Vacinas são administradas a pessoas sadias e, por isso, devem
ter um alto padrão de biossegurança.
Vasco Azevedo
Prof. Adjunto do Departamento de
Biologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais- UFMG. Membro Titular da
CTNBio.
vasco@mono.icb.ufmg.br
Sérgio Costa Oliveira
Prof. Adjunto do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais-UFMG. Membro
Titular da CTNBio.
scozeus@mono.icb.ufmg.br
Foto cedida pelos autores
As duas medidas de saúde pública
que tiveram maior impacto no controle
das enfermidades infecciosas e parasi-
tárias no mundo foram as de tratamen-
to da água e a vacinação, sendo a
segunda a que apresenta o melhor
custo-benefício. Há duzentos anos atrás,
Jenner criou uma nova era na medicina
quando intencionalmente infectou uma
criança com o vírus da varíola bovina.
Esse experimento, que hoje seria con-
siderado pela comunidade científica
como anti-ético, foi o começo para a
erradicação da primeira doença infec-
ciosa no mundo, a varíola humana
(Foto 1). Várias outras doenças e enfer-
midades consideradas de maior gravi-
dade para a saúde humana estão sendo
controladas com vacinas tradicionais
ou de primeira geração (Tabela 1).
Apesar do sucesso dessas vacinas con-
vencionais, ainda existem muitas do-
enças que debilitam ou levam à morte,
como, por exemplo, a AIDS, a malária,
a dengue e a hepatite C, para as quais
46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
não existem vacinas disponíveis ou as
que existem não são efetivas e apre-
sentam riscos inaceitáveis. Com o tre-
mendo avanço da biologia molecular,
que permite manipular, inserir e ex-
pressar genes heterólogos em diferen-
tes organismos, novos tipos de vacinas
estão sendo desenvolvidas como alter-
nativas para o controle dessas enfermi-
dades. Dessas “vacinas recombinan-
tes” , a imunização genética ou vacina
de DNA é a mais promissora. Essa
tecnologia, de menos de uma década,
envolve a administração direta do DNA
plasmidiano carreando o gene codifi-
cador da proteína antigênica, a qual
será expressa no interior da célula do
hospedeiro. Recentemente, foram pu-
blicados nesta revista vários artigos
sobre o assunto (1-3) e na literatura
existe uma infinidade de exemplos
que demonstram a importância desse
novo instrumento na pesquisa biomé-
dica (4,5).
Vacinas são administradas a pesso-
as sadias e, por isso, devem ter um alto
padrão de biossegurança. Os testes
clínicos das vacinas de DNA são simi-
lares aos de outros produtos biológicos
(Tabela 2), sendo o seu controle de
qualidade mais fácil e menos oneroso
pois necessita apenas da certificação
da pureza do DNA. Contudo, existem
riscos potenciais de biossegurança,
como uma possível integração no ge-
noma da célula hospedeira do DNA
plasmidiano, que pode causar ativação
de oncogenes ou inibição de genes
supressores de tumor, e indução de
autoimunidade, que devem ser exaus-
tivamente investigados. Entretanto,
poucas evidências existem de que as
vacinas gênicas possam apresentar ris-
cos superiores aos desencadeados pelo
uso das vacinas convencionais (6).
Neste artigo, daremos ênfase ao tema
risco de integração do DNA vacinal no
genoma da célula hospedeira.
A integração do DNA plasmidiano
em cromossomos de células somáticas
pode potencialmente gerar efeitos pa-
tológicos. A mutagênese por inserção
levaria a um câncer, caso esse evento
ative (proto-oncogenes) ou inative
genes (supressores de tumor) implica-
dos na regulação do ciclo celular. Essa
inserção pode ocorrer ao acaso ou por
meio da recombinação homóloga, sen-
do que o primeiro evento seria o mais
freqüente. Para tentar diminuir a pos-
sibilidade destes eventos ocorrerem,
deve-se evitar, se possível, que exis-
tam seqüências nucleotídicas homólo-
gas ao do genoma humano no plasmí-
dio vacinal e que este não se replique
nas células hospedeiras. Plasmídios
usados na imunização genética possu-
em uma estrutura com elementos regu-
latórios como promotores, acentuado-
res, terminadores, e sítios de poliadeni-
lização reconhecidos pelas células
eucarióticas, marcadores de seleção,
que são, na maioria, antibióticos, e
uma origem de replicação que não é
funcional em células de mamíferos (7).
Apesar dos elementos regulatórios se-
rem funcionais nessas células, as se-
qüências nucleotídicas desses plasmí-
dios não devem possuir homologias
significativas com o DNA genômico
dos mamíferos iguais ou superiores a
0,6 kilobases (kb), o que evitaria uma
maior eficiência na inserção do DNA,
ao acaso. Na recombina-
ção homóloga, além do
requisito anterior, os dois
genomas, o plasmidiano
e o do hospedeiro, de-
vem ser replicativos; como
os plasmídios mais utili-
zados nas vacinas de DNA
não se replicam, a eficiên-
cia desse evento ficaria
comprometida. Esses ar-
gumentos teóricos são in-
dicativos de que a taxa de
integração é baixa, e se
esta ocorresse, a probabi-
lidade de mutação deve-
ria ser insignificante, e isso
foi comprovado pelos ex-
perimentos pré-clínicos
realizados por Nichols e
colaboradores (8) e Martin e colabora-
dores, (9) que utilizaram a técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction).
Como essa técnica é extremamente
sensível, foi necessário realizar algu-
mas adaptações para serem evitados
resultados falso positivos. Para que o
DNA genômico extraído de tecidos
musculares dos quadríceps dos ca-
mundongos vacinados geneticamente
fosse separado do DNA plasmidiano
(vacina gênica), este foi digerido com
uma enzima rara, cujo sítio de clivagem
foi inserido no plasmídeo vacinal para
evitar a formação de concatâmeros,
eliminando uma migração em géis de
agarose conjunta com o DNA genômi-
co. Foram também tomados os clássi-
cos cuidados para evitar contamina-
ções na PCR, e, quando o resultado era
positivo, ou seja, havia a ocorrência do
evento de integração do plasmídeo no
genoma, foi necessário repetir os en-
saios com variantes da técnica de PCR,
como LMPCR ( Ligation-mediated-
PCR), ou PCR inversa, para a sua vali-
dação. Nichols e colaboradores não
detectaram nenhuma evidência de in-
tegração usando de 1 a 7,5 cópias de
plasmídeos por 150.000 células como
limite de sensiblidade, porém Martin e
colaboradores detectaram que entre 3-
30 cópias de plasmídeos ficavam asso-
ciados ao DNA genômico dos animais
vacinados. Apesar de resultados confli-
tantes em relação à integração, a
conclusão dos dois grupos foi unâni-
me no cálculo de freqüência de muta-
ção induzida pela integração do plas- mesmo sendo a probabilidade tão
mídeo no genoma do hospedeiro. A baixa para que eventos oncogênicos
probabilidade de uma mutação ocor- ou patogênicos ocorram, somente um
longo período de avaliação
com um grande número de
voluntários permitiria deter-
minar, em seres humanos, a
ocorrência desses fenôme-
nos biológicos. O que signi-
fica que os testes clínicos
são tão imprescindíveis para
as avaliações desses riscos
teóricos quanto para certifi-
car os benefícios potenciais
dessa nova tecnologia.
A agência reguladora
americana FDA (Food and
Drug Administration) agora
requer que testes com o uso
de PCR sejam feitos com as
adaptações descritas anteri-
ormente nos ensaios pré-
Figura 1: Homem com varíola. clínicos, mas ainda não es-
Foto da coleção do CDC (Center tabeleceu os níveis aceitáveis de inte-
gração plasmidiana no genoma. Essa
for Disease Control and
mesma agência possui um documento
Prevention) autorizada para
bem complexo que estabelece normas
divulgação
para os experimentos em animais e
testes clínicos em humanos com a
utilização de vacinas de DNA (10) . Na
rer em um dado gene devido à imuni- legislação brasileira de biossegurança,
zação gênica, seria 3.000 vezes menor ainda não existe uma instrução norma-
do que a freqüência de mutação es- tiva que seja específica e completa no
pontânea que ocorre no genoma das trato dessa matéria.
células dos mamíferos. Entretanto, Testes clínicos na fase I e II em
seres humanos já estão sendo realiza-
dos com vacinas de DNA contra as
Tabela 1. Datas da utilização em
seguintes enfermidades: AIDS, malá-
seres humanos de vacinas de ria, linfoma das células B, melanoma,
primeira geração. hepatite B, e infecção pelo herpes
Ano Enfermidade vírus. Calarota e colaboradores (11)
1798 Varíola publicaram recentemente, na revista
1885 Raiva “The Lancet”, o resultado de testes
1897 Peste bubônica clínicos na fase I, onde indivíduos
1923 Difteria imunizados com genes do HIV-1 indu-
1926 Coqueluche ziram resposta imune celular específi-
1927 Tuberculose (BCG) ca, sem que efeitos colaterais tenham
1927 Tétano sido observados. O grupo de Stephen
1935 Febre amarela Hoffman (12), na fase I dos testes
1955 Poliomielite injétavel clínicos com a vacina de DNA contra a
malária, relatou que a administração
1962 Poliomielite oral
foi bem tolerada, sem problemas de
1964 Sarampo
biossegurança aparente e com uma
1967 Papeira
excelente indução da resposta celular.
1970 Rubéola Esses resultados deram suporte à pas-
1981 Hepatite B* sagem para a fase II, onde serão feitos
testes de proteção contra essa enfermi-
De acordo com Plotkin & Mortiner
dade.
(15).
Nos tratamentos de câncer, as vaci-
* Vacina de segunda geração
nas de DNA estão sendo usadas em
(proteina recombinante purificada pacientes quando os tumores são refra-
de células)
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 47
 Tabela 2. Testes Clínicos
Fases Número de pacientes Tempo
I 20 a 100
II Algumas centenas
III Algumas centenas até
alguns milhares
O primeiro passo para uma vacina ser aprovada para comercialização é o teste em animais de laboratório; se esses
não apresentarem reações adversas, as etapas posteriores podem ser prosseguidas. O passo seguinte são testes
clínicos em seres humanos, que são divididos em três fases de avaliação do nível de proteção conferido por estas
vacinas e a sua biossegurança. Se nas últimas fases, for comprovada que essas vacinas são efetivas e seguras, então
a indústria farmacêutica pode solicitar aos órgãos competentes a licença para a comercialização do produto
tários às terapias tradicionais. Em
um desses testes clínicos, pacientes
com melanoma receberam injeções
de DNA complexados a lipossomos
diretamente nos tumores. Em al-
guns desses pacientes houve regres-
são do tumor e de suas metástases
(13).
Os testes clínicos relatados ante-
riormente foram realizados através
da injeção direta de DNA no múscu-
lo do indivíduo ou nos tumores,
porém o teste com a vacina de DNA
contra a hepatite B foi realizado por
meio da imunização pelo processo
da biobalística, utilizando-se o “gene
gun” ou arma de genes (14). O “gene
gun” é um aparelho que promove a
aceleração e a introdução de micro-
partículas de ouro encobertas com o
DNA plasmidiano recombinante na
derme dos indivíduos. Os voluntári-
os vacinados não se queixaram de
dor ou de qualquer outro desconfor-
to devido à utilização desse apare-
lho. Uma resposta eritematosa mo-
derada e transiente foi observada, o
que consiste em uma resposta infla-
matória natural da pele após a imu-
nização. Esse estudo demonstra que
essa via de administração das vaci-
nas de DNA, utilizando a arma de
genes “gene gun”, pode viabilizar a
imunização de um grande número
de indivíduos quase que automati-
zando esse processo.
As vacinas de DNA em menos de
uma década têm dado uma contri-
buição real no campo da vacinolo-
gia, e possuem uma grande vanta-
gem em relação às vacinas tradicio-
nais, o que torna essa tecnologia um
instrumento importante no combate
às doenças infecciosas que afetam a
nossa sociedade.
48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
Avaliação da biossegurança Teste de proteção
e efeitos colaterais
Alguns meses +++
Alguns meses até 2 anos +++
Alguns meses até 2 anos +++
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