Méthodes chromatographiques

Introduction
par Marcel CAUDE
Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)
Docteur ès sciences
Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
et Alain JARDY
Ingénieur CNAM
Docteur ès sciences
Maître de Conférences à l’École Supérieure de Physique et Chimie de Paris

1. Principe....................................................................................................... PE 1445 - 3
2. Classification selon la finalité .............................................................. — 5
2.1 Chromatographie analytique...................................................................... — 5
2.2 Chromatographie préparative .................................................................... — 7
2.3 Analyse de traces et traitement de l’échantillon...................................... — 7
Bibliographie ...................................................................................................... — 7

ien que certains historiens fassent remonter l’origine de la chromatographie

B jusqu'à l’Antiquité, on retient, généralement, les travaux du botaniste russe
Tswett, qui, en séparant les pigments de la chlorophylle sous la forme d’anneaux
colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium, a donné le nom de
chromatographie (séparation selon les couleurs) à la méthode (1903). Ont été
rassemblées ici quelques grandes dates de l’évolution de la chromatographie :
1903 − Séparation de pigments (Tswett)
1931 − Séparations préparatives (Kuhn et Lederer)
1938 − Chromatographie sur couche mince (Ismailov et Shraiber)
1939 − Chromatographie par échange d’ions (Samuelson)
1941 − Chromatographie de partage (Martin et Synge)
1952 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes remplies (James et
Martin)
1954 − Séparation des acides aminés par chromatographie d’échange d’ions
(Moore et Stein)
1959 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires (Golay)
1962 − Chromatographie en phase supercritique (Klesper)
1968 − Chromatographie en phase liquide à haute performance (Giddings et
Kirkland)
Comme on le constate, peu de techniques analytiques ont connu un essor
comparable ni aussi diversifié que la chromatographie au cours de cinq derniè-
res décennies. Ce succès tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent
associés une méthode séparative rapide et performante et des détecteurs sensi-
bles et variés permettant non seulement, une quantification des espèces sépa-
rées, mais aussi, pour certains d'entre eux, une identification des espèces.
De ce fait, la chromatographie se prête bien à l’analyse de mélanges
complexes tels ceux que l’on peut rencontrer dans des domaines aussi différents
que les produits pétroliers, les polymères ou les fluides biologiques et à l’ana-

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lyse de traces dans des milieux aussi variés que l’étude de l’environnement
ou le contrôle de la pureté optique de molécules thérapeutiques.

Abréviations et sigles couramment utilisés

avec les méthodes chromatographiques
Général
HEPT Hauteur équivalente HETP Height equivalent
à un plateau théorique to a theoretical plate
CGV Chromatographie à grande HSC High speed chromatography
vitesse
Chromatographie en phase gazeuse
CPG Chromatographie en phase GC Gas chromatography
gazeuse
CGS Chromatographie gaz-solide GSC Gas-solid chromatography
CGL Chromatographie gaz-liquide GLC Gas-solid chromatography
Chromatographie en phase liquide
CPL Chromatographie en phase LC Liquid chromatography
liquide
CLHP Chromatographie en phase HPLC High-performance liquid
liquide à haute performance chromatography
CLS Chromatographie liquide- LSC Liquid-solid chromatography
solide
CLL Chromatographie liquide- LLC Liquid-liquid chromatography
liquide
CPPI Chromatographie de partage RPC Reversed-phase
à polarité de phases inversée chromatography
NPC Normal-phase
chromatography
BPC Bonded-phase
chromatography
CEI Chromatographie d'échange IEC Ion-exchange
d’ions chromatography
CI Chromatographie ionique IC Ion chromatography
CII Chromatographie IIC Ion-intersection
d’interactions ioniques chromatography
CES Chromatographie SEC Size-exclusion
d’exclusion stérique chromatography
CPG Chromatographie GPC Gel permeation
de perméation sur gel chromatography
CFG Chromatographie de filtration GFC Gel filtration chromatography
sur gel
CEL Chromatographie d’échange LEC Ligand-exchange
de ligands chromatography
FFF Fractionement flux force FFF Field flow fractionation
CP Chromatographie planaire PC Planar chromatography
CCM Chromatographie sur couche TLC Thin-layer chromatography
mince
CPC Chromatographie de partage CPC Centrifugal partition
centrifuge chromatography
CCC Chromatographie CCC Counter-current
à contre-courant chromatography
CLLC Chromatographie liquide- CLLC Centrifugal liquid-liquid
liquide centrifuge chromatography
PSC Phase stationnaire chirale CSP Chiral stationary phase

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Abréviations et sigles couramment utilisés

avec les méthodes chromatographiques
Chromatographie en phase supercritique
CPS Chromatographie en phase SFC Supercritical fluid
supercritique chromatography
Traitement de l’échantillon
EPS Extraction en phase solide SPE Solid-phase extraction
MEPS Microextraction en phase SPME Solid-phase microextraction
solide
EPS Extraction en phase SFE Supercritical fluid extraction
supercritique
Méthodes électrophorétiques
EC Électrophorèse capillaire CE Capillary electrophoresis
ECZ Électrophorèse capillaire CZE Capillary zone
de zone electrophoresis
HPCE High performance capillary
electrophoresis
CEM Chromatographie MEC Micellar electrokinetic
électrocinétique micellaire chromatography

1. Principe Phase mobile

Dans toute méthode chromatographique, les séparations sont

fondées sur la distribution des solutés entre deux phases non misci- Système
bles, l’une fixe dite phase stationnaire, l’autre en mouvement dite Échantillon
d'injection
phase mobile (figure 1). De la sorte, l’opération de partage des espè-
ces à séparer entre les deux phases se trouve répétée automatique-
ment un très grand nombre de fois pour chaque espèce de manière
continue permettant ainsi l’exploitation de différences minimes du
coefficient de distribution des espèces entre les deux phases. Alors
que la phase mobile tend à entraîner les espèces à séparer dans son Système Phase
mouvement, la phase stationnaire tend à les retarder, d’autant plus de séparation stationnaire
fortement que les interactions mises en jeu sont plus intenses, nom-
breuses et plus énergétiques ; il en résulte que les analytes ont, pour
la plupart, des vitesses de déplacement différentes et inférieures à
celle de la phase mobile, d’où la notion de rétention et la possibilité
de séparations. Couplé à un système d’injection des échantillons à Système
analyser et à un système de détection en continu au sein d’un chro- de détection
matographe, un tel système de séparation permet des analyses
fines d’une grande qualité dans la mesure où les différents consti-
tuants des mélanges sont séparés avant d’être déterminés quantita-
tivement (figure 1). De plus, des développements technologiques
récents ont mené à des appareils entièrement automatique pilotés Chromatogramme
par microprocesseur.
Figure 1 – Schéma d’un système chromatographique
La phase stationnaire peut être disposée :
— soit dans une colonne et la phase mobile percole celle-ci à
débit (ou pression) constant : c’est la chromatographie sur colonne ; Dans le second cas, l’analyste exploite ces mêmes différences en
— soit en couche mince sur un support plan (plaque de verre, film termes de distance parcourue par chaque espèce à temps de déve-
plastique...) et la phase mobile se déplace par capillarité : c’est la loppement donné : quand le « front » de solvant a parcouru une dis-
chromatographie planaire. tance fixée, on repère la position de chaque soluté, par révélation
Dans le premier cas, l’analyste exploite les différences de vitesses par un système adéquat et on détermine le rapport des vitesses de
de déplacement des différentes espèces en déterminant le temps déplacement (rate factor) que l’on identifie comme étant identique à
mis par chacune pour parcourir une longueur égale à celle de la celui des distances parcourues ; on étudie la distribution isochrone
colonne (les solutés sont injectés en mélange à une extrémité de la (c’est-à-dire à temps de développement constant).
colonne et détectés à l’autre) : on étudie la distribution isoplane des
espèces (c’est-à-dire à distance parcourue fixée). Suivant l'état physique de la phase mobile, on distingue :

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— la chromatographie en phase gazeuse (CPG) : la phase mobile
est un gaz, dit gaz vecteur, et les solutés sont introduits sur la
colonne directement s’il s’agit d’un échantillon gazeux ou après
volatilisation dans la chambre d’injection chauffée s’il s’agit d’un
échantillon liquide (éventuellement après dilution ou dissolution
dans un solvant adéquat) ;
— la chromatographie en phase liquide (CPL) : la phase mobile
est constituée d’un solvant pur ou le plus souvent d’un mélange
plus ou moins complexe de solvants de grande pureté ; elle est
introduite sur la colonne à débit constant par un système de
pompage ;
— la chromatographie en phase supercritique (CPS) : la phase
mobile est un fluide supercritique, c’est-à-dire porté au-delà des
coordonnées en pression et température du point critique, point à
partir duquel il n’existe plus de frontière définie entre les états
liquide et gazeux.
La nature de la phase mobile régit l’étendue du domaine d’appli-
cations de la méthode et la variété des interactions entre les espèces
à séparer et les deux phases. Ainsi, la chromatographie en phase
gazeuse qui nécessite la volatilisation des espèces à séparer − et en
conséquence leur stabilité thermique − ne permet de séparer que
20 % environ des molécules organiques connues sans modification
préalable de celles-ci.
Par ailleurs, comme le montre le tableau 1, les interactions des
différentes espèces n’ont lieu qu’avec la phase stationnaire ; la
nature du gaz vecteur a peu d’influence sur la qualité de la sépara-
tion. Celle-ci est donc régie uniquement par deux paramètres :
nature de la phase stationnaire et température de la colonne chro-
matographique qui gouvernera la volatilité des différentes espèces.
Tableau 1 – Interactions et paramètres gouvernant la rétention
des solutés et la sélectivité des méthodes chromatographiques
Méthode chromatographique CPG
interactions
paramètres régissant • température
la rétention • nature de la phase
et la sélectivité stationnaire
2. Classification selon la
finalité
2.1 Chromatographie analytique
Dans l’optique d’une mise en œuvre à des fins analytiques (sépa-
ration, identification et/ou quantification de tout ou partie des
constituants d’un mélange plus ou moins complexe), on procède
par développement par élution : le système de phases est choisi de
façon à ce que les espèces d’intérêt aient plus d’affinité pour la
phase stationnaire que les constituants de la phase mobile et l’on
n’injecte qu’une très petite quantité de l’échantillon ; les différentes
espèces migrent dans la colonne (ou sur la plaque) à des vitesses
différentes, sous l’influence de la phase mobile agissant par action
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Au contraire, les chromatographies en phases liquide et supercri-
tique montrent des interactions tripartites soluté − phase station-
naire − phase mobile (tableau 1). La chromatographie en phase
liquide ne connaît pas de limitation en ce qui concerne la nature des
solutés. La qualité de la séparation est régie par deux paramètres
principaux : natures de la phase stationnaire et de la phase mobile.
Les séparations ont lieu généralement à une température voisine ou
légèrement supérieure à la température ambiante, ce qui explique le
vaste domaine d’applications de la technique et son apport détermi-
nant dans le domaine biologique (espèces thermosensibles) et dans
celui de l’environnement (espèces souvent ionisées non volatiles).
Comme le montre le tableau 1, la chromatographie en phase
supercritique possède un degré de liberté supplémentaire par rap-
port à la chromatographie en phase liquide ; en effet on peut modi-
fier la masse volumique de la phase supercritique et partant son
pouvoir solvant par l’intermédiaire du couple pression-température.
Malgré cela, la chromatographie en phase supercritique est encore
peu utilisée, ce qui s’explique par la raison suivante ; la chromato-
graphie en phase liquide forte des ses premiers succès a mobilisé la
majorité des efforts de recherche et de mise au point tant sur le plan
méthodologique que technologique et a connu de fait un dévelop-
pement sans précédent qui a entravé celui de la chromatographie
en phase supercritique. Malgré cela, cette jeune technique, encore
dans l'enfance, connaît d’ores et déjà des applications importantes
en particulier dans les domaines pétrolier et pharmaceutique (sépa-
ration des isomères optiques).
CPL CPS
• nature de la • nature de la phase
phase stationnaire stationnaire
• composition de la • état physique de la phase
phase mobile mobile (T,P)
• (température) • composition chimique
de la phase mobile (modificateur)
de masses, et il en résulte, après un parcours sur une longueur suf-
fisante, une séparation complète, dans des conditions bien choisies,
des bandes de solutés. Chaque espèce apparaît dans l’effluent de la
colonne chromatographique sous la forme d’un pic de concentra-
tion de forme sensiblement gaussienne ; la concentration au maxi-
mum du pic est inférieure à celle dans l’échantillon injecté et cet
effet est d’autant plus prononcé que la rétention dans la colonne est
plus prononcée : c’est l’effet de dilution dû au processus chromato-
graphique.
L’aire du pic observé est proportionnelle, pour chaque soluté, à la
quantité injectée ; partant, une dilution croissante entraîne un élar-
gissement du pic. En définitive, les conditions opératoires retenues
doivent permettre aux différentes bandes des constituants du
mélange à analyser de se séparer entre elles plus vite qu’elles ne
s’étalent lors de leur progression dans la colonne (figure 2).
Pour atteindre une bonne détectabilité (c’est-à-dire la détection et
la quantification de faibles quantités injectées, ce qui est détermi-
_____________________________________________________________________________________________________
Injection Détection
Figure 2 – Schéma d’une séparation en développement par élution :
évolution des bandes de solutés entre leur injection et leur passage
dans le détecteur
nant dans le cas de l’analyse de traces) et une grande capacité de
pics (possibilité de séparer un grand nombre de composés dans une
fenêtre de temps donnée) on cherche à limiter l’étalement des ban-
des. C’est ce qui a conduit à la dilution du diamètre des particules de
la phase stationnaire dans le cas des colonnes remplies (CPL, CPS)
et à la mise en œuvre des colonnes capillaires de faible diamètre et
à film mince de phase stationnaire (CPG). Dans les deux cas, l’objec-
tif est de diminuer le parcours moyen d’une molécule de soluté
entre deux sites d’interaction avec la phase stationnaire. Les gains
en efficacité, grandeur caractérisant, à travers le nombre de pla-
teaux théoriques, l’étalement de la bande rapporté au temps de
séjour dans la colonne, ont été tels que les auteurs ont qualifié la
méthode de « haute performance » (chromatographie liquide à
haute performance, CLHP ou high performance liquid chromatogra-
phy, HPLC) ou encore de « haute résolution ».
Dans le cas de mélanges complexes, comportant des molécules
d’affinités très différentes pour la phase stationnaire, on est amené
à modifier graduellement les conditions opératoires au cours de
l’analyse, de façon à diminuer la rétention des espèces les plus for-
tement retenues, sans pour autant nuire à la séparation des espèces
plus faiblement retenues : c’est la technique de l’élution graduée.
Selon la méthode chromatographique mise en jeu on trouve
ainsi, outre la programmation de débit :
— la programmation de température en CPG ;
— la programmation de la composition de la phase mobile (gra-
dient l’élution), visant à une augmentation progressive de sa force
éluante, en CPL ;
— la programmation de la masse volumique du fluide et de la
composition de l’éluant par ajout de modificateur polaire en CPS.
Il est clair que ces techniques, qui requièrent un appareillage plus
sophistiqué, doivent néanmoins être réservées au cas d’analyses
difficiles dans la mesure où, avant toute injection correspondant à
une nouvelle analyse, il y a une étape de régénération ou de recon-
ditionnement nécessaire, de façon à ce que les phases mobile et sta-
tionnaire soient ramenées dans l’état correspondant aux conditions
initiales du gradient. De plus, la précision des analyses se trouve
conditionnée par la reproductibilité de la programmation.
2.2 Chromatographie préparative
L’objectif assigné à la méthode chromatographique peut être la
séparation et la récupération, après fractionnement, de quantités
plus importantes des espèces :
— pour permettre la mise en œuvre de méthodes physico-chimi-
ques d’identification (RMN, spectrométrie de masse, détermination
de la masse molaire) ce qui correspond à une échelle de quelques
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MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES
milligrammes à quelques dizaines de milligrammes (échelle semi-
préparative) ;
— pour permettre des tests cliniques dans le cas de principes
actifs de médicaments (échelle préparative).
Deux possibilités s’offrent alors à l’analyste :
— soit toujours opérer par élution, mais en injectant des quanti-
tés plus importantes ; on dit provoquer une surcharge de la colonne
chromatographique laquelle peut être volumique (on augmente le
volume injecté), massique (on augmente la concentration de
l’échantillon injecté) ou les deux simultanément ;
— soit opérer par développement par déplacement : le déplace-
ment des espèces à séparer initialement fixées en tête de colonne
est effectué par phase mobile ayant une affinité pour la phase sta-
tionnaire supérieure à celle des constituants du mélange. Il résulte,
après un parcours suffisant, un état stationnaire où ces derniers
migrent à vitesse constante, régie par le déplaceur, sous la forme de
bandes adjacentes. L’intérêt principal de cette technique réside dans
le fait que contrairement au développement par élution, elle permet
de recueillir les solutés à séparer sans dilution, par le choix adéquat
de la concentration du déplaceur.
2.3 Analyse de traces et traitement
de l’échantillon
Les méthodes chromatograpiques reçoivent également des appli-
cations dans le domaine des analyse de traces et du traitement des
échantillons y afférant, qu’il s’agisse d’opérations de préconcentra-
tion, d’extraction des solutés de matrices chargées ou des deux à la
fois.
Ainsi l’extraction en phase solide (EPS) (ou solid phase extrac-
tion, SPE) est largement développée pour l’analyse de traces et
ultratraces dans les domaines biologiques et environnementaux. La
mise en œuvre d’absorbants sélectifs placés dans des cartouches ou
des disques d’extraction permet de retenir sélectivement les com-
posés recherchés en traitant de grands volumes d’échantillons. On
a recours à cette technique lorsque l’injection directe est impossible,
soit parce que les quantités qui seraient injectées sont bien inférieu-
res aux limites de détection, soit parce qu’il existe de multiples inter-
férents empêchant la quantification des espèces d’intérêt. La
fixation à partir de grands volumes, dont la limite peut être détermi-
née expérimentalement à partir des fronts de percolation, suivie
d’une élimination des interférents par un lavage adéquat de la car-
touche ou du disque (clean up) et de l’élution des analytes par un
très petit volume d’un solvant de transfert permettent de lever les
difficultés précédentes. De plus cette technique se prête bien à une
automatisation complète, garante de la qualité des analyses.
De même l’extraction en phase supercritique (ou supercritical
fluid extraction, SFE) constitue une alternative aux techniques habi-
tuelles d’extraction par solvants (Soxhlet). Les avantages de cette
extraction (rapidité, grande sélectivité par le choix de la masse volu-
mique du fluide et de la température, quantitativité, coût, récupéra-
tion aisée des solutés, absence de pollution des composés extraits
et de l’environnement) sont essentiellement dus aux propriétés phy-
sico-chimiques des fluides supercritiques qui sont intermédiaires
entre celles des liquides et des gaz.
Enfin, la microextraction en phase solide (ou solid phase microex-
traction, SPME) apporte un moyen d’accroître les performances des
techniques dites d’espace de tête (headspace) pour l’analyse des
composés volatils par CPG. Cette technique consiste à fixer les com-
posés organiques contenus dans des matrices liquides ou gazeuses
sur une fibre de silice recouverte d'un polymère de polydiméthyl-
siloxane. Cette fibre est plongée soit dans l’échantillon liquide, soit
dans le volume gazeux situé au-dessus de la phase liquide ou
solide. Il y a alors partage des solutés entre la phase polymérique et
le liquide ou le gaz. Les solutés sont ensuite désorbés par chauffage
puis analysés par chromatographie en phase gazeuse.
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On peut rattacher aux méthodes chromatographiques

« classiques », d'autres méthodes de séparation récentes (voir enca- Techniques apparentées
dré).
■ Chromatographie électrocinétique micellaire : cette méthode
se situe dans le domaine de l’électrophorèse capillaire, laquelle
exploite la mobilité des espèces ionisées sous l’influence d’un
champ électrique. Ici, la formation de micelles résultant de
l’introduction dans le solution d’un tensio-actif ionique à une
concentration supérieure à la concentration critique micellaire,
permet le transport d’espèce hydrophobes, voire non chargées ;
en effet, ces espèces se partagent, selon leur degré d’hydropho-
bie entre la phase extérieure et le cœur hydrophobe des micel-
les, alors que les charges de surface de celles-ci permettent leur
déplacement dans le champ électrique.
■ Chromatographie de partage centrifuge (CPC) : elle utilise le
partage des espèces entre deux phases liquides non miscibles,
l’une mobile et l’autre stationnaire, cette dernière se trouvant
immobilisée dans la colonne, constituée d’enroulements de
tubes capillaires ou de canaux placés en série, par la force cen-
trifuge résultant d’une mise en rotation du système dans un
mouvement de type planétaire ou centrifuge.
■ Fractionnement par couplage flux-force (flow field fractiona-
tion, FFF). Dans cette technique, un champ (ou un gradient de
champ) est appliqué orthogonalement au flux, liquide, dans un
canal en forme de ruban de faible épaisseur ; les molécules ou
particules qui interagissent fortement avec le champ sont
« plaquées » contre le paroi où la vitesse est beaucoup plus fai-
ble que celle observée loin des parois. Les types de champs uti-
lisés le plus couramment sont : thermique, gravitationnel,
électrique, magnétique. L’analogie avec le processus chromato-
graphique réside dans la distribution entre une région relative-
ment « stationnaire » (au voisinage de la paroi) et une région
relativement « mobile » (loin de la paroi) ; néanmoins on notera
l’absence de phases distinctes. Cette technique a fait l’objet de
développements dans le domaine des macromolécules et des
particules de petite dimension (submicrométriques).

Bibliographie

Dans le traité Analyse et CAUDE (M) et THIEBAUT (D.). – Chromatographie liquide, supercritique et gazeuse. P 1470 (10-
Caractérisation des Techniques de en phase supercritique. P 1460 (1-92). 93).
l’Ingénieur LESEC (J.). – Chromatographie par perméation de
SIOUFFI (A.M.), POSTAIRE (E.) et PRADEAU (D.). –
Chromatographie planaire. P 1475 ; P 1475, 1
gel. P 1465 (4-94). (4-91).
CAUDE (M.) et JARDY (A.). – Chromatographie en
phase liquide. P 1455 (10-94) ; P 1456 et CAUDE (M.) et BARGMANN-LEYDER (N.). – Sépa- TRANCHANT (J.). – Chromatographie en phase
Doc. P 1458 (4-95). rations chirales par chromatographie en phases gazeuse. P 1485 (7-69).

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