Cours de Génie Génétique

1/ Le marquage des sondes :

La sonde : Petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée (par un composé fluorescent, un radio-isotope ou une
enzyme) que l'on utilise pour hybrider et détecter des séquences homologues, c'est-à-dire complémentaires.
L’hybridation peut avoir lieu aussi bien in vivo qu’in vitro et concerne des fragments de 15 nucléotides. Les
sondes doivent être spécifiques et sensibles. Elles ne s’associent qu’avec une séquence complémentaire et sont
facilement repérables et quantifiables.

Il existe en fait plusieurs stratégies pour marquer les sondes :

1.1/ La Nick translation :

La DNase I coupe aléatoirement les

brins de l’ADN bicaténaire. Les
extrémités 3’ ainsi libérées
deviennent un site de fixation pour
l’ADN polymérase I qui va :
1. Détruire l’ADN par son activité
exonucléasique (sens 5’ →3’)
2. Resynthétiser (activité
polymérasique) une nouvelle chaîne
avec les nucléotides dont un au moins
est radioactifs présents dans le milieu
d’incubation enzymatique.

1 .2/ Le multi-amorçage au hasard (multirandom priming).

L’ADN bicaténaire est dénaturé par

chauffage à 100°C afin de séparer les
deux brins, puis refroidi brutalement
pour empêcher que les deux brins ne
se réassociassent.
Chacun des deux brins est hybridé
à 25°C au hasard avec des petites
amorces (6 nucléotides). Les
séquences de ces hexa-nucléotides
sont différentes. C’est une
combinaison de 4 nucléotides parmi 6
positions différentes ; Donc il y aura
certainement quelques hexa-
nucléotides qui s’hybriderons avec
les deux d’ADN.
L’enzyme ADN polymérase I, grâce { son fragment de Klenow, assure la synthèse des deux brins
complémentaires dans le sens 5’ →3’ en utilisant les nucléotides triphosphates (ATP, CTP, TTP et GTP)
dont un est marqué. Les brins d’ADN néo-synthétisés sont alors marqués :

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2/ Comment construit-on les sondes d'ADN ?

Il est possible de construire une sonde d'ADN bien avant de
connaître la séquence des gènes elle-même ! Pour ce faire, on
travaille à partir du produit protéique du gène. Rappelez-vous que
dans notre description de la fabrication des protéines, nous avons
dit qu'un gène était transcrit en ARN messager (ARNm), selon les
simples règles de la complémentarité des bases. L'ARN messager
est transporté hors du noyau et utilisé comme matrice pour la
formation d'une chaîne d'acides aminés, qui se transforme en une
protéine.
Nous pouvons isoler la protéine produite par le gène qui nous
intéresse, et trouver quels sont les 30 premiers acides aminés de la
protéine. Selon cette information, nous pouvons déterminer les 90
premiers nucléotides de cette matrice d'ARN messager de la
protéine (n'oubliez pas que chaque triplet de nucléotides code
pour un acide aminé, d'où le rapport 90:30). Et comme la matrice
d'ARN messager est complémentaire du gène recherché, nous
savons que notre sonde d'ADN devrait avoir une séquence
complémentaire des 90 premiers nucléotides du gène recherché.
Pour construire une sonde d'ADN, nous utilisons une « machine à
gènes » capable de synthétiser en quelques heures à peine une
molécule courte d'ADN monocaténaire contenant la séquence
voulue de nucléotides.

3/ Électrophorèse

L’électrophorèse est utilisée en biologie moléculaire pour la

séparation et la caractérisation des acides nucléiques ou des
protéines. Cette technique est basée sur le déplacement de
molécules ioniques sous l'effet d'un champ électrique. Les
molécules anioniques (chargées négativement) migrent vers
l’anode et les molécules cationiques (chargées positivement) se
déplacent vers la cathode. L'ADN est une molécule chargée
négativement qui se déplacera donc vers la cathode. Les plus
petites molécules pourront plus facilement se frayer un chemin
dans le gel d'agarose et migreront plus loin. Les plus grosses
molécules resteront plus près des puits.

4/ Le Southern blot (Analyse du génome)

C’est la méthode d’analyse de l’ADN imaginée par Southern en 1975 pour visualiser les gènes ou toute
séquence d’un ADN génomique, par une hybridation avec une sonde, marquée et spécifique, avec des fragments
de restriction d’ADN, préalablement séparés par électrophorèse, dénaturés et transférés sur une membrane. On
peut utiliser une ou plusieurs enzymes de restriction pour réaliser ce clivage.
Les fragments de restriction présents dans le gel sont dénaturés grâce à une solution alcaline puis transférés
sur une feuille de nitrocellulose ou sur une membrane en nylon. Ce transfert se fait par blotting.

4.1/ Réalisation de la technique :

1. L’ADN { analyser est soumis { l’action des enzymes de restriction.

2. Prélèvement des échantillons pour une électrophorèse en gel d’agarose (90 mV/1h) .
3. Coloration de l’ADN par le bromure d’éthidium (BET) : une couleur rougeâtre est révélée sous UV (254 nm).
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4. L’ADN bicaténaire est soumis à un traitement alcalin (Ex. NaOH) pour séparer les deux brins.
5. On pose une membrane de nitrocellulose ou de nylon sur le gel d’agarose, puis sur cette membrane est placé
du papier absorbant. Ceci permet aux brins monocaténaires de passer du gel vers la membrane par
simple capillarité : c’est le blotting ou buvardage.
6. La membrane, devenue une copie de migration électrophorétique du gel d’agarose, est soumise soit aux UV
afin de lier l’ADN simple brin à la membrane (liaisons covalentes) dans le cas de membrane de nylon, soit
{ la chaleur dans le cas d’une membrane de nitrocellulose.
7. On place la membrane dans un bain d’une solution d’hybridation qui contient des sondes radioactives d’ADN
monocaténaires. Celles-ci vont s’hybrider (en cas de compatibilité) spécifiquement avec les fragments
monobrins de l’ADN contenu dans la membrane de nitrocellulose. Après hybridation, la sonde en excès
est éliminée de la membrane par différents lavages.
8. Un film photographique est placé sur cette membrane. Les radiations émises par les sondes marquées
permettent l’impression sur le film photographique : c’est l’autoradiographie. Grâce à ce film on pourra
visualiser la localisation de l’hybridation sous forme d’empreintes génétiques.

5/ Le Northern blot (Analyse de l’ARN) :

Son principe est identique

au Southern blot mais dans ce
cas là on travail avec de l’ARN,
avec de fragments de petite
taille et il n’y a pas de
digestion.

Cette technique est

appliquée pour l’étude de
l’expression des gènes et
aussi la taille des ARN .

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6/ La PCR (Polymérisation en chaine de polymérase)

La PCR (Polymerase Chain Reaction), la réaction de polymérisation en chaîne consiste à amplifier

sélectivement une séquence particulière d’ADN par l’action répétée d’une ADN polymérase. Le fragment d’ADN
à amplifier est compris entre deux séquences (complémentaires des amorces) qui doivent être connues et la
longueur ne peut excéder 10 kb.

 Processus : Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase d’une bactérie : Thermus acquaticus qui vit à
75°C dans les eaux thermales. Cette polymérase (Taq polymérase) est toujours active à 94–96°C. La
réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours duquel la quantité d’ADN {
amplifier est doublée. Ces cycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en fonction de la quantité d’ADN
cible de départ et du but recherché.

· la dénaturation de l’ADN { amplifier { 94°C,

· l’hybridation avec une amorce, appariement primer, annealing (56 - 64°C)
· extension de l’amorce { 70 – 72 °C par la Taq polymérase.

L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.

 L’intérêt et application de la PCR : La PCR est la méthode actuelle la plus efficace et la plus rapide
d’amplification d’un ADN cible, c’est pourquoi elle est maintenant largement utilisée. Elle permet de
mettre en œuvre les techniques habituelles de génie génétique même si l’on ne dispose au départ que
d’une faible quantité d’ADN.

7/ Le séquençage :

Il a pour but la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolé pour la mise en évidence de
fonctions éventuelles codées par un ARN ou un fragment d’ADN cloné reconnaissance de séquences
consensus, prédiction de séquences peptidiques...etc.

Deux méthodes classiques sont alors utilisées.

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7.1/ La méthode de Maxam et Gilbert : la méthode chimique :

L’ADN double brin { séquencer est d’abord marqué au 32P au niveau du phosphate en 5’. Il doit ensuite être
digéré par une endonucléase de restriction en deux fragments différents de taille, qui sont séparés par
électrophorèse. On obtient ainsi un fragment dont une seule extrémité 5’ est marquée.
Le principe de la méthode consiste à modifier
spécifiquement par un réactif chimique un type de
base et de cliver la chaîne d’ADN au niveau de
ce nucléotide modifié. Les agents modifiant sont
utilisés en concentration telle que l’on aura qu’une
seule coupure par molécule, et ce à toutes les
positions possibles.
Les réactifs utilisés sont -> DMS (diméthyl
sulfate) - méthylation des purines puis 0,1 M NaOH -
> coupe après G puis 0,1 M HCl -> coupe après A ->
hydrazine - coupe après C et T -> hydrazine + NaCl
-> coupe après C.
Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide des 4 produits de réaction et autoradiographie, les positions
relatives des différentes bases sont déduites de la comparaison des distances de migration des fragments
marqués en 5’.

7.2/ La méthode de Sanger : la méthode enzymatique

C’est la méthode la plus utilisée. Cette

méthode de séquençage enzymatique mise au
point par Sanger par l’incorporation de
didésoxyribonucléotides terminateurs de chaîne a
été universellement adoptée. Cette méthode met
{ profit l’absence d’un hydroxyle en 3’ d’un ddXTP
qui ne permet pas la formation d’une liaison
phosphodiester. la conséquence est un arrêt de
l’élongation lorsqu’un didésoxyribonucléotide est
incorporé dans un brin d’ADN en synthèse. Ce
phénomène est à la base de la méthode de
Sanger.
• Principe = interruption contrôlée de la réplication enzymatique dite méthode des didésoxynucléotides
• On utilise un ADN simple brin et une amorce de petite taille complémentaire
• L'ADN polymérase synthétise le brin complémentaire en présence de dNTP marqué au 32P

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• On stoppe l'élongation de la chaîne par un analogue de chacun des dNTP (4 expériences différentes) un
didesoxy qui arrête l'élongation de la chaîne.
L'ADN polymérase ajoute des nucléotides jusqu'à l'ajout d'un didésoxyribonucléotide qui stoppe la synthèse,
l'enzyme ne pouvant ajouter de nucléotide à un didésoxyribonucléotide (il n'y a plus de fonction hydroxyle). On
obtient donc une série de molécules d'ADN plus ou moins longues dans le tube.

Détection = par autoradiographie ou par fluorescence

• Dans ce dernier cas, un marqueur fluorescent est attaché à l'amorce, on choisit une couleur différente pour
chaque base
• On mélange les milieux réactionnels, sépare par électrophorèse et détecte chaque couleur
• On lit directement sur l'enregistrement .

7.3/ Pyroséquençage : (mini-séquençage luminométrique en temps réel) :

Le Pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse directe d’oligonucléotides. Sa réalisation
nécessite l’emploi d’une cascade de 4 enzymes :

- La taq polymérase pour

l’incorporation des oligonucléotides
( dNTP) ;
- L’ATP sulfurylase pour catalyser le
pyrophosphate inorganique (ppi) en
énergie, source d’ATP.
- La luciférase pour générer la lumière
où le signal fluorescent à partir de
l’ATP.
- La pyrase pour dégrader l’ATP et
l’excès de nucléotides non incorporés.

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A la différence du séquençage automatique par la technique de Sanger, le Pyroséquençage utilise le 2’

déoxyadénosine-5’-o-(1-triphosphate) ou dATPαS { la place du dATP.ce nucléotide est reconnu { la fois par la
polymérase et la luciférase, contrairement au nucléotide d’ATP qui est reconnu seulement par la polymérase. les
quatres oligonucléotides sont introduit un par un.

Le séquençage par Pyroséquençage est réalisé en 5 étapes :

 Etape 1 : l’ADN a analysé est amplifié en présence d’une amorce de séquençage. L’ensemble est ensuite
incubé en présence des 4 enzymes : La taq
polymérase, l’ATP sulfurylase, la luciférase et
l’apyrase, le substrat l’adénosine 5’
phosphosulfate APS est enfin la luciférine.

 Etape 2 : le premier des 04 dNTPs est ajouté dans la réaction .l’ADN polymérase permet l’incorporation de
ce dNTP dans le brin en cours de synthèse, si ce dernier est complémentaire à la base située dans la
séquence { analyser .chaque incorporation de dNTP est suivie d’un relargage d’une molécule de
pyrophosphate (ppi). La quantité de (ppi)
libéré est proportionnelle à celle de dNTP
incorporée.

 Etape 3 : en présence de l’adénosine 5’ phosphosulfate (APS) l’ATP sulfurylase transforme le (ppi) en ATP
en quantité équimolaire. Cet ATP sera utilisé comme substrat par la luciférase lors de la transformation de
la luciférine en oxyluciférine et permet
l’émission d’un signal lumineux dont
l’intensité est proportionnelle { la quantité
d’ATP. Ce signal lumineux sera détecté par
une caméra CCD reliée au séquenceur et
visualisé sous forme d’un pic ou
pyrogramme.la hauteur de ce pic sera
proportionnelle aux nombres de (ppi) libéré
qui est elle-même proportionnelle aux nombres de nucléotides incorporés.

 Etape 4 : l’excès de dNTP non incorporés

ainsi que l’ATP sont dégradés
continuellement par la dernière enzyme de
la cascade : la pyrase.

 Etape 5 : les dNTP sont introduits l’un après

l’autre, selon l’ordre établi. Les dNTP ainsi
incorporés forment une séquence qui sera
déterminée à partir du signal lumineux
spécifique de chaque nucléotide puis capté
et enregistré sur le pyrogramme.

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