Вы находитесь на странице: 1из 15

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю

Г О С У Д АРС Т В Е Н Н О Е О БРАЗО В АТ Е Л Ь Н О Е У ЧРЕ Ж Д Е Н И Е


П РО Ф Е С С И О Н АЛ Ь Н О Г О О БРАЗО В АН И Я
«В О РО Н Е Ж С КИ Й Г О С У Д АРС Т В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РС И Т Е Т »

Больш ой практикум по физ иологии челов екаи


ж ив отны х

Т Е Х НИ К А Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х И С С Л Е Д О В А НИ Й
П ракт и кум

С пеци альност ь 020201 (011600) «Би ологи я»

В оронеж 2005
2

У тв ерж дено научно-методическим сов етом биолого-почв енного


факультета3 ию ня 2005 г., протокол№ 4

С остав итель П оляков а-С еменов аН .Д .

«Больш ой практикум по физ иологии челов ека и ж ив отны х . Т ех ника


гистологических исследов аний » подготов лен на кафедре физ иологии челов ека
и ж ив отны х биолого-почв енного факультета В оронеж ского государств енного
унив ерситета.
Рекомендуется для студентов IV курса биолого-почв енного факультета,
обучаю щ их ся по спец иальности 020201 (011600) «Биология»
3

С О Д Е РЖ АН И Е

В в едение… … … … … … ..… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 4
Т ема1. Ф иксац ия тканей … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 4
1.1 .О бщ ие прав илафиксац ии… … … … … … … … … … … … … … … … 5
1.2 . Ф иксирую щ ие средств аи их применение… … … … … … … … … 5
1.3 . П рактическое з адание I … … … … … … … … … … … … … … ......... 7
Т ема2. П ромы в ание и обез в ож ив ание … … … … … … … … … … … … … … ... 7
2.1. П ромы в ание гистологического материала. .… … … … … … … … 7
2.2. О без в ож ив ание гистологического материала… … … … … … … ... 8
2.3. П рактическое з адание II … … … … … … … … … … … … … … … … .. 8
Т ема3. Залив каматериалав плотны е среды . П риготов ление
гистологических красителей … … … … … … … … … … … … … … … .. 9
3.1. Залив кав парафин .… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 9
3.2. П риготов ление блоков … … … … … … … … … … … … … … … … .. 10
3.3. П рактическое з адание III ...… … … … … … … … … … … … … … … 10
Т ема4. П риготов ление гистологических срез ов … … … … … … … … … … . 11
4.1. П риготов ление срез ов изгистологических блоков .… … … … ... 11
4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле .… … … … … … … … … . 11
4.3. П рактическое з адание IV … … … … … … … … … … … … … … … ...11
Т ема5. О краш ив ание и з аклю чение гистологических срез ов … … … … ... 12
5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание … ..… … … … … … .. 12
5.2. Заклю чение срез ов в смолы … … … … … … … … … … … … … … ...13
5.3. П рактическое з адание V … … … … … … … … … … … … … … … ..14
Т ема6. Анализгистологических препаратов … … … … … … … … … … … … ..14
6.1. П рактическое з адание VI … … … … … … … … … … … … … … .....14
П рилож ение 1 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 15
П рилож ение 2 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .15
Л итература… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 15
4

ВВЕ ДЕ Н И Е

П рактикум по тех нике гистологических исследов аний для студентов ,


спец иализ ирую щ их ся на кафедре физ иологии челов ека и ж ив отны х , посв ящ ен
осв оению методик морфологических исследов аний . О н представ лен ш естью
темами, в каж дой изкоторы х рассматрив аю тся теоретические обоснов ания
раз делов и конкретны е з адания. Д анны й раз дел Больш ого практикума
расш иряет теоретические и практические з нания студентов , полученны е ими
при из учение общ его курса«Г истология».
Работа с методической раз работкой помож ет студентам в ы работать
нав ы ки самостоятельного приготов ления гистологических препаратов и сделать
перв ичны й анализц итоморфологических структур раз личны х в идов тканей .
П еред началом работ по гистологической тех нике студенты прох одят
инструктаж у преподав ателя по т ехнике безопасност и нарабочем месте.
Д ля поз нания з акономерностей раз в ития, строения, обмена в ещ еств и
функц ий клеток и тканей в сов ременной гистологии ш ироко применяю тся
методы исследов аний микроструктур на молекулярном, субклеточном,
клеточном и тканев ом уров нях с помощ ью микроскопиров ания.
Д ля микроскопического из учения исследуемы й объ ект долж ен
удов летв орятьдв ум основ ны м услов иям: 1) он долж ен бы тьпроз рачны м; 2) его
структуры долж ны бы ть контрастны , то есть отличаться одна от другой по
показ ателям преломления или поглощ ения св ета. Больш инств о ж ив отны х
тканей не удов летв оряетэтим требов аниям, поэтому их необх одимо подв ергать
спец иальной обработке с ц елью приготов ления гистологического препаратадля
микроскопического из учения.
О снов ны м методом в гистологических исследов аниях яв ляется из учение
окраш енны х срез ов раз личны х тканей и органов . Т радиц ионны й способ
подготов ки материала для получения постоянного гистологического препарата
в клю чает фи кс аци ю м ат ери ала, проводку (обезвож и вани е), зали вку
(уплот нени е), при гот овлени е ги с т ологи чес ки х с резов, окраши вани е с резов,
заключени е с резоввс вет оопт и чес ки е с реды .

Т Е М А 1. Ф И К С А Ц И Я Т К А НЕ Й

О борудов ание и реактив ы : скальпель средний и глазной , пинц еты - глаз


ной ,
анатомический и х ирургический средний , нож ниц ы средние и больш ие, дв е
чаш ки П етри, лез в ие, стеклянны е бю ксы в местимостью 20-50 мл (15 ш тук),
флаконы для реактив ов и стаканчики в местимостью 50-100 мл, ш ирокогорлы е
банки, перев язочны е материалы .
П икринов ая кислота, ледяная уксусная кислота, формалин (40% раств ор
формальдегида), х лороформ, этилов ы й спирт, дистиллиров анная в ода,
этилов ы й эфир, парафин.
5

1.1. О бщ ие прав илафиксац ии


О бяз ательны м услов ием микроскопической тех ники яв ляется
предупреж дение и з адерж ка посмертны х из менений в тканях . Э то достигается
путем фиксац ии в з ятого для исследов ания материала. В основ е дей ств ия
фиксаторов леж ат физ ико-х имические проц ессы , и, в перв ую очередь, проц есс
коагуляц ии белков .
Ф иксирую щ ая ж идкость долж на отв ечать дв ум основ ны м требов аниям:
перв ое – бы стро проникатьв ткани и в торое – дей ств ов ать«мягко», не в ы з ы в ая
грубы х наруш ений тканев ы х структур (сморщ ив ания, чрез мерного уплотнения
и т. д.).
Н еобх одимо придерж ив аться определенны х прав илфиксац ии.
1. Раз мер исследуемы х кусочков ткани долж ен бы ть таким, чтобы
произ ош ло бы строе его пропиты в ание. В среднем для больш инств а
фиксаторов беруткусочки толщ иной 0,5 – 5 мм.
2. Количеств о фиксирую щ ей ж идкости долж но не менее чем в 20 раз
прев ы ш атьобъ ем исследуемого материала.
3. Ф иксируемы й объ ект нуж но помещ ать так, чтобы обеспечить
однов ременно его пропиты в ание со в сех сторон.
4. Н еобх одимо соблю дать в ремя фиксац ии, которое з ав исит от св ой ств а
фиксирую щ ей ж идкости, исследуемого материала и толщ ины в з ятого
кусочка.
В больш инств е случаев фиксац ию произ в одят при комнатной
температуре. О днако для некоторы х спец иальны х исследов аний (особенно
гистох имических и электронно-микроскопических ) применяю т фиксац ию
ох лаж денны ми ж идкостями при температуре +4оС и ниж е.
Ф иксац ию мож но считать з ав ерш енной после того, как ж идкость
полностью пропитала фиксируемы й объ ект. Рав номерны й ц в ет и одинаков ая
консистенц ия тканей на пов ерх ности раз реза св идетельств ую т о том, что
проц есс фиксац ии з ав ерш ен.

1.2. Ф иксирую щ ие средств аи их применение


С фиксирующ ими смесями следует обращ ат ься сост орожност ью!
Ф иксаторы раз деляю тнадв е основ ны е группы – просты е и слож ны е.
К просты м фиксаторам относятся формалин, этилов ы й спирт, ац етон,
дих лорид ртути ( сулема), соли тяж елы х металлов ( кобальт, платина, уран и т.
д. ) и кислоты ( уксусная, трих лоруксусная, пикринов ая, осмиев ая, х ромов ая и
др. ).
Н аиболее распространенны ми фиксаторами яв ляю тся этилов ы й спирт и
формалин.
Эт анол осущ еств ляетбы струю фиксац ию , не требую щ ую обез в ож ив ания
тканей перед з алив кой в парафин и ц еллоидин. Е го фиксирую щ ее дей ств ие
осущ еств ляется за счет обез в ож ив ания тканей и коагуляц ии белков , при этом
происх одитобез ж ирив ание и сущ еств енное уплотнение тканей .
6

И спольз ую т 96 % и абсолю тны й этилов ы й спирт. В ремя фиксац ии


з ав исит от материала: для тонких кусочков ткани толщ иной 0,5 – 2 мм оно
состав ляет 15 – 30 минут, для кусочков в 3 – 4 мм соотв етств енно
ув еличив ается до 2 – 3 часов .
П риг от овление раст вора формалина.
Раств ор формалина (40% раств ор формальдегида) раз в одят
в одопров одной в одой (дистиллиров анная в ы з ы в ает набух ание тканей ) в
соотнош ении: 1 частьформальдегидаи 10 частей в оды .
П риготов ленны й раств ор формалина необх одимо ней трализ ов ать. В
банку насы паю ткарбонаткальц ия (или магния), чтобы надне образ ов ался слой
толщ иной 1,5 – 2 см. Затем налив аю т формалин, несколько разэнергично
в стрях ив аю ти остав ляю тотстаив аться на2 суток.
В ремя фиксац ии тканей в раств оре формалина от 24 – 48 часов до
нескольких суток.
В гистологической практике часто использ ую тся слож ны е фиксаторы .
Ж идкост ь Б уэна.
Э тот фиксатор яв ляется одним излучш их фиксаторов , так как бы стро
проникает в ткани, в ы з ы в ая незначительное их сж атие, и поз в оляет х орош о
окраш ив ать тканев ы е структуры . Е го применяю т для приготов ления обз орны х
препаратов , для фиксац ии тканей эмбрионов .
Ж идкостьБуэнаготов ится непосредств енно перед фиксац ией .
С остав : Раств ор пикринов ой кислоты (насы щ енны й ) 75 мл
Ф ормалин 25 мл
Л едяная уксусная кислота 5 мл
П икринов ая кислота плох о раств оряется в в оде. Е е насы щ енны й раств ор
необх одимо приготов ить з аранее. В сосуд насы паю т 25-30 г кристаллической
кислоты и з алив аю т1 л горячей дистиллиров анной в оды . И з бы ток кислоты при
ох лаж дении в ы падает в осадок и мож ет бы ть использ ов ан при приготов лении
нов ой порц ии раств ора. Раств ор мож но х ранить неограниченны й период
в ремени.
П родолж ительностьфиксац ии материалав ж идкости Буэнасостав ляетот
2 до 24 часов в з ав исимости от в еличины объ екта. Д лительное (до нескольких
суток) пребы в ание кусочков ткани в фиксаторе не ух удш аеткачеств о фиксац ии
и их последую щ ей обработки.
П осле фиксац ии материалпереносятв 70 – 80 % спирт, которы й меняю т2
– 3 раз ас интерв алом 30 – 60 минут(для удаления пикринов ой кислоты ).
П римеч ание. О бъ ект, фиксиров анны й в ж идкости Буэна, з алив ается
только парафином.
Ж идкост ь К арнуа.
С месь Карнуа яв ляется х орош им фиксатором, как для гистологических
исследов аний , так и для гистох имических методик. Н едостатком яв ляется
легкое сморщ ив ание тканей .
Ж идкостьКарнуаприготав лив аю тнепосредств енно перед фиксац ией .
С остав : Абсолю тны й (или 96 %) этилов ы й спирт 60 мл
7

Х лороформ 30 мл
Л едяная уксусная кислота 10 мл
Кусочки толщ иной до 5 мм фиксирую тв течение от30 минутдо 1 часа(в
зав исимости от толщ ины объ екта). П осле фиксац ии кусочки сраз
у переносят в
абсолю тны й спирт. Е сли фиксатор бы л приготов лен на96 % спирте, то кусочки
следует ополоснуть 2 – 3 раз а в спирте той ж е конц ентрац ии; в случае
необх одимости материалмож но остав итьв спирте на2 – 3 часа.
П римеч ание. Н еобх одимо, чтобы материал нах одился в фиксаторе не
дольш е, чем это нуж но для его пропиты в ания, так как удлинение фиксац ии
усилив аетсж атие и уплотнение объ екта.

1.3. П ракт ич еское задание I


Ц елью работы яв ляется ов ладение методикой з абора тканей у ж ив отны х ,
фиксац ия кусочков материалав раз личны х фиксирую щ их ж идкостях .
1. П риготов ить фиксаторы : ж идкость Буэна, Карнуа, 10 % формалин в
объ еме по 50 мл. Каж ды й фиксатор раз литьв 5 бю ксов по 10 мл
2. П од эфирны м наркоз ом произв ести декапитац ию ж ив отного и изв лечь
голов ной моз г. И ссечь кусочки коры моз га издв игательной з оны и коры
моз ж ечка, отделитьгипофиз . М атериалпогруз итьв бю ксы с фиксатором Буэна.
3. П осле в скры тия брю ш ной полости ж ив отного в з ять печень,
надпочечники и семенники. И зкаж дого органав ы рез атьпо несколько кусочков
и поместить их в бю ксы с фиксирую щ ими ж идкостями (Буэна, Карнуа,
формалин). Записать в ремя начала фиксац ии. Через 40 минут (соблюд ат ь
т оч но) материал изж идкости Карнуа перенести в диоксан. Через30 минут
слить раств ор, наполнить бю кс св еж ей порц ией диоксана и остав ить в нем
материал ещ е на30 минут. Затем з афиксиров анны е кусочки тканей погруз итьв
расплав ленны й парафин (приготов итьз аранее в термостате).

Т Е М А 2. П РО М Ы В А НИ Е И О Б Е З В О Ж И В А НИ Е
О борудов ание и реактив ы : термостат, стеклянны е бю ксы и стаканчики,
пинц еты , стеклянны е или фарфоров ы е сита, марля, нитки, этанол, диоксан.

2.1. П ромы в ание гистологического материала


С пособ промы в ания з ав исит от методики фиксац ии. Н апример, после
фиксирую щ их смесей , содерж ащ их пикринов ую кислоту, дих лорид ртути,
трих лоруксусную кислоту, для их удаления применяю тэтилов ы й спиртраз ной
конц ентрац ии. П осле фиксац ии в формалине, в ж идкостях , содерж ащ их х ром,
осмиев ую кислоту, обы чно употребляю т в оду. В больш инств е случаев
промы в ку кусочков тканей произ в одят в проточной в одопров одной в оде.
Н аиболее удобно это делать, помещ ая объ ект в стеклянны е или фарфоров ы е
сита, которы е з акры в аю т пробкой с отв ерстиями и опускаю т в сосуд с
проточной в одой . П робка обеспечив ает плав учесть, а отв ерстия – постоянную
ц иркуляц ию в оды . Е сли кусочек не прош ит ниткой , то этикетку тож е
помещ аю т в сито. П ри отсутств ии сита кусочек з ав орачив аю т в марлю и
8

подв еш ив аю т з
а нитку в сосуд, наполненны й в одой . В ерх сосуда з акры в аю т
марлей и проделы в аю т в ней небольш ое отв ерстие. К в одопров одному крану
присоединяю т рез инов ы й ш ланг или прив яз ы в аю т ш нур (полоску бинта),
св ободны й конец которого пропускаю тчерезмарлю в сосуд и пускаю тпо нему
не сильную струю в оды . П ри небольш ом количеств е материалакаж ды й кусочек
промы в аю тв отдельной посуде. С реднее в ремя промы в ания 20 – 24 часа.

2.2. О безв ож ив ание гистологического материала


Д ля приготов ления качеств енны х гистологических препаратов
необх одимо, начиная с момента обез в ож ив ания, соблю дать прав ила
постепенного в оз дей ств ия применяемы х в ещ еств на исследуемы е ткани. П осле
промы в ания кусочки подв ергаю т дальней ш ему уплотнению путем
обез в ож ив ания в спиртах ув еличив аю щ ей ся конц ентрац ии (50, 60, 70, 80, 96 и
100%). О без в ож ив ание материала произ в одится в стеклянны х бю ксах или
стаканчиках с притерты ми кры ш ками. П осуду этикетирую т и з алив аю т
спиртами (100 % спирт в дв ух стаканчиках ). Т акой последов ательны й ряд
сосудов получил наз в ание гистологической батареи. С пирты необх одимой
конц ентрац ии приготав лив аю т з аранее согласно таблиц е раз в едения (см.
прилож ение 2).
Е сли препарат промы в али в в оде, то обез в ож ив ание начинаю т с 50%
спирта, если ж е в спиртах , то объ ектпомещ аю тв спиртпоследую щ ей крепости
(из70% в 80% и т. д.). П ри необх одимости обез в ож ив ание начинаю т с 10 –
20% спирта. В ремя пребы в ания кусочков в отдельны х спиртах определяется их
в еличиной и св ой ств ами. О бъ екты толщ иной 5 мм достаточно держ ать в
спиртах меньш ей конц ентрац ии (до 60%) по 2 – 4 часа, а в более
конц ентриров анны х раств орах спирта – от 12 до 24 часов . М елкие и более
тонкие объ екты мож но пров одитьчерезгистологическую батарею бы стрее.
С ледует помнит ь, что длительное пребы в ание объ екта в спиртах низ кой
конц ентрац ии прив одит к мац ерац ии тканей , а з адерж ка в спиртах в ы сокой
конц ентрац ии чрез мерно уплотняет их . П ри необх одимости прерв ать проц есс
обез в ож ив ания, материал мож но остав ить (на 1-2 суток) в «индифферентном»
спирте, крепостькоторого состав ляет70 – 80%.
П осле фиксац ии гистологического материала в ж идкости Карнуа
в озмож но исклю чение этапапров одки по спиртам в осх одящ их конц ентрац ий и
помещ ение кусочков тканей непосредств енно в диоксан, где происх одит
удаление (з амещ ение) остаточной в оды .

2.3. П ракт ич еское задание II


Ц ель работы – приготов ление этанола раз личной конц ентрац ии и
абсолю тного (100 %) спирта(см. прилож ение 1). О св оение тех ники промы в ки и
обез в ож ив ания гистологического материала. П ри необх одимости работа
в ы полняется в течение дв ух дней подряд.
1. П риготов ить раств оры для промы в ания и обезв ож ив ания материала.
П одготов ить«батарею »спиртов , в том числе 100% этанол.
9

2. О сущ еств итьпромы в ку тканей с ц елью удаления фиксаторов . Кусочки


з ав ернуть в марлю , в лож ить этикетки и промы ть проточной в одопров одной
в одой .
3. П ров ести обез в ож ив ание тканей в спиртах в озрастаю щ ей
конц ентрац ии.
4. П оместить поочередно материал в диоксан I и II (дв а стакана
обоз начить– “I” и “II”, в них налитьдиоксан, экспоз иц ия – 30 минутв каж дом).
П осле из в лечения кусочков из диоксана II погруз ить их в расплав ленны й
парафин. П арафин необх одимо растопить в термостате з аранее при
о
температуре 56 – 58 С . Д иоксан I и II мож етиспольз ов аться многократно.

Т Е М А 3. З А Л И В К А М А Т Е РИ А Л А В П Л О Т НЫ Е С РЕД Ы
П РИ Г О Т О В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х К РА С И Т Е Л Е Й
О борудов ание и реактив ы : термостат, скальпель, пинц ет, ш патель,
бумаж ны е фильтры , спец иальны е дерев янны е блоки, фарфоров ы е круж ки с
носиком, спец иальны е формочки, предметны е стекла, стеклянны е емкости для
красителей , мерны е ц илиндры , стеклянны е в оронки, парафин, в оск, эфир,
этанол, гематоксилин, эоз ин, х лоралгидрат, глиц ерин, й одат натрия (NaJO3),
лимонная кислота, калий ны е кв асц ы , ледяная уксусная кислота, тимол,
формалин, куриное яй ц о.
3.1. Залив кав парафин
Д ля приготов ления в ы сококачеств енны х гистологических препаратов
необх одимы рав номерно тонкие срез ы с исследуемого объ екта. Д ля их
получения кусочки тканей надо пропитать и з алить такой средой , которая
прев ратила бы их в х орош о реж ущ ую ся массу. Н аиболее употребительны ми
для этих ц елей материалами яв ляю тся парафин, ц еллоидин и ж елатин.
П арафин при комнатной температуре – тв ердое гомогенное в ещ еств о, он
плав ится при 54 – 56оС . Д ля эластичности к нему следует прибав ить чисты й
пчелины й в оск в количеств е 2 – 5%.
Залив кав парафин требуетсоблю дение дв ух основ ны х услов ий : перв ое –
материал долж ен бы тьполностью обез в ож ен, в торое – он не долж ен содерж ать
спирт. П ерв ое услов ие обеспечив ается в проц ессе обез в ож ив ания и уплотнения
в батарее спиртов пов ы ш енной конц ентрац ии.
Д ля удаления спиртаи подготов ки к пропиты в анию парафином материал
обрабаты в аю т одним израств орителей парафина, обладаю щ им способностью
в ы теснять спирт. К таким в ещ еств ам относятся х лороформ, бенз ол, толуол,
ксилол, диоксан, сероуглерод и др. Чащ е использ ую т диоксан, х лороформ и
бенз ол. Т олуоли ксилолделаю ткусочки ткани более тв ерды ми.
В тех случаях , когда по услов иям работы необх одимо сократить в ремя
приготов ления парафинов ы х блоков , мож но применять ускоренную з алив ку.
П ри этом кусочки ткани толщ иной 1,5 – 2 мм помещ аю т в абсолю тны й (или
96%) спирт, ац етон или диоксан для фиксац ии и обез в ож ив ания на1 – 2 часаи
произ в одится однократная сменафиксатора.
10

П осле окончального пропиты в ания объ екта его з


алив аю т расплав ленны м
парафином (с 5 % пчелиного в оска). П арафин предв арительно подогрев аю т в
термостате при 58оС и в расплав ленном в иде налив аю т в приготов ленную
формочку, з аполняю т ее до самы х краев , из бегая образ ов ания пуз ы рьков
в оз
дух а(использ ую тв ы сокую фарфоров ую круж ку с ручкой и носиком). Затем
подогрев аю т пинц ет или металлический ш патель, бы стро переносят
подготов ленны й к залив ке объ ект в формочку с парафином и ориентирую т в
необх одимом полож ении. П осле этого формочку ох лаж даю тв одой (10 – 18оС ).

3.2. П риготов ление блоков


И ззатв ердев ш его парафина скальпелем в ы рез
аю т четы рех угольны й блок
таким образ ом, чтобы объ ект со в сех сторон бы л окруж ен слоем парафина
толщ иной 1 – 3 мм. Н аклей ку блоков произ в одят на дерев янны е кубики. Н а
дерев янны й кубик наносятнебольш ой кусочек тв ердого парафина, расплав ляю т
его горячим металлическим ш пателем (или скальпелем), пров одят этим ж е
ш пателем по ниж ней пов ерх ности парафинов ого блокаи бы стро придав лив аю т
его к кубику.

3.3. П ракт ич еское занят ие III


Ц ельработы – осв оение тех ники з алив ки ткани в парафин и из готов ления
гистологических блоков .
1. Расплав ить в термостате парафин при 56оС с кусочками тканей (см.
практическое з адание II).
С делатьперед з алив кой этикетиров ку материала.
2. В термостатпостав итьтри баночки с парафином, обоз начитьих 1, 2, 3.
В четв ертую банку поместитьз алив очную смесь(парафин + в оск). П ерелож ить
исследуемую ткань в баночку 1. П оочередно через 40 минут переносить
кусочки тканей в термостате изпарафинаI в парафин II и, далее, в парафин III.
П осле в ы полнения этой проц едуры кусочки тканей осторож но в ы нуть из
парафинаIII, аккуратно улож итьв формочку и з алитьз алив очной смесью .
3. П риготов ить предметны е и покров ны е стекла к следую щ ему з анятию .
П редметны е стекла тщ ательно помы ть в мы льном раств оре, промы ть в
проточной в одопров одной в оде и дистиллиров анной в оде, тщ ательно в ы суш ить
из алить смесью Н икифоров а (1 часть эфира + 1 часть 96о этанола). Х ранить
предметны е стеклав темной стеклянной банке с притертой пробкой .
4. П риготов итькрасители – гематоксилин и эоз ин (см. тему 5)
5. С делатьбелков ы й раств ор для фиксац ии тканей напредметном стекле.
П риг от овление раст вора. К белку изсв еж его куриного яй ц а добав ляю т
рав ной по объ ему количеств о х имически чистого глиц ерина и х орош о
взбалты в аю т (или в з
бив аю т). Раств ор фильтрую т черезв лаж ны й складчаты й
бумаж ны й фильтр в чисты й флакончик. В о из беж ание гниения белкак фильтру
добав ляю т2 – 3 маленьких кусочка(с пш еничное з ерно) тимолаили формалин
(1:100).
11

Т Е М А 4. П РИ Г О Т А В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х С РЕ З О В
О борудов ание и реактив ы : термостат, микротом, электростолик для
суш ки парафинов ы х срез ов , чаш ки П етри, кисточки, препаров альны е иглы .
Д ля приготов ления гистологических срез ов определенной толщ ины
использ ую тспец иальное мех аническое устрой ств о – микротом.
В нимание! С ост ры м ножом микрот ома обращ ат ься с
ост орожност ью.

4.1. П риготов ление срез ов изпарафинов ы х блоков


Н аклеенны й на дерев янную колодку парафинов ы й блок прочно
закрепляю тв з аж име микротома, располож ив длинной осью параллельно длине
микротома. П осле установ ки необх одимого угла рез ания и угла наклона нож а,
его прочно з акрепляю тв интов ы ми з аж имами и располагаю тнад блоком. Затем,
регулируя в интами мех аниз м подачи, блок устанав лив аю т таким образ ом,
чтобы в ерх няя его плоскость нах одилась в гориз онтальном полож ении и не
дох одиладо лез в ия нож а0,5 – 1 мм.
П осле предв арительной подгонки блока к нож у устанав лив аю т
микрометрическую ш калу на получение толсты х срез ов (25 – 30 мкм) и
дв иж ением нож ев ы х салаз ок начинаю т подав ать блок в в ерх до получения с
него перв ы х полны х срез ов . Затем произ в одят моделиров ание блока: срезаю т
скальпелем из бы точны й парафин, остав ляя в округ з алитого объ екта слой не
более 2 – 3 мм, и придаю т блоку прямоугольную форму. П осле этого
устанав лив аю т микрометрическую ш калу на нуж ную толщ ину срез а (4 – 10
мкм) и приступаю тк окончательной рез ке материала.
С ледует помнить, что перемещ ение нож ев ы х салаз ок в доль рельсов ого
пути нуж но произ в одитьплав но и безлиш них усилий . Д в иж ение микротомны м
нож ом в момент прох ож дения над блоком надо произ в одить бы стро и
рав номерно.
Г отов ы й срез осторож но снимаю т с нож а в лаж ной кисточкой (в
направ лении от спинки к лез в ию ) и переносят на подготов ленное предметное
стекло (см. 4.2), расправ ляя его препаров альной иглой ; при необх одимости срез
переносят в чаш ку с теплой (35 – 400С ) дистиллиров анной в одой .
П риготов ленны е препараты в ы суш ив аю т на электростолике при температуре
30 – 400С .

4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле


Н аклеить парафинов ы е срез ы на предметное стекло в расправ ленном
полож ении при помощ и белка с глиц ерином. Д ля этого пов ерх ность
предметного стекла предв арительно покры в аю т тонким слоем белков ого
раств ора, в ы суш ив аю т, з
атем наносят1 – 2 капли дистиллиров анной в оды .

4.3. П ракт ич еское задание IV


Ц ель работы – научиться тех нике приготов ления гистологических
срез
ов .
12

1. Н аклеить с помощ ью расплав ленного парафина кусочки тканей , ранее


залиты х в парафин, на дерев янны е блоки (необх одимо пров ести маркиров ку
блоков ).
2. Закрепить блоки в держ ателе санного микротома и приготов ить
гистологические срез ы толщ иной 5 – 8 мкм.
3. Н аклеить срезы на предметны е стекла с помощ ью белка с глиц ерином
(раств ор долж ен бы ть приготов лен на преды дущ ем з анятии), пров ести
маркиров ку стекол.

Т Е М А 5. О К РА Ш И В А НИ Е И З А К Л Ю Ч Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х
С РЕ З О В
О борудов ание и реактив ы : термостат, пинц еты , колбы , стеклянны е
стаканы , мерны е ц илиндры , в оронки, «батарея» спиртов , ксилол, толуол,
готов ы е красители – гематоксилин и эоз ин (долж ны бы ть приготов лены на
занятии № 3), канадский бальз ам.

В основ е окраш ив ания тканев ы х микроструктур леж ат физ ико-


х имические проц ессы . Красители подразделяю тся на3 группы .
1. О снов ны е – гематоксилин, метилов ы й з елены й и др. Э ти красители
применяю тся для окраш ив ания баз офильны х в ещ еств и структур клеток.
2. Кислотны е – эоз ин, кислы й фуксин и др. О ни окраш ив аю т
оксифильны е в ещ еств а, например, гранулы эоз инофильны х лей коц итов ,
ц итоплаз му клеток;
3. Н ей тральны е – судан III и др., использ ую тся для окраш ив ания
ней трофильны х компонентов клеток, например, липидов .

5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание


К ислы й г емат оксилин Эрлиха. В 100 мл 96 % спирта раств орить 2 г
гематоксилина, прибав ить 100 мл дистиллиров анной в оды , з атем 100 мл
чистого глиц ерина, 3 гкалий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и 10 мл ледяной
уксусной кислоты , в з болтатьи остав итьнасв ету «соз рев ать» в течение 14 дней ,
периодически в з балты в ая. Д ля того чтобы обеспечить постоянны й доступ
в оздух а (проц есс окисления гематоксилина), следует брать ш ирокогорлы й
сосуд и накры в ать в х одное отв ерстие несколькими слоями марли. В проц ессе
«соз рев ания» раств ор изсв етло– красного станов ится темно– красны м. В плотно
з акры том сосуде красительсох раняетсв ой ств адлительное в ремя.
К ислы й г емалаун М айера. В 1 литре дистиллиров анной в оды
раств орить 1 г гематоксилина, добав ить 0,2 г й одата натрия (NaJO3), 50 г
калий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и, непреры в но помеш ив ая, дож даться их
полного раств орения (при этом ж идкость приобретает фиолетов о – синю ю
окраску). Затем добав ляю т50 гх лоралгидратаи 1 гкристаллической лимонной
кислоты , в рез ультате чего раств ор станов ится фиолетов о – красны м. В х орош о
з акры том сосуде изх имически чистого стекла краситель х ранится длительное
в ремя.
13

П реимущ еств о данного метода – бы строе окисление гематоксилина


й одатом натрия, благодаря чему раств ор не требует«соз рев ания»и сразу мож ет
использ ов аться для окраш ив ания. П ри окраш ив ании гематоксилин – эоз ином
фиксац ия мож етбы тьлю бая.
П еред окраш ив анием парафинов ы е срез ы подв ергаю т
депарафинированию – проц ессу, обратному тому, которы й осущ еств ляю тпри
подготов ки объ екта к з алив ке в парафин, то есть срез ы последов ательно
пров одят черезраств оритель парафина, спирты нисх одящ ей конц ентрац ии и
помещ аю т в в оду. Д анны й проц есс в ы полняю т по следую щ ей непреры в ной
сх еме:
1. Ксилол(толуол) – дв е смены по 2 – 4 минуты
2. С пирт96 % - дв е смены по 2 – 3 минуты
3. С пирт70 % - один раз– 2 – 3 минуты
4. В одадистиллиров анная – 1 раз– 2 – 3 минуты и более
Т ех никапров едения окраш ив ания.
П ри окраске в одны ми красителями срез ы переносятиздистиллиров анной
в оды , а при окраски спиртов ы ми – изспирта соотв етств ую щ ей конц ентрац ии,
непосредств енно в красящ ий раств ор (прямое окраш ив ание) или сначала в
ж идкость для протрав ки (непрямое окраш ив ание). П осле приобретения
препаратом необх одимой интенсив ности окраски, его промы в аю т в в оде (или
спирте) для удаления из бы ткакрасителя, аз атем, если нуж но, дифференц ирую т
в соотв етств ую щ ей ж идкости. И злиш ний красительотмы в аю тдо тех пор, пока
он не перестанетперех одитьизсрез ав отмы в аю щ ую ж идкость.
О краш ив ание срезов , наклеенны х на стекла, мож но пров одить как путем
помещ ения их в красящ ий раств ор, так и каплями красителя. П еред нанесением
на гистологические срез ы красящ ие раств оры следует отфильтров ать.
П родолж ительность окраш ив ания состав ляет 2 – 6 минут. П осле окраш ив ания
срез ов гематоксилином из лиш ки красителя отмы в аю т в течение 3 – 5 минут в
дистиллиров анной в оде, з атем помещ аю т препараты в в одопров одную в оду на
10 – 15 минут. П осле этого препарат в нов ь помещ аю т на 3 – 5 минут в
дистиллиров анную в оду. Д ополнительно окраш ив аю тсрез ы эозином в течение
0,2 – 3 минут, после чего препаратпомещ аю тв дистиллиров анную в оду на3 – 5
минут.

5.2. Заклю чение срез ов в смолы


1. О без в ож ив ание срез ов осущ еств ляется погруж ением препаратов в
спирты в озрастаю щ ей конц ентрац ии (60, 80, 96, 100%) на3 – 5 минут.
2. П росв етление срез ов пров одят поочередны м погруж ением препаратов
на3 – 5 минутв три смены ксилола(или толуола).
3. Заклю чение срез ов . Д ля обезв ож енны х и просв етленны х препаратов
наиболее часто применяемой средой з аклю чения яв ляется канадский бальзам,
представ ляю щ ий собой проз рачную древ есную смолу ж елтов атого ц в ета.
Бальзам обладает консерв ирую щ ими св ой ств ами, сох раняет проз рачность
препарата и имеет показ атель преломления, близ кий к показ ателям
14

преломления стекла. Д ля з аклю чения срез ов использ ую т канадский или


пих тов ы й бальзам, раств оренны й в ксилоле до консистенц ии ж идкого меда.
В ы нув стекло со срез ом изксилола, бы стро в ы тираю т ты льную сторону
и, полож ив в гориз онтальном полож ении на стол, наносят несколько капель
бальз ама. Затем берут приготов ленное чистое покров ное стекло (чисты м
пинц етом или, осторож но, дв умя пальц ами з а боков ы е грани, чтобы не
з агряз нить пов ерх ность), став ят его на предметное стекло рядом с
препаратором под углом 45о и, как только бальз ам растечется по краю
покров ного стекла, осторож но опускаю т, при этом в оз дух постепенно
в ы тесняется и бальз ам покры в аетпрепараттонким, рав номерны м слоем.

5.3. П ракт ич еское задание V


Ц ель работы – осв оить методику окраски гистологических срез ов и
заклю чения их в бальз ам.
1. П риготов ить «батарею » спиртов для депарафиниров ания
гистологических срез ов и з аклю чения их в бальз ам.
2. О тфильтров ать гематоксилинов ы й краситель, приготов ленны й ранее.
П роизв ести депарафиниз ац ию и окраш ив ание гистологических срез ов ,
приготов ленны х на преды дущ ем з анятии, гематоксилинов ы м красителем с
дополнительной окраской раств ором эоз ина.
3. П роизв ести обез в ож ив ание и просв етление полученны х препаратов и
заклю читьих в бальз ам.

Т Е М А 6. А НА Л И З Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х П РЕ П А РА Т О В
О борудов ание и реактив ы : микроскопы , готов ы е гистологические
препараты , иммерсионное масло.
Д анная тема яв ляется итогов ой , определяется качеств о гистологических
препаратов . С туденту необх одимо использ ов ать з нания, полученны е на
лабораторны х занятиях по курсу «Г истология».

6.1. П ракт ич еское задание VI


Ц ель работы – анализприготов ленны х препаратов , определение в ида
ткани, дифференц иров каклеточны х структур.
1. С использ ов анием св етов ого микроскопа идентифиц иров ать клетки на
препаратах , окраш енны х гематоксилином – эоз ином (окуляр Х 15, объ ектив Х 20
и Х 40).
2. В ы яв ить ц итоморфологические особенности клеточны х структур –
ядро, х роматин, Э П С , аппаратГ ольдж и в клетках разны х тканей (объ ектив Х 90,
иммерсионное масло).
3. Зарисов атьклетки и их структуры . О формитьпротоколы з анятий .
15

П РИ Л О Ж Е НИ Е 1. С пособприг от овления абсолют ног о спирт а.


Д ля получения абсолю тного спирта изнего необх одимо из в лечь в оду.
Н асы пать порош ок обез в ож енного медного купороса (примерно 10 гна100 мл
спирта) в чистую сух ую стеклянную буты лку с притертой пробкой и з алить960
этанолом. Буты лку периодически в стрях ив ать в течение 1 – 2– х дней .
О безв ож енны й спирт отфильтров ать в чистую сух ую посуду с притертой
стеклянной пробкой .

П РИ Л О Ж Е НИ Е 2. П риг от овление спирт ов различ нойконцент рации.

Д ля Н еобх одимы й объ ем, мл


получения 96% в оды 90% в оды 80% в оды 70% в оды
100 мл спирта спирта спирта спирта
спирта
40% 42 58 44 56 50 50 57 43
45% 47 53 50 50 56 44 64 36
50% 52 48 56 44 63 37 71 29
60% 63 37 67 33 75 25 86 14
70% 73 27 78 22 88 12 - -
80% 83 17 89 11 - - - -
90% 94 6 - - - - - -

Л И Т Е РАТ У РА

1. Бы ков В .Л . Ц итология и общ ая гистология / В .Л .Бы ков . –


С П б.:С О Т И С , 2001.- 520 с.
2. Л абораторны е з анятия по курсу гистологии, ц итологии и эмбриологии
/ П од ред. Ю .И . Афанасьев а. – М . : В ы сш ая ш кола, 1990. – 398 с.
3. Рябов К.В . Г истология с основ ами эмбриологии / К.В .Рябов . – М инск :
Беларусь, 1990.- 238 с.

С остав ительП оляков а– С еменов аН инаД митриев на.

Редактор Т их омиров аО .А.

__________________________________________________________________
Заказ№ … .. от… … … 2005 г. Т ираж 50 экз
. Л аборатория оператив ной полиграфии В Г У .