Profª Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato

Sumário

Conceito de esterilização

Consequências da presença de contaminantes

Aplicação dos processos de esterilização

Modos de ação dos agentes esterilizantes

Métodos de esterilização
◦ Métodos físicos
◦ Métodos químicos

Esterilização de equipamentos

Esterilização de meio

Esterilização de ar
É um processo físico ou químico que destrói ou inativa
todas as formas de vida presentes em um
determinado material, especialmente microrganismos
incluindo bactérias, fungos e vírus
Métodos Métodos
Físicos Químicos

Calor úmido
Líquidos ou gases
Calor seco
Filtração por membranas
Hipoclorito
Fenóis

Radiação ultravioleta Formaldeídos

Radiação com partículas Óxido de etileno

ionizantes Ozônio
Ultra-som Dióxido de enxofre

Consequências da presença de um contaminante no
processo

Compromete seriamente o resultado
• Produção de penicilina, fermentação acetonabutanólica

Afeta negativamente o processo
• Consomem os nutrientes competindo com o microrganismo de
interesse
• Produção de enzimas, vitaminas

Pouco ou nada compromete o processo
• Tratamento de resíduos, produção de vinagre

Eliminação de contaminantes depende de cada caso

Em alguns casos a eliminação de contaminantes pode inviabilizar
economicamente o processo
• Produção de etanol a partir de caldo de cana-de-açúcar
Em um processo fermentativo são três os pontos de esterilização necessários

Meio

Equipamento

Ar

Aplicação dos processos de esterilização
Biorreatores e tubulações
Bombas, filtros, centrífugas,
misturadores, separadores, colunas
cromatográficas, homogeneizadores
Material de laboratório
Meios de cultivo
Ar
Embalagens
• Calor úmido
• Calor úmido
• Calor úmido (autoclaves)
• Calor seco (fornos)
• Radiação ultravioleta
• Calor úmido
• Filtração em membranas
• Cartuchos esterilizantes
• Cartuchos esterilizantes
• Radiação gama
• Calor úmido
• Lavagem com produtos químicos

Modo de ação dos agentes esterilizantes

Agentes
esterilizantes

Célula microbiana

Formação de Alteração de
substâncias letais moléculas essenciais
para manutenção e
sobrevivência celular

Morte do
microrganismo

Modo de ação dos agentes esterilizantes

Alvos possíveis de lesão celular

• Enzimas
• responsáveis pelos processos metabólicos
• Membrana citoplasmática
• que mantém a integridade do conteúdo celular, controlando o
transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo,
além de ser também o local de algumas reações enzimáticas
• Parede celular
• que proporciona rigidez e resistência mecânica aos
microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos
• Dano genético
• responsável pela codificação de alguma enzima essencial
 Métodos físicos

Métodos químicos

Métodos físicos

Calor úmido

Calor seco

Irradiação UV

Radiação ionizante

Calor úmido

É um dos métodos mais efetivos para destruição dos MOs

Vapor de água saturado

Associa a temperatura elevada ao alto grau de umidade

Mata os MOs, principalmente pela desnaturação irreversível
de suas proteínas

Destruindo elementos essenciais para sobrevivência e
multiplicação celular (enzimas
enzimas e membranas celulares)
celulares

Carameliza carboidratos produzindo produtos tóxicos
Equipamento – autoclaves (vapor sob pressão)
Aplicação
◦ Tubulações
◦ Reatores vazios
◦ Reatores com meio de cultura

Calor seco

Destrói os MOs através da oxidação de seus constituintes
químicos

Mais lenta e menos eficaz que o calor úmido

Nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo
uma certa proteção às proteínas

Podendo também ocorrer a coagulação de proteínas
Equipamento – estufas, fornos (T>150ºC)
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais e sólidos

Irradiação por luz ultravioleta (UV)

É absorvida por muitas substâncias celulares, mas
significativamente pelos ácidos nucléicos,
nucléicos onde geralmente ocorre
as lesões

Seu efeito letal depende do grau de radiação aplicada

A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220–300
nm (região abiótica)

Fatores que influenciam na sensibilidade microbiana a UV
• pH, estado fisiológico da célula (fase de crescimento) e constituição
genética
Equipamento - câmara de irradiação ultravioleta
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Utensílios metálicos
◦ Embalagens

Radiação ionizante

São radiações eletromagnéticas (α, β, γ, raios X, raios catódicos e
prótons, nêutrons e elétrons de alta energia)

Causam grande variedade de efeitos físicos e bioquímicos em
MOs

Ataca a molécula de DNA levando a perda de viabilidade celular

Podendo causar mutações
Equipamento - câmara de irradiação
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais
◦ Materiais sólidos (pós, solo, alimentos, sementes, embalagens...)

Métodos químicos

Agentes líquidos – Glutaraldeído

Agentes gasosos – Óxido de etileno

Glutaraldeído

Age na superfície das células

Promove interações glutaraldeído-proteínas gerando diversos
produtos

Interferindo no transporte de aminoácidos de baixo peso
molecular

Podendo ocorrer a aglutinação celular

Equipamento - próprio equipamento

◦ Ciclo de desinfecção/esterilização química
Aplicação
◦ Equipamentos

Óxido de etileno

Reage com a parte sulfídrica da proteína, do sítio ativo no
núcleo do MOs, impedindo assim sua reprodução

Utilizada em produtos que não podem ser expostos ao calor ou
a agentes esterilizantes líquidos

Equipamento – Autoclaves de esterilização por vapor

Aplicação
◦ Itens hospitalares
◦ Artigos plásticos de laboratório...

Esterilização de equipamentos

O agente de uso mais freqüente é o calor úmido, fornecido por
vapor de água saturado
◦ Facilidade de obtenção, de manuseio, sua eficácia e custo
relativamente baixo

O calor é obtido em caldeiras e distribuído por dutos de aço
galvanizado ou inoxidável, isolados termicamente

Pelas altas temperaturas e pressões na caldeira o vapor é
considerado estéril

◦ Esterilização de reatores vazios

◦ Esterilização de reatores com meio de cultura
◦ Esterilização em autoclaves

Esterilização de reatores vazios

Ar
Ar
Vapor Vapor esterilizado
Meio de
cultura
esterilizado

121°
121°C, 1 atm Estabilização P e T

Injeção de vapor no interior do reator promovendo expulsão
de todo o ar presente

Fecha-se o reator e injeta-se vapor até a T e P adequada
(121°C, 1atm)

Terminada a esterilização injeta-se ar esterilizado para evitar
que o resfriamento (condensação do vapor) gere vácuo

Após resfriamento e estabilização na pressão o meio de
cultura esterilizado externamente é carregado

Esterilização com reatores com meio de cultura

Ar Ar Água fria
Vapor na Vapor no Vapor no na
serpentina meio meio serpentina Ar

100°
100°C

96 a 97°
97°C 100°
100°C 121°
121°C, 1 atm Resfriamento

Circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a T do meio
de cultura esteja em torno de 96 a 97°C

Injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até atingir 100°C

Fecha-se o reator, a injeção continua até que a T atinja 121°C e a
P 1 atm (mantidas através da serpentina ou camisa)

Resfriamento feito pela circulação de água fria na serpentina ou
camisa

Quando a T atingir 100°C, deve-se injetar ar no tanque para
evitar formação de vácuo pela condensação do vapor

Esterilização de reatores com meio de cultura

◦ Tempo de esterilização ↔ Condição do reator e do processo

Biorreator onde se usa sempre o mesmo microrganismo

20 – 40 min

Biorreator multipropósito (bactérias ou fungos formadores de
esporos)

Assepsia química + 60 min

Modelos de biorreatores com serpentina e jaqueta para
o sistema de aquecimento/resfriamento

Serpentina interna

Serpentina interna

Jaqueta

Serpentina interna

Esterilização em autoclaves
◦ Para biorreatores de pequeno porte (até 30L)
◦ Vidrarias
◦ Meio de cultura...
◦ Modelos verticais e horizontais
◦ Geração de vapor: elétrica, a gás ou externa (caldeira)

Válvula de segurança Manômetro

Fermentador Vapor
Autoclave

Esterilização em autoclaves (Modo de operação)
Válvula de escape Câmara de vapor Válvula de Manômetro Válvula de controle
segurança

Atingir Vapor Porta

Câmara
T= 1210C de vapor
P=1 atm

Ar

Placa perfurada Tela de

sedimentos

Camisa de vapor Termômetro

Regulador de pressão para

fornecimento de vapor

Linha de resíduos Fornecimento de vapor


Esterilização de meios de cultura por calor úmido

Em escala industrial
◦ Processo descontínuo ou batelada

O meio é colocado no fermentador e, a seguir, aquecido com vapor

Esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador
◦ Processo contínuo

O meio de cultura é esterilizado antes de entrar no fermentador

Meio de cultura e o fermentador são esterilizados separadamente
◦ Processo descontínuo Tempo de esterilização

Aquecimento θ

Esterilização Te
T esterilização

Resfriamento

Resfriamento Esterilização

Aquecimento
Tm
A destruição dos MOs não se

Temperatura
T mínima letal
dá somente na fase de
esterilização. Durante o
aquecimento e resfriamento, Tf
enquanto a T for superior a T T final do meio esterilizado = T de fermentação

mínima letal (80 a 100°C),

Ti T inicial
também ocorre destruição dos Algumas horas
MOs.

Tempo

Vantagem

• Esterilização do meio de cultura e do fermentador simultaneamente, diminuindo os

riscos de contaminação nas operações de transferência do meio para a dorna

Desvantagens

• Manutenção do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 100°C) por

períodos longos (horas) favorece o desenvolvimento de reações químicas no meio
com possíveis alterações indesejadas em sua composição
Ex.: Caramelização da sacarose
• Elevados consumos de vapor (A) e de água (R): consequentes da eficiência baixa
do sistema de troca de calor
• Problemas de corrosão: ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com
o meio aquecido
• Tempo ‘não produtivo’ muito elevado: no período de esterilização, o fermentador é
utilizado como um tanque de esterilização, sem produção
• Processo contínuo
Atinge a T de esterilização
Vapor Termômetro e
manômetro
Tubo de retenção
Termicamente isolado
dimensionado de modo que o
tempo de retenção seja igual ao
tempo de esterilização
Válvula de
redução de
pressão
V
Fermentador
Termômetro e
manômetro

Trocador Trocador Pode ser efetuada

de calor 1 de calor 2 por vapor indireto –
trocador de calor
Meio Água
Bomba
T é reduzida até a T de
fermentação
 Tempo de
esterilização
θ
Esterilização
Te
T esterilização

Resfriamento
Aquecimento
Tm

Temperatura
T mínima letal

A destruição dos MOs Tf

T final do meio esterilizado = T de fermentação
durante o aquecimento e
resfriamento pode ser Ti T inicial
Alguns minutos
desprezada.

Tempo

Vantagens

• Menor destruição de nutrientes do meio de cultura: por trabalhar com T mais

elevadas e por ser um processo mais rápido tanto no aquecimento como no
resfriamento, o tempo de permanência do meio é relativamente pequeno (10 a 15
min)
• Maior rendimento do que as realizadas com meio esterilizado por processo
descontínuo
• Evita contaminação metálica do meio de cultura com a parede do tubo: tubo de
espera com dimensões pequenas
• Dispensa a utilização de motores de potência elevada para acionamento dos
agitadores, como no processo descontínuo
• Economia de vapor, e de água de resfriamento, em relação ao processo
descontínuo
• Cinética de destruição térmica de microrganismos

• Destruição por calor úmido depende

• Microrganismo
• Gênero, espécie, linhagem, existência de esporos, idade da cultura
• Meio de cultivo
• Composição, pH, presença de sólidos em suspensão
• Temperatura

dN Modelo de Rahn
= −k ⋅ N
dt

N = nº de MOs vivos após um t de aquecimento do sistema a T constante

k = Constante de velocidade de destruição térmica do MO
• Cinética de destruição térmica de microrganismos

• Utilizando o mesmo meio na mesma temperatura

• N0 = nº de MOs vivos no instante t=0
dN dN
dt
= −k ⋅ N ∫ N = −k ⋅ ∫ dt ln N = ln N 0 − k ⋅ t

• Usando valores experimentais de N e t → calcula-se k k

12
t N ln N ln N = -0,0341t+ 12,163
(minutos) R² = 0,9998Ln
8
25 8,5 . 104 11,35041
ln N Série1
50 3,5 . 104 10,4631 4
Linear (Série1)
100 6,0 . 103 8,699515
200 2,0 . 102 5,298317
0
0 100 200 300
250 40 3,688879 Tempo (min)
• Cálculo do tempo de esterilização
1 N0
ln N = ln N 0 − k ⋅ t t= ln
k N
Problemas Soluções
Os meios não possuem uma única Escolha de um MO altamente resistente ao calor
espécie de MO Ex.: Bacillus stearothermophilus
k depende também do meio e da Experimentos preliminares para determinação
temperatura de k
Aproximação – k≈ 1 min-1 (a 121°C)
Células estarem em forma de -
aglomerados ou protegidas por
partículas sólidas em suspensão
Como a esterilização tem como Probabilidade de falha da esterilização (P=N)
objetivo destruir todos os MOs
vivos – N=0
• Exercício
Um dado volume de meio a esterilizar contém 2,5.1010
microrganismos vivos. O valor da constante de velocidade de
destruição térmica do microrganismo é de 3,4 min-1. Calcule os
tempos de esterilização para que as probabilidades de falha sejam
de 10%, 1% e 0,1%.

Resolução:
1 2,5.1010
Para P = 0,1(10%) t= ln = 7,7 min
3,4 0,1
1 2,5.1010
Para P = 0,01(1%) t= ln = 8,4 min
3,4 0,01

1 2,5.1010
Para P = 0,001(0,1%) t= ln = 9,1 min
3,4 0,001
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de
esterilização
N2 θ N3
• N1 – Nº inicial de células vivas 1 1
• P – Probabilidade de falha Te
• Tm – Temperatura mínima letal

Resfriamento
N1 Esterilização
P1
• Te – Temperatura de esterilização 1
• k = f(T)

Aquecimento
Tm

Temperatura
• As curvas de aquecimento e
resfriamento do meio

Tf

Ti

t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de esterilização
t2
N1 θ
•Aquecimento
N 2 ∫t1
Aquecimento ln = k A .dt N2 N3
N Te
•Esterilização
Esterilização ln 2 = ke .θ

Resfriamento
N3 N1 Esterilização
P1
t
N3 4
P t∫3
•Resfriamento
Resfriamento ln = k R .dt

Aquecimento
Tm

Temperatura
t t
N1 2 4

ln = ∫ k A .dt +ke .θ + ∫ k R .dt Tf

P t1 t3

Ti
Tempo de esterilização

t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo
Tempo de
esterilização
N2 N3
θ
• Aquecimento e 1 1
Te
resfriamento são Esterilização
muito rápidos N1 P1

Resfriamento
Aquecimento
1
Tm

Temperatura
t t
N1 2 4

ln = ∫ k A .dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3 Tf

N1
ln = ke .θ Ti
P

t1t2 t3 t4
Tempo de esterilização Tempo
• Exercício (esterilização descontínua)
Um meio com 100 m3 de volume a esterilizar tem uma concentração
de microrganismos vivos igual a 7,2.109 células/litro. A temperatura
de esterilização é 120oC, a temperatura mínima letal do
microrganismo 80oC e a probabilidade de falha é 0,1%. A variação
da constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo
(min-1) com a temperatura (oC) é dada pela equação abaixo. Como
também as curvas de aquecimento e resfriamento do meio. Calcule
o tempo de esterilização deste mosto.

k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
N1=7,2.1014Células
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04 •10−11 •e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
θ =?
Tempo de esterilização t t
N1 2 4

ln = ∫ k A .dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3
• Resolução:
t t
N1 2 4

ln = ∫ k A.dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3

• Cálculo de ke

k = 6, 04 •10−11 •e0,200T ke = 6,04 •10−11 • e0, 200.120 = 1,6min−1

 t t
N1 2 4

• Resolução: ln = ∫ k A.dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3

• Cálculo de kA e kR
• A partir das curvas (A e R) e da equação de Bigelow – Tabela (t, T e k)

k = 6, 04 •10−11 •e0,200T Resfriamento

Aquecimento t (min) T (oC) k (min-1)
t (min) T (oC) k (min-1) 0 120 1,6
24 80 0,0005 2 114 0,48
30 87 0,0022 4 109 0,18
40 97 0,016 6 105 0,080
50 105 0,080 8 101 0,036
60 112 0,32 10 97 0,016
70 116 0,72 15 88 0,0026
80 120 1,6 20 80 0,0005
 t t
N1 2 4

• Resolução: ln = ∫ k A.dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3

• Cálculo de kA e kR
• Tabelas A e R - curvas (t x k) – obtém-se as equações – integra-se
80

∫k
24
A .dt ≅ 19,40

20

∫k
0
R .dt ≅ 3,23
t t
N1 2 4

ln = ∫ k A .dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3

7,2 • 1014
ln = 1,6θ + 19,40 + 3,23
0,001
θ ≅ 12 min
 t t
• Resolução: N1 2 4

ln = ∫ k A.dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3
• Cálculo de kA e kR
• Usando a regra de simpson

tn
h
∫ k(t)dt ≈ 3
[ k(t0 ) + 4k(t1 ) + 2k(t2 ) + 4k(t3 ) +... + 2k(tn−2 ) + 4k(tn−1 ) + k(tn )]
t0

tn − t0
h=
n

n= número de partes em que o intervalo foi dividido – deve ser um

número par
h= comprimento de cada intervalo
• Exercício (esterilização contínua)
Com os mesmo dados do exercício anterior, mas com a
temperatura de esterilização igual a 130oC. Qual o tempo de
esterilização?

Resolução:
t t
N1 2 4

ln = ∫ k A.dt +ke .θ + ∫ k R .dt

P t1 t3

k = 6, 04•10−11 •e0,200T = 6, 04•10−11 •e0,200.130 =11,8min −1

41,12 = 11,8θ
θ = 3, 5min
Esterilização
Ar
 Esterilização - Ar

• Aerossóis microbianos
 Solo: ventos
 Água: gotas d’água que se desprendem da superfície
 Irrigação com efluentes de esgoto
 Colheitas
 Abatedouros
 Criação de animais
 Depósitos de resíduos
 Esterilização - Ar

• Métodos para esterilização de ar

Aquecimento Radiação Filtração

 Esterilização – Ar
Aquecimento

• Esterilização por aquecimento

O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores

elétricos, onde o ar é aquecido, e mantê-lo pelo tempo necessário a altas
temperaturas.

• Pouco utilizada
• Exige temperaturas elevadas
• Grandes tempos de esterilização
• Compressores e resfriadores
• Utilizada para pequenas instalações (laboratório e escala piloto)
• Esterilização de ar na saída de fermentações com patógenos
 Esterilização – Ar
Aquecimento

Equipamento para esterilização de ar por aquecimento através de

resistores elétricos
 Esterilização – Ar
Radiação

• Esterilização por radiação ultravioleta

Baixo poder de Longos períodos de

penetração exposição

Inviabilidade do processo

As radiações ultravioletas são utilizadas no interior de salas ou

câmaras para esterilização do ar circundante e de mesas, uma
vez que o ar introduzido nestes locais é previamente
esterilizado por filtração.
 Esterilização – Ar
Filtração

• Esterilização por filtração

• Mais adequada
• Obtenção de altas vazões
• Baixo custo
• Disponibilidade de filtros bastante confiáveis
• Utilizada em praticamente todas as instalações industriais

• Materiais filtrantes
• Carvão
• Algodão
• Papel
• Materiais fibrosos: lã de vidro
• Materiais sinterizados: vidro, metais e materiais cerâmicos
• Materiais poliméricos: membranas de náilon, teflon
• Membranas seletivas (esterilizar o ar e provocar o enriquecimento
com oxigênio) – Futuramente
 Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros de materiais fibrosos (lã de vidro)

• Pouca aplicação industrial

• Operação de filtração em
profundidade, pois as partículas são
retidas ao longo de toda altura da
camada filtrante Lã de vidro
• Retenção dos microrganismos por
impacto direto (retenção mecânica), ...
• A passagem do ar através da
camada filtrante deve ser a uma
temperatura superior a ambiente
para manter a camada aquecida e
evitar a condensação de umidade
 Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros de membranas
• Filtros de membranas
microporosas, elaborados com
material polimérico
• Poros de dimensões menores do que
os microrganismos a serem retidos
(0,2 µm, 0,22 µm ou 0,45 µm)
• Retenção dos microrganismos por
impacto direto na superfície do
elemento filtrante
• Filtros hidrofóbicos: sem água na Retenção na superfície
superfície do filtro diminui o
crescimento microbiano, diminuindo a
possibilidade de enviar ar
contaminado para o biorreator
 Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros HEPA
(High Efficiency Particulate Air)

• Câmaras de fluxo laminar

• Áreas limpas
• Placas de acetato de celulose
• Permite a retenção de pelo menos 99,97% das
células e esporos microbianos ou outras partículas
presentes no ar
• Remove partículas com diâmetro médio de 0,3 µm a
0,5 µm
• São montados com vários elementos filtrantes separados
por folhas de alumínio, obtendo-se grande área para a
passagem do ar e a utilização de ventiladores ao invés
de compressores de ar, devido a baixa perda de pressão
através do leito filtrante