîne
phosphorylée est utilisée comme chaîne accepteuse par PSBE-I. Dans cette réaction,
l'extrémité marquée par 3H est clivée de la chaîne donneuse et ensuite une liaison α (1
→ 6) est formée vers la chaîne accepteur phosphorylée. Cette réaction laisse un
fragment résiduel contenant le groupe terminal marqué par 3H. Les groupes de
phosphate sont indiqués avec •; ø représente l'extrémité réductrice, alors que * ø
représente un groupe d'extrémité marqué 3H. Les flèches indiquent le sens de formation
de la liaison glycosidique α (1 → 6).

La SBE est localisée à la surface des granules d’amidon (Kram et al., 1993)
ou fortement liée aux granules d’amidon (Larsson et al., 1996) et est
supposée intégrer des glucanes α (1 → 4) phosphorylés solubles dans
l’amylopectine par la réaction A Fig. (Fig.7) .7). Cela nécessiterait de
longues chaînes de glucanes non ramifiées dépassant de la surface des
granules, comme proposé par Lineback (1986), et l'existence de glucanes
solubles phosphorylés. L'implication possible de PSBE-I dans
l'introduction de glucanes α (1 → 4) solubles dans l'amylopectine est
corroborée par une augmentation observée du pool de glucanes solubles
dans les tubercules de pomme de terre dans lesquels l'activité de PSBE-I a
été réduite par des techniques antisens (Kossmann et al., 1997). Il a été
proposé que les glucanes α (1 → 4) affectent la synthèse de l'amidon dans
les tubercules de pomme de terre (Denyer et al., 1996). Les tubercules de
pomme de terre contiennent de petites quantités de glucanes α (1 → 4)
solubles et ramifiés, qui peuvent être détectés par analyse HPAEC
(données non présentées). Ces glucanes sont probablement synthétisés
dans le stroma d'amyloplaste par des synthases d'amidon solubles ou par
un isoforme de phosphorylase plastidique ayant une affinité pour les
glucanes α (1 → 4) linéaires de faible masse moléculaire (Steup, 1988). La
quantité de glucanes solubles pouvant être obtenue est trop faible pour
permettre une analyse de leur teneur en phosphate. Les α (1 → 4)
glucanes solubles peuvent également provenir de la coupe ou de la
modification de la molécule d'amylopectine par des enzymes débranchées
ou des amylases (Ball et al., 1996; Mouille et al., 1996). Si les α (1 → 4)
glucanes phosphorylés sont dérivés d'un processus d'élimination du
glucane, le transfert de chaîne d'α (1 → 4) glucanes phosphorylés médiés
par PSBE-I peut ne pas être le principal moyen de phosphoryler l'amidon.
Dans ce cas, cela constituerait un moyen de réintroduire les α (1 → 4)
glucanes phosphorylés libérés dans l'amylopectine.

L’étude actuelle montre que les α (1 → 4) glucanes phosphorylés


participent aux réactions de transfert d’α-glucane catalysées par le PSBE-I.
Il reste à déterminer s'il s'agit d'une caractéristique des SBE de la pomme
de terre et donc d'un facteur discriminant vis-à-vis de la formation
d'amylopectine phosphorylée, ou si les SBE d'autres plantes sont
également capables d'utiliser des glucanes α (1 → 4) phosphorylés pour la
production. d'amylopectine phosphorylée. Ce dernier cas impliquerait que
la capacité à former des glucanes phosphorylés est limitée aux plantes
produisant de l'amidon phosphorylé.

ABRÉVIATIONS:

DP: degré de polymérisation


HPAEC: chromatographie haute performance par échange d'anions
PAD: détection ampérométrique pulsée
PSBE-I: enzyme I ramifiant l'amidon de pomme de terre
SBE: enzyme ramifiant l'amidon