Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
électronique
La microscopie
électronique
Champ d’utilisation des microscopes
Suivant la dimension des échantillons à observer, il convient de choisir l’un ou
l’autre microscope suivant la limite de résolution de chacun.
Petites molécules
Atomes Macromolécules Cellules Organismes multicellulaires
Microscope optique
Microscope électronique
Microscope AFM
Microscope à effet tunnel
Comparaison entre le microscope optique et électronique
Les électrons
traversent la
préparation.
Pulvérisation d’or
ou de platine sur
L’image est l’échantillon.
formée par les
Déflecteur qui
électrons
permet le balayage.
primaires.
Echantillon
Il est très utilisé pour obtenir des
Electrons déviés
images d'organites ou de cellules.
Echantillon
Electrons déviés
Le Bias
Le canon à électron
Les canons thermoélectroniques peuvent avoir trois types de filaments:
tungstène (W), hexaborure de Lanthane (LaB6) et hexaborure de cerium (CeB6)
W LaB6
La relation entre la longueur d’onde d’une particule de masse m, se déplaçant avec une vitesse v,
est donnée par l’équation de De Broglie:
h λ = longueur d’onde
λ =
m*v h = constante de Plank
La vitesse d’un électron pouvant être exprimé par l’ équation de son énergie cinétique
1 2*e*U
m*v2 = e*U soit v=
2 m
h 1 h2
En substituant dans l’équation de De Broglie λ = * =
m 2*e*U 2*m*e*U
m
Comme 1 joule = 107 cm2.g/sec2 on obtient l’équation suivante
150 150
λ = Å en cas de tension élevé λ = Å
U U + 10-6*U2
La longueur d’onde du faisceau d’électrons
h
λ= λ = longueur d’onde
m*v
h = constante de Plank = 6,62 , 10-34 J
m = 9,1.10 -31 kg
e = 1,6,10-19 Coulomb
La résolution du microscope électronique
La résolution des images de microscopie électronique est généralement limitée non pas par le pouvoir de
résolution de l’instrument mais par le contraste.
Le pouvoir de résolution des microscopes électroniques est, le plus couramment, de l’ordre de 0,2-0,3 nm,
alors que, pour la plupart des échantillons biologiques, la limite de résolution est de l’ordre de 1 à 5 nm.
Le contraste des images dépend de la nature et de l’intensité des interactions qui ont lieu entre le faisceau
d’électrons et l’échantillon.
La résolution du microscope électronique
La résolution du microscope électronique
Les aberrations des lentilles électromagnétiques
Tout comme en microscopie optique, le faisceau d’électron traversant les lentilles électromagnétiques est
sujet à toutes sortes d’aberrations:
- Les aberrations sphériques
- Les aberrations chromatiques
- Les comas
- Les astigmatismes
- Les distorsions
- Les aberrations de charge d’espace
L’aberration sphérique
L’aberration chromatique
- déshydrater
- inclure
- contraster
La fixation de l’échantillon
La fixation chimique crée des liaisons entre les molécules existantes. Cela consiste à former un pontage
chimique, un échafaudage qui va consolider les structures.
- les aldéhydes
Le permanganate de potassium
Très utilisé dans les années 60-70, permet la fixation des lipides et de ce fait préserve bien certaines
membranes cellulaires. Cependant, les particules cytoplasmique ayant un contenu élevé en ARN
sont mal conservées. De plus, la fixation des chromosomes n’est pas satisfaisante.
Le tétroxyde d’osmium
Le tétroxyde d’osmium agit sur les doubles liaisons insaturées. Il aura une action ciblée sur la
membrane mais aussi sur certaines chaînes latérales des acides aminés (histidine, lysine, cystéine et
méthionine) entraînant une gélification des protéines.
O O O O
Os Os
Lipide insaturé O O
O O
O O O O
Os Os
O O O O
Le tétroxyde d’osmium est un métal lourd qui est également utilisé pour donner du
contraste à l’image
La fixation de l’échantillon
Les aldéhydes
Trois différents aldéhydes sont utilisés comme fixateur en microscopie électronique, le formaldéhyde,
l’acroléine et le glutaraldéhyde.
H H H H
H O
O O O
H H C
2 H H
H H H
H
Le formaldéhyde possède un pouvoir fixant moins fort (fixateur doux) que le glutaraldéhyde. Il
permet la liaison de deux protéines par leurs groupements amines en réduisant sa double liaison.
H H H H
O + R NH2 H
R NH OH + R’ NH2 R NH NH R’ +
H Protéine H H O
Protéine
De manière générale, les résines d’inclusion sont hydrophobiques est nécessite une étape de
déshydratation de l’échantillon.
La déshydratation de l’échantillon est obtenue par bains successifs dans des solutions de
concentration croissante d’éthanol ou d’acétone.
La déshydratation est finalisée par un bain dans une substance apolaire tel que l’oxyde de propylène.
La déshydratation et l’inclusion
Pour obtenir une bonne qualité de coupe, l’inclusion de l’échantillon doit se faire au plus profond du
tissus.
Une résine apolaire, diluée dans un milieu de transition apolaire et volatile, va pénétrer
progressivement dans l’échantillon.
L’échantillon va passer dans des solutions de concentrations croissantes en résine jusqu’à ce qu’il
soit dans la résine non diluée.
Cette résine contenant l’échantillon est alors placée dans un petit support
(capsule de gélatine) pour débuter la polymérisation et rendre la résine
extrêmement rigide.
La polymérisation de la résine peut être induite par la chaleur d’une étuve, par
des micro-ondes ou par une réaction catalytique sous un rayonnement UV.
La surface en contact avec la lame est rendue aussi petite que possible,
la taille se faisant en pyramide autour de l’échantillon.
Les coupes sont collectées avec les grilles porte-objet et placer sur le porte-échantillon pour
l’observation microscopique
L'ultra microtomie
L'ultra microtomie
0.1 mm
La « coloration » en microscopie électronique
Cette technique est une post-préparation qui vient en complément des préparations de
lames minces et s’effectue sur un échantillon déjà déposé sur une grille support.
Méthode:
C’est une addition chimique de métaux lourds sur ou dans l’échantillon comportant des
sites réactifs tels que double liaison, pont éthylénique, méthylénique, terminaison alcool
ou aldéhyde.
Ex: acétate d’uranyle se fixe surtout sur les protéines et acides nucléiques, alors que
les sels de plomb se fixent sur les lipides
Action:
Elle se fait par réaction chimique d’oxyde ou des sels de métaux lourds.
La « coloration » positive
La « coloration » positive
Procédures:
Pour les coupes ultraminces de matériaux biologiques inclus dans une résine époxy on pratique le
plus souvent un double contraste faisant intervenir d’abord un sel d’uranium et ensuite un sel de
plomb. L’acétate d’uranyle est mis en solution à une concentration proche de la saturation de 0,5 à 9
% selon le solvant utilisé (eau, éthanol, méthanol). Les solutions les plus concentrées étant les plus
contrastantes.
La grille est mise en contact avec la solution pendant 5 minutes à plusieurs heures à température
ambiante ou à chaud (jusqu’à 60°C). Dès que le laps de temps choisi est atteint, la grille est
immédiatement rincée par un courant de solvant correspondant, puis à l’eau. Plusieurs rinçages sont
nécessaires pour éliminer toutes traces du contrastant non chimiquement liées aux structures. La
grille est ensuite laissée séchée quelques heures à une nuit avant d’entreprendre le 2ème contraste.
La deuxième solution utilisée est un sel de citrate de plomb obtenu par réaction de nitrate de plomb
et de citrate de sodium en solution aqueuse à pH voisin de 12. Le contraste est réalisé dans une
enceinte close (boîte de Pétri plastique) contenant des pastilles de soude pour assurer une
atmosphère sèche et basique, dépourvue de CO2. Les grilles, côté coupes, sont déposées sur des
gouttes de la suspension de contrastant pendant un temps court de 1 à 5 minutes. La grille est
ensuite rincée par un courant d’eau distillée, puis laissée séchée avant d’être observée.
Pour les particules en suspension le contraste est pratiqué immédiatement après avoir effectué la
dilution et le dépôt (voir 4.1) et avant séchage complet de la grille support. Cette dernière est
retournée sur une goutte de suspension d’uranyle, pendant 1 à 5 minutes avant d’être rincée comme
précédemment. Le contraste au plomb se fera toujours sur une grille sèche.
La « coloration » positive
Conclusion:
C’est une technique de routine pour les matériaux biologiques qui s’emploie aussi pour les
polymères.
Elle permet dans ce cas de différencier les polymères insaturés de ceux qui le sont et de définir
des phases différentes dans un polymère complexe.
Pour les matériaux biologiques les mêmes atomes lourds -osmium, uranium- peuvent être
utilisées pour la fixation chimique, le contraste négatif et le contraste positif. La différence
proviendra essentiellement du temps de réaction : plusieurs heures pour la fixation, quelques
minutes à 1h pour le contraste positif, (suivi d’un rinçage) et quelques dizaines de secondes pour
le contraste négatif (sans rinçage).
Appareil de golgi
et mitochondries
sans contraste
positif.
Appareil de Golgi et
mitochondries après
contraste positif
uranyle/plomb
La « coloration » négative
But
Cette technique consiste à renforcer le contraste d’un échantillon trop fin ou trop transparent aux
électrons pour être visualisé directement.
Méthode
Elle consiste à entourer l’échantillon d’un corps chimique dense aux électrons, ce qui permettra
d’observer les structures en clair sur fond noir.
Action
Elle est réalisée par un dépôt homogène d’une solution saline comportant un élément chimique
lourd (tungstène, uranyle, molybdate…) par ex acide phosphotungstique. Il n’y a pas de réaction
chimique spécifique entre l’échantillon et le produit déposé.
Matériaux
Cette technique s’applique à des matériaux divisés, de petites tailles, dispersés, constitués
d’éléments légers (C,O,H,N…). Elle est très utilisée pour les polymères et les matériaux
biologiques.
La « coloration » négative
La « coloration » négative
Bactériophage
La « coloration » négative
Adénovirus.
La technique d’ombrage
But
Méthode
Action
Le dépôt de très faible épaisseur est réalisé par évaporation de platine, d’or, de
chrome, ou de tungstène.
Matériaux
Avantages
Cette technique permet l’étude d’échantillons divisés de très petites tailles sans contraste
comme les macromolécules.
Elle est également très intéressante pour mettre en évidence les cristaux bidimensionnels.
Cette technique est basée sur une fixation physique de l’échantillon: congélation de l’échantillon en
présence d’un cryoprotecteur (saccharose, glycérol, DMSO,…) évitant la formation de cristaux de glace.
La cryofracture
Une fois la fracture réalisée, l’échantillon subit une étape d’ombrage par
vaporisation d’un métal lourd (ou platine) avec une incidence de 45°
La cryofracture
La cryofracture
La cryofracture
54
La surface de fracture a été ombrée par des vapeurs métalliques opaques aux électrons
et l'ensemble recouvert d'une couche résistante de carbone transparente aux
électrons. Les structures vivantes sont ensuite détruites et seule la réplique
(moulage) est observée en microscopie électronique à transmission. On observe à
gauche le noyau et les pores nucléaires, au centre du réticulum endoplasmique et à
droite la membrane plasmique avec des vésicules de sécrétion
Le cryodécapage
Le cryodécapage permet d’observer les surfaces externes des cellules et de leurs
membranes.
Les cellules sont aussi congelées dans l’azote liquide, puis fracturées. Puis le niveau de
glace est abaissé autour des cellules par la sublimation dans le vide (=lyophilisation).
Il y a ensuite vaporisation de platine par exemple (=ombrage)
Le cryodécapage
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
En cryofracture ou cryodécapage une nomenclature internationale a été instaurée pour l’interprétation des
clichés microscopique.
Face ES (surface)
Face EF (face)
Face PF (face)
Face PS (surface)
Cytoplasme
Couche E
Couche P
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
Nomenclature en cryofracture ou cryodécapage
En résumé…
Microscopie photonique Microscopie électronique
Les microscopes