УДК 573.4; 574.6; 577.1; 577.2; 577.3; 577.4; 581.5; 591.1; 631.4
ISBN 978-5-9903901-3-3
Пущино, 2013
Микробиология и вирусология
3
Микробиология и вирусология
при острой форме кишечной инфекции и у реконвалесцентных сальмонеллезных
бактерионосителей.
Распространенность известных генов секретируемых ингибиторов лизоцима: хромосомных
гомологов ivyC E. coli и K. pneumoniae, хромосомного гомолога pliC S. enterica и плазмидного
гомолога pliC K. pneumoniae, выявлялась методом ПЦР. Определение антилизоцимной активности
проводилось чашечным методом (Бухарин О.В., 1999). Лизоцимрезистентность определялась в
среде LB с добавлением динатриевой соли ЭДТА (Hiroshi N., 2003).
Показано, что хромосомные гены ivyC E.coli и pliC S.enterica имеются у всех исследованных
штаммов данных видов. Распространенность их гомологов у K. pneumoniae вариабельна:
хромосомный ген ivyC выявлен в 89,5% случаев и ген pliC, локализованный в мегаплазмиде
вирулентности определялся у 20% ivyC-позитивных штаммов.
Высокий уровень антилизоцимной активности (свыше 4 мкг/мл) стабильно выявлялся только у
штаммов клебсиелл, несущих ген pliC плазмидной локализации, штаммы сальмонелл-носителей
хромосомного гомолога pliC демонстрировали высокую вариабельность данного признака.
Уровень антилизоцимной ативности у штаммов E.coli и K. pneumoniae, не содержащих ген pliC, не
превышал 3 мкг/мл. Показано, что уровень лизоцимрезистентности всех штаммов вида K.
pneumoniae более чем в два раза превосходил МПК лизоцима, определенную у S. enterica и E. coli,
у которых данный показатель составил в среднем 0,1 мг/мл.
Таким образом, установлено, что высокий уровень антилизоцимной активности ассоциируется
с присутсвием гена pliC, но не лидирует в обеспечении лизоцимрезистентности энтеробактерий.
7
Микробиология и вирусология
БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА
FILIPENDULA ULMARIA (L.) MAXIM.
Башилов А.В.1, Мурылева Е.В.2, Линник И.А.2, Шутова А.Г.1
1
Центральный ботанический сад НАН Беларуси, 2Белорусский государственный
педагогический университет им. М.Танка, Минск (Беларусь)
anton.bashilov@gmail.com
Цель работы: изучить БД экстракта Filipendula ulmaria (L.) Maxim. на примере 5 культур
микроорганизмов.
Материалы и методы. Объект исследования: воздушно-сухое сырье соцветий Filipendula
ulmaria (L.) Maxim. (таволга вязолистная). Растение культивировалось в коллекции Центрального
ботанического сада НАН Беларуси, 2012 г.
Получение экстракта: 1 г растительного сырья помещали в колбу и прибавляли 8 мл
дистиллированной воды, после чего присоединяли к дефлегматору и нагревали на кипящей
водяной бане в течение 30 мин. Полученные экстракты охлаждали до комнатной температуры и
фильтровали.
Скрининг БД: проводили путем диффузии экстрактивных веществ в агар на питательной
среде. В эксперименте использовали 5 культур микроорганизмов: Sarcina lutea, Bacillus
subtilis, Bacillus polymixa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens. Посев осуществляли
сплошным газоном. На бумажные диски диаметром 8 мм наносили по 10 мкл экстракта
(повторность четырехкратная), контроль – стерильная вода. Культивирование проводили при
комнатной температуре 4 суток. БД определяли в сравнении степени ингибирования роста
бактериальных культур в присутствии и в отсутствии экстрактов (контроль), выражали в %.
Результаты и их обсуждение. Установлено, что водный экстракт Filipendula ulmaria (L.)
Maxim. оказал БД в отношении всех использованных в эксперименте культур микроорганизмов:
Sarcina lutea, Bacillus subtilis,Bacillus polymixa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens. БД
выявлено в большей степени для грамположительных бактерий и максимально выражено для
Bacilluspolymixa – 80%. Наиболее устойчивой к БД растительного экстракта оказалась
грамотрицательная группа микроорганизмов, а именно Pseudomonas putida и Pseudomonas
fluorescens – 20% и 30% соответственно. Уровень БД по отношению к Sarcina lutea и Bacillus
subtilis был примерно одинаковым для обеих бактериальных культур и в среднем составил 55%.
Таким образом, экспериментально установлено БД водного экстракта Filipendula ulmaria (L.)
Maxim. БД растительного экстракта выражено в различной степени, но в наибольшей для
грамположительных культур микроорганизмов. Полученные данные позволят дать некоторую
оценку БД лекарственных форм Filipendula ulmaria (L.) Maxim., а также в дальнейшем расширить
ассортимент лекарственных средств БД на основе отечественного растительного сырья.
14
Микробиология и вирусология
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ЭПИФИТНОЙ МИКРОБИОТЫ НЕКОТОРЫХ ОВОЩНЫХ
КУЛЬТУР И ТРАВ ТАМБОВСКОЙ И МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТЕЙ
Приходько С.И.
РГАУ - МСХА им. К.А.Тимирязева, Москва (Россия)
heven2289@gmail.com
Для изучения состава эпифитных микроорганизмов, мы отобрали следующие растения:
капуста (цветная и белокочанная), кукуруза, укроп, салат; люцерна, клевер, осот. Для получения
культур бактерий мы использовали питательные среды YDC и капустный агар. Далее проводилось
выделение ДНК и постановка классической ПЦР с использованием универсальных бактериальных
праймеров с последующей детекцией ампликонов гельдокументирующей системой, определение
нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК на автоматическом секвенаторе. На основе
анализа полученных данных можно сказать, что микробиота филлосферы исследованных растений
представлена следующими микроорганизмами: Bacillus (B. megaterium, B. thuringiensis, B. mycoides,
B. subtilis), Micrococcus (M. flavus, M. luteus), Curtobacteriumflaccumfaciens, Pseudomonas putida,
Lysinibacillus sp.,Enterobacter cloacae.
С образцов из Московской области больше изолировано бактерий рода Bacillus, а с образцов
из Тамбовской области бактерий рода Pseudomonas. Капуста раннеспелая отличается большим
биоразнообразием микробного сообщества, нежели капуста позднеспелая. Поверхность листьев
кукурузы и трав в меньшей степени обсеменены микроорганизмами. Нам удалось изолировать
единичные штаммы с данных образцов.
С образцов молодых листьев капусты белокочанной из Тамбовской области на капустном
агаре были выделены 9 штаммов: Bacillus (B.safensis, B.pumilus), Enterobacter cloacae,
Agrobacterium tumefaciens. На старых нами было изолирован 21 штамм: Bacillus (B.megaterium,
B.pumilus, B.subtilis,B.licheniformis), Enterobacter cloacae,Curtobacterium flaccumfaciens,
Frigoribacterium sp. Штаммы бактерий, полученные с образцов молодых листьев капусты
белокочанной Московской области: Bacillus (B. pumilus, B. cereus), Micrococcus luteus,
Microbacterium (М.yannicii, М.laevaniformans, М.barkeri). Общее количество штаммов - 14. С
образцов старых листьев капусты белокачанной: Microbacterium barkeri, Bacillus pumilus. Общее
количество штаммов - 10. Штаммы бактерий, полученные на среде капустный агар, с образцов
сорного растения осот полевой: Achromobacter sp., Enterobacter cloacae, Bacillus subtilis. Общее
количество штаммов - 3. Более молодые листья одного и того же растения в меньшей степени
колонизированы микроорганизмами, нежели старые, что ярко выражено на примере образцов из
Тамбовской области.
16
Микробиология и вирусология
АДАПТАЦИЯ ШТАММА PSEUDOMONAS STUTZERI КОС6 К АНТРОПОГЕННЫМ
УСЛОВИЯМ ОБИТАНИЯ
Закирова Я.Н., Девятияров Р.М., Лайков А.В., Григорьева Т. В.
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань (Россия)
yazgulen@mail.ru
Оценка микробного сообщества углеводородного шлама химического предприятия
«Казаньоргсинтез» позволила установить, что значительная часть (до 40%) культивируемых
микроорганизмов отхода представлена бактериями Pseudomonas stutzeri, поэтому штамм данного
вида был выбран в качестве объекта исследования.
Известно, что для бактерий данного вида характерен широкий спектр экологических ниш,
генетическая, морфологическая вариабельность и ряд биотехнологически ценных свойств:
возможность окислять различные органические соединения, для некоторых штаммов
продемонстрирована способность к нитрификации, денитрификации, деградации ароматических
соединений, фиксации атмосферного азота, резистентность к тяжелым металлам. Благодаря
уникальной пластичности генома псевдомонады способны адаптироваться к факторам
окружающей среды, в связи с этим оценка некоторых физиолого-биохимических особенностей
штамма бактерий Р. stutzeri, сформированных в условиях обитания в токсичных химических
отходах, явилась целью данной работы.
Для штамма P. stutzeri КОС6 наряду с широко распространенной способностью к деградации
моноароматических соединений, была выявлена и экспериментально подтверждена способность
утилизировать нафталин и его производные при культивировании штамма на жидкой минеральной
среде с ксенобиотиком в качестве единственного источника углерода и энергии. Кроме того,
деструкторские способности штамма P. stutzeri КОС6 сочетались с его галотолерантностью.
Исследуемый штамм демонстрировал рост при концентрации NaCl до 1,2 М, что позволяет отнести
его к умеренным галотолерантным бактериям. Присутствие нафталина в среде 1 г/л сужает
галотолерантность штамма до 0,5 М NaCl. Еще одним важным с точки зрения обитания в условиях
дисбаланса основных биогенных элементов (C:N) свойством выделенного штамма является
способность к биологической фиксации азота. Наряду с обнаруженными функциональными
генами (nif), азотфиксирующая активность штамма P. stutzeri КОС6, оцененная ацетиленовым
газохроматографическим методом (14,3 нмоль C2H4/ мл*ч-1), оказалась сопоставимой с таковой
истинных азотфиксаторов. P. stutzeri КОС6 можно считать уникальным представителем вида, так
как для него впервые продемонстрировано сочетание метаболических путей деградации нафталина
и фиксации молекулярного азота, а также умеренная галотолерантность, позволяющие ему
выживать в условиях сильного антропогенного загрязнения.
20
Микробиология и вирусология
структуру, были выбраны клубеньковые бактерии рода Rhizobium и фитопатогенные бактерии рода
Xanthomonas.
Целью работы явилось изучение разнообразия природных популяций бактерий родов
Rhizobium и Xanthomonas с помощью самостоятельно разработанной единой маркерной системы
бактериальной идентификации и диагностики.
Нами были разработаны маркерные ПЦР-системы на хромосомный hin-регион, специфичные
для клубеньковых бактерий рода Rhizobium и фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas,
позволяющие изучить их на уровне вида - группы штаммов (подана заявка на патент рег. №
2011135461 от 25.08.2011 и 09.01.2013 получено положительное решение о выдаче). Также
предложен новый подход (saAFLP и hin-регион ПЦР) к изучению генетического разнообразия
данных родов бактерий на внутривидовом уровне, который превосходит аналоги по разрешающей
способности. Так нами показана эффективность разработанных техник ПЦР-фингерпринтинга при
оценке биоразнообразия штаммов рода Xanthomonas, поражающих рапс (Brassica napus) в России,
а на примере симбиотических систем Pisum satіvum и Vicia faba была обнаружена специфичность
генотипов ризобий во взаимодействии с растением-хозяином.
Данная работа проводилась в рамках договора о научном сотрудничестве между Институтом
биохимии им. А.Н. Баха и отделом микробиологии Института сельского хозяйства Крыма при
финансовой поддержке ООО “Гринвайд”.
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ
РАЙОНОВ ТАТАРСТАНА
Алимова Ф.К., Болормаа Ч., Ибрагимов А.Н., Тухбатова Р.И.
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань (Россия)
dysport@bk.ru
Актиномицеты являются наиболее экономически и биотехнологически ценными
прокариотами, которые способны производить широкий спектр биологически активных вторичных
метаболитов, такие как антибиотики, противоопухолевые средства, иммунодепрессанты и
ферменты. Эти метаболиты, как известно, обладают антибактериальным, противогрибковым,
противоопухолевым, противомалярийным и противовоспалительным действием.
Целью настоящей работы явилась физиолого-биохимическая и таксономическая
характеристика актиномицетов.
В ходе работы было выделено 268 изолятов актиномицетов из археологических объектов,
государственного Раифского заповедника, почв и агроценозов, антропогенных ландшафтов
Республики Татарстан. В ходе морфологической идентификации было выявлено 35 видов рода
Streptomyces. 9 видов были идентифицированы на основе данных секвенирования гена 16S рРНК.
Оценка принадлежности к определенным генетическим кластерам проводилась с использованием
депонированных последовательностей базы NCBI.
Применение консортивного подхода к изучению влияния растений и животных на
распространение позволило выявить виды, ассоциированные с ризосферой.
По полученным данным выделенные виды относятся к секции Cinereus сериям Achromogenes,
Chromogenes, Violaceus, Aureus, к секции Albus серии Albus, к секции Roseus серии Roseus, к секции
Helvolo-Flavus серии Flavusа.
По частоте встречаемости в почвах доминируют представители секции Cinereus серий
Violaceus, Achromogenes, Chromogenes, Albus.
Исследование антибиотической активности штаммов Streptomyces показало, что культура
S.achromogenes имеет высокую активность по отношению к исследованным бактериям.
Метаболиты этих штаммов подавляли рост всех исследованных тест-культур: как бактериальных
(зоны задержки роста - 13,0±0,5 - 21,0±0,5), так и грибных (19,0±0,6). Метаболиты S. olivovaribilis
обладали антимикробной активностью только по отношению к фитопатогенным бактериям и грибу
Fusarium oxуsporum (зоны задержки роста 19,0±0,6мм-21,0±0,5 соответственно). Таким образом,
данные виды в дальнейшем могут быть исследованы как возможные продуценты антимикробных
соединений.
21
Микробиология и вирусология
АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА СОБАК КРУПНЫХ ПОРОД В
ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЦИОНОВ ПИТАНИЯ
Иванова А.Ф., Ильина Л.А., Никонов И.Н., Нагорнова К.В., Латев Г.Ю.
ООО «БИОТРОФ», Санкт-Петербург (Россия)
an-21_86@mail.ru
В настоящее время рынок кормов для домашних животных предлагает огромный выбор
готовых сухих кормов, сбалансированных по питательным веществам, ориентированных на
удовлетворение максимальных потребностей животных. Важнейшим критерием выбора
оптимального корма, помимо физиологических и морфологических показателей, способствующим
оптимальному выбору продукта, является микрофлора кишечника. Необходимо отметить, что
важным условием при кормлении собак является сохранение микробиоценоза кишечника с целью
снижения риска возникновения и развития ряда патологических состояний, обусловленных
условно-патогенной микрофлорой.
Целью исследования являлось определение состава и структуры микрофлоры кишечника собак
с применением молекулярно-генетических методов анализа.
В эксперименте участвовали собаки породы «Среднеазиатская овчарка». Собаки получали
стандартный сухой полнорационный корм для взрослых собак с высокой активностью. В состав
рациона собак опытных групп вводили термостабильную форму ферментативного пробиотика
Целлобактерина-Т. Бактериальное сообщество кишечника изучали молекулярно-генетическим
методом оптимизированного для собак T-RFLP-анализа, включающего стадии выделения ДНК,
амплификацию ДНК, секвенирование.
Результаты исследований показали, что микрофлора кишечника собак в значительной степени
представлена некультивируемыми бактериями, молочнокислыми бактериями и бациллами. Наряду
с высоким содержанием полезных лактобактерий семейства Lactobacillaceae и бацилл семейства
Bacillaceae, практически не было зафиксировано бифидобактерий. Количество энтеробактерий
семейства Enterobacteriaceae у всех собак было низким. Обнаружены (в незначительных
количествах) представители бактерий семейства Clostridiaceae, бактероиды филы Bacteroidetes
(рода Bacteroides, Flavobacterium, Flexibacter, Cellulophaga, Prevotella), актинобактерии филы
Actinobacteria, и кампилобактерии (рода Helicobacter). Установлено, что ввод в рацион питания
пробиотика Целлобактерина-Т способствует повышению численности молочнокислых бактерий и
снижению и полному исчезновению условно-патогенных видов в микробиоценозе кишечника.
Таким образом, применение молекулярно-генетического метода определения микрофлоры на
основе T-RFLP-анализа позволяет выявить до 100% видов бактерий, обитающих в кишечнике
собак и определить влияние рационов на состав и структуру микробиоценозов кишечника.
23
Микробиология и вирусология
существенное влияние на способность молекулы в той или иной мере определять доступность
специфических сайтов связывания бактерий с макропартнером.
Таким образом, впервые выявлена концентрационная зависимость влияния флавоноидов на
свойства поверхности и макромолекулярную организацию ЛПС в структуре внешней мембраны
азоспирилл.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (проект 11-04-00533).
25
Микробиология и вирусология
Реконструировали биопленоки с использованием стерильных поликарбонатных фильтров,
которые помещали на поверхность агаризованной среды Е8 с гексадеканом. На фильтры наносили
30-50мкл биопленок, полученных вышеописанными способами. Чашки инкубировали при 280С в
течение 7 суток. Биопленки подвергали диспергированию в жидкой среде и высевали на плотную
среду, до получения чистых культур микроорганизмов. Таким образом, нами были получены
биопленочные микроорганизмы, представленные бактериями родов Rhodococcus и Bacillus.
27
Микробиология и вирусология
ВЫЯВЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРОВ СИНТЕЗА БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
БАКТЕРИЯМИ ARTHROBACTER SULFONIVORANS И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА
СИНТЕЗИРУЕМЫХ ИМИ ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ
Костеневич А.А.
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск (Беларусь)
Bufo_bufo@tut.by
В качестве эффекторов синтеза рассматривались лактоза, являющаяся индуктором синтеза
бета-галактозидазы у большинства штаммов-продуцентов, глюкоза и галактоза как конечные
продукты гидролиза специфического субстрата, а также такие структурные аналоги лактозы как
мальтоза, мелибиоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и лактулоза.
Согласно полученным экспериментальным данным, максимальный положительный эффект на
образование фермента Arthrobacter sulfonivorans оказывает его природный субстрат – лактоза
(15,2 ед/мл)
Получены данные, свидетельствующие о различном влиянии глюкозы и галактозы – продуктов
гидролиза лактозы – на синтез бета-галактозидазы A. sulfonivorans в зависимости от их
концентрации и времени добавления в среду с лактозой. Показано, что галактоза, используемая в
высоких (1,5%) концентрациях, является более сильным, чем глюкоза, репрессором синтеза
ферментного белка. При этом установлено, что галактоза и глюкоза не влияют на активность бета-
галактозидазы.
Выявлен невысокий (0,05 ед/мл) уровень синтеза внеклеточного фермента также при
выращивании исследуемой культуры как в среде без углерода (0,05 ед/мл), так и в средах,
содержащих в качестве единственного источника углеводного питания структурные аналоги
лактозы – трегалозу (0,59-3 ед/мл), лактулозу (0,12-1 ед/мл), мелибиозу (0-0,8 ед/мл), сахарозу (0-
1,3 ед/мл), мальтозу (0,8-1,2 ед/мл), целлобиозу (0,07-0,83 ед/мл).
Полученные результаты дали основание предположить наличие у A. sulfonivorans
множественных молекулярных форм бета-галактозидазы.
Так, в бесклеточном фильтрате культуральной жидкости штамма A. sulfonivorans,
выращенного в среде с лактозой, выявлены по крайней мере две молекулярные формы
каталитически активной бета-галактозидазы – мажорная G-1 и минорная G-2. Причем их
количество не зависит от времени его внесения в среду. Доля выявленных молекулярных форм
фермента в общей массе внеклеточных белков бактерий в этом случае составляет около 30%.
На зимограммах внеклеточных белков, продуцируемых A. sulfonivorans в средах без источника
углерода, а также в средах, содержащих конечные продукты гидролиза лактозы или ее
структурные аналоги в качестве единственных источников углерода, обнаруживается только
минорная форма бета-галактозидазы. Эта же молекулярная форма ферментного белка, выявляется
также и в культуральной жидкости бактерий, растущих в средах с лактозой в условиях репрессии
глюкозой или галактозой.
Необходимы молекулярно-генетические исследования, на основании которых можно будет
сделать вывод о том, являются выявленные молекулярные формы бета-галактозидазы результатом
экспрессии различных генов или посттрансляционных модификаций ферментного белка.
30
Микробиология и вирусология
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЛАНКТОННЫХ И БИОПЛЕНОЧНЫХ КЛЕТОК
КУЛЬТУРЫ ЦЕЛЛЮЛОЗОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS CALU 1629
Майкова А.С., Ткаченко А.А., Рыбальченко О.В.
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург (Россия)
ann-maikova@yandex.ru
Грамотрицательные бактерии Gluconacetobacter xylinus рассматриваются в качестве модельной
системы для исследования биосинтеза бактериальной целлюлозы. По сравнению с растительной,
бактериальная целлюлоза обладает рядом значительных преимуществ и положительных свойств,
которые в настоящее время вызывают интерес у исследователей в связи с возможностью ее
практического использования.
Развивающаяся культура G. xylinus CALU 1629 представляет собой типичный пример
биопленки, формирующейся на границе раздела двух фаз жидкость-воздух. Известно, что клетки,
иммоболизированные в биопленку, и планктонные формы, содержащиеся в жидкой фазе, имеют
различный фенотип и могут отличаться по своим морфофизиологическим свойствам.
Целью настоящего исследования является сравнительный морфофизиологический анализ
планктонной и биопленочной формы клеток культуры целлюлозосинтезирующей бактерии G.
xylinus.
В ходе работы показано, что размножение и синтез целлюлозы клетками G. xylinus CALU 1629
происходит по-разному в зависимости от использования в качестве инокулята планктонных или
биопленочных клеток.
Выявлены различия планктонных и биопленочных клеток по морфологическим и
культуральным свойствам, по чувствительности к повышенной и пониженной температуре, рН и
NaCl, по способности к синтезу каротиноидных пигментов. Планктонные клетки обладают более
ярко выраженными адгезивными свойствами, более жизнеспособны при длительном хранении на
плотной питательной среде по сравнению с клетками из биопленок.
Электронно-микроскопическое исследование методом ультратонких срезов планктонных
клеток из жидкой фазы культуры показало, что на их поверхности образуются многочисленные
мембранные везикулы (блебинг-везикулы) различных размеров. В периплазматическом
пространстве таких клеток отмечено формирование электронно-плотных (осмиофильных) гранул,
по-видимому, белковой или белково-полисахаридной природы. На ультратонких срезах клеток из
биопленок подобные структуры не обнаруживались.
Таким образом, сравнительный анализ морфофизиологических свойств клеток G. xylinus
CALU 1629, образующих биопленки на границе раздела двух фаз жидкость-воздух, показал, что
существуют различия между планктонными и биопленочными формами клеток по
морфологическим и культуральным свойствам. Полученные данные оказались полезными для
оптимизации процесса получения бактериальной целлюлозы, поскольку подтверждают, что для
ускорения синтеза и повышения выхода целлюлозы целесообразно использовать инокулят,
содержащий преимущественно планктонные клетки. Полученные результаты свидетельствуют о
том, что качество инокулята необходимо учитывать как при решении экспериментальных задач,
так и в широкомасштабном производстве бактериальной целлюлозы.
32
Микробиология и вирусология
РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS
THURINGIENSIS
Мартьянова Д.И., Терёхина Л.Д., Ардисланова Э.Ш.
Ульяновский государственный университет, Ульяновск (Россия)
myoctopus@rambler.ru
В настоящее время все чаще говорят о применении биотехнологий в сельском хозяйстве.
Основная цель данной отрасли получение стойких жизнеспособных растений с хорошими
морфометрическими показателям и биомассой. Применение дельта-эндотоксинов Bacillus
thuringiensis один из наиболее экономически оправданных методов, из-за его относительно
простого и дешевого получения. Токсины являются безвредными для человека и эффективными в
борьбе с насекомыми и микроорганизмами, угнетающими развитие, рост и жизнь растений.
Целью исследования было изучить ростостимулирующее действие дельта-эндотоксинов
Bacillus thuringiensis и оценить его антибактериальное действие на бактерии Xanthamonas
campestris.
В работе применяли один из промышленных подвидов продуцента дельта-эндотоксинов
Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki z-52. Тест-объектами служили фитопатогенные бактерии вида
Xanthomonas campestris. Изучали семена капусты огородной (Brassica oleracea L., 1753) – сорт
Номер первый Грибовский 147.
В исследовании рассматривались 5 вариантов опыта. В каждом варианте было по десять чашек
Петри. Повторность опыта трехкратная. В каждой чашке Петри было по 20 семян капусты
огородной. Опыт проводился в течение двух недель. По окончании опыта оценивали
морфометрические показатели капусты огородной. Все семена контрольных групп проросли.
Исследуемые проростки в среде с дельта-эндтоксинами концентрации 0,5% по всем
морфометрическим показателям превышали значения контрольных групп. Длина главного корня и
стебля оказалась больше в среднем на 45%. Растения в среде с суспензией возбудителя развивались
плохо. Корневая система развивалась плохо, стебель укорочен. Проростки в среде возбудителя и
токсина развивались динамично. Показатели длины корня стебля схожи с группам и
проращиваемыми в токсинах. В группах, в которых семена были предварительно обработаны
токсинами в течение трех часов, растения развивались хуже, чем при постоянной инкубации в
растворе дельта-эндотоксинов. Корневая система развита хорошо, но стебель укорочен. В
вариантах опыта, где постоянно присутствовал, дельта-эндотоксин развивались настоящие листья
капусты.
По результатам наших исследований, можно сделать вывод о том, что токсины малых
концентраций оказывают ростостимулирующее действие на растения и подавляют
инфицирующую способность бактерий.
33
Микробиология и вирусология
Бактериальное сообщество кишечника изучали молекулярно-генетическим методом
оптимизированного для птицы T-RFLP-анализа, включающего стадии выделения ДНК,
амплификацию ДНК, секвенирование.
Результаты исследований показали, что микрофлора кишечника бройлеров в значительной
степени представлена некультивируемыми бактериями. Установлено, что значительная часть
микроорганизмов кишечника бройлеров опытных вариантов представлена лактобактериями и
бациллами, обладающими высокой антагонистической активностью в отношении патогенных
микроорганизмов. Обнаружено, что ввод в рацион неферментированного и ферментированного
гидролизата из пера способствовало увеличению доли целлюлозолитических бактерий
(эубактерий, вейлионелл, руминококков) в 1,55 и 1,32 раза в тонком отделе кишечника, а введение
пробиотика в рацион ОР1 - в 1,14 раз. Установлено, что добавление в рацион
неферментированного и ферментированного белкового гидролизата из пера в сочетании с
пробиотиком (Целлобактерин-Т) способствало снижению уровня энтеробактерий (сальмонелл,
кишечной палочки, протеи) в тонком отделе кишечника бройлеров. Ввод в рационы бройлеров
неферментированного и ферментированного белковых гидролизатов из пера в сочетании с
Целлобактерином-Т способствовало снижению уровня актинобактерий и стафилококков в
кишечнике бройлеров по сравнению с контрольным вариантом.
Таким образом, замена рыбной муки на неферментированный и ферментиро-ванный
белковый гидролизат из пера при вводе в комбикорма Целлобактерина-Т позволяет получить не
только хорошую сохранность, высокую живую массу, но и оптимизировать микрофлору
кишечника бройлеров, снизив численность патогенных и условно-патогенных видов бактерий до
минимальных значений, и повысив численность полезной микрофлоры (молочнокислые и
целлюлозолитические бактерии).
35
Микробиология и вирусология
РОДОКОККИ КАК ОСНОВА ДЛЯ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩЕГО БИОПРЕПАРАТА-
ФИТОСТИМУЛЯТОРА
Отрошко Д.Н., Козицын А.Е., Городисская Ю.В., Лень Н.В., Алексеенко К.П.,
Волченко Н.Н.
Кубанский государственный университет, Краснодар (Россия)
otroshko_dmitrii@mail.ru
Современные технологии биоремедиации основываются прежде всего на активности
специфических микроорганизмов-деструкторов, способных разлагать токсические поллютанты.
Среди бактерий, ассимилирующих углеводороды, перспективной группой являются представители
р. Rhodococcus, лежащие в основе ряда биопрепаратов. Целью нашей работы являлось изучение
следующих свойств нефтеокисляющих родококков коллекции кафедры генетики, микробиологии и
биотехнологии КубГУ: кинетика роста культур, возможность совместного жидкофазного
культивирования нескольких штаммов, продукция ими фитогормонов, возможность
флотационного отделения биомассы от среды роста. Способность к деструкции широкого спектра
нефтепродуктов в лабораторных и полевых условиях была показана сотрудниками кафедры ранее.
Микроорганизмы культивировались в колбах на орбитальной качалке и в ферментерё МФ-
100Т, входящим в состав модульного биотехнологического оборудования Ока-01 (производства
ИБП РАН, г.Пущино). Использовались различные варианты минеральных сред, углеводных и
углеводородных источников углерода.
Были исследованы 6 штаммов рода Rhodococcus, отличающихся по уровню гидрофобности
клеточной стенки и образующих колонии R-, S- и М-морфотипов. Из 15 бинарных комбинаций у
4 сочетаний наблюдался стимулирующий эффект, выраженный в лучшем росте, чем в
монокультурах. Оценка кинетических параметров роста этой комбинации родококков показала µ =
0,147 ч-1 и 0,378 ч-1 при культивировании бинарной культуры в колбах и ферментере
соответственно. Одним из наиболее энергоёмких этапов производства биопрепаратов является
отделение микробных клеток от водной среды роста. Оценивалась возможность флотирования
клеток, как дешевого и быстрого способа. Показано, что применение жидких флотирующих
агентов и барботажа воздухом позволяет удалить из среды роста до 90 и 75 % биомассы
соответственно.
В технологиях биоремедиации почв важнейшим критерием является восстановление их
плодородия, возможность культивирования растений, что лежит в основе этапа фиторемедиации.
Полезным свойством штаммов-нефтедеструкторов служит продукция ими фитогормонов.
Обнаружено, что среди исследуемых культур есть PGPR-штаммы, способные продуцировать
индолилуксусную кислоту при росте на сахарозе или гексадекане. Внесение триптофана как
метаболического предшественника увеличивало выход ауксина до 2 мг/мл. Всхожесть тест-
растений при обработке культуральной жидкостью увеличивалась на 30%.
Полученные результаты позволяют заложить научные основы для пилотного производства
нефтеокисляющего биопрепарата, обладающего фитостимулирующим эффектом. Исследования
выполнялись при поддержке госзадания Министерства образования и науки “Разработка научно-
обоснованных подходов к культивированию биотехнологически перспективных микроорганизмов-
нефтедеструкторов для создания регионально-адаптированных биопрепаратов”.
39
Микробиология и вирусология
АНТИМИКРОБНАЯ И АНТИАДГЕЗИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
МЕТАБОЛИТОВ NOCARDIA VACCINII ИМВ В-7405
Покора К.А., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий, Киев (Украина)
khrystya91@ukr.net
Актуальной проблемой на сегодняшний день остается борьба с бактериозами
сельскохозяйственных растений, которая рассматривается как существенный вклад в решение
глобальных продовольственных проблем. Средствами биологического контроля над
фитопатогенами в сельском хозяйстве могут быть микробные поверхностно-активные вещества
(ПАВ). Эти продукты микробного синтеза обладают также антиадгезивными свойствами по
отношению к различным микроорганизмам, образующим биопленки на зубных протезах.
Цель данной работы – исследовать антимикробные и антиадгезивные свойства ПАВ, а также
других внеклеточных метаболитов Nocardia vaccinii ИМВ В-7405 по отношению к некоторым
бактериям и дрожжам.
Объектами исследований при определении антимикробных свойств были фитопатогенные
бактерии родов Pseudomonas, Xanthomonas и Pectobacterium, антиадгезивных – Escherichia coli
ИЭМ-1, Candida albicans Д-6. В исследованиях использовали такие препараты: препарат 1 –
супернатант культуральной жидкости содержащий ПАВ; препарат 2 – раствор ПАВ, выделенный
экстракцией смесью Фолча (из препарата 1); препарат 3 – водная фаза после экстракции ПАВ
смесью Фолча.
Установлено, что после обработки в течение 2 ч как препаратами поверхностно-активных
веществ с концентрацией 0,085 – 0,85 мг/мл, так и другими внеклеточными метаболитами N.
vaccinii ИМВ В-7405 количество клеток фитопатогенных бактерий родов Xanthomonas,
Pseudomonas и Pectobacterium снижалось на 95 – 100 %. Показано, что препарат 2 (0,12 мг/мл)
снижал количество прикрепленных на материале зубов и силиконовом базисе клеток E. coli ИЭМ-
1, C. albicans Д-6 на 80 – 90% по сравнению с необработанными препаратами ПАВ материалами.
Установлено, что даже при снижении концентрации ПАВ в препарате 2 до 0,032 мг/мл степень
адгезии исследуемых тест-культур оставалась на уровне 93%.
Таким образом, внеклеточные метаболиты штамма ИМВ В-7405 могут быть использованы как
эффективные антимикробные и антиадгезивные агенты.
43
Микробиология и вирусология
В общей сложности было получено 42 096 частичных (средняя длина – 430 нп)
последовательностей генов 16S рРНК. Из них 37 229 принадлежали населяющим сфагновый торф
бактериям, а также 2 135 последовательностей относились к Archaea и 2 732 – к Eukarya. По
результатам филогенетического анализа Acidobacteria оказалась самой распространенной группой
как в аэробной, так и в анаэробной зонах (35,5±2,4 и 39,2±1,2% от всех классифицированных
последовательностей, соответственно). Данный факт подтверждает роль представителей
Acidobacteria как основных участников микробных сообществ сфагновых болот.
Совокупное разнообразие ацидобактерий было выражено в операционных таксономических
единицах (ОТЕ) с уровнем сходства 97% , примерно соответствующим уровню вида. Этот
показатель составил 105 ОТЕ для аэробного слоя и 69 ОТЕ – для анаэробного. Из них 21 ОТЕ
были распространены в обоих слоях сфагнового болота. Детальный таксономический анализ
показал, что большинство детектированных ацидобактериальных последовательностей
принадлежали к подгруппам 1, 2 и 3 филума, а также небольшая часть последовательностей (~0,2-
0,6%) относилась к подгруппе 8.
Значительная часть последовательностей генов 16S рРНК не могла быть соотнесена ни с
одним из известных представителей Acidobacteria. Доля таких последовательностей была выше в
анаэробном слое, что указывает на наличие существеннго пробела в знаниях об ацидобактериях,
населяющих бескислородные места обитания. Распределение по глубине «известных» филотипов
согласуется с физиологическими характеристиками соответствующих им близкородственных
ацидобактерий. Данный факт говорит о том, что выявленный нами профиль распределения
филотипов по глубине отражает действительные предпочтения теми или иными ацидобактериями
аэробных или анаэробных условий и может быть использован для оптимизации процедур
выделения чистых культур.
47
Микробиология и вирусология
Полученные результаты могут быть учтены при разработке ростостимулирующих препаратов
на основе дельта-эндотоксинов, а также приёмов их практического использования в сельском
хозяйстве в период вегетации растений, для предпосевной обработки семян.
Парфенова Т.В.2
1
ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный технический университет, Ульяновск
(Россия); 2НИИ Физико-химической медицины, Москва (Россия); 3ФГБОУ ВПО
Ульяновский государственный университет, Ульяновск (Россия)
falova@rambler.ru
В связи с широким распространением и циркуляцией в госпитальной среде
метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) особую актуальность
приобретает вопрос об их обнаружении. Важным для дифференциации таких штаммов является
исследование генных комплексов, входящих в состав стафилококковых хромосомных кассет mec
(staphylococcal chromosome cassette mec - SCCmec).
Целью работы явилось изучение частоты встречаемости метициллинрезистентных штаммов
Staphylococcus spp., полученных от больных с псориазом, экземой, атопическим дерматитом.
Исследованы 185 штаммов стафилококков посредством ПЦР. По полученным результатам
обсемененность кожи стафилококками у обследованных лиц составила 79,8% случаев, среди
которых 43,8% приходилось на штаммы Staphylococcus aureus.
Результаты SCC-mec типирования показали наличие хромосомной кассеты mecA в 15 случаях
из 185 (8,1%) у коагулазоотрицательных штаммов, таких как S. hominis – в 7, S. epidermidis – в 4, S.
haemolyticus – в 4 случаях соответственно. Однако у штаммов золотистого стафилококка,
выделенного как с пораженных, так и с интактных участков кожи, данный ген не был обнаружен.
Анализ результатов в зависимости от клинической формы заболевания обследованных
показал, что коагулазонегативные стафилококки, выделенные от лиц с псориазом, обнаруживали
ген mecA в 26,7% случаев, при экземе – в 66,7%, а при атопическом дерматите – в 6,6% случаев .
Таким образом, штаммы золотистого стафилококка, выделенные с кожи при хронических
дерматозах, не обладали хромосомной кассетой, определяющей устойчивость к метициллину, в то
время как коагулазонегативные стафилококки обнаруживали данный признак в 8,1% случаев.
50
Микробиология и вирусология
наблюдался и в культурах E. coli, дефектных по синтезу глутатиона (gsh), что указывало на участие
других тиолов (например, цистеина) в генерации скачков Eh. Таким образом, требуются
дальнейшие исследования молекулярных механизмов, участвующих в генерации скачка Eh при
стрессах.
В экспериментах использовались штаммы E. coli BW25113 – родительский тип; NM4351
(eamAB gshA) – тройной мутант по синтезу глутатиона и системе транспорта цистеина и JW3901
( menA) – дефектный по синтезу менахинона.
Исследования показали, что как в культурах родительского типа, так и у мутантов eamAB gshA,
остановка роста при добавлении валина (0.5 мг/мл) сопровождалась скачком Eh в область
отрицательных значений продолжительностью 45 мин и амплитудой Eh 45 мВ. Одновременно
наблюдалось повышение рО2 в среде на 20%, что указывает на отсутствие прямой связи между
изменениями Eh и рО2. Во всех указанных выше ситуациях добавление NEM ингибировало
генерацию скачка Eh. Таким образом, отсутствие глутатиона и системы транспорта цистеина не
препятствовало генерации скачка Eh, связанного с повышением экстраклеточныхтиолов.
Многие стрессы вызывают у бактерий процессы, характерные для окислительного стресса:
повышение уровня активных форм кислорода (АФК) и активацию регулонов SoxRS и OxyR. С
другой стороны, показано, что редокс-превращения менахинона, одного из компонентов
электронно-транспортной цепи (ЭТЦ), могут участвовать в генерации АФК. В наших условиях
обработка валином E. coli, лишенных менахинона, приводила к генерации скачка Eh. По
сравнению с бактериями родительского типа, амплитуда скачка у мутантов снижалась на 45%, а
продолжительность – на 67%. Одновременно наблюдалось повышение рО2 на 20%.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской
Федерации,соглашение 8114; при поддержке грантом Президента РФ МК-1763.2012.4 и грантом
президиума УрО РАН «Молекулярная и клеточная биология».
52
Микробиология и вирусология
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ SAAFLP И HIN-РЕГИОН ПЦР ДЛЯ
ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ РИЗОБИЙ - СИМБИОНТОВ
PHASEOLUS VULGARIS
Хапчаева С.А. , Пунина Н.В.1,2, Зотов В.С.1, Дидович С.В.3, Топунов А.Ф.1
1
1
Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 2Медико-генетический научный центр РАМН,
Москва (Россия); 3Институт сельского хозяйства Крыма НААНУ, Симферополь (Украина)
hapchaeva.90@mail.ru
Бактерии рода Rhizobium способны вступать в симбиотические отношения с различными
бобовыми растениями, в том числе сельскохозяйственными культурами. Одной из таких важных
культур является фасоль обыкновенная, которая занимает в настоящий момент второе место в
мире по выращиванию после сои. Известно более семи различных групп ризобий, способных
образовывать клубеньки в симбиозе с Phaseolus vulgaris. Однако одной из главных причин слабого
проявления ассоциации Phaseolus-Rhizobium является наличие большого количества местных
штаммов Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, которые образуют клубеньки с фасолью, и
характеризующихся средней и низкой эффективностью или полным отсутствием фиксации азота.
Поэтому актуальным является вопрос изучения генетического разнообразия микросимбионтов
фасоли и оценка их на перспективность использования в сельскохозяйственной практике.
Целью наших исследований являлась оценка разрешающей способности техник saAFLP и hin-
регион ПЦР (Заявка на патент № 2011135461. Получено положительное решение о выдаче от
09.01.2013 г.) в сравнении с генетическими маркерами 16S рРНК, 16S-23S рРНК, nodD, nifD-K и
gyrB для изучения разнообразия и происхождения бактерий рода Rhizobium симбионтов фасоли на
внутривидовом уровне.
Нами была показана видовая принадлежность штаммов-симбионтов фасоли, культивируемой в
Харьковской области Украины, к видам R. leguminosarum и R. giardinii, а также высокий уровень
их генетического разнообразия: по данным сравнения последовательностей hin-региона и
фингерпринтов saAFLP выявлено 5 генотипов. По совокупности полученных нами генетических
данных штамм Rlp 700-st следует переименовать в R. phaseoli 700-st, а обособленная группа
штаммов генотипа II (по hin-региону и гену gyrB) и удалённый штамм Rlp ФН-6 могут
претендовать на выделение в отдельные виды, что требует дальнейшего более подробного
изучения.
Также отмечена большая информативность предложенного нами маркера hin-региона, по
сравнению с аналогами (16S рРНК, 16S-23S рРНК и gyrB), а в совокупности с техникой saAFLP
становится возможным более эффективно описывать внутри- и межвидовое генетическое
разнообразие клубеньковых бактерий рода Rhizobium симбионтов фасоли.
Данная работа проводилась в рамках договора о научном сотрудничестве между Институтом
биохимии им. А.Н. Баха и отделом микробиологии Института сельского хозяйства Крыма при
финансовой поддержке ООО “Гринвайд” и целевой программы Президиума РАН «Поддержка
молодых ученых».
Sabaneyeva E.V.1
1
Saint-Petersburg State University, Faculty of Biology and Soil Sciences, Saint-Petersburg
(Russia); 2University of Pisa, Department of Biology, Pisa (Italy); 3University of Stuttgart,
Biological Institute, Stuttgart (Germany)
ghostelf@mail.ru
Little is known about intracellular motile endobionts inhabiting the macronucleus of the ciliate
Paramecium multimicronucleatum. To give a proper microbiological description of this endobiont
according to the rules of modern microbiological nomenclature, the cells of the stock LSA 11-2 isolated
from the natural population in Tuscany, Italy, were studied using light, confocal, electron and atomic force
microscopy.To identify their phylogenetic relationship, fluorescent in situ hybridization (FISH) with
rRNA targeted oligonucleotide probes was performed. Theendobiontslive mostly in the chromatin free
intranuclear lacunae or directly under the nuclear envelope. Two different morphological forms can be
distinguished: a motile thin rod-like cell 2- 2,5µm long and 0,7µm wide, and an immobile oval form of
the same length, but 1,5 µm in width. The symbionts have a lot of flagellae on the cell surface. The
flagellae are more than 10 µm long and allow the cell to move very rapidly. The cytoplasm of the
endobionts contains large electron- transparent granules, reminiscent of lipid droplets, and tiny electron-
dense inclusions. Most of the bacteria harbor virus-like particles in their cytoplasm.The bacteria seem to
lack infectivity and do not confer killer trait to their host. FISH with the universal eubacterial probe EUB
338 and the alphaproteobacteria specific probe demonstrated that the endobiont belongs to the
alphaproteobacteria. No signal was observed with the probespecific for Holospora, the most common
intranuclearendobionts of ciliates. Specially designed Rickettsia-specific probe used under stringent
57
Микробиология и вирусология
conditions in hybridization indicated that the motile intranuclear bacteria are related to Rickettsia. This is a
first observation of Rickettsia-like bacteria bearing flagellae.
Supported by Marie Curie Actions, IRSES, № 247658 CINAR PATHOBACTER.
SAAFLP, 16S RRNA, GYRB AND ERIC-, BOX-PCR ANALYSIS FOR INVESTIGATION
OF GENETIC DIVERSITY OF BACILLUS SUBTILIS STRAINS FROM UKRAINE
Punina N.V., Zotov V.S., Khapchaeva S.A., Parkhomenko A.L., Parkhomenko T.U.,
Kuznetsova L.N., Topunov A.F.
Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow (Russia)
hin-enkelte@yandex.ru
The Bacillus subtilis group is a complex of 9 closely related species which cannot be differentiated on
the basis of phenotypic characteristics. DNA-DNA hybridization and 16S rRNA also don't allow to
identify species within this group, and resolve phylogenetic relationships. At the same time the possibility
to distinguish the species within B subtilis group is not only the taxonomic task but also is very important
for biotechnological and industrial applications.
Analysis of nucleotide sequences of 16S rRNA and gyrB genes, ERIC-, BOX-PCR markers and
saAFLP were used to characterize 40 isolates and strains of B subtilis group from different regions of
Ukraine. All isolates from soil showed antagonostic properties against a number of bacteria and
micromycetes. 16S rRNA gene sequence analysis confirmed that all isolates belonged to B. subtilis group.
But as it was expected 16S rRNA gene sequences were highly conserved for resolving closely related
strains. The sequence similarities between strains were 97.9%-100.0%. GyrB gene, which encodes the
subunit B protein of DNA gyrase, was selected as an alternative phylogenetic marker. The similarity of the
gyrB nucleotide sequences among the strains ranged from 75.0% to 96.9 %. All strains were divided into
5 groups with high bootstrap levels: B. subtilis, B atrophaeus, B. amyloliquefaciens-B. velezensis group, B.
pumilus-B. altitudinis group and B. axarguiensis-B. malacitensis-B. mojavensis group. Although gyrB
gene provided higher resolution than 16S rRNA it did not allow to distinguish the species in the 3 last
groups.
The results of ERIC-, BOX-PCR and modified saAFLP analysis using XmaJI restrictase were in a
good agreement with the previous data and showed high level of diversity of Ukrainian strains. At the
same time saAFLP analysis was more informative than ERIC-, BOX-PCR. Despite the fact, that B.
axarguiensis, B. malacitensis, and B. mojavensis were reclassified and referred to B. mojavensis species
based on the data of the other investigators before we revealed the different types of patterns for every
species. The results obtained by saAFLP analysis allowed dividing these species with high lever of
reliability. It should be notice, that completely different specific types of saAFLP patterns were also found
for every species.
59
Математическая биология и биоинформатика
63
Математическая биология и биоинформатика
Измерив значения всех трех морфометрических показателей у каждого растения, мы
вычислили их выборочные числовые характеристики: среднее, дисперсию, среднеквадратическое
отклонение, коэффициент вариации.
Оказалось, что вариация длины стебля небольшая, длины листа – умеренная, а ширины
листовой пластинки – большая. Сравнивая средние значения морфометрических показателей
растений в двух выборках можно сделать вывод о том, что длина стебля, длина и ширина листовой
пластинки, больше у растений пастушьей сумки, произрастающей в лесу, а не на лугу.
Также с помощью параметрического критерия однородности Z, мы установили, что средние
значения всех трёх морфометрических показателей значимо больше у растений, произрастающих в
лесу, чем на лугу, что подтверждает выдвинутые нами гипотезы.
Таким образом, по результатам исследования, длина стебля и размеры листовых пластинок
пастушьей сумки обыкновенной больше в лесу, чем на лугу. Это может быть связано с тем, что
суточные колебания температуры в лесу слабее и различия между увлажнением и высыханием
лесной почвы выражены не так резко, как на лугу. Следовательно, можно говорить, о том, что
биотоп «лес» более благоприятен для произрастания пастушьей сумки обыкновенной.
Полученный результат позволяет повысить эффективность выращивания растений пастушьей
сумки обыкновенной с лекарственными целями.
64
Математическая биология и биоинформатика
F2BREED – ПРОСТОЙ СПОСОБ ОЦЕНИТЬ СЕГРЕГАЦИЮ
Жернаков А.И.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург (Россия)
azhernakov@gmail.com
Двумя главными задачами генетического картирования являются: (1) попарная оценка
расстояний между исследуемыми генетическими локусами (генами, генетическим маркерами и
т.п.); и (2) линейное размещение локусов в соответствии с расположением соответствующих им
ДНК-последовательностей на хромосоме с максимальной правдоподобностью.
Теоретический и математический аппарат для решения первой задачи разработан достаточно
давно и заключается в вычислении такой частоты рекомбинации между парой локусов, при
которой вероятность появления экспериментально полученных частот фенотипических классов
максимальна.
Вторая задача является более сложной. Для группы из n генов число возможных «порядков»
составляет n!/2. Для нахождения наиболее правдоподобного варианта можно использовать разные
алгоритмы. Часто используются рекурсивные, так называемые «жадные» (greedy) алгоритмы,
которые предполагают выбор пары отдельных локусов (или групп локусов), соседство которых
наиболее вероятно по сравнению с остальными вариантами. Такой подход, например, реализован в
программе JoinMap (http://www.kyazma.nl/) (в настоящий момент доступна версия JoinMap 4.1.).
Однако, как показывает практика, данный подход плохо применим для точного картирования
генов, в случае, когда в исследуемой популяции математическое ожидание количества
рекомбинационных событий между локусом интереса и предполагаемыми связанными с ним
локусами близко к 1 или менее. Другой подход для расположения генов на генетической карте
заключается в ориентации n точек, соответствующих n генам выборки, в (n-1)-ом пространстве и
рассмотрении различных проекций данной структуры в 3-х, 2-х и 1-ом пространстве. Данный
подход был предложен японским ученым Ясуо Укаи (Yasuo Ukai, Tokyo University) и реализован
им в программе MAPL (http://lbm.ab.a.u-tokyo.ac.jp/~ukai/mapl98.html).
Автор представляет новую программу для ОС семейства Windows для оценки рекомбинации
между локусами и построения проекций фигуры в многомерном пространстве при анализе
сегрегации признаков в F2-популяции F2breed. Программа характеризуется удобным, понятным
интерфейсом для ввода данных, проста в управлении и хорошо подходит для оценки связи внутри
небольших групп локусов (менее 100).
Другой особенностью программы F2breed, не реализованной в упомянутых программах
JoinMap и MAPL, является возможность оценить частоту рекомбинации и генетические расстояния
между локусами, а также составить проекцию расположения локусов в многомерном пространстве
на основе анализа сегрегации признаков только части популяции F2 (например, только
гомозиготных по одному из локусов интереса или только гетерозиготных особей популяции F2).
Практика показывает, что данная особенность может быть крайне полезна, так как часто в анализ
вовлекается лишь четверть популяции F2 (гомозиготы по мутантной аллели локуса интереса).
66
Математическая биология и биоинформатика
МАТЕМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ПЕРИОДИЧЕСКИМИ
ВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ НА ТЕРРИТОРИИ РФ НА ПРИМЕРЕ КРАСНУХИ
И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА
Ермакова А.А., Гребенкина Н.А., Контаров Н.А., Юминова Н.В.
ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова»
РАМН, Москва (Россия)
kontarov@mail.ru
В работе предложен комплексный подход к оценке и прогнозу заболеваемости
периодическими вирусными инфекциями с применением математической модели Вольтерра-Лотки
и R/S – анализа с расчетом коэффициента Херста. На первом этапе анализа с помощью модели
Вольтерра-Лотки проводится анализ устойчивости системы, состоящей из восприимчивых и
инфицированных членов популяции на конкретной территории. По типу фазового портрета,
определенного с помощью качественного анализа системы дифференциальных уравнений модели
Вольтерра-Лотки, делается предварительный прогноз об изменении заболеваемости.
Следующим этапом является проведение R/S – анализа с расчетом коэффициента Херста. В
зависимости от значений коэффициента Херста можно определить наличие или отсутствия тренда
в снижении заболеваемости. Сопоставляя результаты, полученные с помощью модели Вольтерра-
Лотки и R/S – анализа, можно сделать окончательный прогноз относительно изменения
заболеваемости той или иной инфекцией. Особый интерес представляют периодические вирусные
инфекции, поддающиеся вакцинопрофилактике, изменение заболеваемости которых во времени
представляет собой затухающий колебательный процесс.
В нашей работе для математического анализа заболеваемости были взяты две детские
вирусные инфекции: краснуха и эпидемический паротит (ЭП). В результате были получены
результаты, указывающие на процесс элиминации данных инфекций. Качественный анализ модели
Вольтерра-Лотки для обеих инфекций позволил определить тип фазового портрета – устойчивый
фокус, что указывало на наличие затухающего колебательного процесса. Были получены высокие
значения коэффициентов затухания: для ЭП - 0,99, для краснухи – 0,95. Рассчитанные значения
коэффициентов Херста большие 0,5 указывали на наличие самоподдерживающегося процесса
снижения заболеваемости.
67
Математическая биология и биоинформатика
Исследовательская работа выполнена в рамках научного гранта А-2-089+(А-2-056) на тему
“Полиморфизм Y-хромосомы популяций Узбекистана. Криминалистический аспект” при ГКНТ
РУз.
68
Математическая биология и биоинформатика
ПЕРЕХОД НА ГЕТЕРОГЕННУЮ АРХИТЕКТУРУ ПРОГРАММЫ РАСЧЕТА
МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ
Лихачев И.В., Балабаев Н.К.
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
ilya_lihachev@mail.ru
В настоящее время методом моделирования молекулярной динамики (МД) пользуются во
многих исследовательских лабораториях. В научном сообществе известны такие программные
пакеты молекулярной динамики как GRAMACS, NAMD, Hyperchem, HOOMD и пр. Несмотря на
богатые возможности приведенных программ, создание своего программного комплекса
необходимо в первую очередь для детального знания о процессе моделирования, а также ради
способности воссоздать любые силовые воздействия на моделируемый объект.
В качестве математической и физической основы для создания нового программного продукта
был взят комплекс МД-моделирования PUMA, разработанный Балабаевым Н.К. в Лаборатории
молекулярной динамики ИМПБ РАН. Выбор обусловлен прозрачными возможностями по
воссозданию силового поля Amber, а также практической потребностью в увеличении
быстродействия существующего программного комплекса.
В последнее время, помимо требований к инструментарию подобного рода программ,
предъявляются требования и по быстродействию. Многие программы МД-моделирования
способны работать в многопроцессорной среде с разными видами памяти. Программа должна
обладать свойством масштабируемости. Если речь идет о ядрах одного процессора (технология
OpenMP), то мы ограничены 12-32 ядрами. Технология MPI предоставляет программе куда
большее количество ядер, расположенных на разных узлах, которое ограничивается, на первый
взгляд, экономическими возможностями организации. Однако при выделении определенного числа
ядер, которое зависит и от самой программы, и от моделируемого объекта, общая
производительность начинает падать. Это происходит из-за большого временного вклада операций
по обмену данными между узлами кластера. Здесь на помощь приходят скоростные сетевые
технологии InfiniBand, но не смотря на это описанный эффект снижения быстродействия имеет
место.
В конце первого десятилетия 21 века большое внимание стало уделяться использованию
графических процессоров в качестве математического сопроцессора, в частности, технологии
NVIDIA CUDA. Многие вычислительные комплексы, входящие в рейтинг TOP500 supercomputers
(в частности, Cray Titan – 1-е место, ноябрь 2012) оснащены NVIDIA Tesla – специальными
вычислителями, построенными по принципу GPU.
Стало очевидным, что необходимо пытаться ускорить в МД-расчеты, используя графические
процессоры. С одной стороны, сейчас доступны кластеры с графическими сопроцессорами, с
другой – программа будет способна работать на любом современном домашнем графическом
адаптере NVIDIA.
Создана программа моделирования молекулярной динамики, в которой используются
графические процессоры для ускорения наиболее трудоемких операций – расчеты Ван-дер-
Ваальсового и Кулоновского взаимодействий.
75
Математическая биология и биоинформатика
КОМБИНИРОВАННАЯ БЛОЧНАЯ МОДЕЛЬ СИСТЕМЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ С
ОБРАТНЫМИ СВЯЗЯМИ И ОГРАНИЧЕННЫМ РЕСУРСОМ
Русинов М.А.1,2, Куликов С.М.2, Уварова Л.А.1
1
Московский государственный технологический университет «Станкин», 2ФГБУ
«Гематологический научный центр» МЗ РФ, Москва (Россия)
rusinov@blood.ru
Система кроветворения представляет собой древовидную систему созревающих клеток, с
полипотентными стволовыми клетками в стволе дерева, и всем многообразии клеток крови на
ветвях структуры. Небольшое количество стволовых клеток подчиняется законам случайных
событий. Большое же количество зрелых клеток (ежедневная потребность составляет 109) может
быть хорошо описано дифференциальными моделями. Попытки описания всего многообразие
процессов, происходящих с созревающими клетками с использованием одного похода приводят к
необходимости детализации описания в одних частях системы и поверхностного описания в
других, что может приводить к потере ключевых деталей.
Модель, предложенная Ленаертсом и коллегами [Lenaerts et al (2010). Haematologica. 95, 900–
907], предоставляет мощный инструментарий для исследования кинетики клонального состава, в
практическом отношении модель позволяет осуществлять предварительный анализ системы при
подготовке клинических исследований препаратов для лечения различных заболеваний системы
кроветворения.
Модель представляет собой комбинированную блочную схему, на нижних уровнях которой
переходы осуществляются стохастически, согласно Морановскому процессу, на более же высоких
стадиях (при увеличении объема компартмента) процесс перехода происходит по
дифференциальному закону.
Модель Морана описывает процессы, происходящие с конечными популяциями
биологических объектов и используется для моделирования процессов изменения вариативности
популяции, таких как закрепление мутаций, дрейф генов и естественный отбор.
Однако в данной модели не учитывается влияние регулирующих факторов обратной связи
(цитокинов), а так же влияние разделяемого ресурса, что может оказать существенное влияние на
кинетические параметры системы, как показано нами ранее.
Предлагается введение двух обратных связей – регуляции дифференцировки и пролиферации
клеток, по двум типам воздействия на систему с целью изменения количественных показателей, и
введение разделяемого клетками ресурса, физического объема костного мозга. Предлагаемая
модель может помочь в понимании патогенезза таких патологические процессов, как бластный
криз и угнетение иммунитета при таких заболеваниях как хронический миелолейкоз и др.
78
Математическая биология и биоинформатика
СИСТЕМА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ РАСЧЕТНЫХ НАУЧНЫХ ВЕБ-СЕРВЕРОВ
Соболев Е.В., Пятков М.И., Соболев О.В.
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
egor@impb.psn.ru
Обычно результатом научных исследований, связанных с разработкой новых методов
обработки экспериментальных данных или моделированием, являются реализующие их
вычислительные программы. В дальнейшем исследователи сталкиваются с проблемой
популяризации своих разработок. От будущих пользователей потребуется меньше усилий, чтобы
начать работу с новой научной программой, если доступ к ней будет организован через Интернет с
помощью простого интерфейса. Поэтому в последнее время стало популярным создание научных
веб-серверов.
Разработка веб-сервера связана со значительными инженерными трудностями. Необходимо
организовать сбор, проверку и подготовку входных данных, запуск расчетной программы,
отображение результатов в наглядном виде, хранения результатов, ведение журналов расчетов, и,
при необходимости трудоемких расчетов, запуск задач на суперкомпьютере.
С другой стороны, все эти задачи имеют одинаковую программную реализацию почти для всех
научных приложений. Поэтому представляется актуальным создание фреймворка – каркаса
расчетного научного веб-сервера в самом общем виде. Чтобы настроить такой фреймворк для
работы с конкретным научным приложением, нужно будет лишь описать входные и выходные
данные, в то время как все типовые задачи перечисленные выше уже запрограммированы.
Очевидно, что подобный каркас значительно упростит разработку и позволит ученому без
привлечения профессиональных программистов создать качественный и надежный веб-сервер.
В настоящее время авторы ведут разработку каркаса научного веб-сервера. В качестве
инструмента используется фреймворк для создания веб-сайтов Djangо и язык программирования
Python. К настоящему моменту реализован запуск на локальном и удаленном вычислителях с
использованием очереди Torque и представления некоторых типов выходных данных: текст,
таблица, график. Работа была поддержана грантами РФФИ 12-04-31096, 12-07-31085, 11-07-00635.
82
Математическая биология и биоинформатика
КОМПЬЮТЕРНЫЕ ПОДХОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ ПРИРОДНЫХ ТОКСИНОВ
Шукурбекова Д.О., Левицкая Ю.В.
Национальный университет Узбекистана им. Мирзо Улугбека, Ташкент (Узбекистан)
asuslov2000@yahoo.com
Благодаря применению компьютерных методов возрастает интенсивность исследований
биологически активных пептидов и снижается стоимость этих работ. Возникает потребность в
создании специализированных баз данных (БД) по структуре и активности токсинов. Целью
исследования было поставлено следующее: используя компьютерные методы, изучить свойства
природных токсинов.
Сравнивались состав и свойства ядов среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana), чёрной вдовы
(Latrodectus tredecimguttatus) и жёлтого толстохвостого скорпиона (Androctonus australis), а также
аминокислотные последовательности других организмов . Для поиска в базах данных
секвенированных последовательностей и в структурных базах данных успешно используются
программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) и Protein Data Bank, PDB .
Была проанализированна пространственная организация некоторых токсинов, в частности
нейротоксин II от яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana 1H-NMR методами и
вычислительным анализом. Филогенетическое древо изучаемых токсинов в результате
множественного выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью программы
ClustalW также было получено .В результате исследования белковых последовательностей в
программе BLAST были обнаружены для Naja naja oxiana - 2 последовательности совпадающих
на 100% из 10; для Latrodectus tredecimguttatus-1 последовательность совпадающая на 100% из 6;
для Androctonus australis – 4 последовательности совпадающие на 100% из 32; E-value
статистическая значимость данного выравнивания также заметно отличалась друг от друга для
Naja naja oxiana- 1.9; для Latrodectus tredecimguttatus-2.0; для Androctonus australis 1.1
В результате анализа пространственной организации двух видов организмов, с помощью
программы SYBYL , удалось установить следующее: для кобры количество α -спиралей и β -
структур у нейротоксинов I и II одинаковое (5/5), но расположение в пространстве отличается;
токсины скорпиона - LqhIII и BmK, количество α -спиралей различается (4/3), β -структуры имеют
одинаковое количество (4/4), расположение в пространстве различно.
Проанализировав полученные данные в результате множественного выравнивания
аминокислотных последовательностей удалось получить укоренённое филогенетическое древо.
Вышеизложенное позволяет сделать вывод, что компьютерные подходы необходимы для
исследования и тщательного изучения природных токсинов.
84
Математическая биология и биоинформатика
This phenomenon is investigated using the probability density functions for the random trajectories.
We show that the threshold value of the noise intensity corresponding to the splitting bifurcation
significantly depends on a stochastic sensitivity level of the considered cycle. Using the stochastic
sensitivity function technique [Bashkirtseva I. A., Ryashko L. B. Stochastic sensitivity of 3D-cycles //
Math. and Comp. in Simulat. 2004. Vol. 66. P. 55.], we find the critical value of a parameter
corresponding to the most sensitive cycle and we carry out the comparative parametrical analysis of the
stochastic cycle splitting effect in the neighborhood of the found critical value.
The stochastic sensitivity function technique allows us to construct confidence domains (ellipses and
bands) that are sufficiently simple and evident geometrical models for the spatial description of
configuration arrangement of random states around the deterministic solution (equilibrium or limit cycle).
Using the confidence bands method we managed to predict the beginning of the stochastic cycle splitting
and we estimated a critical value of the noise intensity corresponding to the splitting bifurcation.
86
Математическая биология и биоинформатика
Availability: SEEK code is open source and available for download http://code.google.com/p/sysmo-
db/. For a demonstration of the SEEK capabilities, and to try out the software, demo SEEK is available
here https://demo.sysmo-db.org/. RightField download: http://www.sysmo-db.org/rightfield.
For the understanding of cellular processes, the fundamental question is how to model and simulate
complex biological networks. During the last 15 years, Petri nets have attracted more and more attention
to help to solve this key problem. Regarding the published papers, it seems clear that hybrid functional
Petri nets are the adequate method to model complex biological networks. Today, a Petri net model of
biological networks is built manually by drawing places, transitions and arcs with mouse events.
Therefore, based on relevant molecular database and information systems biological data integration is an
essential step in constructing biological networks. In this talk, we will motivate the application of Petri
nets for modeling and simulation of biological networks. Furthermore, we will discuss a type of access to
relevant metabolic databases such as KEGG, BRENDA, etc. Therefore we implemented different
information systems based on bio data warehouse concepts.
Keywords: Functional Petri net, Model construction, Data integration, Cardio-disease network,
VANESA
References:
R. Hofestädt, S. Thelen. Quantitative Modeling of Biochemical Networks. In Silico Biology 1(1), pp
39-53, IOS Press, 1998. Available online via URL: http://www.bioinfo.de/isb/1998/01/0006/
M. Heiner, R. Hofestädt (eds.). Biological Processes & Petri Nets. Proceedings of the 3rd
International Workshop on Biological Processes & Petri Nets, a satellite event of PETRI NETS 2012.
CEUR-WS, 2012. Online Journal: http://ceur-ws.org/Vol-852/
87
Биофизика и радиобиология
92
Биофизика и радиобиология
Низкая доза таксифолина (30 мкг/кг) снижает повышенную L-NAME активность АПФ в аорте
крыс до контрольного уровня
У 44-недельных (пожилых) крыс после 2-недельного потребления таксифолина (100 мкг/кг)
активность АПФ в аорте снижается до уровня, характерного для молодых крыс
Таксифолин (100 мкг/кг) снижает активность АПФ аорты крыс, повышенную обработкой
дексаметазоном, до нормального уровня
Таксифолин (100 мкг/кг) снижает образование АФК в аорте крыс, обработанных ингибитором
NO-синтазы.
Таким образом, низкие дозы таксифолин (30-100 мкг/кг) нормализует активность АПФ и
количество АФК в аорте крыс, повышенные при старении, действии ингибитора NO-синтазы или
дексаметазона. Сравнение эффективных доз кверцетина и таксифолина показывает, что
таксифолин является более эффективным лекарственным средством для уменьшения риска
сердечно-сосудистых заболеваний, чем кверцетин.
97
Биофизика и радиобиология
При исследовании содержания ТБК-положительных продуктов в сердечной мышце под
действием гистамина в исследованных концентрациях показано достоверное снижение их
количества на протяжении всего опыта.
В результате проведённых исследований мы можем сделать выводы о снижении содержимого
продуктов липопероксидации, поскольку в клетках сердца уменьшается интенсивность
окислительно-восстановительных процессов.
98
Биофизика и радиобиология
скорость УЗ волн), размеров неоднородностей и параметров УЗ излучения (интенсивность,
частота, режим излучения, направление озвучивания), показывающая границы возникновения
артефакта в различных средах.
При распространении УЗ волн в неоднородных средах имеют место тепловые эффекты,
которые могут вызвать локальный перегрев тканей. Скорость роста температуры при облучении
ультразвуком сред более сложных по структуре выше, чем для однородных сред, так при
озвучивании (частота 880 кГц, интенсивность 1 Вт/см2) плазмы крови скорость роста температуры
равна 0,002 °С/сек, кровезаменителя «Перфторан» - 0,0073 °С/сек, молочной сыворотки – 0,0013
°С/сек.
Помимо ложного диагноза и потенциального риска теплового воздействия УЗ излучения
возникновение артефакта «псевдопоток» при исследовании может привести к неправильному
определению скорости кровотока, при этом измеряется не истинная скорость кровотока, а некая
сумма истинной скорости кровотока и дополнительной скорости движения частиц крови,
вызванной УЗ излучением. Расчеты погрешности показывают, что изменение скорости кровотока
намного ниже чувствительности УЗ допплеровской системы, однако при вводе в кровоток
контрастных веществ погрешность может достигать нескольких единиц см/с, а на резонансной
частоте - нескольких сотен см/с.
Таким образом, возникновение артефакта «псевдопоток» может привести к постановке
ложного диагноза, погрешности получения диагностической информации, а также
свидетельствовать об опасности локального перегрева в процессе УЗ диагностики.
Работа выполнена в рамках проекта по государственному заданию Министерства образования
и науки ИжГТУ имени М.Т.Калашникова» на 2012 - 2014 годов в части проведения НИР (рег. ном.
НИР: 7.1378.2011), при поддержке программы стратегического развития ИжГТУ имени М.Т.
Калашникова на 2012-2016 годы (ПСР/М2/Н2.5/МВВ).
1. Коробейникова О.В., Кузнецов Е.П., Богдан О.П. Исследование физических механизмов
артефакта ультразвуковой допплерографии «псевдопоток» // журнал «Медицинская физика» –
2009. – № 3 (43). С. 64–70.
99
Биофизика и радиобиология
Помимо дозиметрических задач в биологических исследованиях ТЕМ-камера исполь