Introduction :

Préparation des solutions

Le but d'une solution tampon est d'aider à maintenir un pH stable lorsqu'une petite quantité
d'acide ou de base est introduite dans une solution. Une solution tampon phosphate est un
tampon pratique à avoir autour, en particulier pour les applications biologiques. L'acide
phosphorique ayant plusieurs constantes de dissociation. Le tampon est le plus souvent
préparé à pH 7 en utilisant du phosphate monosodique (NaH2PO4) et sa base conjuguée, le
phosphate sdisodique (Na2HPO4)

Matériaux tampon phosphate

Pour fabriquer votre tampon phosphate, vous aurez besoin des matériaux suivants:

 Phosphate monosodique
 Phosphate disodique.
 pH-mètre
 Fiole jaugée
 L’eau distillé
 Béchers
 Barres d'agitation
 Plaque chauffante

La solution acide (NaH2PO4) La solution basique (Na2HPO4)

50mM ; v=250mL 50mM ; v=250mL
Masse molaire :156g/mol Masse molaire :141.96g/mol

Étape 1. Décidez des propriétés du tampon

Avant de faire un tampon, vous devez d'abord savoir quelle molarité vous voulez qu'il soit,
quel volume faire et quel est le pH souhaité.

Solution acide : NaH2PO4

156g1mol1L(1M)
156mg1mmol1L(1mM)
7.8g50mmol1L(50mmol)
1.95g12.5mmol250mL(50mM)

Solution basique : Na2HPO4

141.96g 1mol1L(1M)
141.96mg1mmol1L(1mM)
7.08g50mmol1L(50mmol)
1.77g12.5mmol250mL(50mM)
Étape 2. Mélanger la base d'acide et de conjugué
Préparez un peu moins de 500mL de solution en utilisant les quantités correctes de
phosphate monosodique et de phosphate disodique. En diluant 1.95g d'acide dans 250ml
d'eau distillée, et 1.77g de base dans 250ml d'eau distillée.
(Agitation à l’aide de barre d’agitation sur la plaque chauffante)

Étape3. Vérifiez le pH
Utilisez une sonde de pH pour confirmer que le pH correct pour le tampon est atteint.

Étape 4. Corrigez le volume

Une fois le pH souhaité atteint, porter le volume de tampon à 500mL. Diluez ensuite le
tampon comme vous le souhaitez.

Avantages et inconvénients des tampons au phosphate

Les deux principaux avantages des tampons au phosphate sont que le phosphate est
hautement soluble dans l'eau et qu'il a une capacité tampon extrêmement élevée. Cependant,
ceux-ci peuvent être compensés par certains inconvénients dans certaines situations.
Les phosphates inhibent les réactions enzymatiques.
Le phosphate précipite dans l'éthanol, il ne peut donc pas être utilisé dans des préparations
pour précipiter l'ADN ou l'ARN.
Les phosphates séquestrent les cations divalents (par exemple, Ca2 + et Mg2 +).

TECHNIQUE DE PURIFICATION DES ENZYMES

La technique de chromatographie sur colonne repose sur le même principe que la
chromatographie sur couche mince : les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins
entraînées par un éluant sur une phase fixe :
1 : La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l'alumine remplissant une
colonne.
2 : L'échantillon est déposé en haut de la colonne, La séparation des espèces chimiques est
obtenue par l'écoulement continu d'une phase mobile (l’éluant) à travers la colonne.

 La séparation est basée sur une différence de vitesses d'entraînement des espèces
chimiques vers le bas de la colonne.

L'objectif de ce TP est donc de séparer et de purifier des enzymes par la technique de la

chromatographie sur colonne 

MATÉRIELS UTILISÉS :
 Colonne de chromatographie.
 Bécher.
 Une pince.
 Coton.
 Sable.
  Gel en poudre.
 Une pipette plastique.
 Un spectrophotomètre.

PRÉPARATION DE LA COLONNE (PHASE FIXE) :

 Le choix de la colonne en fonction de quantité d’échantillon qu’on va séparer.
 Fixer verticalement la colonne (qui comporte deux pistons en bas et en haut) à l'aide
d'une pince.
 Déposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne.
 Déposer un peu de sable pour rendre la surface plane.
 Peser environ 3g gel en poudre (ex : silice) plus l’ajoute d’une solution tampon de 100
mL ( pour qu’il est un gonflement) pour l’obtention 25 mL du gel .
 Une fois le gel est bien gonflé, on fait un dégagement de gaz pour avoir une bonne
séparation par une pompe à vide.
 On Introduire le gel dans la colonne de façon continue (éviter les couches de gel et
l’entrée des bulles d’air.
 Tapoter la colonne afin d'obtenir une surface plane de gel : rajouter un peu de sable
pour aplanir.
 Vérification du ph et l’absorbance par lavage pour éviter les impuretés.
 Placer un bêcher sous la colonne.
 Introduire doucement de solution tompon (à l'aide d'une pipette plastique par
écoulement de long de la paroi de la colonne).

DÉPÔT DE L'ÉCHANTILLON À SÉPARER :

 Déposer très doucement à l'aide d'une pipette, sans toucher les parois de la colonne,
l’échantillon : attention à ne pas déformer la surface de la phase stationnaire pendant
cette opération.
 Lorsque l’échantillon a pénétré la surface de la phase stationnaire, éluer avec solution
tompon en remplissant la colonne doucement à la pipette plastique.

 Liez le piston en haut (qui contient un filtre pour établisse la phase stationnaire) avec
la phase mobile pour garder la même quantité rajouter et le même débit .
 Réglage de débit chaque 9 à 11 seconde par une goutte.
 Relier la colonne avec un collecteur qui permet les changements des tubes remplis.
 Récupérés les tubes remplis et lire l’absorbance À l'aide d'un spectrophotomètre qui
va nous tracer les spectres d’absorbance.

CALCULER DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE : 

(Par plusieurs méthodes pour confirmer que la réalisation de la purification est bonne).

CONCLUSION :
La technique de la chromatographie sur colonne permet la séparation des différents
constituants d'un mélange, mais elle peut être utilisée couplée à un moyen de détection,
 comme par exemple une spectroscopie UV – visible ou une spectrométrie de masse et on
obtient ainsi une chaîne complète automatisable d'analyse.

Dosage enzymatique de la catalase

 Définitions :
H2O2 + H2O2 ----- Catalase ------> 2 H2O + O2
La catalase : c’est une enzyme qui a pour fonction la décomposition du peroxyde d’hydrogène
(H2O2) en oxygène moléculaire et en eau .ces enzymes sont présent dans pratiquement tous
les organismes aérobies notamment au niveau du cytoplasme des cellules du foie en quantité
élevées. Activité enzymatique :
c’est la mesure de la quantité d’enzymes active dans une préparation. elle est définie soit par
la quantité de substrat disparaissant par unité de temps ou de quantité de produit
apparaissant par unité de temps.

 But du TP : c’est la mesure de l’activité enzymatique de la catalase par la mesure de la

disparition de peroxyde d’hydrogène en spectrophotométrie.
 Matériels et méthode :

Matériels :
-Tampon phosphate 50Mm à pH : 7,4
-Substrat qui est le H2O2 a 0.03%
-Tubes a essai neufs et sec
-Papier aluminium et pipette pasteur
-Spectrophotomètre a 240 nm
Méthode :
- On prépare le mélange réactionnelle : Dans un bécher on met le tompon phosphate filtrer
et on ajoute progressivement le h2o2 jusqu'à l’obtention d’une DO= 0,6.
– On dépose 2,9ml du mélange réactionnelle dans des tubes a essai neuf qui seront
recouvert avec du papier aluminium (évite la dégradation du H2O2 qui est sensible a la
lumière.)
– Ajouter au mélange 100μml de l’échantillon S1 (surnagent du tp2)
–Agiter l’échantillon a l’aide d’un agitateur magnétique puis le déposé dans des cuve en
quartz du spectrophotomètre
– une fois l’échantillon mis dans les cuve on démarrer le chronomètre et on lit l’absorbance
chaque 30s pendant 2 min et on dégage les bulles d’aire toute les 30s.et on calcule la ΔDO

 Résultats

DO/E A 30s A 1min A 1min30s A 2min

E1 0.5 0.35 0.25 0.11
E2 0.83 0.75 0.68 0.58
E3 0.65 0.52 0.41 0.2
ΔDO/E ΔDO1 ΔDO2 ΔDO3
E1 0.15 0.1 0.14
E2 0.08 0.07 0.1
E3 0.13 0.11 0.22
 Dosage enzymatique demyéloperoxydase
 Définition :
Est une oxydoréductase qui catalyse la réaction :

Cl - + H2 O2 + H+ HCLO +H2O

Est une enzyme héminique présente dans les granules primaires des cellules neutrophile
elle présente deux activité : de chloration et de peroxydase, la MPO exerce une forte
activité antimicrobienne.

 But du TP : C’est la mesure de l’activité enzymatique de myéloperoxydase par la

mesure de la disparition de peroxyde d’hydrogène en spectrophotométrie

 Matériels et méthode :

Matériels :

- Tampon phosphaté 50 mM, PH =6.

- Substrat chromogène = Orthodianisidine 0 ,167 mM (244,16 g/mol).
- Substrat H2O2 à  0 ,03%.
- Tubes à essai sec.
- Papier aluminium et pipette pasteur.
- Spectrophotomètre a 460 nm.

Méthode :

- On prépare le mélange réactionnelle : Dans un bécher on met le tampon phosphaté et

on ajout. ajoute progressivement le h2o2 .
- On dépose 900 µl du mélange réactionnel dans des tubes a essai sec qui sont
recouvert avec aluminium pour évite la dégradation du H202.
- Ajouter au mélange 100 µl de l’échantillon S2.
- Agiter l’échantillon à l’aide d’un agitateur magnétique puis déposé dans la cuve du
spectrophotomètre.
- On démarrer le chronomètre et on lit l’absorbance chaque 1 min pendant 3 min et on
dégage les bulles d’air toute une minute et on calcule la ΔDO

 Résultat :

ΔDO/E ΔDO1 ΔDO2

E1 0 ,05 0,04

E2 0,1 0,12

E3 0,15 0,18

UNIVERSITÉ SAAD DHLEB BLIDA 1

FACULTÉ SCIENCE DE LA NATURE ET DE LA VIE
DÉPARTEMENT BPC
OPTION MICROBIOLOGIE
COMPTE RÉNDU
ENZYMOLOGIE

PRÉSENTÉ PAR :
LOUZRI FATIMA ZOHRA

BELAROUCI LINA

NECHE SOHILA

BOUDJAKDJI SADJIA

GHMDANI SARA